Mikrotensiometer för konfokalmikroskopivisualisering av dynamiska gränssnitt

Summary

Detta manuskript beskriver utformningen och driften av ett mikrotensiometer / konfokalmikroskop för att göra samtidiga mätningar av gränsspänning och ytutvidgningsreologi samtidigt som man visualiserar den interfaciala morfologin. Detta ger realtidskonstruktion av struktur-egenskapsrelationer mellan gränssnitt som är viktiga inom teknik och fysiologi.

Abstract

Adsorption av ytaktiva molekyler till vätske-vätskegränssnitt är allestädes närvarande i naturen. För att karakterisera dessa gränssnitt krävs mätning av ytaktiva adsorptionshastigheter, utvärdering av jämviktsytspänningar som en funktion av bulktens ytaktiva koncentration och relaterar hur ytspänningen förändras med förändringar i gränsområdet efter jämvikt. Samtidig visualisering av gränssnittet med hjälp av fluorescensavbildning med ett höghastighets konfokalmikroskop möjliggör direkt utvärdering av struktur-funktionsrelationer. I kapillärtrycksmikrotensiometern (CPM) fästs en halvklotformig luftbubbla i slutet av kapillären i en vätskebehållare med 1 ml volym. Kapillärtrycket över bubbelgränssnittet styrs via en kommersiell mikrofluidisk flödesregulator som möjliggör modellbaserad tryck-, bubbelkröknings- eller bubbelområdeskontroll baserat på Laplace-ekvationen. Jämfört med tidigare tekniker som Langmuir-tråget och hängdroppen förbättras mät- och kontrollprecisionen och svarstiden kraftigt; kapillärtrycksvariationer kan appliceras och kontrolleras i millisekunder. Det dynamiska svaret från bubbelgränssnittet visualiseras via en andra optisk lins när bubblan expanderar och drar ihop sig. Bubbelkonturen är anpassad till en cirkulär profil för att bestämma bubbelkrökningsradien, R, samt eventuella avvikelser från cirkularitet som skulle ogiltigförklara resultaten. Laplace-ekvationen används för att bestämma gränssnittets dynamiska ytspänning. Efter jämvikt kan små tryckoscillationer införas av den datorstyrda mikrofluidiska pumpen för att svänga bubbelradien (frekvenser på 0,001-100 cykler / min) för att bestämma dilatationsmodulen Systemets övergripande dimensioner är tillräckligt små för att mikrotensiometern passar under linsen på ett höghastighets konfokalmikroskop som gör att fluorescerande märkta kemiska arter kan spåras kvantitativt med submikron lateral upplösning.

Introduction

Luft-vattengränssnitt som omfattas av ytaktiva filmer är allestädes närvarande i det dagliga livet. Ytaktiva vatteninjektioner används för att förbättra oljeåtervinningen från utarmade fält och används som hydrauliska sprickbildningslösningar för skiffergas och skifferolja. Gas-flytande skum och flytande-flytande emulsioner är vanliga för många industriella och vetenskapliga processer som smörjmedel och rengöringsmedel och är vanliga i livsmedel. Ytaktiva ämnen och proteiner vid gränssnitt stabiliserar antikroppskonformationer under förpackning, lagring och administrering 1,2,3,4,5, tårfilmsstabilitet i ögat ^6,7,8 och lungmekanik 9,10,11,12,13,14, ¹⁵.

Studien av ytaktiva medel eller ytaktiva ämnen som adsorberar till gränssnitt och deras egenskaper har en lång historia med många olika experimentella tekniker 16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27 . En ny utveckling är kapillärtrycksmikrotensiometern (CPM), som möjliggör undersökning av gränssnittsegenskaper på mycket krökta gränssnitt, i mycket mindre längdskalor, samtidigt som man använder betydligt färre material än andra vanliga metoder 9,23,24,25. Konfokal fluorescensmikroskopi (CFM) kan användas för att studera morfologin hos lipider och proteiner vid luft-vattengränssnitten i CPM²² eller på Langmuir-tråg 20,26,27,28,29. Här har en CPM och CFM kombinerats för att koppla morfologiska fenomen till dynamiska och jämviktsgränssnitt för att utveckla struktur-funktionssamband för biologiska och tekniska gränssnitt.

Det finns många parametrar av betydelse i gränssnittsaktiva ytaktiva system som är tillgängliga för CPM-CFM. I CPM fästs en luftbubbla med en diameter på 30-200 μm på spetsen av ett glaskapillärrör. I tidigare versioner av CPM styrdes kapillärtrycksskillnaden mellan bubblans insida och utsida via en vattenpelare och oscillerande sprutpump ^9,30 ; den nya versionen som beskrivs här ersätter dessa med en datorstyrd mikrofluidisk pump med högre precision. Ytspänningen (γ) bestäms via Laplace-ekvationen, ΔP = 2γ/R, från tryckfallet över gränssnittet som ställts in av pumpen, ΔP, och optisk analys av bubblans krökningsradie, R. Gränssnittets dynamiska ytspänning kan bestämmas med 10 ms tidsupplösning efter generering av en ny bubbla i kontakt med en bulkvätska som innehåller ett lösligt ytaktivt medel. Den ytaktiva adsorptionsdynamiken kan beskrivas med den klassiska Ward-Tordai-ekvationen^10,31 för att bestämma väsentliga egenskaper hos det ytaktiva ämnet, inklusive diffusivitet, yttäckning och förhållandet mellan bulkkoncentration och jämviktsytspänning. När en jämviktsytspänning har uppnåtts kan gränsområdet svängas för att mäta dilatationsmodulen, , genom att registrera förändringarna i ytspänningen, inducerade av små förändringar i bubbelytan, A³². För mer komplexa gränssnitt som utvecklar sina egna inre strukturer såsom intrasslade polymerer eller proteiner ersätts ytspänningen, , med en mer allmän ytspänning ^4,33, .

Lungstabilitet under andning kan vara direkt knuten till att upprätthålla både en låg ytspänning och en hög dilatationsmodul vid det alveolära luft-vätskegränssnittet ^9,10. Alla inre lungytor är fodrade med en kontinuerlig, mikron tjock film av epitelfodervätska för att upprätthålla vävnadshydrering³⁴. Denna epitelfodervätska är främst vatten, med salter och olika andra proteiner, enzymer, sockerarter och lungtensider. Som det är fallet för alla krökta vätske-ånggränssnitt induceras ett kapillärtryck med trycket högre på insidan av alveolus (eller bubblan). Men om ytspänningen var konstant överallt i lungorna visar Laplace-ekvationen, ΔP = 2γ / R, att mindre alveoler skulle ha ett högre inre tryck i förhållande till större alveoler, vilket tvingade gasinnehållet i de mindre alveolerna att strömma till större alveoler med lägre tryck. Detta kallas “Laplace Instabilitet”^9,35. Nettoresultatet är att de minsta alveolerna skulle kollapsa och fyllas med vätska och bli svåra att blåsa upp igen vilket får en del av lungan att kollapsa, och andra delar skulle överblåsa, som båda är typiska symtom på akut respiratoriskt nödsyndrom (ARDS). Men i en väl fungerande lunga förändras ytspänningen dynamiskt när gränssnittet mellan luft-epitelvätska i alveolusgränssnittet expanderar och drar ihop sig under andningen. Om , eller , minskar Laplace-trycket med minskande radie och ökar med ökande radie för att eliminera Laplace-instabiliteten och därigenom stabilisera lungan⁹. Därför , och hur det beror på frekvens, monolagermorfologi och sammansättning och alveolär vätskekomposition kan vara avgörande för lungstabilitet. CPM-CFM har också tillhandahållit de första demonstrationerna av effekterna av gränsfallskurvatur på ytaktiv adsorption²⁵, monolagermorfologi²² och dilatationsmodul⁹. Den lilla volymen (~ 1 ml) av behållaren i CPM möjliggör snabb introduktion, borttagning eller utbyte av vätskefasen och minimerar den erforderliga mängden dyra proteiner eller ytaktiva ämnen¹⁰.

Kontrast i en CPM-CFM-bild beror på fördelningen av små fraktioner av fluorescerande taggade lipider eller proteiner vid gränssnittet^16,27. Tvådimensionella ytaktiva monolager uppvisar ofta lateral fasseparation som en funktion av ytspänning eller yttryck, π är skillnaden mellan ytspänningen hos ett rent vätske-vätskegränssnitt, γ₀, och ett ytaktivt täckt gränssnitt, γ. π kan tänkas som 2-D “trycket” som orsakas av interaktionerna mellan ytaktiva molekyler vid gränssnittet som verkar för att sänka den rena vätskans ytspänning. Vid låga yttryck är lipidmonoskikt i ett vätskeliknande oorganiserat tillstånd; detta är känt som den vätskeutvidgade (LE) fasen. När yttrycket ökar och arean per lipidmolekyl minskar orienterar lipiderna med varandra och kan genomgå en första ordningens fasövergång till den långväga beställda vätskekondenserade (LC) fasen 16,20,27. LE- och LC-faserna kan samexistera vid olika yttryck och kan visualiseras när fluorescerande märkta lipider utesluts från LC-fasen och separeras till LE-fasen. Således är LE-fasen ljus och LC-fasen är mörk när den avbildas med CFM¹⁶.

Målet med detta manuskript är att beskriva de steg som krävs för att bygga och driva den kombinerade konfokala mikroskopmikrotensiometern. Detta gör det möjligt för läsaren att utföra adsorptionsstudier, mäta ytspänning, reologiskt beteende och undersöka gränssnittsmorfologi samtidigt på ett mikronskala luft / vatten eller olja / vatten gränssnitt. Detta inkluderar en diskussion om hur man drar, skär och hydrofoberar de nödvändiga kapillärerna, instruktioner för användning av tryck-, kröknings- och ytområdeskontrolllägen och gränssnittsöverföring av olösligt ytaktivt medel till det mikrotensiometerböjda gränssnittet.

Protocol

1. Beredning av kapillärrör Placera kapillären i en kapillärdragare och kör önskat dragprogram för att göra två avsmalnande kapillärer med en ytterdiameter (OD) på ~ 1 μm vid spetsen.OBS: Kapillärens OD innan du drar måste vara den OD som anges för att passa i kapillärhållaren i mikrotensiometercellen. Kapillärens innerdiameter (ID) kan variera, men kommer att påverka kapillärens kritiska radie efter dragning. Ett dragprogram väljs så att den resulterande avsmalningen …

Representative Results

En viktig källa till mätfel uppstår från kapillärerna som har defekter antingen från skärprocessen (figur 5A,B) eller beläggningsprocessen (figur 5D). Båda typerna av defekter leder till fel vid bestämning av bubbelform och storlek av det optiska bildanalyssystemet, vilket leder till felaktiga ytspänningsvärden. Det är viktigt att noggrant undersöka varje ny kapillär efter att den har dragits och belagts under det optiska mikrosko…

Discussion

Den kombinerade CPM/CFM är ett kraftfullt verktyg för att undersöka gränssnittsdynamik, jämvikt och morfologi. Detta protokoll beskriver de steg som krävs för att erhålla data med CPM / CFM.

Figur 2 visar celldesignen med kanaler för kapillär-, lösningsmedels- och värmeväxlingen som anges. Inloppet för lösningsmedelsutbyte bör vara längst ner i cellen medan utloppet ska vara högst upp, vilket gör att cellen inte kan rinna över under utbytet. I …

Materials

1.5 O.D. Tygon tubing	Fischer Scientific		Tubing
A1RHD Multiphoton upright confocal microscope	Nikon		Confocal Microscope
Acid Cleaning Solution			Sulfuric acid and Alnochromix diluted with water 50% by volume, wait until clear befor diluting
Alnochromix	Alconox	2510	Mixed with sulfuric acid to package instructionand diluted to make acid cleaning solution
Ceramic glass cutter	Sutter Instruments
Chloroform	Sigma-Aldrich	650471	HPLC Plus
Curosurf	Chiesi		Lung Surfactant
Di Water			18.5 MΩ – cm
Ethanol	any		200 proof used for hydrophobization, denatured used for cleaning
Fiber-Lite Model 190 fiber optic illuminator	Dolan-Jenner Industries Inc.	281900100	Light source; other light sources should work as well
Flow EZ F69 mbar w/Link Module	Fluigent	LU-FEZ-0069	Microfluidic Pump
Fluigent SDK VIs	Fluigent		Required for CPM virtual Interface
Fluoroelastomer gaskets			Machined from 1 mm thick Viton sheet, See figure 3
Gas filter	Norgren	F07-100-A3TG	Put between microfluidic pump and pressure regulator
Gas regulator	Norgren	10R0400R	Steps down pressure from sorce to range of pump, connected to gas filter range 2-120 psi
Glass Capilary	Sutter Instruments	B150-86-10	Borosilicate glass O.D. 1.5 mm I.D. 0.86 mm
Glass Slide	any		75 mm x 25 mm
Glass Syringe	Hamilton	84878	25 μL glass syringe
Hydrophobizing Agent	Sigma-Aldrich	667420	1H,1H,2H,2H-Perfluoro-octyltriethoxysilane 98%, other hydrophobic triethoxysilane can be substituted
Insoluble surfactant	Avanti	850355C-200mg	16:0 DPPC in chloroform
LabVIEW Software	National Instruments		2017
Longpass Filter	ThorLabs	FEL0650	650 nm Longpass filter, wavelength must remove excitation lazer frequence
Lyso-PC	Avanti	855675P	16:0 Lyso PC 1-palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine
Masterflex L/S variable speed analog consol pump system w/  Easy-Load II pump head	Masterflex	HV-77916-20	Peristaltic Pump
MATLAB	Mathworks		R2019
Micropipette Puller P-1000	Sutter Instruments		Capillary Puller
Microtensiometer Cell and Holder			Cell machined from PEEK, holder machined from aluminum, See Figure 3 and 4
Microtensiometer Objective	Nikon		Fluor 20x/0.50W DIC M/N2 ∞/0 WD 2.0 mm
NI Vision Development Module	National Instruments		Required for CPM virtual Interface
PEEK finger tight fittings	IDEX	F-120x	10-32 Coned Ports
PEEK plug	IDEX	P-551	10-31 Coned Ports
pippette tips	Eppendorf	22492225	100 μL – 1000 μL, Autoclaved
Plastic Forceps	Thermo Scientific	6320-0010
Plastic Syringe	Fischer Scientific	14-955-459	10 mL
Plumbing parts	Fischer Scientific		3-way valves and other plumbing parts to connect tubing.
Research Plus 1-channel 100 μL–1000 μL	Eppendorf	3123000063	Micro pipetter
Sulfuric Acid	any		Used for acid cleaning solution
T Plan SLWD 20x/0.30 OFN25 WD 30 mm	Nikon		Confocal Microscope Objective
Texas Red DHPE triethylammonim salt	Thermo Fischer Scientific	1395MP	Fluorophore
Vaccum Pump	Gast	DOA-P704-AA