Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Engineering
Click here for the English version

Engineering

Микротензиометр для конфокальной микроскопии Визуализация динамических интерфейсов

Published: September 9, 2022 doi: 10.3791/64110
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 1
1Department of Chemical Engineering and Materials Science, University of Minnesota, 2Department of Chemical Engineering, Carnegie Mellon University

Summary

Эта рукопись описывает конструкцию и работу микротензиометра / конфокального микроскопа для одновременного измерения межфазного натяжения и поверхностной дилатационной реологии при визуализации межфазной морфологии. Это обеспечивает построение в реальном времени отношений структура-свойство интерфейсов, важных в технике и физиологии.

Abstract

Адсорбция поверхностно-активных молекул к интерфейсам жидкость-жидкость повсеместно распространена в природе. Характеристика этих интерфейсов требует измерения скорости адсорбции поверхностно-активных веществ, оценки равновесного поверхностного напряжения как функции объемной концентрации поверхностно-активного вещества и сопоставления того, как поверхностное натяжение изменяется с изменениями в межфазной области после равновесия. Одновременная визуализация интерфейса с использованием флуоресцентной визуализации с помощью высокоскоростного конфокального микроскопа позволяет непосредственно оценить структурно-функциональные отношения. В микротензиометре капиллярного давления (CPM) полусферический воздушный пузырь зажимается на конце капилляра в резервуаре жидкости объемом 1 мл. Капиллярное давление через пузырьковый интерфейс контролируется с помощью коммерческого микрофлюидного контроллера потока, который позволяет управлять давлением на основе модели, кривизной пузырьков или зоной пузырьков на основе уравнения Лапласа. По сравнению с предыдущими методами, такими как желоб Ленгмюра и подвесное падение, точность измерения и управления и время отклика значительно улучшены; изменения капиллярного давления могут применяться и контролироваться в миллисекундах. Динамический отклик пузырькового интерфейса визуализируется через вторую оптическую линзу, когда пузырь расширяется и сжимается. Контур пузырька подходит к круглому профилю для определения радиуса кривизны пузырька, R, а также любых отклонений от циркулярности, которые могут аннулировать результаты. Уравнение Лапласа используется для определения динамического поверхностного натяжения интерфейса. После уравновешивания небольшие колебания давления могут быть наложены управляемым компьютером микрофлюидным насосом для колебания радиуса пузырька (частоты 0,001-100 циклов / мин) для определения модуля дилатации Общие размеры системы достаточно малы, чтобы микротензиометр помещался под линзой высокоскоростного конфокального микроскопа, позволяя количественно отслеживать флуоресцентно помеченные химические виды с субмикронным боковым разрешением.

Introduction

Воздушно-водные интерфейсы, покрытые поверхностно-активными пленками, повсеместно распространены в повседневной жизни. Закачки поверхностно-активного раствора используются для повышения нефтеотдачи с истощенных месторождений и используются в качестве решений для гидравлического разрыва сланцевого газа и нефти. Газожидкостные пены и жидко-жидкие эмульсии являются общими для многих промышленных и научных процессов в качестве смазочных материалов и чистящих средств и распространены в пищевых продуктах. Поверхностно-активные вещества и белки на границах раздела стабилизируют конформацию антител при упаковке, хранении и введении 1,2,3,4,5, стабильность слезной пленки в глазу 6,7,8 и легочную механику 9,10,11,12,13,14, 15.

Изучение поверхностно-активных агентов или поверхностно-активных веществ, адсорбирующих интерфейсы и их свойства, имеет долгую историю со многими различными экспериментальными методами 16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27 . Недавней разработкой является микротензиометр капиллярного давления (CPM), который позволяет исследовать межфазные свойства на сильно изогнутых интерфейсах в гораздо меньших масштабах длины, используя при этом значительно меньше материалов, чем другие распространенные методы 9,23,24,25. Конфокальная флуоресцентная микроскопия (CFM) может быть использована для изучения морфологии липидов и белков на границах раздела воздух-вода в CPM22 или на впадинах Ленгмюра 20,26,27,28,29. Здесь CPM и CFM были объединены для связи морфологических явлений с динамическими и равновесными межфазными свойствами для развития структурно-функциональных отношений для биологических и технологических интерфейсов.

Существует множество важных параметров в межфазных поверхностно-активных системах, доступных для CPM-CFM. В CPM воздушный пузырь диаметром 30-200 мкм прижимается к кончику стеклянной капиллярной трубки. В более ранних версиях CPM разность капиллярного давления между внутренней и внешней частью пузыря контролировалась с помощью водяного столба и колебательного шприцевого насоса 9,30; новая версия, описанная здесь, заменяет их более высокоточным микрофлюидным насосом с компьютерным управлением. Поверхностное натяжение (γ) определяется с помощью уравнения Лапласа, ΔP = 2γ/R, из перепада давления через интерфейс, заданного насосом, ΔP и оптического анализа радиуса кривизны пузыря, R. Динамическое поверхностное натяжение интерфейса может быть определено с временным разрешением 10 мс после образования нового пузырька, контактирующего с объемной жидкостью, содержащей растворимое поверхностно-активное вещество. Динамика адсорбции поверхностно-активного вещества может быть описана классическим уравнением Уорда-Тордая10,31 для определения существенных свойств поверхностно-активного вещества, включая диффузионность, поверхностное покрытие и взаимосвязь между объемной концентрацией и равновесным поверхностным натяжением. Как только достигается равновесное поверхностное натяжение, межфазная область может колебаться для измерения дилатационного модуля, Equation 1регистрируя изменения поверхностного натяжения, вызванные небольшими изменениями в площади поверхности пузыря, A32. Для более сложных интерфейсов, которые развивают свои собственные внутренние структуры, такие как запутанные полимеры или белки, поверхностное натяжение, заменяется более общим поверхностным напряжением 4,33, Equation 2.

Стабильность легких во время дыхания может быть напрямую связана с поддержанием как низкого поверхностного натяжения, так и высокого модуля дилатации на альвеолярной воздушно-жидкостной границе раздела 9,10. Все внутренние поверхности легких выстланы непрерывной пленкой эпителиальной выстилающей жидкости толщиной в микроны для поддержания гидратации тканей34. Эта эпителиальная подкладочная жидкость в основном представляет собой воду, с солями и различными другими белками, ферментами, сахарами и поверхностно-активным веществом для легких. Как и в случае с любой изогнутой границей раздела жидкость-пар, капиллярное давление индуцируется давлением выше на внутренней стороне альвеолы (или пузыря). Однако, если поверхностное натяжение было постоянным везде в легких, уравнение Лапласа, ΔP = 2γ / R, показывает, что меньшие альвеолы будут иметь более высокое внутреннее давление по сравнению с более крупными альвеолами, заставляя газовое содержимое меньших альвеол перетекать в более крупные альвеолы с более низким давлением. Это известно как «нестабильность Лапласа»9,35. Конечным результатом является то, что мельчайшие альвеолы разрушаются и заполняются жидкостью и становятся трудными для повторного раздувания, вызывая коллапс части легкого, а другие части будут чрезмерно раздуваться, оба из которых являются типичными симптомами острого респираторного дистресс-синдрома (ОРДС). Однако в правильно функционирующем легком поверхностное натяжение динамически изменяется, поскольку граница раздела воздух-эпителиальная жидкость в межфазной области альвеол расширяется и сжимается во время дыхания. Если Equation 3, или Equation 4, давление Лапласа уменьшается с уменьшением радиуса и увеличивается с увеличением радиуса, чтобы устранить нестабильность Лапласа, тем самым стабилизируя легкое9. Следовательно, и то, Equation 5как это зависит от частоты, морфологии и состава монослоя, а также состава альвеолярной жидкости, может иметь важное значение для стабильности легких. CPM-CFM также обеспечил первые демонстрации влияния межфазной кривизны на адсорбцию поверхностно-активных веществ25, монослойную морфологию22 и дилатационный модуль9. Небольшой объем (~1 мл) резервуара в CPM позволяет быстро вводить, удалять или обменивать жидкую фазу и сводит к минимуму необходимое количество дорогостоящих белков или поверхностно-активных веществ10.

Контрастность в изображении CPM-CFM обусловлена распределением малых фракций флуоресцентно меченых липидов или белков на границераздела 16,27. Двумерные монослои поверхностно-активного вещества часто демонстрируют боковое фазовое разделение в зависимости от поверхностного натяжения или поверхностного давления, Equation 6 π представляет собой разницу между поверхностным натяжением чистой границы раздела жидкость-жидкость, γ0, и интерфейсом, покрытым поверхностно-активным веществом, γ. π можно рассматривать как 2-D «давление», вызванное взаимодействиями молекул поверхностно-активного вещества на границе раздела, который действует для снижения поверхностного натяжения чистой жидкости. При низком поверхностном давлении липидные монослои находятся в жидком дезорганизованном состоянии; это называется жидкой расширенной (LE) фазой. По мере увеличения поверхностного давления и уменьшения площади на молекулу липида липиды ориентируются друг с другом и могут подвергаться фазовому переходу первого порядка в фазовую фазу длинного порядка с конденсированной жидкостью (LC) 16,20,27. Фазы LE и LC могут сосуществовать при различных поверхностных давлениях и могут быть визуализированы, поскольку флуоресцентно помеченные липиды исключаются из фазы LC и отделяются от фазы LE. Таким образом, фаза LE яркая, а фаза LC темная при изображении с помощью CFM16.

Целью этой рукописи является описание шагов, необходимых для создания и эксплуатации комбинированного микроскопического микроскопического микроскопа. Это позволит читателю выполнять адсорбционные исследования, измерять поверхностное натяжение, реологическое поведение и одновременно изучать межфазную морфологию на микронной границе раздела воздух/вода или масло/вода. Это включает в себя обсуждение того, как вытягивать, разрезать и гидрофобизировать необходимые капилляры, инструкции по использованию режимов давления, кривизны и контроля площади поверхности, а также межфазный перенос нерастворимого поверхностно-активного вещества на изогнутый интерфейс микротензиометра.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Подготовка капиллярных трубок

  1. Поместите капилляр в капиллярный съемник и запустите нужную программу вытягивания, чтобы сделать два конических капилляра с наружным диаметром (OD) ~ 1 мкм на кончике.
    ПРИМЕЧАНИЕ: OD капилляра перед вытягиванием должен соответствовать OD, указанному для размещения в капиллярном держателе в ячейке микротензиометра. Внутренний диаметр (ID) капилляра может варьироваться, но будет влиять на критический радиус капилляра после вытягивания. Программа вытягивания выбирается таким образом, что полученный конус сначала быстро уменьшает капиллярные OD и ID, затем достигает радиуса вблизи нужных капиллярных OD и ID, а затем уменьшается в диаметре медленнее. Это создаст большую длину капилляра, которая может быть оценена, чтобы получить пригодный для использования капилляр 30-100 мкм в ID.
  2. Оцените кончик капилляра в нужном месте, чтобы получить id 30-100 мкм и отломите наконечник. Капилляр теперь будет иметь OD и ID желаемого радиуса на кончике (рисунок 1A). Капилляры можно хранить до шага 2.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Срезанный край капилляра должен иметь чистый разрыв на 90°. Любой дефект кромки среза приведет к плохому закреплению пузырька к капилляру и плохим измерениям свойств поверхности. Конические кончики капилляров очень деликатные. Они будут уничтожены, если они вступят в контакт с чем-либо, кроме растворов (например, стенки флаконов, воздушная насадка).

2. Гидрофобизация капилляров

  1. Соберите вытянутые стеклянные капилляры, раствор для кислотной очистки, пластиковый пинцет, деионизированную (DI) воду, раствор для гидрофобизации (2% силан в этаноле), вакуумный насос и раствор этанола. Подробности см. в Таблице материалов .
    ВНИМАНИЕ: Раствор для кислотной очистки очень токсичен, вызывает коррозию / раздражение кожи и глаз, окисляет. Раствор для гидрофобизации является раздражителем кожи/глаз/дыхательных путей. Носите средства защиты глаз, лабораторные халаты и перчатки и работайте с растворами в вытяжном капюшоне.
  2. Кислотно-очистите капилляры
    ПРИМЕЧАНИЕ: Кислотная очистка капилляра удаляет любые органические остатки внутри капилляра и подготавливает стеклянную поверхность к реакции силанизации, которая делает капилляр гидрофобным.
    1. Крепко захватите капилляр возле его широкого конца пинцетом.
    2. Окуните конический наконечник в раствор для кислотной очистки, прикрепив шланг от вакуумного насоса к широкому концу капилляра. Это будет всасывать раствор в капилляр.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Наконечник пипетки может быть прикреплен к концу капиллярного шланга, чтобы обеспечить лучшее прилегание к капиллярному концу.
    3. Остановитесь, когда кислотный чистящий раствор заполнит около половины капилляра.
      ПРИМЕЧАНИЕ: После удаления кончика капилляра из раствора кислотной очистки раствор на внешней стороне капилляра часто образует шарик возле кончика капилляра. Аккуратно прикосните капилляр к шейке флакона с раствором, чтобы удалить лишний раствор.
    4. Дайте раствору кислотной очистки оставаться в капиллярах не менее 30 минут, гарантируя, что пробка жидкости остается на коническом конце капилляра.
    5. Удалите кислотный чистящий раствор из капилляра, крепко удерживая капилляр пинцетом и используя вакуумный шланг, чтобы вытащить жидкость из большого конца капилляра.
  3. Промыть капилляры
    1. Погрузите конический конец капилляра в воду DI, гарантируя, что он погружен достаточно глубоко, чтобы покрыть любой внешний вид, который был погружен в раствор для кислотной очистки. Пока наконечник погружен в воду, используйте вакуумный шланг, чтобы протянуть воду DI через капилляр. Извлеките капилляр из воды и удалите оставшуюся воду вакуумным шлангом.
    2. Повторите описанный выше шаг по крайней мере 4 раза.
  4. Выполните этап 2.3, снова заменив воду DI этанолом.
  5. Применяйте всасывание непрерывно до тех пор, пока этанол полностью не испарится из внутренней части капилляра. Капилляр станет мутным и холодным на ощупь, поскольку этанол начнет испаряться, но очистится через 30-45 с.
  6. Покрыть капилляр раствором гидрофобизации
    1. Кратковременно окуните широкий конец капилляра в ~2% силан в растворе этанола. Капиллярное действие приведет к тому, что раствор покрытия поднимется внутри капилляра. Извлеките капилляр из раствора, как только пробка размером ~ 1 см поднимется внутри капилляра.
    2. Ориентируйте капилляр так, чтобы конический кончик был обращен вниз, позволяя раствору покрытия падать с гравитацией к коническому кончику.
    3. Дайте раствору покрытия остаться в капилляре не менее 3 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В пробке раствора покрытия, контактирующей с внутренней частью конического наконечника, не должно быть пузырьков воздуха. Если есть пузырь воздуха, то внутренняя часть капилляра, вероятно, была недостаточно высушена на этапе 2.5. Чтобы устранить эту проблему, при необходимости повторите шаги 2.4-2.6.
  7. Промыть капилляры этанолом 1x так же, как и на этапе 2.3.
  8. Установка гидрофобного покрытия на капилляр
    1. Поместите чистые и сухие сцинтилляционные флаконы в вакуумную печь при температуре 120 °C. Поместите покрытые оболочкой капилляры во флаконы (в идеале один капилляр на флакон) с широкими концами, опирающимися на основание флакона. Дайте капиллярам оставаться в печи в течение не менее 6 ч (предпочтительно в течение ночи), чтобы добиться постоянного склеивания гидрофобного силанового слоя с капиллярами. Капилляры можно хранить до шага 4.

3. Пробоподготовка и хранение

  1. Смешайте и храните растворы поверхностно-активных веществ и флуорофоров в чистых флаконах, промытых кислотой, чтобы избежать загрязнения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Коммерчески доступные липиды должны быть самой высокой чистоты и храниться между использованием при -20 °C. Старые или загрязненные липиды часто приводят к тому, что результаты трудно воспроизвести.

4. Настройка микротензиометра

  1. Соберите ячейку CPM, как описано на рисунке 2.
    1. Поместите большую сторону капилляра в верхнюю часть ячейки CPM, пока она не продвинется на нижнюю сторону клетки.
    2. Осторожно затяните заглушку PEEK, чтобы закрепить капилляр, а затем прикрепите трубку от микрофлюидного насоса к большой стороне капилляра. Будьте осторожны, чтобы не коснуться конуса капилляра.
  2. При необходимости прикрепите шланги для обмена резервуара и/или контроля температуры к соответствующим входным и выходным отверстиям на ячейке CPM (рисунок 2); в противном случае подключите неиспользуемые входы и розетки.
  3. Прикрепите ячейку CPM к ступени конфокального микроскопа, примерно выровняв ее с объективом CFM, камерой CPM и источником света CPM (рисунок 3).
  4. Откройте поток газа для микрофлюидного насоса при рекомендуемом рабочем давлении насоса (150 мбар для микрофлюидного насоса, используемого здесь) и убедитесь, что поток в капилляр открыт.
  5. Запустите виртуальный интерфейс CPM (Файл дополнительного кодирования 1: Виртуальный микротензиометр Interface.vi) в режиме контроля давления с частотой и амплитудой колебаний капиллярного давления, установленными равными нулю (рисунок 4-7). На рисунке 4 показан снимок экрана виртуального интерфейса. Для воды DI и капиллярного радиуса ~ 35 мкм давление ~ 20 мбар гарантирует, что вода не попадет в капилляр.
  6. Наполните ячейку CPM водой с помощью пипетки.
  7. Сосредоточьтесь на кончике капилляра с помощью камеры микротензиометра.
  8. Сосредоточьтесь на капиллярном наконечнике с помощью CFM. Если есть трудности с поиском капилляра, используйте камеру CPM, чтобы найти цель CFM. Это поможет приблизить расстояние между целью CFM и пузырем, достигнув правильного рабочего расстояния.
  9. После того, как кольцевое кольцо (проекция зеленого сектора) будет центрировано на пузыре, вручную отрегулируйте фокус так, чтобы край пузыря был четко виден (рисунок 4-3).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Положение, начальный и конечный угол, а также внутренний и внешний радиусы кольцевого кольца можно регулировать с помощью меню под окном обзора.
  10. Нажмите на Reset Bubble, и убедитесь, что образовался новый пузырь (можно будет услышать старый пузырь, и новый пузырь будет виден из окна просмотра панели управления; Рисунок 4-3). Если пузырь не лопается, увеличьте давление сброса или увеличьте время задержки сброса на вкладке Сброс пузырьков под окном просмотра. Проверьте, составляет ли поверхностное натяжение около 73 мН/м (для солевых растворов или пузырьков воды/воздуха) (рисунок 4-9).
  11. Выньте воду через шприц с прямым доступом к ячейке (рисунок 3-13), опорожните ее и снова подключите. Образец готов к загрузке для запуска эксперимента.

5. Адсорбционное исследование

  1. Заполните ячейку нужным образцом с помощью автоклавной пипетки, удерживающей программное обеспечение CPM в режиме контроля давления . Убедитесь, что начальное поверхностное натяжение составляет около 73 мН/м при создании нового пузырькового интерфейса.
  2. Определите радиус вновь образованного пузырька и введите это значение в элемент управления центральной областью (рисунок 4-7) и измените тип элемента управления на элемент управления областью, щелкнув вкладку Area Control (рисунок 4-8).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Также может использоваться постоянное регулирование давления, но это приводит к непрерывному изменению радиуса пузырька по мере изменения поверхностного натяжения интерфейса. Эта изменяющаяся область может усложнить анализ скорости адсорбции поверхностно-активных веществ и привести к тому, что пузырь лопнет во время исследования.
  3. Начните запись конфокального видео.
  4. Нажмите на Reset Bubble (рисунок 4-5) и сразу же нажмите На Collect Data (Рисунок 4-6). Сигнальный индикатор на кнопке станет зеленым.
  5. Отрегулируйте скорость записи данных в соответствии с концентрацией образца, сдвинув полосу, показанную на рисунке 4-6. Для более медленных адсорбций используйте более медленную скорость записи. Это может быть скорректировано в середине прогона, если требуется более высокая скорость записи на ранней стадии, но более медленная скорость предпочтительна для длительных исследований, чтобы уменьшить размер файла.
  6. После окончания эксперимента (когда достигнуто окончательное плато поверхностного натяжения) сохраните файл, выбрав правильный путь к файлу (рисунок 4-1) и нажав на кнопку Сохранить (рисунок 4-2).
  7. Остановите и сохраните запись на CFM.

6. Исследование колебаний/релаксации

  1. Заполните ячейку образцом с помощью автоклавной пипетки, удерживающей программное обеспечение CPM в режиме контроля давления . Убедитесь, что поверхностное натяжение составляет около 73 мН/м при создании нового пузырькового интерфейса.
  2. Подождите, пока образец полностью адсорбируется в интерфейсе. Это может быть выполнено непосредственно после исследования адсорбции, а не начинать заново с новым пузырьковым интерфейсом.
  3. Решите, будет ли колебание колебанием давления, колебанием площади или колебанием кривизны, выбрав соответствующую вкладку (рисунок 4-8) и введя желаемое базовое значение, процент колебаний и частоту колебаний (рисунок 4-7).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Колебания пилообразной, квадратной и треугольной волновой области также доступны из раскрывающегося меню на вкладке «Колебания другой области ».
  4. Начните запись конфокального видео и нажмите «Собрать данные» (рисунок 4-6) на программном обеспечении CPM.
  5. Запустите колебание. Обязательно запишите не менее семи циклов для достижения наилучших результатов. Выберите скорость сбора данных (рисунок 4-6), чтобы дать достаточное количество точек данных для каждого цикла колебаний.
  6. Если требуются другие амплитуды или частоты колебаний, измените значения во время эксперимента.
  7. Сохраните результаты, как показано в шагах 5.6 и 5.7.

7. Исследование обмена растворителями

  1. Заполните ячейку образцом с помощью автоклавной пипетки, поддерживая программное обеспечение CPM в режиме контроля давления. Убедитесь, что поверхностное натяжение составляет около 73 мН/м, когда создается новый пузырьковый интерфейс.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Исследования адсорбции и/или колебаний могут быть выполнены до исследования обмена растворителем.
  2. Соедините впускную трубку с флаконом нужного обменного раствора (рис. 3-11) с перистальтическим насосом (рис. 3-10).
  3. Запустите запись видео в конфокальном программном обеспечении и нажмите На Collect Data (Рисунок 4-6) на программном обеспечении CPM.
  4. Установите скорость перистальтического насоса. Это будет контролировать скорость обмена жидкости и должно быть выбрано исходя из требований к эксперименту, то есть того, как быстро растворитель должен быть заменен.
  5. Если необходимо заменить несколько жидкостей, остановите перистальтический насос и подключите входное отверстие к другому обменному раствору.
  6. После завершения обмена (~20 мин) сохраните результаты, как на шагах 5.6 и 5.7.

8. Нерастворимая адсорбция поверхностно-активных веществ

ПРИМЕЧАНИЕ: Если поверхностно-активное вещество, подлежащее адсорбированию, не растворимо в резервуарной жидкости, этот метод может быть использован для переноса монослоя с границы раздела воздух/вода ячейки на поверхность пузырька. Многие бислоеобразующие липиды почти нерастворимы в солевом растворе и не всасываются спонтанно в пузырь при суспендировании в резервуарном растворе.

  1. Заполните ячейку образцом с помощью автоклавной пипетки, удерживающей программное обеспечение CPM в режиме контроля давления . Убедитесь, что поверхностное натяжение составляет около 73 мН/м, когда создается новый пузырьковый интерфейс.
  2. Нанесите монослой нерастворимого поверхностно-активного вещества на воздушно-водную границу раздела ячейки из раствора в летучий органический раствор. Используя шприц, нанесите небольшие капли на границе раздела и позвольте растворителю испариться, оставив липид позади в виде тонкой пленки.
    ВНИМАНИЕ: Хлороформ используется в качестве растворителя для фосфолипидов, таких как фосфатидилхолины и жирные кислоты. Разбрасывающие растворы обычно составляют 0,01-0,02 мг липидов на мл растворителя. Хлороформ остро токсичен, может вызывать раздражение кожи и глаз и является канцерогенным. Наденьте соответствующую защиту глаз, лабораторное пальто и перчатки и сделайте раствор в вытяжном капюшоне.
  3. Уменьшите площадь поверхности с помощью контроля давления по осевой линии (рисунок 4-7) пузыря до тех пор, пока он не станет почти плоским. Это предотвращает лопание пузыря после адсорбции поверхностно-активного вещества.
  4. Извлеките резервуарную жидкость из ячейки с помощью прямого шприца до тех пор, пока граница раздела воздух/вода не пройдет мимо кончика капилляра. В то время как шприцевой насос может быть использован, этот шаг может быть достигнут вручную с помощью шприца.
  5. Увеличьте высоту резервуара жидкости до его начального уровня.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После повторного погружения наконечника пузырь будет больше из-за поверхностно-активного вещества, которое теперь адсорбируется на интерфейсе. Монослой теперь будет готов к экспериментам по колебаниям или обмену растворителями.

9. Очистка

  1. Выключите CFM.
  2. Перейдите в режим контроля давления .
  3. Извлеките образец из ячейки с помощью пипетки. Загрузите ячейку водой DI и увеличьте давление до ~ 50 мбар, чтобы пузырьки постоянно выходили из капилляра и очищали кончик капилляра. Повторите этот процесс 2x.
  4. Закройте предохранительный клапан и выключите CPM, нажав на красную кнопку в левом верхнем углу, выключите световую и синюю панель управления давлением и закройте источник давления.
  5. Извлеките клетку из стадии конфокального микроскопа. Промойте ячейку этанолом и водой DI. Извлеките капиллярную трубку из клетки CPM.

10. Очистка ячейки

  1. Разберите ячейку. Очистите внутреннюю стенку зубной щеткой, смывая под водой DI. Погрузите детали в этанол и храните его ультразвуком в течение ~ 30 мин.
  2. Промойте все детали водой DI несколько раз. Высушите детали, либо продув их газообразным азотом, либо высушив их в вакуумной печи.

11. Анализ колебаний

  1. Запустите код Dilatational_Rheology_Analysis.m (дополнительный файл кодирования 2), выбрав нужный файл, сохраненный из виртуального интерфейса CPM. Образцы данных включены в дополнительные файлы.
  2. График давления и времени будет отображаться так, как показано на дополнительном рисунке 1. Щелкните левой кнопкой мыши точку, где начинается колебание, и щелкните левой кнопкой мыши еще раз там, где заканчивается колебание. Если данные содержат несколько колебаний, повторите этот процесс для всех колебаний.
    1. Когда все начальная и конечная точки будут щелкнуты левой кнопкой мыши, щелкните правой кнопкой мыши в любом месте. Например, как показано на дополнительном рисунке 1, можно щелкнуть левой кнопкой мыши в точках 1, 2, 3 и 4, а затем щелкнуть правой кнопкой мыши.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Код рассчитает дилатационный модуль и фазовый угол, и результаты будут записаны в новый файл .csv в исходном расположении файла. Результаты для образца данных можно увидеть в результатах кода, приведенных в файле дополнительного кодирования 2. MATLAB также сгенерирует несколько графических представлений данных, как показано на дополнительном рисунке 2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Основным источником погрешности измерений являются капилляры, дефекты которых возникают либо в процессе резки (рисунок 5A, B), либо в процессе нанесения покрытия (рисунок 5D). Оба типа дефектов приводят к ошибкам в определении формы и размера пузырьков системой оптического анализа изображений, что приводит к неточным значениям поверхностного натяжения. Важно тщательно изучить каждый новый капилляр после того, как он вытянут и покрыт под оптическим микроскопом, прежде чем вставлять капилляр в CPM. Неправильно отрезанный капилляр должен быть выброшен, но плохо покрытый капилляр может быть очищен кислотой и повторно покрыт для улучшения закрепления пузырьков на конце капилляра (этап 2 Протокола). Капилляры работают лучше всего, если концевой срез идеально перпендикулярен капилляру (рисунок 5C) и пузырьковые штифты непосредственно на конце капилляра (рисунок 5E). Гидрофобное покрытие на капилляре станет менее эффективным при закреплении с использованием, требуя повторной очистки капилляра и повторного покрытия.

Репрезентативные данные адсорбции поверхностно-активных веществ в сравнении со временем представлены на рисунке 6. Предыдущие экспериментальные методы, такие как кулон или сидячие капли, используемые для измерения адсорбции поверхностно-активного вещества, не имели механизма динамической регулировки капиллярного давления, поскольку изменение поверхностного натяжения приводит к изменению площади пузырьков во время адсорбции 30,36,37. Фактически, для более крупных пузырьков и капель изменения формы пузырька или капли (и, следовательно, площади поверхности) необходимы для определения поверхностного натяжения из анализа формы границы раздела, поскольку капиллярное давление не измеряется независимо, а капиллярное давление изменяется над каплей или поверхностью пузырька37. Это также усложняет анализ адсорбции, потому что по мере того, как поверхностно-активное вещество адсорбируется к интерфейсу, поверхностное натяжение уменьшается, и для удовлетворения уравнения Лапласа площадь поверхности пузыря должна увеличиваться, требуя дополнительного поверхностно-активного вещества для адсорбции для достижения равновесия. В CPM фиксированное капиллярное давление требует, чтобы начальный радиус пузырька был в небольшом диапазоне до адсорбции поверхностно-активного вещества, чтобы предотвратить выброс пузыря из капилляра, если поверхностное натяжение уменьшается слишком сильно. Динамика адсорбции поверхностно-активных веществ часто моделируется классическим уравнением Уорда-Тордая31, которое описывает адсорбцию молекул поверхностно-активного вещества к чистому интерфейсу постоянной межфазной области. Хотя уравнение Уорда-Тордая может быть модифицировано для учета изменяющейся площади поверхности, это вводит дополнительные параметры и значительно усложняет анализ38,39.

Чтобы преодолеть эти проблемы, была разработана основанная на модели петля обратной связи с использованием уравнения Лапласа, которое удерживает кривизну (и площадь поверхности) постоянной пузырька на протяжении всего процесса адсорбции путем динамической регулировки капиллярного давления. Существуют значительные различия в скорости изменения поверхностного натяжения, поскольку площадь пузыря не увеличивается постоянно. Изменения в области пузырьков во время адсорбции не являются постоянными со временем, так как поверхностное натяжение сначала изменяется медленно, а затем быстро ускоряется до уравновешивания. Дополнительным осложнением является то, что дробное изменение в области зависит от начального радиуса пузырька. Дополнительным преимуществом постоянного радиуса пузырьков является то, что визуализация интерфейса упрощается, поскольку поверхность пузырька остается фиксированной, что упрощает фокусировку CFM. Во время процесса адсорбции, когда поверхностно-активное вещество адсорбируется на интерфейсе (Видео 1), флуоресцентный сигнал от интерфейса увеличивается. Если поверхностно-активное вещество образует поверхностные домены, то можно наблюдать, что этих доменов образуется и растет22.

Изменения поверхностного натяжения во время колебаний площади показаны на рисунке 7. В предыдущих версиях CPM колебания производились в пузырьковом капиллярном давлении; однако генерация синусоиды в капиллярном давлении не переводится непосредственно в синусоиду в площади поверхности, поскольку они связаны через уравнение Лапласа. Используя преимущества цикла обратной связи на основе модели с использованием уравнения Лапласа, колебания создаются в области, а не в капиллярном давлении, что приводит к данным, которые легче анализировать и собирать в большем диапазоне амплитуд. В результате данные о поверхностном натяжении и площади, собранные с помощью этого метода, могут быть использованы для непосредственного расчета межфазного дилатационного модуля слоя поверхностно-активного вещества: Equation 7 (рисунок 8), где Equation 8 — суммарное напряжение системы, а τнапряжение— неизотропное девиаторное напряжение, часто отсутствующее в простых растворах поверхностно-активного вещества 4,33. Таким образом, для простой поверхностно-активной системы, Equation 9. Для интерфейсов, в которых могут образовываться упругие сети, такие как поверхностно-активные белки, часто присутствуют дополнительные напряжения и, следовательно, должны учитываться при определении модуля дилатации. Видео 2 показывает CFM-видео движения черных LC-доменов в непрерывной цветной фазовой матрице LE в монослоях фосфолипидов. Отдельные домены LC на интерфейсе реорганизуются в разветвленную сеть, которая охватывает интерфейс, когда колебания происходят на изогнутом пузыре22,40. Вкладка «Колебания другой области» может использоваться для создания пилообразных, квадратных и треугольных волн, как показано на дополнительном рисунке 3, а вкладка «Сжатие» обеспечивает сжатие и расширение области с постоянной скоростью.

Для исследований обмена растворителями поверхностно-активному веществу сначала дают адсорбироваться на границе раздела, а затем обменивают пластовую жидкость, чтобы позволить второму поверхностно-активному виду контактировать с этим интерфейсом. Можно исследовать изменение поверхностного натяжения, поскольку второе поверхностно-активное вещество конкурирует с исходным поверхностно-активным веществом на границе раздела. Поверхностный дилатационный модуль часто является более чувствительным зондом обмена поверхностно-активных веществ вместе с морфологией поверхности через CFM. На рисунке 9 показано изменение поверхностного натяжения, модуля дилатации поверхности и морфологии поверхности, поскольку происходит один из таких обменов растворителями. Хотя специфика такого обмена может варьироваться, изменение любого из трех свойств может указывать на интеграцию второго компонента в монослой или сольватацию первичного компонента в массу. Вторая флуоресцентная метка может быть прикреплена к вторичному виду для наблюдения за его взаимодействием с интерфейсом из изображений CFM.

Figure 1
Рисунок 1: Капиллярное лечение. (А) Изображение, показывающее оценку капилляра. Стеклянная керамика удерживается в зажиме, чтобы удерживать его устойчивым. (B) Кислотная очистка капилляров. Раствор для кислотной очистки втягивается в капилляр с помощью вакуумного насоса. (C) Гидрофобизация капилляра. Пробка раствора силана, удерживаемая внутри капилляра Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Конструкция ячейки. (1) Большой алюминиевый держатель ячейки, (2) прокладка фторэластомера (всего четыре), (3) стеклянный затвор (всего два), (4) ячейка PEEK и (5) маленький алюминиевый держатель ячейки. При сборке фторэластомерная прокладка помещается по обе стороны от каждого стеклянного слайда. Ячейка удерживается вместе винтами и болтами. Увеличенное изображение ячейки PEEK показывает расположение различных портов: (6) капиллярный порт, (7) входное отверстие для обмена растворителем, (8) выходное отверстие для обмена растворителем и (9,10) входное и выходное отверстие для регулирования температуры. Заглушка PEEK может быть использована для прикрепления трубки или капилляра к клетке. Порты, которые не используются, могут быть полностью закрыты разъемами без каналов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Схема CPM/CFM, не для масштабирования. (1) ячейка CPM, (2) капиллярная трубка с пузырьком на кончике, (3) объектив конфокального микроскопа, (4) объектив камеры микроскопа с фильтром, (5) источник света CPM, (6) микрофлюидный насос, (7) предохранительный клапан, (8) вход для обмена жидкостью, (9) выход для обмена жидкостью, (10) перистальтический насос, (11) резервуар для обмена жидкости, (12) отходы обмена жидкости, (13) непосредственно на клеточный шприц, (14) входное и выходное отверстие рубашки для регулирования температуры и (15) резервуар и насос с регулируемой температурой. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Виртуальный интерфейс CPM. (1) путь к файлу, в котором будут сохранены данные; (2) системные параметры, комментарии и кнопка Сохранить. Все поля в этой области сохраняются в итоговый файл данных; (3) изображение камеры CPM; (4) настройки, управляющие анализом изображения, измерением кольцевых соединений, сбросом пузырьков и отслеживанием кадров в секунду; (5) кнопка Bubble Reset; (6) кнопка «Собирать данные», контроль скорости записи данных и индикаторы сбора данных; (7) элементы управления для всех значений осевой линии рабочего режима, амплитуды колебаний и частоты колебаний; (8) Переключатель режима работы: нажатие на каждую вкладку изменяет этот режим управления. Каждый режим показывает сигнал давления, посылаемый на насос на графике «Сигнал давления», а также некоторые дополнительные элементы управления; (9) данные о поверхностном натяжении в реальном времени; 10) данные о давлении в реальном времени; (11) радиус действия данных кривизны в реальном времени; 12) данные о площади поверхности в реальном времени; и (13) данные о поверхностном натяжении и площади поверхности в реальном времени, которые могут быть использованы для приблизительного определения фазового угла во время исследования колебаний. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 5
Рисунок 5: Капиллярные дефекты. (A) и (B) Неправильно вырезанные капилляры; (C) правильно разрезанный капилляр, (D) капилляр с плохим закреплением из-за плохого или деградированного покрытия и (E) правильно закрепленный капилляр. Красные стрелки в D и E указывают, где закреплены пузырьки. Для достижения наилучших результатов пузырь будет прикалываться к кончику капилляра. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 6
Рисунок 6: Результаты исследования адсорбции микротензиометра как для адсорбции постоянного давления (оранжевый), так и для адсорбции постоянной площади (синий). Площадь поверхности пузырьков для адсорбции постоянной площади значительно увеличивается на протяжении всего исследования и приводит к тому, что адсорбция занимает больше времени, чтобы достичь того же поверхностного натяжения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 7
Рисунок 7: Типичные колебания управления площадью поверхности. (A) Давление, (B) кривизна и (C) данные о площади поверхности. Данные о площади поверхности являются синусоидой, в то время как данные о давлении и кривизне — нет, о чем свидетельствуют значения осевой линии, не находящиеся в средней точке колебания. Математическая связь между тремя значениями означает, что только одно из них может быть истинной синусоидой. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 8
Рисунок 8: Выборка реологических результатов после анализа. Дилатационный модуль Lyso PC (1-пальмитоил-2-гидрокси-sn-глицеро-3-фосфохолин) в зависимости от частоты увеличения концентраций Lyso PC для пузырьков радиусом ~45 мкм. Концентрации >0,1 мМ Lyso PC, которые сопровождают воспаление, уменьшают дилатационный модуль в диапазоне нормальных скоростей вентиляции / дыхания (желтый), чтобы составить 2ε−γ < 0, что является перекрестным значением для индуцирования нестабильности Лапласа (пунктирная красная линия). Низкие концентрации Lyso PC ≤0,01 мМ, которые могут возникать в нормальных легких, не вызывают нестабильности. На частотах >10 рад/сек все концентрации Lyso PC выше кроссовера и не будут восприимчивы к нестабильности Лапласа. Сплошные красные линии соответствуют теоретическим требованиям к данным. Рисунок воспроизводится из ссылки9. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 9
Рисунок 9: Результаты CFM и CPM для исследования обмена растворителем для поверхностно-активного вещества легких, обмениваемого с водой DI, а затем Lyso PC. (A) показывает, как поверхностное натяжение и модуль поверхностной дилатации изменяются на протяжении всего исследования. График разделен на четыре области: когда поверхностно-активное вещество легких адсорбируется к интерфейсу (синий), когда LS обменивается водой DI (зеленый), когда обменный раствор переключается на раствор Lyso PC (красный) и когда ячейка заполняется раствором Lyso PC (оранжевый). Можно увидеть, что свойства изменяются на различных биржах, что указывает на изменение интерфейса. (B) показывает конфокальное изображение легочного поверхностно-активного вещества, адсорбированного к интерфейсу перед обменом, и (C) показывает ту же поверхность после завершения обмена с раствором Lyso PC. В обоих случаях белый пунктирный круг указывает на внутренний край капилляра. Структура доменов на монослое резко изменяется после обмена растворителем, подтверждая результаты CPM. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Видео 1: Конфокальное видео исследования адсорбции постоянного давления для поверхностно-активного вещества в легких. Ложный цвет показывает расстояние в z-направлении с цветовой полосой в левой части видео, причем фиолетовый указывает на пузырь вблизи капилляра, а зеленый - на вершину пузыря. Интерфейс изначально тускло освещен, так как адсорбируется только немного флуоресцентного поверхностно-активного вещества. По мере того, как все больше и больше поверхностно-активных адсорбируется, пузырь начинает расти, поскольку цвет смещается больше на зеленый, и интерфейс заполняется черными доменами LC, которые могут перемещаться по интерфейсу. Агрегаты поверхностно-активного вещества в растворе можно увидеть плавающими в растворе в виде ярких аморфных форм, и некоторые из них оседают на пузырьковой границе, распадаясь и осаждая свое поверхностно-активное вещество на интерфейсе. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.

Видео 2: Конфокальное видео исследования колебаний поверхностно-активного вещества в легких. Ложный цвет показывает расстояние в направлении z с цветовой шкалой в левой части видео. Поверхность подвергается воздействию нескольких различных частот колебаний, и можно увидеть, что темные домены LC на интерфейсе изменяются во время колебаний. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.

Дополнительный рисунок 1: Пример промежуточного шага в коде для определения дилатационной реологии. Когда появится этот экран, пользователь должен щелкнуть левой кнопкой мыши по крайнему левому краю колебания для анализа, а затем щелкнуть левой кнопкой мыши крайний правый край. Несколько колебаний могут быть проанализированы таким образом, чтобы пользователь мог щелкнуть левой кнопкой мыши 1, 2, 3 и 4, а затем щелкнуть правой кнопкой мыши, чтобы проанализировать эти два колебания. Показанные колебания имеют разные амплитуды и частоты. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок 2: Пример графических результатов, полученных с помощью кода дилатационной реологии. Это показывает припадки синусоид к колебаниям давления, радиуса, площади поверхности и поверхностного натяжения, а также преобразование Фурье каждого колебания. В идеале вторая гармоника в преобразовании Фурье должна составлять менее 10% от первой гармоники для площади поверхности и поверхностного натяжения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок 3: Альтернативные режимы работы. (A) Синусоида, (B) Пилообразная волна, (C) Квадратная волна, (D) Треугольная волна, (E) Постоянная скорость расширения и (F) Постоянная скорость сжатия. Режимы сжатия и экспансивные режимы позволяют создавать изотермы типа Ленгмюра для нерастворимых поверхностно-активных веществ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный кодовый файл 1: Виртуальный Interface.vi микротензиометра. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный кодовый файл 2: Dilatational_Rheology_Analysis м. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Комбинированный CPM/CFM является мощным инструментом для изучения межфазной динамики, равновесия и морфологии. Этот протокол описывает шаги, необходимые для получения данных с помощью CPM/CFM.

На фиг.2 показана конструкция ячейки с указанными каналами для капилляра, растворителя и теплообмена. Входное отверстие для обмена растворителем должно находиться в нижней части ячейки, в то время как выходное отверстие должно быть в верхней части, что позволяет ячейке не переполняться во время обмена. На практике входные и выходные расходы могут немного отличаться для одного и того же перистальтического насоса. Одной из распространенных проблем с этой конструкцией ячейки является утечка из ячейки. Чаще всего это вызвано плохой связью между ячейкой и одним из соединений, но если все соединения сухие и не протекают, это может быть связано с трещиной в стеклянном скольжении ячейки из-за чрезмерного затягивания болтов, окружающих ячейку.

На рисунке 3 показаны соединения между различными насосами и ячейкой, а также выравнивание ячейки с целями CFM и CPM. Камера CPM (4) используется для изображения формы пузырька во время работы. Камера CPM должна быть оснащена оптическим фильтром, который предотвращает попадание возбуждающего лазерного света CFM в камеру CPM. В противном случае лазер CFM делает изображения в камере CPM чрезвычайно шумными и трудными для установки с помощью анализа изображений. Предохранительный клапан соединяет капилляр и микрофлюидный насос (7) и позволяет вносить изменения в насос и источник давления воздуха без риска обратного потока из ячейки, достигающего насоса. Второй клапан (13) обеспечивает доступ к шприцу для прямого впрыска жидкости в резервуар и из него. Возможно, потребуется добавить жидкость в резервуар в случае утечки и, возможно, потребуется удалить на этапе 8 протокола (нерастворимая адсорбция поверхностно-активного вещества) или удалить пузырьки, выдуваемые из капилляра, если они прикреплены к конфокальному объективу.

Во время каждого эксперимента необходимо тщательно выполнять несколько ключевых шагов. Большинство проблем, которые возникают после запуска инструмента, связаны с самим капилляром. Таким образом, тщательная резка и покрытие могут свести к минимуму трудности. Разрезание капилляра до нужного диаметра является сложным и малопродуктивным процессом. Любой чип или неровности в кончике капилляра приведут к плохим показаниям радиуса пузырька. Кроме того, если гидрофобное покрытие нанесено неправильно или если оно разлагается со временем и использованием, пузырь не будет правильно закреплен на кончике капилляра. На это может указывать пузырь, который, по-видимому, зажат внутри капилляра или скользит по внутренней части капилляра во время колебательного исследования. Капилляр, который хорошо разрезан, но не закреплен должным образом, может быть повторно собран и гидрофобно обработан.

Другим ключевым шагом и возможным источником ошибки является очистка резервуара ячейки, трубки и капилляра между различными материалами или различными концентрациями одного и того же материала. В резервуаре есть много небольших щелей, и поверхностно-активное вещество может адсорбировать и изменять измерения, сделанные в более позднее время, если не очистить должным образом. Полная разборка и замачивание ячейки часто требуются для обеспечения удаления любого избыточного поверхностно-активного материала. Лучше начать с использования самой низкой концентрации, если необходимо изучить ряд концентраций одного и того же поверхностно-активного вещества.

Иногда выровнять капиллярную трубку с конфокальной целью может быть сложно. Микротензиометрическая камера может быть использована для выравнивания конфокального объектива, но для большого рабочего расстояния объектива CFM это может быть бесполезно. Если конфокальный микроскоп сфокусирован за пределами кончика капилляра, поперечное сечение капилляра, область, лишенная какого-либо флуоресцентного материала, также может быть использовано для помощи в ориентации цели. Если капиллярный пузырь не выбрасывается, может возникнуть проблема с давлением, подаваемым на капилляр (которое должно составлять 150 мбар при нормальной работе). Это можно проверить, войдя в режим контроля давления и установив давление на высокое значение. Если давление не достигает заданного давления, вероятно, произойдет утечка в трубке от микрофлюидного насоса или насос не получает достаточного давления газа. Как и во многих исследованиях, связанных с наукой о поверхности, важно обеспечить, чтобы загрязняющие материалы не вводились в растворы в любой момент. Если показания не соответствуют ожиданиям (поверхностное натяжение начинается слишком низко или уменьшается слишком быстро), создание нового образца или использование хорошо изученного образца или чистой жидкости также является хорошим ранним шагом в устранении неполадок.

В аппарат может быть внесено несколько модификаций для достижения других экспериментальных целей. Масло или вода могут быть добавлены в капилляр, что позволяет изучать масляную воду вместо границ39 раздела 39 воздух-вода. Это увеличивает риск обратного потока в насос, поэтому необходимо проявлять дополнительную осторожность, потенциально даже может потребоваться добавление масляной ловушки в трубку между насосом и капилляром.

Существует несколько ограничений для CPM/CFM. CPM имеет ограниченный рабочий диапазон размеров капилляров, 20-300 мкм для капиллярного OD для насоса и оптики в системе. Хотя можно добавить нерастворимое поверхностно-активное вещество к интерфейсу с помощью обмена растворителем41 или способа, описанного здесь, поверхностная концентрация может быть выведена только из изотерм поверхностного натяжения по отношению к площади и сравнения с концентрациями, полученными из желоба Ленгмюра. CFM может обнаруживать только флуоресцентные материалы, поэтому любые нефлуоресцентные или нефлуоресцентно помеченные материалы не могут быть визуализированы. Многие поверхностно-активные вещества представляют собой небольшие молекулы, и их маркировка может потенциально изменить их свойства, хотя это должно быть меньшей проблемой для более крупных поверхностно-активных молекул, таких как белки или полимеры26,27.

Этот метод имеет несколько ключевых преимуществ по сравнению с предыдущими CPM и CFM-анализами поверхностно-активных интерфейсов. Наиболее важным является то, что гибридный прибор позволяет визуализировать интерфейс при измерении различных динамических и равновесных свойств поверхности. Изменения морфологии интерфейса могут быть напрямую связаны с межфазной динамикой и реологическими свойствами. Предыдущая CFM поверхностно-активных интерфейсов была выполнена с использованием плоского желоба Ленгмюра 16,20,28,29,42,43,44,45,46,47, в то время как метод, описанный здесь, может быть выполнен на сильно изогнутых интерфейсах22 . Кроме того, весь интерфейс может быть изображен сразу, показывая отслеживаемое в режиме реального времени изменение конкретных доменов, тогда как поверхностные потоки на впадине Ленгмюра привели к тому, что домены входили и выходили из конфокального визуального окна. Поверхностные сжатия на этом аппарате также изотропны, в то время как барьеры на впадинах Ленгмюра имеют определенные направления сжатия. CPM допускает гораздо более быстрые колебания площади, чем это было бы возможно на впадине Ленгмюра.

Новая кривизна и зональный контроль в этом исследовании имеют значительные преимущества по сравнению с предыдущими версиями CPM30. Как правило, размер пузырьков контролировался путем установки фиксированного капиллярного давления; для измерения дилатационных модулей капиллярное давление колебалось. Когда капиллярное давление удерживается постоянным, поскольку поверхностно-активное вещество адсорбируется к границе раздела, поверхностное натяжение пузырька уменьшается. Чтобы удовлетворить уравнение Лапласа, ΔP = 2γ/R, радиус кривизны должен уменьшаться по мере уменьшения поверхностного натяжения. Для полусферического пузыря в CPM уменьшение радиуса пузырька кривизны увеличивает площадь пузырька 9,48:

Equation 10

в котором Rc— капиллярный радиус, а R — пузырьковый радиус кривизны. Изменяющийся радиус пузыря изменяет площадь границы раздела при адсорбции, что усложняет анализ адсорбции с помощью уравнений Уорда-Тордая10,38 Кроме того, если поверхностное натяжение пузырька достаточно понизить, радиус пузырька станет меньше радиуса капилляра и пузырь будет выброшен. Петля обратной связи в этом новом CPM / CFM сохраняет площадь пузырька постоянной на протяжении всей адсорбции, что означает, что можно использовать исходное уравнение Уорда-Тордая, нет риска выброса пузырьков, и адсорбция происходит быстрее, поскольку поверхность не увеличивается в области. Для колебательных исследований образование синусоиды в давлении не производит синусоиду в площадиповерхности 48. Предыдущие методы CPM основывались на поддержании малых колебаний, чтобы изменение площади, вызванное колебаниями, управляемыми давлением, приблизилось к синусоиде48. Описанный способ непосредственно контролирует площадь пузыря и может быть использован для создания истинных синусоидальных колебаний в межфазной области. Можно напрямую связать напряжение (изменение поверхностного натяжения) с межфазной деформацией (изменением площади поверхности) для расчета модуля дилатации.

Чтобы помочь с реализацией этого протокола, здесь описано краткое описание кода, управляющего микротензиометром. Код состоит из трех сегментов в цикле: один выдает команды микрофлюидному насосу, другой управляет механизмом сброса пузырька, а другой измеряет радиус пузыря и сохраняет рассчитанные значения. Контроллер насоса имеет три основных режима работы: контроль давления, контроль кривизны и контроль площади. При управлении давлением пользователь напрямую вводит заданное значение для давления, создаваемого насосом. Этот режим важен, потому что он не требует петли обратной связи, и как таковой является наиболее стабильным из режимов. Управление кривизной использует ранее измеренное поверхностное давление и уравнение Лапласа для расчета того, какое давление требуется для создания интерфейса заданной кривизны. Режим управления площадью поверхности основывается на этом, вычисляя, какая кривизна требуется для создания заданной площади поверхности на основе геометрии сферического колпачка, что также требует точного измерения радиуса капилляра. Эти два режима особенно полезны для исследований адсорбции и колебаний, но требуют постоянного потока данных о постоянном поверхностном давлении. Таким образом, подачу в эти два контроллера, возможно, потребуется сгладить из необработанных данных для лучшей работы. Когда решение недостаточно ясное, часто из-за сильно мутного образца, этот режим не будет работать должным образом, так как получение хорошего изображения пузырькового интерфейса невозможно. Элементы управления для колебаний также включены в этот раздел кода. Средний сегмент кода позволяет очистить пузырь от капилляра. Здесь заданное давление капилляра устанавливается на высокое значение и удерживается там в течение определенного периода времени, позволяя пузырьку лопнуть и создать новый интерфейс. Последний раздел кода использует программное обеспечение для получения зрения для отслеживания края пузыря и измерения его радиуса. Этот радиус затем используется с уравнением Лапласа для расчета поверхностного натяжения, которое затем подается в начальную часть петли.

Этот гибридный метод CPM / CFM оказался очень полезным для наших исследований модельных и клинических поверхностно-активных веществ легких на границах раздела воздух-вода. Размеры пузырьков приближены к размерам в альвеолах в легком человека, а влияние межфазного искривления на морфологию и динамику монослоев сурфактанта легких можно наблюдать 9,10,22. Гибридный инструмент также будет важен для исследований других поверхностно-активных материалов, которые повсеместно распространены в приложениях, начиная от нефтехимии до бытовой химии, от слезных пленок до стабилизации антител. Комбинированный CPM/CFM позволяет исследовать динамические межфазные свойства в масштабе фазоразделенных доменов и визуализировать морфологии на поверхности по мере изменения внешних условий. Этот метод особенно полезен в тех случаях, когда дорогостоящие материалы требуют использования образцов минимального размера. Одновременное наблюдение межфазной динамики и монослойной морфологии практически невозможно при любом другом методе, что делает его широко применимым к области межфазной науки.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

У авторов нет конфликта интересов для раскрытия.

Acknowledgments

Все изображения конфокальной микроскопии были получены с помощью многофотонного конфокального микроскопа Nikon A1RHD. Мы признаем руководство и помощь вспомогательного персонала, особенно Гильермо Маркеса, в Университетском центре визуализации в Университете Миннесоты. Эта работа была поддержана грантом NIH HL51177. SI был поддержан грантом Рут Л. Киршштейн NRSA на институциональную исследовательскую подготовку F32 HL151128.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 O.D. Tygon tubing Fischer Scientific Tubing
A1RHD Multiphoton upright confocal microscope Nikon Confocal Microscope
Acid Cleaning Solution Sulfuric acid and Alnochromix diluted with water 50% by volume, wait until clear befor diluting
Alnochromix Alconox 2510 Mixed with sulfuric acid to package instructionand diluted to make acid cleaning solution
Ceramic glass cutter Sutter Instruments
Chloroform Sigma-Aldrich 650471 HPLC Plus
Curosurf Chiesi  Lung Surfactant
Di Water 18.5 MΩ - cm
Ethanol any 200 proof used for hydrophobization, denatured used for cleaning
Fiber-Lite Model 190 fiber optic illuminator Dolan-Jenner Industries Inc. 281900100 Light source; other light sources should work as well
Flow EZ F69 mbar w/Link Module Fluigent LU-FEZ-0069 Microfluidic Pump
Fluigent SDK VIs Fluigent Required for CPM virtual Interface
Fluoroelastomer gaskets Machined from 1 mm thick Viton sheet, See figure 3
Gas filter Norgren F07-100-A3TG Put between microfluidic pump and pressure regulator
Gas regulator Norgren 10R0400R Steps down pressure from sorce to range of pump, connected to gas filter range 2-120 psi
Glass Capilary Sutter Instruments B150-86-10 Borosilicate glass O.D. 1.5 mm I.D. 0.86 mm
Glass Slide any 75 mm x 25 mm
Glass Syringe Hamilton 84878 25 μL glass syringe
Hydrophobizing Agent Sigma-Aldrich 667420 1H,1H,2H,2H-Perfluoro-octyltriethoxysilane 98%, other hydrophobic triethoxysilane can be substituted
Insoluble surfactant Avanti 850355C-200mg 16:0 DPPC in chloroform
LabVIEW Software National Instruments 2017
Longpass Filter ThorLabs FEL0650 650 nm Longpass filter, wavelength must remove excitation lazer frequence
Lyso-PC Avanti 855675P 16:0 Lyso PC 1-palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine
Masterflex L/S variable speed analog consol pump system w/  Easy-Load II pump head Masterflex HV-77916-20 Peristaltic Pump
MATLAB Mathworks R2019
Micropipette Puller P-1000 Sutter Instruments Capillary Puller
Microtensiometer Cell and Holder Cell machined from PEEK, holder machined from aluminum, See Figure 3 and 4
Microtensiometer Objective Nikon Fluor 20x/0.50W DIC M/N2 ∞/0 WD 2.0 mm
NI Vision Development Module National Instruments Required for CPM virtual Interface
PEEK finger tight fittings IDEX F-120x 10-32 Coned Ports
PEEK plug IDEX P-551 10-31 Coned Ports
pippette tips Eppendorf 22492225 100 μL - 1000 μL, Autoclaved
Plastic Forceps Thermo Scientific 6320-0010
Plastic Syringe Fischer Scientific 14-955-459 10 mL
Plumbing parts Fischer Scientific 3-way valves and other plumbing parts to connect tubing.
Research Plus 1-channel 100 μL–1000 μL Eppendorf 3123000063 Micro pipetter
Sulfuric Acid any Used for acid cleaning solution
T Plan SLWD 20x/0.30 OFN25 WD 30 mm Nikon Confocal Microscope Objective
Texas Red DHPE triethylammonim salt Thermo Fischer Scientific 1395MP Fluorophore
Vaccum Pump Gast DOA-P704-AA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Freer, E. M., Yim, K. S., Fuller, G. G., Radke, C. J. Interfacial rheology of globular and flexible proteins at the hexadecane/water interface: Comparison of shear and dilatation deformation. Journal of Physical Chemistry B. 108 (12), 3835-3844 (2004).
  2. Freer, E. M., Yim, K. S., Fuller, G. G., Radke, C. J. Shear and dilatational relaxation mechanisms of globular and flexible proteins at the hexadecane/water interface. Langmuir. 20 (23), 10159-10167 (2004).
  3. Kannan, A., Shieh, I. C., Fuller, G. G. Linking aggregation and interfacial properties in monoclonal antibody-surfactant formulations. Journal of Colloid and Interface Science. 550, 128-138 (2019).
  4. Kannan, A., Shieh, I. C., Leiske, D. L., Fuller, G. G. Monoclonal antibody interfaces: Dilatation mechanics and bubble coalescence. Langmuir. 34 (2), 630-638 (2018).
  5. Li, J. J., et al. Interfacial stress in the development of biologics: Fundamental understanding, current practice, and future perspective. The AAPS Journal. 21 (3), 44 (2019).
  6. Bhamla, M. S., Giacomin, C. E., Balemans, C., Fuller, G. G. Influence of interfacial rheology on drainage from curved surfaces. Soft Matter. 10 (36), 6917-6925 (2014).
  7. Fuller, G. G., Vermant, J. Complex fluid-fluid interfaces: Rheology and structure. Annual Review of Chemical and Biomolecular Engineering. 3, 519-543 (2012).
  8. Rosenfeld, L., et al. Structural and rheological properties of meibomian lipid. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (4), 2720-2732 (2013).
  9. Barman, S., Davidson, M. L., Walker, L. M., Anna, S. L., Zasadzinski, J. A. Inflammation product effects on dilatational mechanics can trigger the Laplace instability and acute respiratory distress syndrome. Soft Matter. 16 (29), 6890-6901 (2020).
  10. Barman, S., et al. Recent Advances in Rheology: Theory, Biorheology, Suspension and Interfacial Rheology. Ramachadran, A., et al. , chap. 7 (2022).
  11. Alonso, C., Zasadzinski, J. A. A brief review of the relationship between monolayer viscosity, phase behavior, surface pressure and temperature using a simple monolayer viscometer. The Journal of Physical Chemistry B. 110 (44), 22185-22191 (2006).
  12. Alonso, C., et al. More than a monolayer: Relating lung surfactant structure and mechanics to composition. Biophysical Journal. 87 (6), 4188-4202 (2004).
  13. Alonso, C., Bringezu, F., Brezesinski, G., Waring, A. J., Zasadzinski, J. A. Modifying calf lung surfactant by hexadecanol. Langmuir. 21 (3), 1028-1035 (2005).
  14. Alonso, C., Waring, A. J., Zasadzinski, J. A. Keeping lung surfactant where it belongs: Protein regulation of two-dimensional viscosity. Biophysical Journal. 89 (1), 266-273 (2005).
  15. Zasadzinski, J. A., et al. Inhibition of pulmonary surfactant adsorption by serum and the mechanisms of reversal by hydrophilic polymers: Theory. Biophysical Journal. 89 (3), 1621-1629 (2005).
  16. McConnell, H. M. Structures and transitions in lipid monolayers at the air-water-interface. Annual Reviews of Physical Chemistry. 42, 171-195 (1991).
  17. McConnell, H. M., Moy, V. T. Shapes of finite two-dimensional lipid domains. Journal of Physical Chemistry. 92 (15), 4520-4525 (1988).
  18. Zasadzinski, J. A., Stenger, P., Shieh, I., Dhar, P. Overcoming rapid inactivation of lung surfactant: analogies between competitive adsorption and colloid stability. Biochemica et Biophysica Acta. 1798 (4), 801-828 (2010).
  19. Zasadzinski, J. A., et al. Surfactant Progress. Nag, K. , New York. (2008).
  20. Valtierrez-Gaytan, C., et al. Spontaneous evolution of equilibrium morphology in phospholipid-cholesterol monolayers. Science Advances. 8 (14), (2022).
  21. Williams, I., Zasadzinski, J. A., Squires, T. M. Interfacial rheology and direct imaging reveal domain-templated network formation in phospholipid monolayers penetrated by fibrinogen. Soft Matter. 15 (44), 9076-9084 (2019).
  22. Sachan, A. K., Zasadzinski, J. A. Interfacial curvature effects on the monolayer morphology and dynamics of a clinical lung surfactant. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (2), 134-143 (2018).
  23. Alvarez, N. J., Anna, S. L., Saigal, T., Tilton, R. D., Walker, L. M. Intefacial dynamics and rheology of polymer grafter nanoparticles at air-water and xylene-water interfaces. Langmuir. 28 (21), 8052-8063 (2012).
  24. Alvarez, N. J., Vogus, D. R., Walker, L. M., Anna, S. L. Using bulk convection in a microtensiometer to approach kinetic-limited surfactant dynamics at fluid-fluid interfaces. Journal of Colloid and Interface Science. 372 (1), 183-191 (2012).
  25. Alvarez, N. J., Walker, L. M., Anna, S. L. Diffusion-limited adsorption to a spherical geometry: The impact of curvature and competitive time scales. Physical Review. E, Statistical, Nonlinear, and Soft Matter Physics. 82, 011604 (2010).
  26. Shieh, I., Waring, A. J., Zasadzinski, J. A. Visualizing the analogy between competitive adsorption and colloid stability to restore lung surfactant function. Biophysical Journal. 102 (4), 777-786 (2012).
  27. Shieh, I., Zasadzinski, J. A. Visualizing monolayers with a water-soluble fluorophore to quantify adsorption, desorption and the double-layer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (8), 826-835 (2015).
  28. Lipp, M. M., Lee, K. Y. C., Takamoto, D. Y., Zasadzinski, J. A., Waring, A. J. Coexistence of buckled and flat monolayers. Physical Review Letters. 81, 1650-1653 (1998).
  29. Lipp, M. M., Lee, K. Y. C., Waring, A., Zasadzinski, J. A. Fluorescence, polarized fluorescence, and Brewster angle microscopy of palmitic acid and lung surfactant protein B monolayers. Biophysical Journal. 72 (6), 2783-2804 (1997).
  30. Alvarez, N. J., Walker, L. M., Anna, S. L. A microtensiometer to probe the effect of radius of curvature on surfactant transport to a spherical interface. Langmuir. 26 (16), 13310-13319 (2010).
  31. Ward, A. F. H., Tordai, L. Time dependents of boundary tensions of solutions. 1. The role of diffusion in time-effects. Journal of Chemical Physics. 14, 453-461 (1946).
  32. Lucassen, J., Vanden Tempel, M. Dynamic measurements of dilatational properties of a liquid interface. Chemical Engineering Science. 27 (6), 1283-1291 (1972).
  33. Lin, G. L., et al. Interfacial dilatational deformation accelerates particle formation in monoclonal antibody solutions. Soft Matter. 12 (14), 3293-3302 (2016).
  34. Bastacky, J., et al. Alveolar lining layer is thin and continuous: low temperature scanning electron microscopy of rat lung. Journal of Applied Physiology. 79 (5), 1615-1628 (1995).
  35. Adamson, A. W., Gast, A. P. Physical Chemistry of Surfaces, Sixth ed. , Wiley-Interscience. New York. 784 (1997).
  36. del Rio, O. I., Kwok, D. Y., Wu, R., Alvarez, J. M., Neumann, A. W. Contact angle measurements by axisymmetric drop shape analysis and an automated polynomial fit program. Colloids and Surfaces A Physicochemical and Engineering Aspects. 143 (2-3), 197-210 (1998).
  37. Kanthe, A., et al. No ordinary proteins: Adsorption and molecular orientation of monoclonal antibodies. Science Advances. 7 (5), 14 (2021).
  38. Manikantan, H., Squires, T. M. Surfactant dynamics: hidden variables controlling fluid flows. Journal of Fluid Mechanics. 892, 115 (2020).
  39. Narayan, S., et al. Dilatational rheology of water-in-diesel fuel interfaces: effect of surfactant concentration and bulk-to-interface exchange. Soft Matter. 17 (18), 4751-4765 (2021).
  40. Meng, G. N., Paulose, J., Nelson, D. R., Manoharan, V. N. Elastic instability of a crystal growing on a curved surface. Science. 343 (6171), 634-637 (2014).
  41. Kotula, A. P., Anna, S. L. Insoluble layer deposition and dilatational rheology at a microscale spherical cap interface. Soft Matter. 12 (33), 7038-7055 (2016).
  42. Lipp, M. M., Lee, K. Y. C., Zasadzinski, J. A., Waring, A. J. Phase and morphology changes in lipid monolayers induced by SP-B protein and its amino-terminal peptide. Science. 273 (5279), 1196-1199 (1996).
  43. Pocivavsek, L., et al. Stress and fold localization in thin elastic membranes. Science. 320 (5878), 912-916 (2008).
  44. Pocivavsek, L., et al. Lateral stress relaxation and collapse in lipid monolayers. Soft Matter. 4 (10), 2019-2029 (2008).
  45. Kim, K., Choi, S. Q., Squires, T. M., Zasadzinski, J. A. Cholesterol nanodomains: their effect on monolayer morphology and dynamics. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (33), 3054-3060 (2013).
  46. Kim, K., Choi, S. Q., Zasadzinski, J. A., Squires, T. M. Interfacial microrheology of DPPC monolayers at the air-water interface. Soft Matter. 7 (17), 7782-7789 (2011).
  47. Kim, K., Choi, S. Q., Zasadzinski, J. A., Squires, T. M. Nonlinear chiral rheology of phospholipid monolayers. Soft Matter. 14 (13), 2476-2483 (2018).
  48. Kotula, A. P., Anna, S. L. Regular perturbation analysis of small amplitude oscillatory dilatation of an interface in a capillary pressure tensiometer. Journal of Rheology. 59, 85-117 (2015).

Tags

Инженерия выпуск 187 микротензиометр капиллярного давления межфазная реология поверхностно-активное вещество для легких конфокальная микроскопия морфология поверхности микрофлюидика
Микротензиометр для конфокальной микроскопии Визуализация динамических интерфейсов
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Iasella, S. V., Barman, S., Ciutara, … More

Iasella, S. V., Barman, S., Ciutara, C., Huang, B., Davidson, M. L., Zasadzinski, J. A. Microtensiometer for Confocal Microscopy Visualization of Dynamic Interfaces. J. Vis. Exp. (187), e64110, doi:10.3791/64110 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter