Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Engineering
Click here for the English version

Engineering

Microtensómetro para microscopía confocal Visualización de interfaces dinámicas

Published: September 9, 2022 doi: 10.3791/64110
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 1
1Department of Chemical Engineering and Materials Science, University of Minnesota, 2Department of Chemical Engineering, Carnegie Mellon University

Summary

Este manuscrito describe el diseño y operación de un microscopio microtensómetro/confocal para realizar mediciones simultáneas de tensión interfacial y reología dilatacional superficial mientras visualiza la morfología interfacial. Esto proporciona la construcción en tiempo real de relaciones estructura-propiedad de interfaces importantes en tecnología y fisiología.

Abstract

La adsorción de moléculas tensoactivas a interfaces fluido-fluido es omnipresente en la naturaleza. La caracterización de estas interfaces requiere medir las tasas de adsorción de surfactante, evaluar las tensiones superficiales de equilibrio en función de la concentración de surfactante a granel y relacionar cómo cambia la tensión superficial con los cambios en el área interfacial después del equilibrio. La visualización simultánea de la interfaz mediante imágenes de fluorescencia con un microscopio confocal de alta velocidad permite la evaluación directa de las relaciones estructura-función. En el microtensiómetro de presión capilar (CPM), una burbuja de aire hemisférica se fija al final del capilar en un depósito líquido de 1 ml de volumen. La presión capilar a través de la interfaz de burbujas se controla a través de un controlador de flujo microfluídico comercial que permite el control de presión, curvatura de burbujas o área de burbujas basado en modelos basado en la ecuación de Laplace. En comparación con técnicas anteriores como el canal de Langmuir y la caída colgante, la precisión de medición y control y el tiempo de respuesta se mejoran considerablemente; Las variaciones de presión capilar se pueden aplicar y controlar en milisegundos. La respuesta dinámica de la interfaz de la burbuja se visualiza a través de una segunda lente óptica a medida que la burbuja se expande y se contrae. El contorno de burbuja se ajusta a un perfil circular para determinar el radio de curvatura de la burbuja, R, así como cualquier desviación de la circularidad que invalide los resultados. La ecuación de Laplace se utiliza para determinar la tensión superficial dinámica de la interfaz. Después del equilibrio, la bomba microfluídica controlada por computadora puede imponer pequeñas oscilaciones de presión para oscilar el radio de burbuja (frecuencias de 0.001-100 ciclos / min) para determinar el módulo dilatacional Las dimensiones generales del sistema son lo suficientemente pequeñas como para que el microtensómetro quepa bajo la lente de un microscopio confocal de alta velocidad que permite rastrear cuantitativamente las especies químicas marcadas fluorescentemente con resolución lateral submicrona.

Introduction

Las interfaces aire-agua cubiertas por películas de surfactante son omnipresentes en la vida diaria. Las inyecciones de agua de surfactante se utilizan para mejorar la recuperación de petróleo de campos agotados y se utilizan como soluciones de fracturación hidráulica para gas y petróleo de esquisto. Las espumas gas-líquido y las emulsiones líquido-líquido son comunes a muchos procesos industriales y científicos como lubricantes y agentes de limpieza y son comunes en los alimentos. Los surfactantes y las proteínas en las interfaces estabilizan las conformaciones de anticuerpos durante el envasado, almacenamiento y administración 1,2,3,4,5, la estabilidad de la película lagrimal en el ojo 6,7,8 y la mecánica pulmonar 9,10,11,12,13,14, 15.

El estudio de los agentes tensioactivos o tensioactivos que se adsorben a las interfaces y sus propiedades tiene una larga historia con muchas técnicas experimentales diferentes 16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27 . Un desarrollo reciente es el microtensómetro de presión capilar (CPM), que permite el examen de las propiedades interfaciales en interfaces altamente curvas, a escalas de longitud mucho más pequeñas, mientras que utiliza significativamente menos materiales que otros métodos comunes 9,23,24,25. La microscopía de fluorescencia confocal (CFM) se puede utilizar para estudiar la morfología de lípidos y proteínas en las interfaces aire-agua en la CPM22 o en los canales de Langmuir 20,26,27,28,29. Aquí se han combinado un CPM y un CFM para conectar fenómenos morfológicos con propiedades interfaciales dinámicas y de equilibrio para desarrollar relaciones estructura-función para interfaces biológicas y tecnológicas.

Existen numerosos parámetros de importancia en los sistemas de surfactantes interfaciales accesibles al CPM-CFM. En el CPM, una burbuja de aire de 30-200 μm de diámetro se fija a la punta de un tubo capilar de vidrio. En versiones anteriores del CPM, la diferencia de presión capilar entre el interior y el exterior de la burbuja se controlaba a través de una columna de agua y una bomba de jeringa oscilatoria 9,30 ; la nueva versión descrita aquí los reemplaza con una bomba microfluídica controlada por computadora de mayor precisión. La tensión superficial (γ) se determina a través de la ecuación de Laplace, ΔP = 2γ/R, a partir de la caída de presión a través de la interfaz establecida por la bomba, ΔP, y el análisis óptico del radio de curvatura de la burbuja, R. La tensión superficial dinámica de la interfaz se puede determinar con una resolución de tiempo de 10 ms después de la generación de una nueva burbuja en contacto con un líquido a granel que contiene un surfactante soluble. La dinámica de adsorción del surfactante se puede describir mediante la ecuación clásica de Ward-Tordai10,31 para determinar las propiedades esenciales del surfactante, incluida la difusividad, la cobertura superficial y la relación entre la concentración a granel y la tensión superficial de equilibrio. Una vez que se alcanza una tensión superficial de equilibrio, el área interfacial se puede oscilar para medir el módulo dilatacional, Equation 1registrando los cambios en la tensión superficial, inducidos por pequeños cambios en el área de superficie de la burbuja, A32. Para interfaces más complejas que desarrollan sus propias estructuras internas como polímeros o proteínas entrelazadas, la tensión superficial, , se sustituye por una tensión superficial más general 4,33, Equation 2.

La estabilidad pulmonar durante la respiración puede estar directamente relacionada con el mantenimiento de una tensión superficial baja y un módulo dilatacional alto en la interfaz aire-líquido alveolar 9,10. Todas las superficies pulmonares internas están revestidas con una película continua de micras de espesor de líquido de revestimiento epitelial para mantener la hidratación del tejido34. Este líquido de revestimiento epitelial es principalmente agua, con sales y varias otras proteínas, enzimas, azúcares y surfactante pulmonar. Como es el caso de cualquier interfaz curva líquido-vapor, se induce una presión capilar con la presión más alta en el interior del alvéolo (o burbuja). Sin embargo, si la tensión superficial fuera constante en todas partes dentro de los pulmones, la ecuación de Laplace, ΔP = 2γ / R, muestra que los alvéolos más pequeños tendrían una presión interna más alta en relación con los alvéolos más grandes, lo que obligaría a los contenidos de gas de los alvéolos más pequeños a fluir a alvéolos más grandes y de menor presión. Esto se conoce como "Inestabilidad de Laplace"9,35. El resultado neto es que los alvéolos más pequeños colapsarían y se llenarían de líquido y se volverían difíciles de volver a inflar, lo que haría que parte del pulmón colapsara, y otras partes se inflarían en exceso, los cuales son síntomas típicos del síndrome de dificultad respiratoria aguda (SDRA). Sin embargo, en un pulmón que funciona correctamente, la tensión superficial cambia dinámicamente a medida que la interfaz aire-líquido epitelial en el área interfacial del alvéolo se expande y se contrae durante la respiración. Si Equation 3, o Equation 4, la presión de Laplace disminuye con el radio decreciente y aumenta con el aumento del radio para eliminar la inestabilidad de Laplace, estabilizando así el pulmón9. Por lo tanto, Equation 5y cómo depende de la frecuencia, la morfología y composición monocapa, y la composición del líquido alveolar pueden ser esenciales para la estabilidad pulmonar. El CPM-CFM también ha proporcionado las primeras demostraciones de los efectos de la curvatura interfacial sobre la adsorción de surfactante25, la morfología monocapa22 y el módulo dilatacional9. El pequeño volumen (~1 ml) del reservorio en el CPM permite la rápida introducción, eliminación o intercambio de la fase líquida y minimiza la cantidad requerida de proteínas o surfactantes costosos10.

El contraste en una imagen CPM-CFM se debe a la distribución de pequeñas fracciones de lípidos o proteínas marcados fluorescentemente en la interfaz16,27. Las monocapas de surfactante bidimensional a menudo exhiben separación de fase lateral en función de la tensión superficial o la presión superficial, Equation 6 π es la diferencia entre la tensión superficial de una interfaz fluido-fluido limpia, γ0, y una interfaz cubierta de surfactante, γ. π puede pensarse como la "presión" 2-D causada por las interacciones de las moléculas de surfactante en la interfaz que actúa para reducir la tensión superficial del fluido puro. A bajas presiones superficiales, las monocapas lipídicas están en un estado desorganizado similar al líquido; esto se conoce como la fase de expansión líquida (LE). A medida que aumenta la presión superficial y disminuye el área por molécula lipídica, los lípidos se orientan entre sí y pueden sufrir una transición de fase de primer orden a la fase condensada líquida ordenada (LC) de largo alcance 16,20,27. Las fases LE y LC pueden coexistir a varias presiones superficiales y se pueden visualizar a medida que los lípidos marcados fluorescentemente se excluyen de la fase LC y se segregan a la fase LE. Por lo tanto, la fase LE es brillante y la fase LC es oscura cuando se visualiza con CFM16.

El objetivo de este manuscrito es describir los pasos necesarios para construir y operar el microtensómetro combinado de microscopio confocal. Esto permitirá al lector realizar estudios de adsorción, medir la tensión superficial, el comportamiento reológico y examinar la morfología interfacial simultáneamente en una interfaz aire/agua o aceite/agua a escala micrométrica. Esto incluye una discusión sobre cómo tirar, cortar e hidrofobizar los capilares requeridos, instrucciones para usar los modos de control de presión, curvatura y área de superficie, y transferencia interfacial de surfactante insoluble a la interfaz curva del microtensiómetro.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Preparación de tubos capilares

  1. Coloque el capilar en un extractor capilar y ejecute el programa de tracción deseado para hacer dos capilares cónicos con un diámetro exterior (OD) de ~ 1 μm en la punta.
    NOTA: El OD del capilar antes de tirar debe ser el OD especificado para caber en el soporte capilar en la celda del microtensómetro. El diámetro interno (ID) del capilar puede variar, pero afectará el radio crítico del capilar después de tirar. Se elige un programa de tracción para que la contracción resultante reduzca inicialmente el OD capilar y el ID rápidamente, luego alcance un radio cerca del OD capilar y el ID deseados, y luego reduzca el diámetro más lentamente. Esto creará una mayor longitud capilar que se puede puntuar para producir un capilar utilizable de 30-100 μm en ID.
  2. Puntúe la punta del capilar en el lugar deseado para obtener una identificación de 30-100 μm y romper la punta. El capilar ahora tendrá un OD e ID del radio deseado en la punta (Figura 1A). Los capilares se pueden almacenar hasta el paso 2.
    NOTA: El borde cortado del capilar debe ser una rotura limpia de 90°. Cualquier defecto en el borde cortado conducirá a una mala fijación de la burbuja al capilar y a malas mediciones de la propiedad de la superficie. Las puntas capilares cónicas son muy delicadas. Se destruirán si entran en contacto con algo que no sean las soluciones (por ejemplo, paredes viales, boquilla de aire).

2. Hidrofobización de capilares

  1. Reúna los capilares de vidrio tirado, la solución de limpieza ácida, las pinzas de plástico, el agua desionizada (DI), la solución de hidrofobización (2% de silano en etanol), la bomba de vacío y la solución de etanol. Consulte la Tabla de materiales para obtener más información.
    PRECAUCIÓN: La solución de limpieza ácida es extremadamente tóxica, causa corrosión / irritación de la piel y los ojos, es oxidante. La solución de hidrofobización es un irritante cutáneo/ocular/respiratorio. Use protección para los ojos, batas de laboratorio y guantes y trabaje con soluciones en una campana extractora de humos.
  2. Limpiar con ácido el capilar
    NOTA: La limpieza ácida del capilar elimina cualquier residuo orgánico dentro del capilar y prepara la superficie del vidrio para la reacción de silanización que hace que el capilar sea hidrófobo.
    1. Agarra un capilar firmemente cerca de su extremo ancho con las pinzas.
    2. Sumerja la punta cónica en la solución de limpieza ácida mientras conecta la manguera de la bomba de vacío al extremo ancho del capilar. Esto succionará la solución en el capilar.
      NOTA: Se puede unir una punta de pipeta al extremo de la manguera capilar para permitir un mejor ajuste con el extremo capilar.
    3. Deténgase cuando la solución de limpieza ácida haya llenado aproximadamente la mitad del capilar.
      NOTA: Después de retirar la punta capilar de la solución de limpieza ácida, la solución en el exterior del capilar a menudo forma una cuenta cerca de la punta capilar. Toque suavemente el capilar hasta el cuello del vial de solución para eliminar el exceso de solución.
    4. Permita que la solución de limpieza ácida permanezca en los capilares durante al menos 30 minutos, asegurando que el tapón del líquido permanezca en el extremo cónico del capilar.
    5. Retire la solución de limpieza ácida del capilar sosteniendo firmemente el capilar con las pinzas y usando la manguera de vacío para extraer el líquido del extremo grande del capilar.
  3. Enjuague el capilar
    1. Sumerja el extremo cónico del capilar en agua DI asegurándose de que esté sumergido lo suficientemente profundo como para cubrir cualquier exterior que se haya sumergido en la solución de limpieza ácida. Mientras la punta está sumergida, use la manguera de vacío para tirar del agua DI a través del capilar. Retire el capilar del agua y retire el agua restante con la manguera de vacío.
    2. Repita el paso anterior al menos 4 veces.
  4. Realice el paso 2.3 nuevamente sustituyendo el etanol por agua DI.
  5. Aplicar succión continuamente hasta que el etanol se evapore completamente del interior del capilar. El capilar se volverá turbio y frío al tacto a medida que el etanol comience a evaporarse, pero se aclarará después de 30 a 45 s.
  6. Cubra el capilar con la solución de hidrofobización
    1. Sumerja brevemente el extremo ancho del capilar en el silano ~ 2% en solución de etanol. La acción capilar hará que la solución de recubrimiento se eleve dentro del capilar. Retire el capilar de la solución una vez que un tapón de ~ 1 cm de tamaño se haya elevado dentro del capilar.
    2. Oriente el capilar de modo que la punta cónica mire hacia abajo, permitiendo que la solución de recubrimiento caiga con gravedad hacia la punta cónica.
    3. Deje que la solución de recubrimiento permanezca en el capilar durante al menos 3 min.
      NOTA: No debe haber burbujas de aire en el tapón de la solución de recubrimiento que esté en contacto con el interior de la punta cónica. Si hay una burbuja de aire, entonces el interior capilar probablemente no estaba lo suficientemente seco en el paso 2.5. Para remediar esto, repita los pasos 2.4-2.6 según sea necesario.
  7. Enjuague los capilares con etanol 1x de la misma manera que el paso 2.3.
  8. Coloque el recubrimiento hidrófobo en el capilar
    1. Coloque los viales de centelleo limpios y secos en un horno al vacío a 120 °C. Coloque los capilares recubiertos en los viales (idealmente un capilar por vial) con extremos anchos que descansan sobre la base del vial. Permita que los capilares permanezcan en el horno durante al menos 6 h (se prefiere durante la noche) para lograr la unión permanente de la capa de silano hidrófobo a los capilares. Los capilares se pueden almacenar hasta el paso 4.

3. Preparación y almacenamiento de muestras

  1. Mezcle y almacene las soluciones de surfactante y fluoróforo en viales limpios lavados con ácido para evitar la contaminación.
    NOTA: Los lípidos disponibles comercialmente deben ser de la más alta pureza y almacenarse entre usos a - 20 °C. Los lípidos viejos o contaminados a menudo hacen que los resultados sean difíciles de reproducir.

4. Configuración del microtensómetro

  1. Ensamble la celda CPM como se describe en la Figura 2.
    1. Coloque el lado grande del capilar en la parte superior de la célula CPM hasta que empuje hacia la parte inferior de la célula.
    2. Apriete suavemente el tapón PEEK para asegurar el capilar y luego conecte el tubo de la bomba microfluídica al lado grande del capilar. Tenga cuidado de no tocar la punta capilar cónica.
  2. Según sea necesario, conecte las mangueras de intercambio de depósito y/o de control de temperatura a las entradas y salidas respectivas en la celda CPM (Figura 2); de lo contrario, enchufe las entradas y tomas de corriente no utilizadas.
  3. Conecte la célula CPM a la etapa del microscopio confocal, alineándola aproximadamente con el objetivo CFM, la cámara CPM y la fuente de luz CPM (Figura 3).
  4. Abra el flujo de gas a la bomba microfluídica a la presión de funcionamiento recomendada de la bomba (150 mbar para la bomba microfluídica utilizada aquí) y asegúrese de que el flujo hacia el capilar esté abierto.
  5. Comience a ejecutar la interfaz virtual CPM (Supplemental Coding File 1: Microtensiometer Virtual Interface.vi) en modo de control de presión con la frecuencia de oscilación y amplitud de la presión capilar establecidas en cero (Figura 4-7). La figura 4 muestra una captura de pantalla de la interfaz virtual. Para el agua DI y un radio capilar de ~ 35 μm, una presión de ~ 20 mbar asegura que no entre agua en el capilar.
  6. Llene la celda CPM con agua con una pipeta.
  7. Enfoque en la punta capilar con la cámara del microtensómetro.
  8. Concéntrese en la punta capilar con el CFM. Si hay dificultad para encontrar el capilar, use la cámara CPM para encontrar el objetivo CFM. Esto ayudará a aproximar la distancia entre el objetivo CFM y la burbuja, logrando la distancia de trabajo correcta.
  9. Después de que el anillo (proyección del sector verde) se centre en la burbuja, ajuste manualmente el enfoque para que el borde de la burbuja se pueda ver claramente (Figura 4-3).
    NOTA: La posición, el ángulo de inicio y final, y los radios interno y externo del anillo se pueden ajustar a través del menú debajo de la ventana de vista.
  10. Haga clic en Restablecer burbuja y asegúrese de que se forme una nueva burbuja (uno podrá escuchar el estallido de la burbuja anterior y la nueva burbuja será observable desde la ventana de visualización del panel de control; Figura 4-3). Si la burbuja no aparece, aumente la presión de restablecimiento o aumente el tiempo de retardo de restablecimiento en la pestaña Restablecimiento de burbuja debajo de la ventana de visualización. Compruebe si la tensión superficial es de alrededor de 73 mN/m (para burbujas salinas o de agua/aire) (Figura 4-9).
  11. Saque el agua a través de la jeringa directa a la célula (Figura 3-13), vacíela y vuelva a colocarla. La muestra está lista para cargarse para ejecutar el experimento.

5. Estudio de adsorción

  1. Llene la celda con la muestra deseada utilizando una pipeta en autoclave manteniendo el software CPM en modo de control de presión . Asegúrese de que la tensión superficial inicial sea de alrededor de 73 mN/m cuando se cree una nueva interfaz de burbujas.
  2. Determine el radio de la burbuja recién formada e introduzca ese valor en el control de área de la línea central (Figura 4-7) y cambie el tipo de control a control de área haciendo clic en la ficha Control de área (Figura 4-8).
    NOTA: También se puede utilizar el control de presión constante, pero esto hace que el radio de la burbuja cambie continuamente a medida que cambia la tensión superficial de la interfaz. Esta área cambiante puede complicar el análisis de las tasas de adsorción de surfactante y hacer que la burbuja estalle durante el estudio.
  3. Comience a grabar el video confocal.
  4. Haga clic en Restablecer burbuja (Figura 4-5) e inmediatamente haga clic en Recopilar datos (Figura 4-6). La luz de señalización en el botón se volverá verde.
  5. Ajuste la velocidad de registro de datos de acuerdo con la concentración de la muestra deslizando la barra que se muestra en la Figura 4-6. Para adsorciones más lentas, use una velocidad de grabación más lenta. Esto se puede ajustar en medio de una ejecución si se desea una velocidad de grabación más alta desde el principio, pero es preferible una tasa más lenta para estudios largos con el fin de reducir el tamaño del archivo.
  6. Después del final del experimento (cuando se haya alcanzado una meseta de tensión superficial final), guarde el archivo eligiendo la ruta correcta del archivo (Figura 4-1) y haciendo clic en el botón Guardar (Figura 4-2).
  7. Detenga y guarde la grabación en el CFM también.

6. Estudio de oscilación/relajación

  1. Llene la celda con la muestra utilizando una pipeta en autoclave manteniendo el software CPM en modo de control de presión . Asegúrese de que la tensión superficial sea de alrededor de 73 mN/ m cuando se cree una nueva interfaz de burbujas.
  2. Espere hasta que la muestra esté completamente adsorbida a la interfaz. Esto se puede realizar directamente después de un estudio de adsorción en lugar de comenzar de nuevo con una nueva interfaz de burbujas.
  3. Decida si la oscilación será una oscilación de presión, oscilación de área u oscilación de curvatura seleccionando la pestaña apropiada (Figura 4-8) e ingresando el valor de referencia deseado, el% de oscilación y la frecuencia de oscilación (Figura 4-7).
    NOTA: También se puede acceder a las oscilaciones de área de onda triangular, cuadradas y de diente de sierra desde el menú desplegable de la pestaña Otra oscilación de área .
  4. Inicie la grabación del video confocal y haga clic en Recopilar datos (Figura 4-6) en el software CPM.
  5. Inicie la oscilación. Asegúrese de registrar al menos siete ciclos para obtener los mejores resultados. Elija una tasa de adquisición de datos (Figura 4-6) para dar un número adecuado de puntos de datos para cada ciclo de oscilación.
  6. Si se desean otras amplitudes o frecuencias de oscilación, cambie los valores durante el experimento.
  7. Guarde los resultados como en los pasos 5.6 y 5.7.

7. Estudio de intercambio de disolventes

  1. Llene la celda con la muestra utilizando una pipeta en autoclave manteniendo el software CPM en modo de control de presión. Asegúrese de que la tensión superficial sea de alrededor de 73 mN / m, cuando se cree una nueva interfaz de burbujas.
    NOTA: Los estudios de adsorción y/u oscilación se pueden realizar antes del estudio de intercambio de disolventes.
  2. Conecte el tubo de entrada con la botella de solución de intercambio deseada (Figura 3-11) a la bomba peristáltica (Figura 3-10).
  3. Inicie la grabación del video en el software confocal y haga clic en Recopilar datos (Figura 4-6) en el software CPM.
  4. Ajuste la velocidad de la bomba peristáltica. Esto controlará la tasa de intercambio de fluidos y debe elegirse en función de los requisitos para el experimento, es decir, qué tan rápido se debe intercambiar el solvente.
  5. Si es necesario intercambiar varios fluidos, detenga la bomba peristáltica y conecte la entrada a otra solución de intercambio.
  6. Una vez finalizado el intercambio (~20 min), guarde los resultados como en los pasos 5.6 y 5.7.

8. Adsorción de surfactante insoluble

NOTA: Si el surfactante a adsorber no es soluble en el líquido reservorio, este método se puede utilizar para transferir una monocapa desde la interfaz aire/agua de la célula a la superficie de la burbuja. Muchos lípidos formadores de bicapa son casi insolubles en solución salina y no se absorben espontáneamente a la burbuja cuando están suspendidos en la solución reservorio.

  1. Llene la celda con la muestra utilizando una pipeta en autoclave manteniendo el software CPM en modo de control de presión . Asegúrese de que la tensión superficial sea de alrededor de 73 mN / m, cuando se cree una nueva interfaz de burbujas.
  2. Depositar una monocapa de surfactante insoluble en la interfaz aire-agua de la célula a partir de una solución en una solución orgánica volátil. Usando una jeringa, deposite pequeñas gotas en la interfaz y permita que el solvente se evapore dejando el lípido como una película delgada.
    PRECAUCIÓN: El cloroformo se utiliza como disolvente para fosfolípidos como fosfatidilcolinas y ácidos grasos. Las soluciones para untar suelen ser 0.01-0.02 mg de lípido por ml del solvente. El cloroformo es extremadamente tóxico, puede causar irritación de la piel y los ojos, y es cancerígeno. Use protección ocular adecuada, bata de laboratorio y guantes y haga la solución en una campana extractora de humos.
  3. Disminuya el área de superficie a través del control de presión de la línea central (Figura 4-7) de la burbuja hasta que esté casi plana. Esto evita que la burbuja estalle después de que el surfactante se haya adsorbido.
  4. Retire el líquido del depósito de la célula a través de la jeringa directa a la célula hasta que la interfaz aire/agua se mueva más allá de la punta del capilar. Si bien se puede usar una bomba de jeringa, este paso se puede lograr usando manualmente la jeringa.
  5. Aumente la altura del líquido del depósito a su nivel inicial.
    NOTA: Después de que se vuelva a sumergir la punta, la burbuja será más grande debido al surfactante que ahora se adsorbe en la interfaz. La monocapa ahora estará lista para experimentos de oscilación o intercambio de solventes.

9. Limpiar

  1. Apague el CFM.
  2. Cambie al modo Control de presión .
  3. Retire la muestra de la celda con una pipeta. Cargue la celda con agua DI y aumente la presión a ~ 50 mbar para hacer que las burbujas escapen constantemente del capilar y limpien la punta capilar. Repita este proceso 2x.
  4. Cierre la válvula de seguridad y apague el CPM haciendo clic en el botón rojo en la esquina superior izquierda, apague el panel de control de presión de luz y azul y cierre la fuente de presión.
  5. Retire la célula de la etapa de microscopio confocal. Enjuague la celda con etanol y agua DI. Retire el tubo capilar de la célula CPM.

10. Limpieza de la celda

  1. Desmonta la celda. Cepille la pared interior con un cepillo de dientes mientras se enjuaga con agua DI. Sumerja las piezas en etanol y sonicarlo durante ~ 30 min.
  2. Enjuague todas las partes con agua DI varias veces. Seque las piezas soplándolas con gas nitrógeno o secándolas dentro de un horno al vacío.

11. Análisis de oscilación

  1. Ejecute el código Dilatational_Rheology_Analysis.m (Supplemental Coding File 2), eligiendo el archivo deseado guardado desde la interfaz virtual de CPM. Los datos de muestra se incluyen en los archivos complementarios.
  2. La gráfica presión vs. tiempo aparecerá como se muestra en la Figura Suplementaria 1. Haga clic con el botón izquierdo en el punto donde comienza la oscilación y vuelva a hacer clic con el botón izquierdo donde termina la oscilación. Si los datos contienen varias oscilaciones, repita este proceso para todas las oscilaciones.
    1. Cuando se haya hecho clic con el botón izquierdo en todos los puntos de inicio y finalización, haga clic con el botón derecho del ratón en cualquier lugar. Por ejemplo, como se muestra en la Figura suplementaria 1, se puede hacer clic con el botón izquierdo en los puntos 1, 2, 3 y 4, seguido de un clic con el botón derecho.
      NOTA: El código calculará el módulo dilatacional y el ángulo de fase y los resultados se escribirán en un nuevo archivo .csv en la ubicación del archivo original. Los resultados de los datos de muestra se pueden ver en los resultados de código dados en el Archivo de codificación suplementario 2. MATLAB también generará varias representaciones gráficas de los datos, como se muestra en la Figura complementaria 2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Una fuente importante de error de medición surge de los capilares que tienen defectos, ya sea del proceso de corte (Figura 5A, B) o del proceso de recubrimiento (Figura 5D). Ambos tipos de defectos conducen a errores en la determinación de la forma y el tamaño de la burbuja por el sistema de análisis óptico de imágenes, lo que lleva a valores de tensión superficial inexactos. Es importante examinar cuidadosamente cada nuevo capilar después de que se tira y se recubre bajo el microscopio óptico antes de insertar el capilar en el CPM. Un capilar mal cortado debe descartarse, pero un capilar mal recubierto puede limpiarse con ácido y volver a recubrirse para mejorar la fijación de burbujas al final del capilar (paso 2 del Protocolo). Los capilares funcionan mejor si el corte final es perfectamente perpendicular al capilar (Figura 5C) y la burbuja pasa directamente al final del capilar (Figura 5E). El recubrimiento hidrófobo en el capilar se volverá menos efectivo en la fijación con el uso, lo que requerirá que el capilar se vuelva a limpiar y recubrir.

En la Figura 6 se presentan datos representativos para la adsorción de surfactante frente al tiempo. Las técnicas experimentales anteriores, como un colgante o gotas sésiles utilizadas para medir la adsorción de surfactante, no tenían un mecanismo para ajustar dinámicamente la presión capilar, ya que el cambio en la tensión superficial hace que el área de la burbuja cambie durante la adsorción 30,36,37. De hecho, para burbujas y gotas más grandes, se requieren cambios en la forma de la burbuja o gota (y por lo tanto en el área de superficie) para determinar la tensión superficial a partir del análisis de la forma de la interfaz, ya que la presión capilar no se mide de forma independiente y la presión capilar varía sobre la superficie de gota o burbuja37. Esto también complica el análisis de la adsorción porque a medida que el surfactante se adsorbe a la interfaz, la tensión superficial disminuye, y para satisfacer la ecuación de Laplace el área de superficie de la burbuja debe aumentar, requiriendo surfactante adicional para adsorber para alcanzar el equilibrio. En el CPM, una presión capilar fija requiere que el radio de burbuja inicial debe estar dentro de un pequeño rango antes de la adsorción de surfactante para evitar que la burbuja se expulse del capilar si la tensión superficial disminuye demasiado. La dinámica de adsorción de surfactante a menudo se modela mediante la ecuación clásica de Ward-Tordai31, que describe la adsorción de moléculas de surfactante a una interfaz limpia de área interfacial constante. Si bien la ecuación de Ward-Tordai se puede modificar para tener en cuenta el área de superficie cambiante, esto introduce parámetros adicionales y complica enormemente el análisis38,39.

Para superar estos problemas, se desarrolló un bucle de retroalimentación basado en modelos utilizando la ecuación de Laplace que mantiene la curvatura (y el área de superficie) de la burbuja constante durante todo el proceso de adsorción ajustando dinámicamente la presión capilar. Hay diferencias significativas en la tasa de cambio de la tensión superficial porque el área de la burbuja no aumenta constantemente. Los cambios en el área de la burbuja durante la adsorción no son constantes con el tiempo, ya que la tensión superficial cambia lentamente al principio, y luego se acelera rápidamente antes del equilibrio. Una complicación adicional es que el cambio fraccional en el área depende del radio de burbuja inicial. Un beneficio adicional del radio de burbuja constante es que la obtención de imágenes de la interfaz se simplifica a medida que la superficie de la burbuja permanece fija, lo que simplifica el enfoque del CFM. Durante el proceso de adsorción, a medida que el surfactante se adsorba a la interfaz (Video 1), la señal fluorescente de la interfaz aumenta. Si el surfactante forma dominios superficiales, estos dominios se pueden observar formando y creciendo22.

Los cambios en la tensión superficial durante las oscilaciones de área se muestran en la Figura 7. En versiones anteriores del CPM, se realizaban oscilaciones en la presión capilar de la burbuja; sin embargo, generar una onda sinusoidal en la presión capilar no se traduce directamente en una onda sinusoidal en el área de superficie, ya que los dos están relacionados a través de la ecuación de Laplace. Al aprovechar un bucle de retroalimentación basado en modelos utilizando la ecuación de Laplace, se crean oscilaciones en el área en lugar de en la presión capilar, lo que lleva a datos que son más fáciles de analizar y recopilar en un rango más amplio de amplitudes. Como resultado, los datos de tensión superficial vs. área recopilados de este método se pueden utilizar para calcular directamente el módulo dilatacional interfacial de la capa surfactante: Equation 7 (Figura 8), donde Equation 8 es la tensión total del sistema y la tensión τ es latensióndesviatoria no isotrópica a menudo ausente en soluciones simples de surfactante 4,33. Por lo tanto, para un sistema de surfactante simple, Equation 9. Para las interfaces donde se pueden formar redes elásticas, como las proteínas tensoactivas, a menudo hay tensiones adicionales presentes y, por lo tanto, deben tenerse en cuenta al definir el módulo dilatacional. El video 2 muestra un video CFM del movimiento de dominios LC negros en una matriz de fase LE de color continuo en monocapas de fosfolípidos. Los distintos dominios LC en la interfaz se reorganizan en una red ramificada que cubre la interfaz cuando se producen oscilaciones en la burbuja curva22,40. La pestaña Otras oscilaciones de área se puede usar para crear ondas de diente de sierra, cuadradas y triangulares como se ve en la Figura suplementaria 3 y la pestaña Compresión permite la compresión y expansión del área de velocidad constante.

Para los estudios de intercambio de solventes, primero se permite que un surfactante se adsorba a la interfaz, y luego se intercambia el líquido del reservorio para permitir que una segunda especie tensoactiva entre en contacto con esa interfaz. Es posible examinar el cambio en la tensión superficial a medida que el segundo surfactante compite con el surfactante original en la interfaz. El módulo dilatacional de la superficie es a menudo una sonda más sensible del intercambio de surfactante junto con la morfología de la superficie a través de CFM. La Figura 9 muestra el cambio en la tensión superficial, el módulo dilatacional superficial y la morfología superficial a medida que se produce uno de estos intercambios de disolventes. Si bien los detalles de dicho intercambio pueden variar, un cambio en cualquiera de las tres propiedades podría indicar la integración del segundo componente en la monocapa o la solvatación del componente primario en el volumen. Se podría adjuntar una segunda etiqueta fluorescente a la especie secundaria para observar su interacción con la interfaz a partir de las imágenes CFM.

Figure 1
Figura 1: Tratamiento capilar. (A) Imagen que muestra la puntuación del capilar. La cerámica de puntuación de vidrio se mantiene en una abrazadera para mantenerla estable. (B) Limpieza ácida del capilar. La solución de limpieza ácida se introduce en el capilar con la bomba de vacío. (C) Hidrofobización del capilar. Tapón de solución de silano sostenido dentro del capilar Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Construcción de celdas. (1) Soporte de celdas de aluminio grandes, (2) Junta de fluoroelastómeros (cuatro en total), (3) portaobjetos de vidrio (dos en total), (4) celdas PEEK y (5) soportes pequeños de celdas de aluminio. Cuando se ensambla, se coloca una junta de fluoroelastómero a cada lado de cada portaobjetos de vidrio. La celda se mantiene unida con tornillos y pernos. La imagen ampliada de la celda PEEK muestra las ubicaciones de los diversos puertos: (6) puerto capilar, (7) entrada de intercambio de solvente, (8) salida de intercambio de solvente y (9,10) entrada y salida de la camisa de control de temperatura. Se puede usar un tapón PEEK para conectar el tubo o capilar a la celda. Los puertos que no se están utilizando pueden cerrarse completamente mediante enchufes sin canales. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Esquema de CPM/CFM, no a escala. (1) la célula CPM, (2) el tubo capilar con una burbuja en la punta, (3) el objetivo del microscopio confocal, (4) el objetivo de la cámara del microscopio con el filtro, (5) la fuente de luz CPM, (6) la bomba microfluídica, (7) la válvula de seguridad, (8) la entrada de intercambio de fluidos, (9) la salida de intercambio de fluidos, (10) la bomba peristáltica, (11) el depósito de fluido de intercambio, (12) los residuos de intercambio de fluidos, (13) la jeringa directa a la celda, (14) entrada y salida de la camisa de control de temperatura, y (15) depósito y bomba con temperatura controlada. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Interfaz virtual CPM. (1) la ruta del archivo donde se guardarán los datos; (2) parámetros del sistema, comentarios y el botón Guardar. Todos los campos de esta área se guardan en el archivo de datos final; (3) la imagen de la cámara CPM; (4) configuraciones que controlan el análisis de imágenes, la medición de anillos, el restablecimiento de burbujas y el seguimiento de fotogramas por segundo; (5) el botón Bubble Reset; (6) el botón Recopilar datos, el control de la velocidad de registro de datos y los indicadores de recopilación de datos; (7) controles para todos los valores de la línea central del modo de funcionamiento, la amplitud de oscilación y la frecuencia de oscilación; (8) interruptor de modo de funcionamiento: al hacer clic en cada pestaña se cambia a ese modo de control. Cada modo muestra la señal de presión que se envía a la bomba en el gráfico "Señal de presión", así como algunos controles adicionales; (9) datos de tensión superficial en vivo; (10) datos de presión en vivo; (11) radio vivo de datos de curvatura; (12) datos de superficie viva; y (13) datos de tensión superficial y área de superficie en vivo, que se pueden utilizar para determinar aproximadamente el ángulo de fase durante un estudio de oscilación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Defectos capilares. (A) y (B) Capilares mal cortados; (C) capilar cortado correctamente, (D) capilar con mala fijación debido a un recubrimiento deficiente o degradado, y (E) capilar correctamente fijado. Las flechas rojas en D y E indican dónde están fijadas las burbujas. Para obtener los mejores resultados, la burbuja se fijará en la punta capilar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: Resultados del microtensómetro del estudio de adsorción para adsorciones de presión constante (naranja) y área constante (azul). El área de superficie de burbuja para la adsorción de área constante aumenta significativamente a lo largo del estudio y hace que la adsorción tarde más en alcanzar la misma tensión superficial. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 7
Figura 7: Oscilación típica del control del área de superficie. (A) Datos de presión, (B) curvatura y (C) área de superficie. Los datos del área de superficie son sinusoides, mientras que los datos de presión y curvatura no lo son, como lo demuestra que los valores de la línea central no estén en el punto medio de la oscilación. La relación matemática entre los tres valores significa que sólo uno puede ser un verdadero sinusoide. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 8
Figura 8: Resultados reológicos de la muestra después del análisis. Módulo dilatacional de Lyso PC (1-palmitoil-2-hidroxi-sn-glicero-3-fosfocolina) en función de la frecuencia para aumentar las concentraciones de Lyso PC para burbujas de radio de ~45 μm. Las concentraciones >0.1 mM de Lyso PC que acompañan a la inflamación disminuyen el módulo dilatacional en el rango de las tasas normales de ventilación / respiración (amarillo) para hacer 2ε-γ < 0, que es el valor cruzado para inducir la inestabilidad de Laplace (línea roja punteada). Las bajas concentraciones de Lyso PC ≤0.01 mM, que pueden ocurrir en pulmones normales no inducen inestabilidad. A frecuencias >10 rad/seg, todas las concentraciones de Lyso PC están por encima del cruce y no serían susceptibles a la inestabilidad de Laplace. Las líneas rojas sólidas son ajustes de teoría a los datos. Figura reproducida a partir de la referencia9. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 9
Figura 9: Resultados de CFM y CPM para un estudio de intercambio de solventes para surfactante pulmonar intercambiado con agua DI y luego Lyso PC. (A) muestra cómo cambian la tensión superficial y el módulo dilatacional superficial a lo largo del estudio. El gráfico se divide en cuatro regiones: cuando el surfactante pulmonar se adsorbe a la interfaz (azul), cuando el LS se intercambia con agua DI (verde), cuando la solución de intercambio se cambia a una solución Lyso PC (rojo) y cuando la celda se llena con la solución Lyso PC (naranja). Se puede ver que las propiedades cambian a lo largo de los diversos intercambios que indican que la interfaz está cambiando. (B) muestra una imagen confocal del surfactante pulmonar adsorbido a la interfaz antes del intercambio y (C) muestra la misma superficie después de que se complete el intercambio con la solución Lyso PC. En ambos casos, el círculo discontinuo blanco indica el borde interno del capilar. La estructura de los dominios en la monocapa cambia drásticamente después del intercambio de disolventes, corroborando los resultados de CPM. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Video 1: Video confocal del estudio de adsorción por presión constante para surfactante pulmonar. El color falso muestra la distancia en la dirección z con la barra de color en el lado izquierdo del video, con el púrpura indicando la burbuja cerca del capilar y el verde siendo la parte superior de la burbuja. La interfaz está inicialmente tenuemente iluminada ya que solo se adsorbe un poco del surfactante fluorescente. A medida que más y más surfactante se adsorbe, la burbuja comienza a crecer a medida que el color cambia más a verde y la interfaz se llena de dominios LC negros que pueden moverse a través de la interfaz. Los agregados de surfactante en la solución se pueden ver flotando en la solución como formas amorfas brillantes y varios se asientan en la interfaz de la burbuja, desintegrándose y depositando su surfactante en la interfaz. Haga clic aquí para descargar este video.

Video 2: Video confocal del estudio de oscilación para surfactante pulmonar. El color falso muestra la distancia en la dirección z con la barra de color en el lado izquierdo del video. La superficie está sujeta a varias frecuencias de oscilación diferentes y se puede ver que los dominios LC oscuros en la interfaz cambian a lo largo de las oscilaciones. Haga clic aquí para descargar este video.

Figura complementaria 1: Ejemplo de un paso intermedio en el código para determinar la reología dilatacional. Cuando aparezca esta pantalla, el usuario debe hacer clic con el botón izquierdo en el borde más a la izquierda de la oscilación para analizar y, a continuación, hacer clic con el botón izquierdo en el borde más a la derecha. Se pueden analizar múltiples oscilaciones para que el usuario pueda hacer clic con el botón izquierdo en 1, 2, 3 y 4, y luego hacer clic con el botón derecho para analizar esas dos oscilaciones. Las oscilaciones mostradas son de diferentes amplitudes y frecuencias. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria 2: Ejemplo de los resultados gráficos producidos por el código reológico dilatacional. Esto muestra los ajustes de los sinusoides a las oscilaciones en presión, radio, área de superficie y tensión superficial, así como la transformada de Fourier de cada oscilación. Idealmente, el segundo armónico en la transformada de Fourier debe ser inferior al 10% del primer armónico para el área de superficie y la tensión superficial. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura suplementaria 3: Modos de operación alternativos. (A) Onda sinusoidal, (B) Onda diente de sierra, (C) Onda cuadrada, (D) Onda triangular, (E) Expansión de tasa constante y (F) Compresión de tasa constante. Los modos de compresión y expansión permiten crear isotermas de tipo Langmuir para tensioactivos insolubles. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo de codificación suplementario 1: microtensiómetro Virtual Interface.vi. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo de codificación suplementario 2: Dilatational_Rheology_Analysis.m. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

El CPM/CFM combinado es una herramienta poderosa para examinar la dinámica interfacial, los equilibrios y la morfología. Este protocolo describe los pasos necesarios para obtener datos con CPM/CFM.

La Figura 2 muestra el diseño de la célula con canales para el intercambio capilar, solvente y de calor indicado. La entrada para el intercambio de disolventes debe estar en la parte inferior de la celda, mientras que la salida debe estar en la parte superior, lo que permite que la celda no se desborde durante el intercambio. En la práctica, los caudales de entrada y salida pueden ser ligeramente diferentes para la misma bomba peristáltica. Un problema común con este diseño de celda es la fuga de la célula. Esto es causado con mayor frecuencia por una mala conexión entre la celda y una de las conexiones, pero si todas las conexiones están secas y no tienen fugas, esto puede deberse a una grieta en el portaobjetos de vidrio de la celda debido al apriete excesivo de los pernos que rodean la celda.

La Figura 3 muestra las conexiones entre las diversas bombas y la celda, así como la alineación de la celda con los objetivos CFM y CPM. La cámara CPM (4) se utiliza para obtener imágenes de la forma de la burbuja durante el funcionamiento. La cámara CPM debe estar equipada con un filtro óptico que impida que la luz láser excitante CFM entre en la cámara CPM. De lo contrario, el láser CFM hace que las imágenes en la cámara CPM sean extremadamente ruidosas y difíciles de ajustar utilizando el análisis de imágenes. Una válvula de seguridad conecta el capilar y la bomba microfluídica (7) y permite realizar cambios en la bomba y la fuente de presión de aire, sin el riesgo de que el reflujo de la celda llegue a la bomba. Una segunda válvula (13) proporciona acceso a una jeringa para permitir la inyección directa de líquido dentro y fuera del depósito. Es posible que sea necesario agregar líquido al reservorio en caso de fuga y puede ser necesario eliminarlo para el paso 8 del protocolo (adsorción de surfactante insoluble) o para eliminar las burbujas purgadas del capilar si se han unido al objetivo confocal.

Durante cada experimento, se deben realizar varios pasos clave con cuidado. La mayoría de los problemas que ocurren una vez que el instrumento está funcionando, involucran al propio capilar. Como tal, el corte y el recubrimiento cuidadosos pueden minimizar las dificultades. Cortar el capilar al diámetro deseado es un proceso difícil y de bajo rendimiento. Cualquier chip o desnivel en la punta del capilar conducirá a lecturas deficientes del radio de la burbuja. Además, si el recubrimiento hidrofóbico no se aplica correctamente, o si se degrada con el tiempo y el uso, la burbuja no se fijará correctamente en la punta del capilar. Esto puede ser indicado por la burbuja que parece estar fijada dentro del capilar o deslizándose a lo largo del interior del capilar durante un estudio oscilatorio. Un capilar que se corta bien pero no se fija adecuadamente puede ser relimpiado y tratado hidrofóbicamente.

Otro paso clave y posible fuente de error es limpiar el depósito celular, el tubo y el capilar entre diferentes materiales o diferentes concentraciones del mismo material. Hay muchas grietas pequeñas en el reservorio y el surfactante puede adsorber y alterar las mediciones tomadas en momentos posteriores si no se limpia adecuadamente. A menudo se requiere un desmontaje completo y el remojo de la célula para garantizar la eliminación de cualquier exceso de material tensoactivo. Es mejor comenzar utilizando la concentración más baja si se va a estudiar una serie de concentraciones del mismo surfactante.

A veces, alinear el tubo capilar con el objetivo confocal puede ser difícil. La cámara del microtensómetro se puede utilizar para ayudar a alinear el objetivo confocal, pero para una gran distancia de trabajo del objetivo CFM, esto puede no ser útil. Si el microscopio confocal se enfoca más allá de la punta del capilar, la sección transversal capilar, una región desprovista de cualquier material fluorescente, también se puede utilizar para ayudar a orientar el objetivo. Si la burbuja capilar no se expulsa, puede haber un problema con la presión que se suministra al capilar (que se supone que es de 150 mbar en funcionamiento normal). Esto se puede verificar ingresando al modo de control de presión y ajustando la presión a un valor alto. Si la presión no alcanza la presión establecida, es probable que haya una fuga en el tubo de la bomba microfluídica o que la bomba no esté recibiendo suficiente presión de gas. Al igual que con muchos estudios relacionados con la ciencia de superficies, es importante asegurarse de que no se introduzcan materiales contaminantes en las soluciones en ningún momento. Si las lecturas no son las esperadas (la tensión superficial comienza demasiado baja o disminuye demasiado rápido), hacer una nueva muestra o usar una muestra bien estudiada o líquido puro también es un buen paso temprano en la solución de problemas.

Se pueden hacer varias modificaciones en el aparato para lograr otros objetivos experimentales. Se puede agregar aceite o agua en el capilar, lo que permite el estudio de las interfaces aceite-agua en lugar de aire-agua39. Esto aumenta el riesgo de reflujo en la bomba, por lo que se debe tener cuidado adicional, lo que podría ser necesario incluso agregar una trampa de aceite al tubo entre la bomba y el capilar.

Hay varias limitaciones para el CPM/CFM. El CPM tiene un rango de trabajo limitado de tamaño capilar, 20-300 μm para el OD capilar para la bomba y la óptica en el sistema. Si bien es posible agregar surfactante insoluble a la interfaz utilizando el intercambio de solvente41 o el método descrito aquí, la concentración superficial solo se puede inferir haciendo tensión superficial vs. isotermas de área y comparándolas con las obtenidas de un canal de Langmuir. CFM solo puede detectar materiales fluorescentes, por lo que no se puede visualizar ningún material no fluorescente o no marcado fluorescentemente. Muchos surfactantes son moléculas pequeñas, y etiquetarlos puede cambiar potencialmente sus propiedades, aunque esto debería ser un problema menor para moléculas más grandes de superficie activa como proteínas o polímeros26,27.

Este método tiene varias ventajas clave sobre los análisis anteriores de CPM y CFM de interfaces cargadas de surfactantes. Lo más importante es que el instrumento híbrido permite la visualización de la interfaz mientras se miden varias propiedades de superficie dinámicas y de equilibrio. Los cambios en la morfología de la interfaz pueden estar directamente relacionados con la dinámica interfacial y las propiedades reológicas. El CFM anterior de interfaces cargadas de surfactantes se realizó utilizando un canal de Langmuir plano 16,20,28,29,42,43,44,45,46,47, mientras que el método descrito aquí se puede realizar en interfaces altamente curvadas 22 . Además, toda la interfaz se puede visualizar a la vez, mostrando un cambio rastreable en tiempo real de dominios específicos, mientras que los flujos superficiales en el canal de Langmuir llevaron a dominios que fluyen dentro y fuera de la ventana visual confocal. Las compresiones superficiales en este aparato también son isotrópicas, mientras que las barreras en los canales de Langmuir tienen direcciones de compresión particulares. El CPM permite oscilaciones de área mucho más rápidas de lo que sería posible en un canal de Langmuir.

La nueva curvatura y el control basado en el área en este estudio tienen grandes ventajas sobre las versiones anteriores del CPM30. Típicamente, el tamaño de la burbuja se controlaba estableciendo una presión capilar fija; para las mediciones de módulos dilatacionales, la presión capilar fue oscilada. Cuando la presión capilar se mantiene constante, a medida que el surfactante se adsorbe a la interfaz, la tensión superficial de la burbuja disminuye. Para satisfacer la ecuación de Laplace, ΔP = 2γ/R, el radio de curvatura debe disminuir a medida que disminuye la tensión superficial. Para la burbuja hemisférica en el CPM, la disminución del radio de curvatura de la burbuja aumenta el área de burbuja 9,48:

Equation 10

en el que Rces el radio capilar y R es el radio de burbuja de la curvatura. El radio cambiante de la burbuja cambia el área de la interfaz durante la adsorción, lo que complica el análisis de la adsorción utilizando las ecuaciones de Ward-Tordai10,38 Además, si la tensión superficial de la burbuja se reduce lo suficiente, el radio de la burbuja se volverá más pequeño que el radio capilar y la burbuja será expulsada. El bucle de retroalimentación en este nuevo CPM / CFM mantiene el área de burbuja constante durante toda la adsorción, lo que significa que se puede usar la ecuación original de Ward-Tordai, no hay riesgo de eyección de burbujas y la adsorción ocurre más rápidamente ya que la superficie no aumenta en el área. Para los estudios oscilatorios, producir una onda sinusoidal en la presión no produce una onda sinusoidal en el área de superficie48. Los métodos anteriores de CPM se basaban en mantener las oscilaciones pequeñas para que el cambio de área causado por la oscilación impulsada por la presión se aproximara a una onda sinusoidal48. El método descrito controla directamente el área de la burbuja y se puede utilizar para crear verdaderas oscilaciones de onda sinusoidal en el área interfacial. Es posible relacionar directamente la tensión (cambio en la tensión superficial) con la tensión interfacial (cambio en el área de superficie) para calcular el módulo dilatacional.

Para ayudar con la implementación de este protocolo, aquí se describe una breve descripción del código que controla el microtensómetro. El código consta de tres segmentos en un bucle: uno que emite comandos a la bomba microfluídica, otro que controla el mecanismo de reinicio de la burbuja y otro que mide el radio de la burbuja y guarda los valores calculados. El controlador de la bomba tiene tres modos de funcionamiento principales: control de presión, control de curvatura y control de área. En el control de presión, el usuario ingresa directamente un punto de ajuste para la presión creada por la bomba. Este modo es importante porque no requiere un bucle de retroalimentación, y como tal es el más estable de los modos. El control de curvatura utiliza la presión superficial medida previamente y la ecuación de Laplace para calcular qué presión se requiere para crear una interfaz de una curvatura dada. El modo de control de área de superficie se basa en esto calculando qué curvatura se requiere para crear un área de superficie dada basada en la geometría de la tapa esférica, que también requiere una medición precisa del radio capilar. Estos dos modos son especialmente útiles para estudios de adsorción y oscilación, pero requieren un flujo constante de datos de presión superficial consistentes. Como tal, la alimentación en estos dos controladores puede necesitar ser suavizada a partir de los datos sin procesar para una mejor función. Cuando la solución no es lo suficientemente clara, a menudo debido a una muestra altamente turbia, este modo no funcionará correctamente ya que no es posible obtener una buena imagen de la interfaz de burbujas. Los controles para la oscilación también se incluyen en esta sección del código. El segmento medio del código permite que la burbuja se elimine del capilar. Aquí, la presión establecida del capilar se establece en un valor alto y se mantiene allí durante un período de tiempo determinado, lo que permite que la burbuja estalle y se cree una nueva interfaz. La última sección del código utiliza un software de adquisición de visión para rastrear el borde de la burbuja y medir su radio. Este radio se utiliza con la ecuación de Laplace para calcular la tensión superficial, que luego se alimenta a la parte inicial del bucle.

Esta técnica híbrida de CPM /CFM ha demostrado ser muy beneficiosa para nuestros estudios de surfactantes pulmonares modelo y clínicos en interfaces aire-agua. Las dimensiones de la burbuja se aproximan a las de los alvéolos en el pulmón humano y se pueden observar los efectos de la curvatura interfacial sobre la morfología y la dinámica de las monocapas de surfactante pulmonar 9,10,22. El instrumento híbrido también será importante para los estudios de otros materiales tensoactivos que son omnipresentes con aplicaciones que van desde productos petroquímicos hasta productos químicos domésticos, desde películas lagrimales hasta estabilización de anticuerpos. La combinación de CPM / CFM nos permite sondear propiedades interfaciales dinámicas en la escala de dominios separados por fases y visualizar las morfologías en la superficie a medida que cambian las condiciones externas. Este método es particularmente útil en aplicaciones donde los materiales caros requieren el uso de muestras de tamaño mínimo. La observación simultánea de la dinámica interfacial y la morfología monocapa es casi imposible con cualquier otra técnica, por lo que es ampliamente aplicable al campo de la ciencia interfacial.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Acknowledgments

Todas las imágenes de microscopía confocal se obtuvieron utilizando el microscopio confocal vertical Nikon A1RHD Multiphoton. Agradecemos la orientación y asistencia del personal de apoyo, especialmente Guillermo Marques, en el Centro de Imágenes de la Universidad de Minnesota. Este trabajo fue apoyado por NIH Grant HL51177. SI fue apoyado por una Beca de Capacitación en Investigación Institucional Ruth L. Kirschstein NRSA F32 HL151128.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 O.D. Tygon tubing Fischer Scientific Tubing
A1RHD Multiphoton upright confocal microscope Nikon Confocal Microscope
Acid Cleaning Solution Sulfuric acid and Alnochromix diluted with water 50% by volume, wait until clear befor diluting
Alnochromix Alconox 2510 Mixed with sulfuric acid to package instructionand diluted to make acid cleaning solution
Ceramic glass cutter Sutter Instruments
Chloroform Sigma-Aldrich 650471 HPLC Plus
Curosurf Chiesi  Lung Surfactant
Di Water 18.5 MΩ - cm
Ethanol any 200 proof used for hydrophobization, denatured used for cleaning
Fiber-Lite Model 190 fiber optic illuminator Dolan-Jenner Industries Inc. 281900100 Light source; other light sources should work as well
Flow EZ F69 mbar w/Link Module Fluigent LU-FEZ-0069 Microfluidic Pump
Fluigent SDK VIs Fluigent Required for CPM virtual Interface
Fluoroelastomer gaskets Machined from 1 mm thick Viton sheet, See figure 3
Gas filter Norgren F07-100-A3TG Put between microfluidic pump and pressure regulator
Gas regulator Norgren 10R0400R Steps down pressure from sorce to range of pump, connected to gas filter range 2-120 psi
Glass Capilary Sutter Instruments B150-86-10 Borosilicate glass O.D. 1.5 mm I.D. 0.86 mm
Glass Slide any 75 mm x 25 mm
Glass Syringe Hamilton 84878 25 μL glass syringe
Hydrophobizing Agent Sigma-Aldrich 667420 1H,1H,2H,2H-Perfluoro-octyltriethoxysilane 98%, other hydrophobic triethoxysilane can be substituted
Insoluble surfactant Avanti 850355C-200mg 16:0 DPPC in chloroform
LabVIEW Software National Instruments 2017
Longpass Filter ThorLabs FEL0650 650 nm Longpass filter, wavelength must remove excitation lazer frequence
Lyso-PC Avanti 855675P 16:0 Lyso PC 1-palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine
Masterflex L/S variable speed analog consol pump system w/  Easy-Load II pump head Masterflex HV-77916-20 Peristaltic Pump
MATLAB Mathworks R2019
Micropipette Puller P-1000 Sutter Instruments Capillary Puller
Microtensiometer Cell and Holder Cell machined from PEEK, holder machined from aluminum, See Figure 3 and 4
Microtensiometer Objective Nikon Fluor 20x/0.50W DIC M/N2 ∞/0 WD 2.0 mm
NI Vision Development Module National Instruments Required for CPM virtual Interface
PEEK finger tight fittings IDEX F-120x 10-32 Coned Ports
PEEK plug IDEX P-551 10-31 Coned Ports
pippette tips Eppendorf 22492225 100 μL - 1000 μL, Autoclaved
Plastic Forceps Thermo Scientific 6320-0010
Plastic Syringe Fischer Scientific 14-955-459 10 mL
Plumbing parts Fischer Scientific 3-way valves and other plumbing parts to connect tubing.
Research Plus 1-channel 100 μL–1000 μL Eppendorf 3123000063 Micro pipetter
Sulfuric Acid any Used for acid cleaning solution
T Plan SLWD 20x/0.30 OFN25 WD 30 mm Nikon Confocal Microscope Objective
Texas Red DHPE triethylammonim salt Thermo Fischer Scientific 1395MP Fluorophore
Vaccum Pump Gast DOA-P704-AA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Freer, E. M., Yim, K. S., Fuller, G. G., Radke, C. J. Interfacial rheology of globular and flexible proteins at the hexadecane/water interface: Comparison of shear and dilatation deformation. Journal of Physical Chemistry B. 108 (12), 3835-3844 (2004).
  2. Freer, E. M., Yim, K. S., Fuller, G. G., Radke, C. J. Shear and dilatational relaxation mechanisms of globular and flexible proteins at the hexadecane/water interface. Langmuir. 20 (23), 10159-10167 (2004).
  3. Kannan, A., Shieh, I. C., Fuller, G. G. Linking aggregation and interfacial properties in monoclonal antibody-surfactant formulations. Journal of Colloid and Interface Science. 550, 128-138 (2019).
  4. Kannan, A., Shieh, I. C., Leiske, D. L., Fuller, G. G. Monoclonal antibody interfaces: Dilatation mechanics and bubble coalescence. Langmuir. 34 (2), 630-638 (2018).
  5. Li, J. J., et al. Interfacial stress in the development of biologics: Fundamental understanding, current practice, and future perspective. The AAPS Journal. 21 (3), 44 (2019).
  6. Bhamla, M. S., Giacomin, C. E., Balemans, C., Fuller, G. G. Influence of interfacial rheology on drainage from curved surfaces. Soft Matter. 10 (36), 6917-6925 (2014).
  7. Fuller, G. G., Vermant, J. Complex fluid-fluid interfaces: Rheology and structure. Annual Review of Chemical and Biomolecular Engineering. 3, 519-543 (2012).
  8. Rosenfeld, L., et al. Structural and rheological properties of meibomian lipid. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (4), 2720-2732 (2013).
  9. Barman, S., Davidson, M. L., Walker, L. M., Anna, S. L., Zasadzinski, J. A. Inflammation product effects on dilatational mechanics can trigger the Laplace instability and acute respiratory distress syndrome. Soft Matter. 16 (29), 6890-6901 (2020).
  10. Barman, S., et al. Recent Advances in Rheology: Theory, Biorheology, Suspension and Interfacial Rheology. Ramachadran, A., et al. , chap. 7 (2022).
  11. Alonso, C., Zasadzinski, J. A. A brief review of the relationship between monolayer viscosity, phase behavior, surface pressure and temperature using a simple monolayer viscometer. The Journal of Physical Chemistry B. 110 (44), 22185-22191 (2006).
  12. Alonso, C., et al. More than a monolayer: Relating lung surfactant structure and mechanics to composition. Biophysical Journal. 87 (6), 4188-4202 (2004).
  13. Alonso, C., Bringezu, F., Brezesinski, G., Waring, A. J., Zasadzinski, J. A. Modifying calf lung surfactant by hexadecanol. Langmuir. 21 (3), 1028-1035 (2005).
  14. Alonso, C., Waring, A. J., Zasadzinski, J. A. Keeping lung surfactant where it belongs: Protein regulation of two-dimensional viscosity. Biophysical Journal. 89 (1), 266-273 (2005).
  15. Zasadzinski, J. A., et al. Inhibition of pulmonary surfactant adsorption by serum and the mechanisms of reversal by hydrophilic polymers: Theory. Biophysical Journal. 89 (3), 1621-1629 (2005).
  16. McConnell, H. M. Structures and transitions in lipid monolayers at the air-water-interface. Annual Reviews of Physical Chemistry. 42, 171-195 (1991).
  17. McConnell, H. M., Moy, V. T. Shapes of finite two-dimensional lipid domains. Journal of Physical Chemistry. 92 (15), 4520-4525 (1988).
  18. Zasadzinski, J. A., Stenger, P., Shieh, I., Dhar, P. Overcoming rapid inactivation of lung surfactant: analogies between competitive adsorption and colloid stability. Biochemica et Biophysica Acta. 1798 (4), 801-828 (2010).
  19. Zasadzinski, J. A., et al. Surfactant Progress. Nag, K. , New York. (2008).
  20. Valtierrez-Gaytan, C., et al. Spontaneous evolution of equilibrium morphology in phospholipid-cholesterol monolayers. Science Advances. 8 (14), (2022).
  21. Williams, I., Zasadzinski, J. A., Squires, T. M. Interfacial rheology and direct imaging reveal domain-templated network formation in phospholipid monolayers penetrated by fibrinogen. Soft Matter. 15 (44), 9076-9084 (2019).
  22. Sachan, A. K., Zasadzinski, J. A. Interfacial curvature effects on the monolayer morphology and dynamics of a clinical lung surfactant. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (2), 134-143 (2018).
  23. Alvarez, N. J., Anna, S. L., Saigal, T., Tilton, R. D., Walker, L. M. Intefacial dynamics and rheology of polymer grafter nanoparticles at air-water and xylene-water interfaces. Langmuir. 28 (21), 8052-8063 (2012).
  24. Alvarez, N. J., Vogus, D. R., Walker, L. M., Anna, S. L. Using bulk convection in a microtensiometer to approach kinetic-limited surfactant dynamics at fluid-fluid interfaces. Journal of Colloid and Interface Science. 372 (1), 183-191 (2012).
  25. Alvarez, N. J., Walker, L. M., Anna, S. L. Diffusion-limited adsorption to a spherical geometry: The impact of curvature and competitive time scales. Physical Review. E, Statistical, Nonlinear, and Soft Matter Physics. 82, 011604 (2010).
  26. Shieh, I., Waring, A. J., Zasadzinski, J. A. Visualizing the analogy between competitive adsorption and colloid stability to restore lung surfactant function. Biophysical Journal. 102 (4), 777-786 (2012).
  27. Shieh, I., Zasadzinski, J. A. Visualizing monolayers with a water-soluble fluorophore to quantify adsorption, desorption and the double-layer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (8), 826-835 (2015).
  28. Lipp, M. M., Lee, K. Y. C., Takamoto, D. Y., Zasadzinski, J. A., Waring, A. J. Coexistence of buckled and flat monolayers. Physical Review Letters. 81, 1650-1653 (1998).
  29. Lipp, M. M., Lee, K. Y. C., Waring, A., Zasadzinski, J. A. Fluorescence, polarized fluorescence, and Brewster angle microscopy of palmitic acid and lung surfactant protein B monolayers. Biophysical Journal. 72 (6), 2783-2804 (1997).
  30. Alvarez, N. J., Walker, L. M., Anna, S. L. A microtensiometer to probe the effect of radius of curvature on surfactant transport to a spherical interface. Langmuir. 26 (16), 13310-13319 (2010).
  31. Ward, A. F. H., Tordai, L. Time dependents of boundary tensions of solutions. 1. The role of diffusion in time-effects. Journal of Chemical Physics. 14, 453-461 (1946).
  32. Lucassen, J., Vanden Tempel, M. Dynamic measurements of dilatational properties of a liquid interface. Chemical Engineering Science. 27 (6), 1283-1291 (1972).
  33. Lin, G. L., et al. Interfacial dilatational deformation accelerates particle formation in monoclonal antibody solutions. Soft Matter. 12 (14), 3293-3302 (2016).
  34. Bastacky, J., et al. Alveolar lining layer is thin and continuous: low temperature scanning electron microscopy of rat lung. Journal of Applied Physiology. 79 (5), 1615-1628 (1995).
  35. Adamson, A. W., Gast, A. P. Physical Chemistry of Surfaces, Sixth ed. , Wiley-Interscience. New York. 784 (1997).
  36. del Rio, O. I., Kwok, D. Y., Wu, R., Alvarez, J. M., Neumann, A. W. Contact angle measurements by axisymmetric drop shape analysis and an automated polynomial fit program. Colloids and Surfaces A Physicochemical and Engineering Aspects. 143 (2-3), 197-210 (1998).
  37. Kanthe, A., et al. No ordinary proteins: Adsorption and molecular orientation of monoclonal antibodies. Science Advances. 7 (5), 14 (2021).
  38. Manikantan, H., Squires, T. M. Surfactant dynamics: hidden variables controlling fluid flows. Journal of Fluid Mechanics. 892, 115 (2020).
  39. Narayan, S., et al. Dilatational rheology of water-in-diesel fuel interfaces: effect of surfactant concentration and bulk-to-interface exchange. Soft Matter. 17 (18), 4751-4765 (2021).
  40. Meng, G. N., Paulose, J., Nelson, D. R., Manoharan, V. N. Elastic instability of a crystal growing on a curved surface. Science. 343 (6171), 634-637 (2014).
  41. Kotula, A. P., Anna, S. L. Insoluble layer deposition and dilatational rheology at a microscale spherical cap interface. Soft Matter. 12 (33), 7038-7055 (2016).
  42. Lipp, M. M., Lee, K. Y. C., Zasadzinski, J. A., Waring, A. J. Phase and morphology changes in lipid monolayers induced by SP-B protein and its amino-terminal peptide. Science. 273 (5279), 1196-1199 (1996).
  43. Pocivavsek, L., et al. Stress and fold localization in thin elastic membranes. Science. 320 (5878), 912-916 (2008).
  44. Pocivavsek, L., et al. Lateral stress relaxation and collapse in lipid monolayers. Soft Matter. 4 (10), 2019-2029 (2008).
  45. Kim, K., Choi, S. Q., Squires, T. M., Zasadzinski, J. A. Cholesterol nanodomains: their effect on monolayer morphology and dynamics. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (33), 3054-3060 (2013).
  46. Kim, K., Choi, S. Q., Zasadzinski, J. A., Squires, T. M. Interfacial microrheology of DPPC monolayers at the air-water interface. Soft Matter. 7 (17), 7782-7789 (2011).
  47. Kim, K., Choi, S. Q., Zasadzinski, J. A., Squires, T. M. Nonlinear chiral rheology of phospholipid monolayers. Soft Matter. 14 (13), 2476-2483 (2018).
  48. Kotula, A. P., Anna, S. L. Regular perturbation analysis of small amplitude oscillatory dilatation of an interface in a capillary pressure tensiometer. Journal of Rheology. 59, 85-117 (2015).

Tags

Ingeniería Número 187 microtensómetro de presión capilar reología interfacial surfactante pulmonar microscopía confocal morfología superficial microfluídica
Microtensómetro para microscopía confocal Visualización de interfaces dinámicas
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Iasella, S. V., Barman, S., Ciutara, … More

Iasella, S. V., Barman, S., Ciutara, C., Huang, B., Davidson, M. L., Zasadzinski, J. A. Microtensiometer for Confocal Microscopy Visualization of Dynamic Interfaces. J. Vis. Exp. (187), e64110, doi:10.3791/64110 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter