Detta manuskript beskriver utformningen och driften av ett mikrotensiometer / konfokalmikroskop för att göra samtidiga mätningar av gränsspänning och ytutvidgningsreologi samtidigt som man visualiserar den interfaciala morfologin. Detta ger realtidskonstruktion av struktur-egenskapsrelationer mellan gränssnitt som är viktiga inom teknik och fysiologi.
Adsorption av ytaktiva molekyler till vätske-vätskegränssnitt är allestädes närvarande i naturen. För att karakterisera dessa gränssnitt krävs mätning av ytaktiva adsorptionshastigheter, utvärdering av jämviktsytspänningar som en funktion av bulktens ytaktiva koncentration och relaterar hur ytspänningen förändras med förändringar i gränsområdet efter jämvikt. Samtidig visualisering av gränssnittet med hjälp av fluorescensavbildning med ett höghastighets konfokalmikroskop möjliggör direkt utvärdering av struktur-funktionsrelationer. I kapillärtrycksmikrotensiometern (CPM) fästs en halvklotformig luftbubbla i slutet av kapillären i en vätskebehållare med 1 ml volym. Kapillärtrycket över bubbelgränssnittet styrs via en kommersiell mikrofluidisk flödesregulator som möjliggör modellbaserad tryck-, bubbelkröknings- eller bubbelområdeskontroll baserat på Laplace-ekvationen. Jämfört med tidigare tekniker som Langmuir-tråget och hängdroppen förbättras mät- och kontrollprecisionen och svarstiden kraftigt; kapillärtrycksvariationer kan appliceras och kontrolleras i millisekunder. Det dynamiska svaret från bubbelgränssnittet visualiseras via en andra optisk lins när bubblan expanderar och drar ihop sig. Bubbelkonturen är anpassad till en cirkulär profil för att bestämma bubbelkrökningsradien, R, samt eventuella avvikelser från cirkularitet som skulle ogiltigförklara resultaten. Laplace-ekvationen används för att bestämma gränssnittets dynamiska ytspänning. Efter jämvikt kan små tryckoscillationer införas av den datorstyrda mikrofluidiska pumpen för att svänga bubbelradien (frekvenser på 0,001-100 cykler / min) för att bestämma dilatationsmodulen Systemets övergripande dimensioner är tillräckligt små för att mikrotensiometern passar under linsen på ett höghastighets konfokalmikroskop som gör att fluorescerande märkta kemiska arter kan spåras kvantitativt med submikron lateral upplösning.
Luft-vattengränssnitt som omfattas av ytaktiva filmer är allestädes närvarande i det dagliga livet. Ytaktiva vatteninjektioner används för att förbättra oljeåtervinningen från utarmade fält och används som hydrauliska sprickbildningslösningar för skiffergas och skifferolja. Gas-flytande skum och flytande-flytande emulsioner är vanliga för många industriella och vetenskapliga processer som smörjmedel och rengöringsmedel och är vanliga i livsmedel. Ytaktiva ämnen och proteiner vid gränssnitt stabiliserar antikroppskonformationer under förpackning, lagring och administrering 1,2,3,4,5, tårfilmsstabilitet i ögat 6,7,8 och lungmekanik 9,10,11,12,13,14, 15.
Studien av ytaktiva medel eller ytaktiva ämnen som adsorberar till gränssnitt och deras egenskaper har en lång historia med många olika experimentella tekniker 16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27 . En ny utveckling är kapillärtrycksmikrotensiometern (CPM), som möjliggör undersökning av gränssnittsegenskaper på mycket krökta gränssnitt, i mycket mindre längdskalor, samtidigt som man använder betydligt färre material än andra vanliga metoder 9,23,24,25. Konfokal fluorescensmikroskopi (CFM) kan användas för att studera morfologin hos lipider och proteiner vid luft-vattengränssnitten i CPM22 eller på Langmuir-tråg 20,26,27,28,29. Här har en CPM och CFM kombinerats för att koppla morfologiska fenomen till dynamiska och jämviktsgränssnitt för att utveckla struktur-funktionssamband för biologiska och tekniska gränssnitt.
Det finns många parametrar av betydelse i gränssnittsaktiva ytaktiva system som är tillgängliga för CPM-CFM. I CPM fästs en luftbubbla med en diameter på 30-200 μm på spetsen av ett glaskapillärrör. I tidigare versioner av CPM styrdes kapillärtrycksskillnaden mellan bubblans insida och utsida via en vattenpelare och oscillerande sprutpump 9,30 ; den nya versionen som beskrivs här ersätter dessa med en datorstyrd mikrofluidisk pump med högre precision. Ytspänningen (γ) bestäms via Laplace-ekvationen, ΔP = 2γ/R, från tryckfallet över gränssnittet som ställts in av pumpen, ΔP, och optisk analys av bubblans krökningsradie, R. Gränssnittets dynamiska ytspänning kan bestämmas med 10 ms tidsupplösning efter generering av en ny bubbla i kontakt med en bulkvätska som innehåller ett lösligt ytaktivt medel. Den ytaktiva adsorptionsdynamiken kan beskrivas med den klassiska Ward-Tordai-ekvationen10,31 för att bestämma väsentliga egenskaper hos det ytaktiva ämnet, inklusive diffusivitet, yttäckning och förhållandet mellan bulkkoncentration och jämviktsytspänning. När en jämviktsytspänning har uppnåtts kan gränsområdet svängas för att mäta dilatationsmodulen, , genom att registrera förändringarna i ytspänningen, inducerade av små förändringar i bubbelytan, A32. För mer komplexa gränssnitt som utvecklar sina egna inre strukturer såsom intrasslade polymerer eller proteiner ersätts ytspänningen, , med en mer allmän ytspänning 4,33, .
Lungstabilitet under andning kan vara direkt knuten till att upprätthålla både en låg ytspänning och en hög dilatationsmodul vid det alveolära luft-vätskegränssnittet 9,10. Alla inre lungytor är fodrade med en kontinuerlig, mikron tjock film av epitelfodervätska för att upprätthålla vävnadshydrering34. Denna epitelfodervätska är främst vatten, med salter och olika andra proteiner, enzymer, sockerarter och lungtensider. Som det är fallet för alla krökta vätske-ånggränssnitt induceras ett kapillärtryck med trycket högre på insidan av alveolus (eller bubblan). Men om ytspänningen var konstant överallt i lungorna visar Laplace-ekvationen, ΔP = 2γ / R, att mindre alveoler skulle ha ett högre inre tryck i förhållande till större alveoler, vilket tvingade gasinnehållet i de mindre alveolerna att strömma till större alveoler med lägre tryck. Detta kallas “Laplace Instabilitet”9,35. Nettoresultatet är att de minsta alveolerna skulle kollapsa och fyllas med vätska och bli svåra att blåsa upp igen vilket får en del av lungan att kollapsa, och andra delar skulle överblåsa, som båda är typiska symtom på akut respiratoriskt nödsyndrom (ARDS). Men i en väl fungerande lunga förändras ytspänningen dynamiskt när gränssnittet mellan luft-epitelvätska i alveolusgränssnittet expanderar och drar ihop sig under andningen. Om , eller , minskar Laplace-trycket med minskande radie och ökar med ökande radie för att eliminera Laplace-instabiliteten och därigenom stabilisera lungan9. Därför , och hur det beror på frekvens, monolagermorfologi och sammansättning och alveolär vätskekomposition kan vara avgörande för lungstabilitet. CPM-CFM har också tillhandahållit de första demonstrationerna av effekterna av gränsfallskurvatur på ytaktiv adsorption25, monolagermorfologi22 och dilatationsmodul9. Den lilla volymen (~ 1 ml) av behållaren i CPM möjliggör snabb introduktion, borttagning eller utbyte av vätskefasen och minimerar den erforderliga mängden dyra proteiner eller ytaktiva ämnen10.
Kontrast i en CPM-CFM-bild beror på fördelningen av små fraktioner av fluorescerande taggade lipider eller proteiner vid gränssnittet16,27. Tvådimensionella ytaktiva monolager uppvisar ofta lateral fasseparation som en funktion av ytspänning eller yttryck, π är skillnaden mellan ytspänningen hos ett rent vätske-vätskegränssnitt, γ0, och ett ytaktivt täckt gränssnitt, γ. π kan tänkas som 2-D “trycket” som orsakas av interaktionerna mellan ytaktiva molekyler vid gränssnittet som verkar för att sänka den rena vätskans ytspänning. Vid låga yttryck är lipidmonoskikt i ett vätskeliknande oorganiserat tillstånd; detta är känt som den vätskeutvidgade (LE) fasen. När yttrycket ökar och arean per lipidmolekyl minskar orienterar lipiderna med varandra och kan genomgå en första ordningens fasövergång till den långväga beställda vätskekondenserade (LC) fasen 16,20,27. LE- och LC-faserna kan samexistera vid olika yttryck och kan visualiseras när fluorescerande märkta lipider utesluts från LC-fasen och separeras till LE-fasen. Således är LE-fasen ljus och LC-fasen är mörk när den avbildas med CFM16.
Målet med detta manuskript är att beskriva de steg som krävs för att bygga och driva den kombinerade konfokala mikroskopmikrotensiometern. Detta gör det möjligt för läsaren att utföra adsorptionsstudier, mäta ytspänning, reologiskt beteende och undersöka gränssnittsmorfologi samtidigt på ett mikronskala luft / vatten eller olja / vatten gränssnitt. Detta inkluderar en diskussion om hur man drar, skär och hydrofoberar de nödvändiga kapillärerna, instruktioner för användning av tryck-, kröknings- och ytområdeskontrolllägen och gränssnittsöverföring av olösligt ytaktivt medel till det mikrotensiometerböjda gränssnittet.
Den kombinerade CPM/CFM är ett kraftfullt verktyg för att undersöka gränssnittsdynamik, jämvikt och morfologi. Detta protokoll beskriver de steg som krävs för att erhålla data med CPM / CFM.
Figur 2 visar celldesignen med kanaler för kapillär-, lösningsmedels- och värmeväxlingen som anges. Inloppet för lösningsmedelsutbyte bör vara längst ner i cellen medan utloppet ska vara högst upp, vilket gör att cellen inte kan rinna över under utbytet. I …
The authors have nothing to disclose.
Alla konfokalmikroskopibilder erhölls med Nikon A1RHD Multiphoton upprätt konfokalmikroskop. Vi erkänner vägledningen och hjälpen från supportpersonalen, särskilt Guillermo Marques, vid University Imaging Center vid University of Minnesota. Detta arbete stöddes av NIH Grant HL51177. SI stöddes av ett Ruth L. Kirschstein NRSA Institutional Research Training Grant F32 HL151128.
1.5 O.D. Tygon tubing | Fischer Scientific | Tubing | |
A1RHD Multiphoton upright confocal microscope | Nikon | Confocal Microscope | |
Acid Cleaning Solution | Sulfuric acid and Alnochromix diluted with water 50% by volume, wait until clear befor diluting | ||
Alnochromix | Alconox | 2510 | Mixed with sulfuric acid to package instructionand diluted to make acid cleaning solution |
Ceramic glass cutter | Sutter Instruments | ||
Chloroform | Sigma-Aldrich | 650471 | HPLC Plus |
Curosurf | Chiesi | Lung Surfactant | |
Di Water | 18.5 MΩ – cm | ||
Ethanol | any | 200 proof used for hydrophobization, denatured used for cleaning | |
Fiber-Lite Model 190 fiber optic illuminator | Dolan-Jenner Industries Inc. | 281900100 | Light source; other light sources should work as well |
Flow EZ F69 mbar w/Link Module | Fluigent | LU-FEZ-0069 | Microfluidic Pump |
Fluigent SDK VIs | Fluigent | Required for CPM virtual Interface | |
Fluoroelastomer gaskets | Machined from 1 mm thick Viton sheet, See figure 3 | ||
Gas filter | Norgren | F07-100-A3TG | Put between microfluidic pump and pressure regulator |
Gas regulator | Norgren | 10R0400R | Steps down pressure from sorce to range of pump, connected to gas filter range 2-120 psi |
Glass Capilary | Sutter Instruments | B150-86-10 | Borosilicate glass O.D. 1.5 mm I.D. 0.86 mm |
Glass Slide | any | 75 mm x 25 mm | |
Glass Syringe | Hamilton | 84878 | 25 μL glass syringe |
Hydrophobizing Agent | Sigma-Aldrich | 667420 | 1H,1H,2H,2H-Perfluoro-octyltriethoxysilane 98%, other hydrophobic triethoxysilane can be substituted |
Insoluble surfactant | Avanti | 850355C-200mg | 16:0 DPPC in chloroform |
LabVIEW Software | National Instruments | 2017 | |
Longpass Filter | ThorLabs | FEL0650 | 650 nm Longpass filter, wavelength must remove excitation lazer frequence |
Lyso-PC | Avanti | 855675P | 16:0 Lyso PC 1-palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine |
Masterflex L/S variable speed analog consol pump system w/ Easy-Load II pump head | Masterflex | HV-77916-20 | Peristaltic Pump |
MATLAB | Mathworks | R2019 | |
Micropipette Puller P-1000 | Sutter Instruments | Capillary Puller | |
Microtensiometer Cell and Holder | Cell machined from PEEK, holder machined from aluminum, See Figure 3 and 4 | ||
Microtensiometer Objective | Nikon | Fluor 20x/0.50W DIC M/N2 ∞/0 WD 2.0 mm | |
NI Vision Development Module | National Instruments | Required for CPM virtual Interface | |
PEEK finger tight fittings | IDEX | F-120x | 10-32 Coned Ports |
PEEK plug | IDEX | P-551 | 10-31 Coned Ports |
pippette tips | Eppendorf | 22492225 | 100 μL – 1000 μL, Autoclaved |
Plastic Forceps | Thermo Scientific | 6320-0010 | |
Plastic Syringe | Fischer Scientific | 14-955-459 | 10 mL |
Plumbing parts | Fischer Scientific | 3-way valves and other plumbing parts to connect tubing. | |
Research Plus 1-channel 100 μL–1000 μL | Eppendorf | 3123000063 | Micro pipetter |
Sulfuric Acid | any | Used for acid cleaning solution | |
T Plan SLWD 20x/0.30 OFN25 WD 30 mm | Nikon | Confocal Microscope Objective | |
Texas Red DHPE triethylammonim salt | Thermo Fischer Scientific | 1395MP | Fluorophore |
Vaccum Pump | Gast | DOA-P704-AA |