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Biology

在实验室条件下收集和长期维护切叶蚁（Atta）

Published: August 30, 2022 doi: 10.3791/64154
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Institute of Biosciences, Department of General and Applied Biology, Laboratory of Leaf-cutting Ants, São Paulo State University, 2Institute of Psychology, Laboratory Walter Hugo Cunha, São Paulo University

Summary

在这里，描述了一种在实验室条件下成功收集和维持健康的 Atta （膜翅目：Formicidae）蚁群的方案。此外，还详细介绍了不同的巢穴类型和配置以及可能的实验程序。

Abstract

蚂蚁是地球上生物多样性最丰富的动物群体之一，栖息在不同的环境中。在受控环境中维持蚁群可以丰富对其生物学的理解，从而有助于应用研究。这种做法通常用于造成经济损失的物种（如 阿塔 蚂蚁）的种群控制研究。为了培养它们的互利真菌，这些切叶蚁收集叶子，因此被认为是广泛分布在整个美洲大陆的农业害虫。它们是高度社会化的，栖息在由各种房间组成的精心制作的地下巢穴中。它们在受控环境中的维护取决于此处描述的几种程序和频繁护理的日常工作。它从在繁殖季节（即婚礼飞行）收集蜂王开始，然后将其单独转移到塑料容器中。由于蜂王的死亡率很高，第二次收集可以在婚礼飞行后约6个月进行，届时挖掘出具有发达真菌团的早期巢穴，手工采摘并放置在塑料容器中。在实验室中，每天将叶子提供给已建立的菌落，每周将蚂蚁产生的废物与剩余的干燥植物材料一起清除。随着真菌园的不断生长，菌落根据实验目的转移到不同类型的容器中。切叶蚁群被放置在相互连接的容器中，代表组织系统，其功能室由自然界中的这些昆虫建造。此设置非常适合监控废物量、真菌花园健康以及工人和蜂王的行为等因素。促进数据收集和更详细的观察被认为是将蚁群保持在受控条件下的最大优势。

Introduction

蚂蚁由对大多数陆地环境产生影响的多样化个体组成1.它们充当高效的分散者2，3，4，捕食者5和生态系统工程师6，7，8，9，10，突出了它们对自然生态系统的重要性和生态成功。所有蚂蚁物种都被归类为真社会昆虫;然而，它们的社会组织在不同物种群体之间差异很大，即分工系统、功能群体、个体之间的交流、牧草组织、菌落基础和繁殖过程11。作为一个高度多元化的群体，他们求助于多种食物资源和专门的喂养行为。事实上，农业不仅是人类文明的一大步，也是蚂蚁物种的一大步。大约 55 至 65 Ma 前12，蚂蚁开始培养真菌并将它们纳入几乎排他性的饮食中。他们变得如此专业化，以至于他们发展出严格、依赖和强制性的互动，被归类为共生，其中一个个体没有另一个个体就无法生存。

低等真菌生长的蚂蚁收集和处理死亡的有机物，例如腐烂的叶子碎片，以培养它们的互利真菌;而高等真菌生长的蚂蚁收获新鲜的植物材料，构成了最成功的共生自然系统之一13。这种高度专业化的农业技术使他们能够抓住一个新的利基市场。高等蚂蚁包括切叶蚁，这是一个单系群，在19Ma（15-24Ma）和18Ma（14-22Ma）之间引起14，15，16由四个有效属组成：Atta Fabricius，Acromyrmex Mayr，Amoimyrmex Cristiano和Pseudoatta Gallardo。由切叶蚁执行的切叶农业系统是从衍生的农业系统演变而来的17.这些物种中的大多数专门利用互惠真菌物种Leucoagaricus gongylophorus Singer 18（也称为Leucocoprinus gongylophorus Heim 19），标志着一个显着的进化转变11。真菌品种垂直传播，从原始巢到后代，表明它们是克隆繁殖的20。

值得注意的是， 阿塔 社会发展了一个复杂的组织结构，其环境非常重要，并且引起了myrmecologists的极大兴趣。他们的人口可以由数百万人组成，其中大多数是不育的女工，表现出明显的多态性，即不同的大小和解剖形态。种群根据年龄、生理状态、形态类型、行为和殖民地的专门活动按种姓区分21.工人可能被区分为园丁和护士、巢内通才、觅食者和挖掘者以及捍卫者或士兵21.这种组织允许合作执行任务，以及可以产生高度结构化的集体行为的自组织系统，使他们能够有效地对环境干扰做出反应22.

人口更新的作用由单个女王（即一夫一妻制）扮演，只要她活着，就构成了永久的生殖种姓22.众所周知，阿塔女王的寿命超过20年，在其一生中产卵23。由于女王是不可替代的，它的耐力对于殖民地13，20，23，24的生存至关重要。然而，在繁殖季节，巢中可以找到数千只有翅膀的繁殖雌性和雄性，但没有一只留在原来的巢中，形成了一个临时种姓22。在Atta sexdens殖民地，产生了近3，000只生殖雌性和14，000只生殖雄性25。它发生在一个菌落达到性成熟时，大约在实施后38个月，并且每年重复一次，直到它被消灭23，25。新的阿塔殖民地是通过单倍体建立的，其中一个女王开始一个新的巢穴。

当环境条件有利时，繁殖者离开地下巢穴开始婚礼飞行。其发生时间因地区而异，根据物种的不同，整个巴西领土全年都在变化。然而，该事件之前似乎有降雨和湿度升高26，这可能与土壤湿度22导致的挖掘便利有关。通常，在婚前1-5周，巢穴入口和通道被拓宽，以方便生殖个体离开。在离开它们的母群之前，有翅膀的雌性在颊下腔中收集并储存一部分互助真菌20，27。在飞行途中进行多次交配，并计算出在某些物种中，一个女王可以被三到八只雄性（即一妻多夫制）授精28，确保遗传变异性29。之后，蜂王进入土壤，优先考虑没有或很少植被的地方25，在那里它们移除翅膀并挖掘它们的第一个巢室。这是唯一可以在巢穴外看到女王的时期。虽然在人工巢中看到了临时种姓的个体，但尚不清楚在实验室条件下是否进行了任何成功的交配（即婚礼飞行）24。

最初的筑巢对应于殖民地最关键的时期，可以持续6小时到8小时23，25。这时，女王在最初的房间里隐居，几天后，产卵开始了。第一批卵被喂给蜂王反刍的菌丝体，标志着殖民地真菌花园的开始。第一只幼虫大约在 25 天22 出现，几乎在第一个月末，菌落由一个增殖真菌垫组成，未成熟的真菌（卵、幼虫和蛹）嵌套在那里，以及女王，她孤立地抚养她最初的后代23。卵也是第一批幼虫的食物资源，被蜂王高度消耗13.此外，女王通过脂肪身体储备和分解代谢不再使用的翅膀肌肉来维持自己13.最初的真菌培养物不会被消耗，因为菌落的生存取决于其发育，在此期间，蜂王用粪液使其受精13。出巢几天后，第一批工人打开巢穴入口，开始在巢穴附近区域进行觅食活动13.他们将收集的材料作为真菌花园的基质，现在作为工人的食物13，22。在加入真菌培养物之前，将工人携带的植物材料切成小块并用粪便液体润湿13。蚂蚁操纵真菌接种物来增加和控制其生长，这将用于分隔大土壤挖掘室，专门用于调理花园13，22，25。

婚后约6个月， A. sexdens 巢包含一个真菌室和几个通道。切叶蚁巢的建设具有很大的专业化作用，可以作为抵御天敌和不利环境因素的防御机制22.众所周知，切叶蚁会在真菌花园中破碎，并在房间开始变干时将其转移到高湿度的房间中13。因此，尽管挖掘巢穴具有相当大的能源成本，但投入的能量在殖民地本身的利益中被逆转了22。除了少数例外， 阿塔 物种还为殖民地的废物制作专门的房间，主要由耗尽的真菌基质和死蚂蚁的尸体制成，将其与巢穴的其余部分隔离开来，并建立了重要的社会免疫策略30。此外，一组不同的工人直接操纵垃圾，以避免污染其他人。工人们不断觅食以培育真菌，这是菌落的主要营养资源。然而，它们也可以在切割碎片时以植物汁液为食。植物材料经过精心挑选用于真菌园维护，并受到许多因素的影响，例如叶片性状和生态系统的特性13。

切叶蚁获取新鲜材料的觅食策略非常复杂，再加上已建立的殖民地的高收获需求，给农业生产者造成了相当大的经济损失，并危及森林恢复区22，31。因此，这些蚂蚁在可能遇到的大多数地区都可以归类为害虫，范围从美国南部到阿根廷东北部11，13，22，32。由于这些昆虫生物学中固有的一系列适应性（即社会组织、觅食、真菌栽培、卫生和复杂的巢穴结构）33，因此消灭有问题的菌落具有挑战性33。因此，种群控制策略不同于通常应用于其他害虫的策略，主要诉诸有吸引力的受污染诱饵产品33，34。然而，由于这些蚂蚁可以拒绝对真菌和群体个体的有害物质，并损害耕地33，因此不断测试新的天然化合物和控制替代品33，35，36。由于很难在经过现场测试的菌落上监测实验结果，因此初步论文是在受控环境中进行的。

因此，考虑到蚂蚁的异质生活方式，支持物种水平的研究，并将群体视为操作单位，其中一只蚂蚁是复杂超有机体的元素，实验方案必须适应感兴趣的群体11。到目前为止收集的有关 Atta 属的报告使得在实验室条件下成功收集和维持菌落并承认其基本需求和一般功能成为可能。基于它们的繁殖、群体建立和摄食行为等自然过程，已经开发出一种常规的做法，允许在不同类型的巢穴中长期建立群体。在这里，描述了在实验室中维持切叶蚁的程序协议，并强调了可能的一般研究，具有不同的实验目的和科学推广。

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Protocol

1. 皇后收藏

  1. 在文献中搜索感兴趣地区的阿塔繁殖季节。繁殖季节的发生、频率和日间时间因地区气候条件而异（表1）。虽然它通常在春季进行，但必须针对打算进行收集的位置收集此信息37，38，39，40，41，42，43，44，45，46。
  2. 确定并标记将 阿塔 巢视为收集蜂王和年轻殖民地的可能区域的位置。在婚礼飞行期间，蜂王分散在巢穴周围;因此，拥有更多殖民地的地区更有可能拥有女王着陆点，在那里它们开始新的巢穴挖掘。
  3. 检查先前选择的区域，在 阿塔 蚂蚁的繁殖季节是否有结婚飞行的迹象。跟踪婚礼飞行日的环境状况，例如炎热和降雨天气。
  4. 在先前选择的区域识别切叶蚁巢，并寻找表明有翼繁殖蚁即将离开的外部特征。巢穴的特征包括隧道入口变宽（图1），增加的工人流量对可能的捕食者表现出更具攻击性的行为，以及出现在隧道入口处的有翼繁殖蚁（图1）。当心降雨后的高湿度天，因为它们通常在婚礼飞行之前。
  5. 准备带有底部石膏层的塑料盖容器，以单独保留皇后。确保容器体积约为 200 mL，底部的石膏层高度约为 1 cm，并且具有高吸水性以控制湿度。
    注意：要准备石膏底座，请按照制造商的说明进行操作。
  6. 准备一个温度恒定为23±1°C的环境，相对湿度约为70%±10%。选择一个没有激烈活动和人流量大的地方，以避免振动和干扰。使用中性香味的清洁产品，以防止对蚂蚁行为的任何干扰。
    注意：特定环境条件的波动会导致水凝结或水分流失，并损害真菌园。
  7. 婚礼飞行后，收集已经开始筑巢挖掘的无翼女王，并将它们小心地单独放入用石膏层准备的塑料容器中。避免徒手触摸蜂王，并使用乳胶手套或昆虫镊子。
    注意：翅膀移除和土壤挖掘行为表明已经交配的生殖雌性，因此能够开始一个新的殖民地。皇后区收藏也被视为这件作品中的第一个收藏。
  8. 将装有蜂王的容器移动到先前选择的受控环境的位置。执行蜂王运输时要格外小心，避免过多的干扰并保持最低温度恒定。
  9. 收集后约3天内不要操纵或移动蜂王，以避免压力。

Figure 1
图1.巢穴入口扩大，有翅膀的蚂蚁繁殖和工人。加宽的隧道入口是指示阿塔婚礼飞行发生的巢穴特征之一。 请点击此处查看此图的大图。

2. 皇后区的维护

  1. 最初，在针头注射器的帮助下，每2天向受体的石膏层添加2.5毫升水。
    1. 不要打开收件人，而是小心地用针刺穿容器盖，以避免由于操作而受到干扰。在此期间可以使用相同的孔。确保添加的水不会浸泡石膏层。避免直接浇水女王、最初的真菌海绵和任何未成熟的。只要真菌花园表现出干燥的一面，缺水，请灌溉石膏层。
  2. 收集两周后，检查真菌是否被蜂王反刍。如果没有真菌，转移从已建立的菌落获得的约2g真菌。此外，如果真菌没有发育，请执行此步骤。
    注意：对于真菌转移，有必要从已建立的菌落中收集健康的真菌并清除其上可能出现的所有蚂蚁。使用汤匙、昆虫学镊子和乳胶手套来操纵真菌。
  3. 在第一批工人出现后，根据菌落的切割活动，开始定期提供年轻和薄叶的碎片。确保提供的叶子是健康的，并且植物没有经过杀虫剂或其他化学物质的处理。在早期阶段，确保叶子碎片不超过4厘米。
    注意：由于第一批工人开始觅食，因此必须在它们出现后提供植物材料。产品频率取决于工人将植物材料加入真菌的敏捷性，但可以每周 2-3 天。也可以提供燕麦片和玉米片，但应与叶子交替使用，以避免真菌干燥。
  4. 提供新叶时，清除菌落废物和干燥的叶子碎片。操纵皇后时，避免使用香水、保湿霜、面霜或任何有强烈气味的物质。此外，在所有过程中使用乳胶手套。
  5. 跟随菌落的发育，当真菌园达到容器体积的至少一半时，将菌落转移到人工持久巢中。
    注意：由于每个菌落的发育速度是固有的，因此没有估计的菌落转移时间。通常，由于真菌花园小，来自第一个收集的菌落被转移到具有最大体积为1L的真菌花园室的巢穴中。

3. 幼菌群的收集

  1. 获取大约 500 mL 体积的塑料容器。
  2. 婚后约6个月，在先前标记的切叶蚁位置上识别带有早期Atta巢穴的颗粒状土壤颗粒（图1）（图2）的指示性塔形土丘。
    注意：婚礼飞行六个月后，幼蜂群的巢穴估计在土壤中深达1米。在此期间指出了一个新的收藏品，以实现大量成功和持久菌落的更高机会。
  3. 用花园锄头挖掘巢穴入口，直到到达容纳年轻殖民地的房间。收集蜂王、真菌园、未成熟和年轻工人，并将它们放入塑料容器中。尽可能轻柔地执行收集过程。
    注意：当然，也会收集大量的土壤，应该在实验室未来的维护程序中逐渐清除。
  4. 将装有菌落的塑料盖容器移动到指定的受控环境中。运输幼菌时要格外小心，避免过多干扰并保持最低温度恒定性。避免操纵或移动菌落约 3 天以避免压力。如果房间有活跃的例行程序，可以在菌落上一块深色布。

Figure 2
图2.塔形土丘。 特征性的塔形土丘表明存在Atta sexdens和Atta laevigata的早期殖民地。请点击此处查看此图的大图。

4. 维持幼菌落

  1. 每周提供3次薄嫩叶。
    1. 确保提供的叶子是健康的，并且植物没有经过杀虫剂或其他化学物质的处理。在此阶段，确保叶子碎片长度至少为 7 厘米。
      注意：也可以提供燕麦片和玉米片，但应与叶子交替使用，以避免真菌干燥。
    2. 供应频率取决于工人将植物材料加入真菌的敏捷性。随着切割活动的激烈，每周三次或每周 5 天每天增加两次供应。
  2. 提供新叶子时，请借助勺子清除菌落废物，包括土壤残留物。在所有过程中使用乳胶手套。在操纵年轻菌落时，避免使用香水，保湿剂，面霜或任何具有强烈气味的物质。
    注意：工人自己将从真菌中分离土壤和废物。
  3. 跟随菌落的发育，当真菌园达到容器体积的至少一半时，将菌落转移到人工持久巢中。
    注意：由于每个菌落的发育速度是固有的，因此没有估计的菌落转移时间。

Figure 3
图3：容纳Atta sexdens 和 Atta laevigata 菌落的人工巢的类型。 切叶蚁的持久人造巢的插图：隐蔽的垂直巢设置，隐蔽的水平巢设置和开放的竞技场巢设置。 请点击此处查看此图的大图。

5. 耐用的人工巢

  1. 如下所述准备一个封闭的垂直巢穴设置（图3和 图4）。
    注意：与世隔绝的巢穴配置应始终具有不同的接收者，分别摆出（1）真菌花园室，（2）废物处理室和（3）觅食室。最初，它应该从三个容器开始，但可以添加更多的收件人来增加真菌花园。巢的大小和材料可能根据其实验目的而有所不同，尽管这里描述并建议使用透明材料。容器必须没有开口，否则蚂蚁会逃脱。下面描述的巢穴类型可用于一般研究，但由于取下盖子时会引起干扰，因此不建议用于自信的蚂蚁收集，从而导致个体之间的极大骚动。尽管如此，由于材料透明，即使真菌园填满了整个容器，也可以找到女王和不同的蚂蚁种姓。由于这是一种趋势，因此始终假设未成熟的真菌位于真菌花园的中心，因为它占据了垂直容器中的大部分可用空间。
    1. 选择一个大约 1 L 的透明有盖容器，并添加 1 厘米的高吸水性石膏底座。这将是真菌花园室。选择两个带盖的透明容器，每个容器约 500 mL，作为废物处理和觅食室。蚂蚁将选择每个房间，然后确保它们不互换。
      注意：要准备石膏底座，请按照制造商的说明进行操作。
    2. 穿孔并用透明管或软管连接三个容器。如有必要，在管子边缘贴上遮蔽胶带，以确保大腿与容器的连接并避免蚂蚁逃逸。将石膏基础容器放在中间，其他容器放在相对的两侧。
    3. 小心地将选定菌落的真菌海绵（参见步骤2.5和步骤4.3）与蜂王，工人和未成熟菌一起转移到石膏基础容器中。在转移之前，请确保石膏底座已浇水。使用乳胶手套。
  2. 如下所述准备一个隐蔽的水平巢穴设置（图3和 图4）。
    注意：水平配置的巢可以密切观察真菌花园和工人朝向它的活动。由于真菌园的年轻部分位于顶部，因此可以观察到工人最近提供的基质正在合并。真菌的新部分可以通过其颜色发现，这将类似于最后提供的资源的颜色，而较旧的部分通常带有米色。后代和蜂王也可以很容易地找到，因为在水平容器中，它们通常位于真菌花园的顶部，即使它占据了大部分空间。这种配置可用于以行为为中心的研究、焦点采样和科学推广目的，因为它给出了巢穴内部组织的感觉。
    1. 获取一个尺寸约为 31 厘米 x 21 厘米 x 4.5 厘米的透明带盖容器，并添加一层 1 厘米的高吸水性石膏底座。这将是真菌花园室。选择两个带盖的透明容器，每个容器约 500 mL，作为废物处理和觅食室。蚂蚁将选择每个房间，然后确保它们不互换。
      注意：要准备石膏底座，请按照制造商的说明进行操作。如有必要，用遮蔽胶带关闭盖子和容器之间的小空间，以防止蚂蚁逃脱。
    2. 穿孔并用透明管或软管连接容器。如有必要，在管子边缘贴上遮蔽胶带，以确保大腿与容器的连接并避免蚂蚁逃逸。将石膏基础容器放在中间，其他容器放在相对的两侧。
    3. 小心地将选定菌落的真菌海绵（参见步骤2.5和步骤4.3）与蜂王，工人和未成熟菌一起转移到石膏基础容器中。在转移之前，请确保石膏底座已浇水。使用乳胶手套。
  3. 如下所述准备一个开放的竞技场巢穴设置（图 3 和 图 5）。
    注意：开放的竞技场巢穴允许收集蚂蚁而不会受到太大干扰和觅食行为分析。它们还可以为科学推广目的提供自然界中发现的殖民地的可靠表示。
    1. 选择一个大约 1 L 的透明盖容器，并添加 1 厘米的高吸水性石膏层底座。这将是真菌花园室。
      注意：建议从 1 L 容器开始，然后逐渐传递到容量较大的容器中，以获得更大的真菌花园。但是，容器不应超过5升的容积。根据需要添加任意数量的容器。
    2. 选择一个开放的竞技场。竞技场的大小可以根据学习目的而有所不同。如果选择大型竞技场，请将装有真菌园的容器放在其内部（图5）。如果是小竞技场，请使用透明软管或管将其连接到真菌花园容器（图3）。竞技场将用作觅食和废物处理室，因此请确保它不会太小。
    3. 将一层聚四氟乙烯液体单次涂抹到竞技场边界以容纳蚂蚁。使用浸有液体的棉花和丁腈手套。
      注意：使用聚四氟乙烯液体时避免吸入和皮肤接触。
    4. 小心地将选定菌落的真菌海绵（参见步骤2.5和步骤4.3）与蜂王，工人和未成熟菌一起转移到石膏基础容器中。在转移之前，请确保石膏底座已浇水。使用乳胶手套。

Figure 4
图4：切叶蚁Atta sexdens 和 Atta laevigata的人工隐居巢穴。 与世隔绝的垂直巢设置顶部（A）和侧视图（B）;回廊水平巢设置顶部（C）和侧视图（D）。 请点击此处查看此图的大图。

Figure 5
图5：切叶蚁Atta sexdens 和 Atta laevigata的人工开放竞技场巢穴。 阿 塔六分球顶部（A）和侧视图（B）的开放式竞技场巢穴设置。1）真菌花园室;2）浪费;3）橙片;4）带有聚四氟乙烯（PTFE）层的玻璃。 请点击此处查看此图的大图。

6. 发达菌落的维护

  1. 每天在每个菌落中至少提供一片大叶子进入觅食室，并附有 1 L 真菌园。如果蚂蚁的切割活动很强烈，请增加叶子的数量。如果真菌干燥，请预先润湿叶子以提供额外的湿度。在与世隔绝的巢穴中，迅速进行祭品，以避免蚂蚁逃离觅食室。
    注意：在这里，叶子是从桑树（桑葚），芒果（芒果），桉树（桉 树属），jambolan（Syzygium cumini），芙蓉（木槿 属），金合欢（Acalypha wilkesiana）和Ligustrum（Ligustrum lucidum）等植物物种中收集的。
    1. 提供橙子和苹果等水果，以及燕麦和玉米片，以多样化和补充饮食。对于觅食活动频繁的大型殖民地，每天提供燕麦片和玉米片，每周提供一次水果。如果不是这种情况，请与叶子交替提供薄片，但每周不超过三次，每月一次或两次水果。根据蚂蚁的觅食活动调整每种食物的数量和频率。
    2. 如果上述选项不可用，请确定蚂蚁在区域树木和灌木的叶子、花朵和果实中的觅食偏好，甚至是商业化的蔬菜、谷物和其他薄片。避免提供含有防御性化合物和杀虫剂的资源。
  2. 每2周从所有菌落中取出废物室的所有内容物。出于人口控制目的，也移除工人。如果工人将健康的真菌转移到废物室，请确保蜂王不在上面并将其移除。如果处理的废物量很大或太潮湿，请每周清除一次。
  3. 每当提供新的蚂蚁时，请从蚂蚁室中取出未带走的材料，并确保它始终干净。
    1. 如果工人将健康的真菌转移到觅食室，请打扰它，打开容器盖并将中性滑石粉涂抹在觅食室边缘表面。仅当真菌室上仍有一些空间时才执行此过程，这样工人才会将真菌转移回容器而不会丢失它或任何未成熟物。
  4. 如果需要更多的真菌花园，请添加另一个抹灰容器，并将一部分真菌海绵移入其中。直到真菌到达容器的一半，在真菌室中加入叶子。真菌园的生长应该逐渐发生，以免损害菌落平衡。如果需要更大的容器，请确保在转移之前让真菌占据最小容器的整个空间。不应让菌落废物和干叶积聚到真菌花园室中。
  5. 检查容器中的石膏底座，随着时间的推移，由于蚂蚁排泄、废物运输和高湿度浓度，它可能会变成深棕色并变得无效。此外，一些菌落可能会切割该层并处理掉它。在这些情况下，将真菌园转移到新的抹灰容器中。

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Representative Results

描述蚂蚁收集过程的流程图如图 6 所示。这里显示了使用上述收集、维护和巢穴设置协议获得的一些结果。

Figure 6
图6：采摘切叶蚁群的流程图。按照协议，第一次收集在婚礼飞行后立即进行。取下翅膀的蜂王被收集起来，放在一个带有石膏底座的小容器中。婚礼飞行6个月后，进行第二次收集。收集挖掘土壤并成功开始殖民地基础的皇后。菌落发育后，它们被转移到更大的容器中，并可选择转移到不同的巢穴设置中。请点击此处查看此图的大图。

生殖状况对切叶蚁后免疫反应的影响
不同种类的蚂蚁女王寿命长，因此更有可能多次接触相同的病原体47。通过启动一个新的群体， 阿塔 女王被隔离，繁殖和免疫之间的权衡可能会减少对这些创始蚁免疫防御的投资。因此，它们对病原体的抵抗力可能与它们的生殖状况有关47，48。通过在卵后早期生命周期的不同时刻收集蜂王，并将尼龙线引入个体的胃中（图7），可以评估个体对病原体的包膜反应，并比较处女蜂王，最近交配的蜂王和6个月前交配到个体胃部的蜂王之间的免疫抵抗力。

Figure 7
图 7：封装响应文章。 实验装置旨在根据 Atta sexdens 和 Atta laevigata queens的繁殖状态评估包封变异的个体免疫反应。处女女王，新交配的女王和6个月前交配的女王在胃的第4和第5个tergite之间接受了尼龙丝插入以作为抗原。24小时后取出尼龙长丝并拍照以彩色覆盖量化。皇后是在婚礼飞行之前、婚礼飞行后和婚礼飞行后 6 个月收集的，按照所述协议的主题 1、2 和 3 中的步骤收集的。 请点击此处查看此图的大图。

一旦未交配的雌性只出现在婚外飞行事件中，对这些处于这种繁殖状态的个体的研究依赖于特定的知识来预测特定现象的发生，并了解蚂蚁的收集和维持协议。为了保证繁殖者尚未交配，直接从巢穴中收集个体，这些巢穴的入口为这些蚂蚁的离开而扩大（图1）。由于在物种水平上鉴定繁殖很麻烦，因此收集了来自同一殖民地的工人进行验证。在交配个体的情况下，雌性在婚礼飞行后立即被移除翅膀并开始挖掘土壤，假设它们已经交配。对于两个生殖阶段，都收集了大量雌性，以确保测试的个体数量，因为此时的死亡率很高。一旦交配的蚂蚁从原始群体中分散，通过表皮碳氢化合物剖面比较确定物种49。皇后交配了6个月，因为婚礼飞行已经开始了他们的殖民地，此时由一个小的真菌花园，几个工人和未成熟的真菌组成。这些早期生命的殖民地是通过独特的塔形土丘发现的（图2）。收集是按照前面第3节“收集年轻殖民地”中所述的步骤进行的。在这个阶段研究雌性繁殖，有必要维持年轻的殖民地，因为只有女王很快就会灭亡。鉴定是使用殖民地的工人进行的。使用前面描述的协议总共收集了大约200个蜂王。

每次收集后，对蜂王进行称重，测量，并很快收到尼龙长丝插入物，24小时后将其取出以进行颜色覆盖分析。对于 Atta laevigata 物种，6个月前交配的蜂王显示出最深的尼龙丝，因此，更高的包封率和更有效的免疫防御（图8）。然而，新交配的蜂王在婚礼飞行后收集，而处女女王在婚礼飞行前收集，具有大致相同的封装率（图8）。因此，验证了 Atta laevigata 蚂蚁的封装细胞防御可以随着繁殖状态和交配后经过的时间而变化，但不会随着体重和头部长度而改变。最初，该研究旨在收集和比较 Atta sexdens女王 ，但不可能收集处女女王，因为所确定的巢穴在观察到的孔中没有任何繁殖活动。尽管困难重重，但对切叶蚁繁殖的细胞防御机制的一般研究可能有助于阐明昆虫的免疫反应和改进当前的控制方法。

切叶蚁对饵料中使用的子产品的偏好
目前，切叶蚁群应用最多的种群控制方法是通过毒饵供奉。通常，它们与有吸引力的植物来源化合物有关，柠檬浆是最常用的。然而，众所周知，在事先接触后，工人可以以某种方式将诱饵毒性与有吸引力的化合物联系起来并拒绝它，从而使该方法效率低下。因此，建议使用替代有吸引力的化合物，如大豆（100%），大豆加柠檬浆（50%/50%）和腰果加柑橘浆（50%/50%），以便在诱饵之间可能轮换。这些化合物是在 对Atta sexdens 和 Atta laevigata 菌落进行偏好实验后选择的。巢与玻璃竞技场相连，并提供不同成分的无杀虫剂诱饵（图9）。

Figure 8
图8：不同生殖阶段的阿塔六分虫和阿塔蜂王的包膜率。通过插入个体胃部的尼龙丝图像的平均灰度值评估封装水平。最暗的线被认为代表有效的细胞防御，因为假设更多的重叠血细胞排列在目标上，如图中的X轴所示。Atta laevigata 交配蜂王表现出最高的包封水平（方差分析，Tukey-Kramer，标准偏差; p < 0.01;N = 29），因此有效的个体免疫防御。据观察，同一物种的新交配蜂王和处女蜂王同样表现出较低的包膜率，因此个体免疫防御效果较差。结果表明，交配和筑巢事件会影响蜂王的细胞免疫反应。Atta sexdens queens显示出相反的结果，MQ的封装水平最低（方差分析，Tukey-Kramer，标准偏差，P < 0.01;N = 46）。然而，由于无法收集该物种的处女女王，因此无法在所有组之间进行比较。请点击此处查看此图的大图。

Figure 9
图9：切叶蚁对诱饵子产品的偏好论文。 实验设置旨在评估Atta sexdens 和 Atta laevigata 工人对具有不同吸引力子产品的诱饵的偏好。一个玻璃竞技场连接到真菌室，以容纳不同的诱饵，这些诱饵由玻璃隔板隔开。每个诱饵 5 克以随机位置提供，一次三个。在实验结束后对诱饵进行称重，这要么在观察1小时后发生，要么在工人完全取走诱饵后立即发生。通过装载活动评估偏好，该活动通过从觅食室移除的诱饵负载来估计。 请点击此处查看此图的大图。

总共使用32个菌落和约1L真菌园。菌落先前使用所描述的方案收集和维持。紫 薇 中含量最高的处理是柠檬浆、大豆加柠檬浆（50%/50%）和腰果加柠檬浆（50%/50%; 图 10）。同样， 蚂 蚁负荷最大的处理是柠檬浆、大豆（100%）和大豆加柠檬浆（50%/50%; 图 10）。结果表明，大豆和腰果副产品仅次于柠檬浆，表明其他饵料组合物可用于切叶蚁的化学种群控制。

Figure 10
图10：有吸引力的诱饵意味着Atta laevigata 和 Atta sexdens 工人的装载百分比。 同样，柠檬浆（100%）、大豆（100%）和大豆加柠檬浆（50%/50%）处理对这两个物种的负荷最大。然而，Atta sexdens （腰果加柠檬浆）的最小负荷处理是由 Atta laevigata 工人装载的60%。在整个实验过程中，对每个物种的五个菌落进行了五次重复。诱饵在重复中排列不同;然而，柠檬酸浆始终作为阳性对照存在。 请点击此处查看此图的大图。

研究和科学推广
自1990年以来，每年收集约350个蜂王和100个菌落，在实验室中维护。至少有三名实习生被指定每天照顾蚂蚁，在这段时间内，每年有近250个蚁群同时被保留用于实验和教育目的。在2016年至2019年期间，来自约34所学校的约2，020名学生能够参观切叶蚁实验室（LAFC），并观察使用上述协议收集和维护的蚁群。短途旅行有不同的目标，从普通生物学到社会行为学习。除了蚂蚁等昆虫的已知重要性外，它们在自然界中构建的复杂物理结构，也在人工巢穴中观察到，是具有教育意义的集体努力和工作组织的一个例子。对于每个教育水平（图11），给出了不同的详细介绍，有时遵循负责学生的教师建议的方法。为此目的，维持了两个具有开放竞技场巢穴设置的菌落，每个菌落都有大约66个房间和177升真菌花园（图5）。不幸的是，短途旅行在大流行期间被取消，但可以看到教育工作者的兴趣越来越大，因为在过去 4 年中报告了访问的学生人数增加（图 12）。尽管如此，为了在大流行期间保持科学外展，我们通过视频共享平台进行了虚拟访问。与 Manual do Mundo 频道合作制作的视频50 展示了里面是如何切叶蚁的巢穴的，在不到一年的时间里，观看次数超过 240 万次，评论超过 3，000 条。在那里，人们开始在实验室中研究切叶蚁的生物学和创造。

Figure 11
图11：2016-2019年学生在短途旅行中的教育水平。 根据教育水平，2016-2019年期间参加切叶蚁实验室游览的学生人数。这些短途旅行针对不同的方法，涉及在切叶蚁实验室中维护的切叶蚁群。 请点击此处查看此图的大图。

Figure 12
图12：2016-2019年参加短途旅行的学生人数。 2016-2019年期间参加切叶蚁实验室短途旅行的学生人数。可以看到教育组织对举办活虫（如蚂蚁）展览的兴趣增加，这些展览可以让学生仔细观察。 请点击此处查看此图的大图。

物种 月份和日 年 城市 州 国家 大陆 纬度 经度 引用
Atta bisphaerica 十一月 4 1996 - - 巴西 南美洲 - - 37
阿塔·卡皮瓜拉 10 月 6 日 2006 肉毒杆菌 圣保罗 巴西 南美洲 22° 50' 60“ 南 48° 26' 10“ W 38
阿塔·卡皮瓜拉 十月 27 2007 肉毒杆菌 圣保罗 巴西 南美洲 22° 50' 60“ 南 48° 26' 10“ W 38
阿塔·卡皮瓜拉 十一月 2008 肉毒杆菌 圣保罗 巴西 南美洲 22° 50' 60“ 南 48° 26' 10“ W 39
阿塔·卡皮瓜拉 十一月 2009 肉毒杆菌 圣保罗 巴西 南美洲 22° 50' 60“ 南 48° 26' 10“ W 39
阿塔头孢 3月至6月 - 伊列乌斯 巴伊亚 巴西 南美洲 - - 40
阿塔头孢 九月 - 伊列乌斯 巴伊亚 巴西 南美洲 - - 40
阿塔·科隆比卡 6月4日 1993 - 甘博亚 巴拿马 中美洲 - - 41
阿塔·科隆比卡 6月7日 1993 - 甘博亚 巴拿马 中美洲 - - 41
阿塔·科隆比卡 - 1998 - 甘博亚 巴拿马 中美洲 - - 42
Atta laevigata 10 月 6 日 2006 肉毒杆菌 圣保罗 巴西 南美洲 22° 50' 60“ 南 48° 26' 10“ W 39
Atta laevigata 十月 27 2007 肉毒杆菌 圣保罗 巴西 南美洲 22° 50' 60“ 南 48° 26' 10“ W 39
Atta laevigata 十一月 2008 肉毒杆菌 圣保罗 巴西 南美洲 22° 50' 60“ 南 48° 26' 10“ W 39
Atta laevigata 十一月 2009 肉毒杆菌 圣保罗 巴西 南美洲 22° 50' 60“ 南 48° 26' 10“ W 39
Atta laevigata 10月15日 2016 里奥克拉罗 圣保罗 巴西 南美洲 - - 这项工作
Atta laevigata 十月 26 2016 里奥克拉罗 圣保罗 巴西 南美洲 - - 这项工作
Atta laevigata 十月 31 2017 里奥克拉罗 圣保罗 巴西 南美洲 - - 这项工作
Atta laevigata 十一月 6 2017 里奥克拉罗 圣保罗 巴西 南美洲 - - 这项工作
Atta laevigata 9月22日 2018 里奥克拉罗 圣保罗 巴西 南美洲 - - 这项工作
Atta laevigata 10月10日 2018 里奥克拉罗 圣保罗 巴西 南美洲 - - 这项工作
Atta laevigata 10月10日 2019 里奥克拉罗 圣保罗 巴西 南美洲 - - 这项工作
Atta laevigata * 十月 21 2020 里奥克拉罗 圣保罗 巴西 南美洲 - - 这项工作
Atta laevigata 十一月 15 2020 里奥克拉罗 圣保罗 巴西 南美洲 - - 这项工作
Atta laevigata 十一月 20 2020 里奥克拉罗 圣保罗 巴西 南美洲 - - 这项工作
Atta laevigata 10月17日 2021 里奥克拉罗 圣保罗 巴西 南美洲 - - 这项工作
Atta laevigata 十月 25 2021 里奥克拉罗 圣保罗 巴西 南美洲 - - 这项工作
阿塔混二头肌 三月 8 2022 马卡伊巴 北里奥格兰德州 巴西 南美洲 - - **
Atta sexdens - 1986年至1991年 维索萨 米纳斯吉拉斯州 巴西 南美洲 20.45° 南 42.51° 西 43
Atta sexdens 十月 21 2009 肉毒杆菌 圣保罗 巴西 南美洲 22° 49' 53.25“ 南 48° 25' 24.22“ W 44
Atta sexdens 九月 18 2010 里奥克拉罗 圣保罗 巴西 南美洲 22° 23' 70.50“ 南 47° 32' 54.40“ 西 45
Atta sexdens 十月 31 2010 肉毒杆菌 圣保罗 巴西 南美洲 22° 49' 53.25“ 南 48° 25' 24.22“ W 44
Atta sexdens 10月10日 2011 里奥克拉罗 圣保罗 巴西 南美洲 22° 23' 70.50“ 南 47° 32' 54.40“ 西 45
Atta sexdens 10月10日 2011 肉毒杆菌 圣保罗 巴西 南美洲 22° 23' 70.50“ 南 47° 32' 54.40“ 西 45
Atta sexdens 10月15日 2016 里奥克拉罗 圣保罗 巴西 南美洲 - - 这项工作
Atta sexdens 十月 26 2016 里奥克拉罗 圣保罗 巴西 南美洲 - - 这项工作
Atta sexdens 十月 31 2017 里奥克拉罗 圣保罗 巴西 南美洲 - - 这项工作
Atta sexdens 十一月 6 2017 里奥克拉罗 圣保罗 巴西 南美洲 - - 这项工作
Atta sexdens 9月22日 2018 里奥克拉罗 圣保罗 巴西 南美洲 - - 这项工作
Atta sexdens 10月10日 2018 里奥克拉罗 圣保罗 巴西 南美洲 - - 这项工作
Atta sexdens 10月10日 2019 里奥克拉罗 圣保罗 巴西 南美洲 - - 这项工作
Atta sexdens* 十月 21 2020 里奥克拉罗 圣保罗 巴西 南美洲 - - 这项工作
Atta sexdens 十一月 15 2020 里奥克拉罗 圣保罗 巴西 南美洲 - - 这项工作
Atta sexdens 十一月 20 2020 里奥克拉罗 圣保罗 巴西 南美洲 - - 这项工作
Atta sexdens 10月17日 2021 里奥克拉罗 圣保罗 巴西 南美洲 - - 这项工作
Atta sexdens 十月 25 2021 里奥克拉罗 圣保罗 巴西 南美洲 - - 这项工作
Atta sexdens 11月至3月 - 伊列乌斯 巴伊亚 巴西 南美洲 - - 40
阿塔德克萨纳 五月 1992 纳科多切 得克萨斯州 美国 北美洲 32° 北 95° 西 43
Atta vollenweideri - 2004 到 2010 - 台湾 阿根廷 南美洲 26° 18' 南 58° 49' W 46
Atta vollenweideri 10 月 6 日 2006 - 台湾 阿根廷 南美洲 26° 18' 南 58° 49' W 46
Atta vollenweideri 十月 2009 - 台湾 阿根廷 南美洲 25° 07' 南 58° 10' W 46
Atta vollenweideri 十一月 2009 - 台湾 阿根廷 南美洲 25° 07' 南 58° 10' W 46
Atta vollenweideri 12月8日 2010 - 台湾 阿根廷 南美洲 26° 18' 南 58° 49' W 46
Atta vollenweideri 十月 24 - - 台湾 阿根廷 南美洲 26° 18' 南 58° 49' W 46
*仅观察到男性**门东萨，G.A.，个人通信（数据未公布）

表1：阿塔物种的婚期记录。根据地区，交配飞行发生在不同的时期和频率，但它们通常发生在春季，如从阿塔蚂蚁的发生区域收集的报告所示37，38，39，40，41，42，43，44，45，46。请按此下载此表格。

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Discussion

这里描述的维持切叶蚁群的协议已经以自信和可复制的方式开发和应用了三十多年。它允许开展受现场条件限制的研究。因此，健康的蚂蚁和蚁群可用于多个领域的研究，例如个体和群体水平的比较形态学，毒理学51，52，组织学53和微生物学54，55，56。它们在实验室中的维护包括此处描述的几个程序，其中包括在有利的非生物条件下进行位点准备，收集蜂王和年轻菌落以及持续护理。

几个步骤对于在受控条件下成功维护切叶蚁至关重要。早期阶段的蜂王和蜂群需要杰出的照顾，遵循详细的初始程序可以保证它们的生存。例如，有必要确定发现该物种的地点以及有翼繁殖开始婚礼飞行的时期。在南美洲，大多数交配飞行发生在春季（表1）。目前，圈养繁殖的可能性极低，因为它是在实验室24中记录婚礼飞行。此外，在肥沃期的切叶蚁群很大且难以挖掘，考虑到巢穴结构，寻找和收集蜂王6是一个挑战。例如，Atta laevigata巢可以达到67 m 2的巢面积，并占据超过563 m2的内部表面积，分为7，864个房间，深度为7m57。

婚后及时采集蜂王的好处是保证在短时间内和接近地表的繁殖形式数量较多。从第一个集合中，可以开发生殖形式的实验（图7），包括男性。技术限制是需要在不确定的日期收集生殖个体。如果蜂王的存活率很低，那么就需要第二次收集年轻的殖民地。在婚礼飞行后几个月收集年轻的殖民地，确保女王的房间不会深入地表。在这个阶段，只剩下身体状况更好的蜂王，因为它们忍受了食物短缺阶段，能够在幽闭阶段照顾真菌和第一批工人58，59，60，61。在实验室条件下，蜂王的存活率在最初几个月可以达到14.5%，即使健康真菌转移到90%的蜂王（数据未发表）。Mota-Filho62记录了类似的Atta sexdens生存数据。这可能是由于缺乏真菌发育或昆虫病原真菌63的自然污染。

在早期阶段收集蜂王或菌落的主要缺点之一（图6和图7）是分类学鉴定的困难，因为它可以通过主要工人更容易完成12，这些工人只有在几个月后才出现，此时有更多的资源用于幼虫喂养。该技术中的一些关键步骤与促进真菌园的生长，保持巢穴清洁和避免可能的逃逸有关。一些行动包括频繁添加新鲜蔬菜材料，这些材料不断被工人掺入真菌中。真菌用作工人的葡萄糖和淀粉供应，以及幼虫的蛋白质64。去除旧的和废弃的材料，并保持巢穴清洁，防止可能的有害微生物的出现。为避免逃逸，应始终检查管连接，在露天竞技场的情况下，应保持聚四氟乙烯层。在巢穴配置中维持菌落的优势描述为模拟自然界中发现的真实结构，具有用于觅食和浪费的特定房间，以及具有完整社会组织（即蜂王，工人和后代）的蜂群。对无蜂王菌落进行的研究表明，由于蜂王的缺席，工蚁表现出不同的行为。行为研究得出结论，蜂王除了生殖功能外，对群体凝聚力也很重要66。

此处涉及的协议的实施可以应用于其他具有科学意义的物种，例如来自 Acromyrmex属的其他真菌生长蚂蚁。这些切叶蚁也被认为是美国特定地区的农业害虫，最近引起了人们对早期群体发育67和有毒诱饵相互作用68重点研究的更多兴趣。虽然这项工作专门针对切叶蚁，但维护方案和所描述的不同类型的巢穴也可能适用于其他蚂蚁群体。该程序的每个部分都概述了在受控条件下保存蚂蚁时必须考虑的基本蚂蚁必需品，例如：确定最合适的饮食;在觅食室或特定区域定期提供食物;提供一个带有石膏底座的高湿度室，以保持女王和未成熟;避免蚂蚁通过添加到人工巢穴结构中的应急物质逃逸;从巢中取出蚂蚁丢弃的物质;并在必要时将菌落转移到另一个人工巢穴。

在过去的十年中，大学和研究人员一直致力于更具包容性，邀请社会成为实验室及其研究的一部分69.蚂蚁实验室坚定地接受了教育目的，成为吸引人们好奇心并将学术界与常识联系起来的工具。根据目标，这项工作中介绍的巢穴类型可用于不同的活动，例如教育和展览。例如，开放式巢穴（图5）将在大学向参观者展示，而与世隔绝的巢穴（图4）则可用于科学博览会和巡回展览，因为交通便利。在所有情况下，公众都可以观察蚁群，了解基本的生物学和有趣的事实，并被煽动质疑。在更具表现力的层面上，通过“Primeiros Passos na Ciência”（科学的第一步）69等扩展项目，学生实际上可以成为研究团队的一员。因此，具有教育目的的蚂蚁研究有利于学生的发展，因为它增强了调查和经验，同时鼓励了对科学研究的更大兴趣。

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Disclosures

作者没有利益冲突需要披露。

Acknowledgments

献给马里奥·奥托里（纪念） 和沃尔特·雨果·德·安德拉德·库尼亚，他们对切叶蚂蚁研究做出了巨大贡献。我们感谢圣保罗州立大学和生物科学研究所的支持。这项研究的部分资金来自巴西高级国家财政代码001、国家公民和技术发展委员会、圣保罗国家宪法权利保障基金和联合国国家发展基金会。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Entomologic forceps N/A N/A N/A
Glass tank N/A N/A Tempered glass, custom made
Hose N/A N/A Transparent, PVC 1/2 Inch x 2,0 mm
Latex gloves Descarpack 550301 N/A
Nitrile gloves Descarpack 433301 N/A
Open arena N/A N/A Polypropylene crate
Plaster pouder N/A N/A Plaster pouder used in construction, must be absorbant
Plastic Containers for collection Prafesta Natural Cód.: 8231/Natural Cód.: 8262 Lidded, transparent , polypropylene
Plastic containers for nests Prafesta Discontinued Polystyrene, hermetic
Teflon Dupont N/A Polytetrafluoroethylene liquid (PTFE Dispertion 30)

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生物学，第186期，
在实验室条件下收集和长期维护切叶蚁（<em>Atta</em>）
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Nogueira, B. R., de Oliveira, A. A., da Silva, J. P., Bueno, O. C. Collection and Long-Term Maintenance of Leaf-Cutting Ants (Atta) in Laboratory Conditions. J. Vis. Exp. (186), e64154, doi:10.3791/64154 (2022).

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