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Biology

Raccolta e mantenimento a lungo termine delle formiche tagliafoglie (Atta) in condizioni di laboratorio

Published: August 30, 2022 doi: 10.3791/64154
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Institute of Biosciences, Department of General and Applied Biology, Laboratory of Leaf-cutting Ants, São Paulo State University, 2Institute of Psychology, Laboratory Walter Hugo Cunha, São Paulo University

Summary

Qui, viene descritto un protocollo per raccogliere e mantenere con successo colonie di formiche Atta (Hymenoptera: Formicidae) sane in condizioni di laboratorio. Inoltre, diversi tipi e configurazioni di nidificazione sono dettagliati insieme a possibili procedure sperimentali.

Abstract

Le formiche sono uno dei gruppi di animali più ricchi di biodiversità del pianeta e abitano ambienti diversi. Il mantenimento delle colonie di formiche in ambienti controllati consente una comprensione arricchita della loro biologia che può contribuire alla ricerca applicata. Questa pratica è solitamente impiegata negli studi di controllo della popolazione di specie che causano perdite economiche, come le formiche Atta . Per coltivare il loro fungo mutualistico, queste formiche tagliafoglie raccolgono foglie e per questo sono considerate parassiti agricoli ampiamente distribuiti in tutto il continente americano. Sono altamente organizzati socialmente e abitano nidi sotterranei elaborati composti da una varietà di camere. Il loro mantenimento in un ambiente controllato dipende da una routine quotidiana di diverse procedure e cure frequenti che sono descritte qui. Inizia con la raccolta delle regine durante la stagione riproduttiva (cioè il volo nuziale), che vengono poi trasferite individualmente in contenitori di plastica. A causa dell'alto tasso di mortalità delle regine, una seconda raccolta può essere effettuata circa 6 mesi dopo il volo nuziale, quando i nidi incipienti con batuffolo fungino sviluppato vengono scavati, raccolti a mano e collocati in contenitori di plastica. Nel laboratorio, le foglie vengono fornite quotidianamente alle colonie stabilite e i rifiuti prodotti dalle formiche vengono rimossi settimanalmente insieme al materiale vegetale secco rimanente. Mentre il giardino dei funghi continua a crescere, le colonie vengono trasferite in diversi tipi di contenitori in base allo scopo sperimentale. Le colonie di formiche tagliafoglie sono collocate in contenitori interconnessi, che rappresentano il sistema organizzativo con camere funzionali costruite da quegli insetti in natura. Questa configurazione è ideale per monitorare fattori quali la quantità di rifiuti, la salute del giardino dei funghi e il comportamento dei lavoratori e della regina. La raccolta facilitata dei dati e le osservazioni più dettagliate sono considerate il più grande vantaggio di mantenere le colonie di formiche in condizioni controllate.

Introduction

Le formiche compongono un gruppo eterogeneo di individui che esercitano un'influenza sulla maggior parte degli ambienti terrestri1. Agiscono come efficienti dispersori 2,3,4, predatori5 e ingegneri ecosistemici 6,7,8,9,10, evidenziando la loro importanza e successo ecologico sugli ecosistemi naturali. Tutte le specie di formiche sono classificate come insetti eusociali; Tuttavia, la loro organizzazione sociale varia notevolmente tra i diversi gruppi di specie, cioè i sistemi di divisione del lavoro, i gruppi funzionali, la comunicazione tra gli individui, l'organizzazione del foraggio, la fondazione della colonia e il processo di riproduzione11. Come gruppo altamente diversificato, ricorrono a diverse risorse alimentari e comportamenti alimentari specializzati. È un dato di fatto, l'agricoltura non è stata solo un enorme passo per la civiltà umana, ma anche per le specie di formiche. Circa 55-65 Mafa 12, le formiche attine hanno iniziato a coltivare funghi e incorporarli in una dieta quasi esclusiva. Sono diventati così specializzati che hanno sviluppato interazioni rigorose, dipendenti e obbligatorie classificate come simbiosi, in cui un individuo non sopravvive senza l'altro.

Le formiche che crescono funghi inferiori raccolgono e trattano la materia organica morta, come frammenti di foglie in decomposizione, per far crescere il loro fungo mutualistico; mentre le formiche più alte che crescono funghi raccolgono materiale vegetale fresco, componendo uno dei sistemi naturali simbiotici di maggior successo13. Questa tecnica agricola altamente specializzata ha permesso loro di cogliere una nuova nicchia. Le formiche attine superiori comprendono le formiche tagliafoglie, un gruppo monofiletico che suscita tra 19 Ma (15-24 Ma) e 18 Ma (14-22 Ma)14,15,16 composto da quattro generi validi: Atta Fabricius, Acromyrmex Mayr, Amoimyrmex Cristiano e Pseudoatta Gallardo. Il sistema di agricoltura tagliafoglie eseguito dalle formiche tagliafoglie, si è evoluto dai sistemi agricoli derivati17. La maggior parte di queste specie sfrutta esclusivamente la specie fungina mutualistica Leucoagaricus gongylophorus Singer18 (chiamata anche Leucocoprinus gongylophorus Heim 19), segnando una significativa transizione evolutiva11. Le cultivar fungine sono trasmesse verticalmente, dai nidi originali alla prole, suggerendo che siano clonalmente propagate20.

Sorprendentemente, le società Atta svilupparono una complessa struttura organizzativa di enorme importanza nel loro ambiente e di grande interesse per i mirmecologi. La loro popolazione può essere composta da milioni di individui, la maggior parte dei quali operaie sterili che mostrano un accentuato polimorfismo, cioè dimensioni e morfologia anatomica distinte. La popolazione si distingue per caste in base all'età, allo stato fisiologico, al tipo morfologico, ai comportamenti e alle attività specializzate nella colonia21. I lavoratori possono essere discriminati in giardinieri e infermieri, generalisti all'interno del nido, raccoglitori ed escavatori, difensori o soldati21. Questa organizzazione consente l'esecuzione di compiti in cooperazione e un sistema auto-organizzante in grado di produrre comportamenti collettivi altamente strutturati, consentendo loro di rispondere in modo efficiente ai disturbi ambientali22.

Il ruolo di rinnovamento della popolazione è svolto da una singola regina (cioè monogina), per tutto il tempo in cui vive, costituendo la casta riproduttiva permanente22. Le regine Atta sono note per vivere per più di 20 anni, deponendo le uova per tutta la loro durata di vita23. Poiché la regina è insostituibile, la sua resistenza è cruciale per la sopravvivenza della colonia 13,20,23,24. Tuttavia, migliaia di femmine e maschi riproduttivi alati possono essere trovati nel nido durante le stagioni riproduttive, ma nessuno rimane nel nido originale, formando una casta temporanea22. Nelle colonie di Atta sexdens, quasi 3.000 femmine riproduttive e 14.000 maschi riproduttivi ne producono25. Si verifica quando una colonia raggiunge la maturità sessuale, circa 38 mesi dalla sua realizzazione, e si ripete annualmente da allora fino a quando non si estingue23,25. Le nuove colonie di Atta si stabiliscono attraverso l'aplometrosi, dove una regina inizia un nuovo nido.

Quando le condizioni ambientali sono favorevoli, i riproduttori lasciano il nido sotterraneo per iniziare il volo nuziale. Il periodo della sua presenza differisce da regione a regione, variando lungo l'anno in tutto il territorio brasiliano a seconda della specie. Tuttavia, l'evento sembra essere preceduto da precipitazioni e umidità26, che possono essere correlate alla facilitazione dello scavo dovuta all'umidità del suolo22. Frequentemente, 1-5 settimane prima del volo nuziale, gli ingressi e i canali del nido vengono allargati per facilitare la partenza degli individui riproduttivi. Prima di lasciare le loro colonie madri, le femmine alate raccolgono e immagazzinano, in una cavità infrabuccale, una porzione del fungo mutualistico20,27. Copulazioni multiple vengono eseguite a metà volo, e si calcola che una regina possa essere inseminata da tre a otto maschi (cioè poliandria) in alcune specie28, garantendo la variabilità genetica29. In seguito, le regine procedono verso il suolo, dando la preferenza a luoghi con poca o nessuna vegetazione25, dove rimuovono le ali e scavano la loro prima camera di nido. Questo è l'unico periodo in cui le regine possono essere viste al di fuori del nido. Sebbene gli individui della casta temporanea siano stati visti in nidi artificiali, non è noto se una copulazione riuscita (cioè il volo nuziale) sia stata eseguita in condizionidi laboratorio 24.

La costruzione iniziale del nido corrisponde al periodo più cruciale della colonia, che può durare da 6 h a 8 h23,25. In questo momento, la regina si chiude nella camera iniziale e, nel giro di pochi giorni, inizia l'ovideposizione. Le prime uova vengono somministrate al miceliale che la regina rigurgita, segnando l'inizio del giardino dei funghi della colonia. Le prime larve compaiono in circa 25 giorni22, e quasi alla fine del primo mese, la colonia consiste in un tappeto di funghi proliferanti, dove sono annidati gli immaturi (uova, larve e pupe) e la regina, che alleva la sua prole iniziale in isolamento23. Le uova sono anche la risorsa alimentare delle prime larve e molto consumate dalla regina13. Inoltre, la regina si sostiene con riserve di corpo grasso e catabolizzando i muscoli delle ali che non sono più utili13. La coltura fungina iniziale non viene consumata poiché la sopravvivenza della colonia dipende dal suo sviluppo e, durante questo periodo, la regina la fertilizza con liquido fecale13. Giorni dopo essere emerse, le prime operaie aprono l'ingresso del nido e iniziano un'attività di foraggiamento nelle immediate vicinanze del nido13. Incorporano il materiale raccolto come substrato del giardino dei funghi, che ora serve come cibo per i lavoratori13,22. Prima di essere aggiunto alla coltura fungina, il materiale vegetale trasportato dai lavoratori viene tagliato in piccoli pezzi e inumidito con liquido fecale13. Le formiche manipolano l'inoculo fungino per aumentarne e controllarne la crescita, che servirà per la suddivisione delle grandi camere scavate del terreno, specializzate nel condizionamento del giardino 13,22,25.

Circa 6 mesi dopo il volo nuziale, i nidi di A. sexdens contengono una camera fungina e alcuni canali. La grande specializzazione nella costruzione di nidi di formiche tagliafoglie funziona come meccanismo di difesa contro i nemici naturali e fattori ambientali sfavorevoli22. Le formiche tagliafoglie sono note per frammentare il giardino dei funghi e trasporlo in camere con elevata umidità quando le camere iniziano ad asciugarsi13. Così, nonostante lo scavo del nido abbia un costo energetico considerevole, l'energia investita viene invertita in benefici per la colonia stessa22. Con poche eccezioni, le specie Atta creano anche camere specializzate per i rifiuti della colonia, fatte principalmente di substrato fungino impoverito e corpi di formiche morte, isolandolo dal resto del nido e stabilendo un'importante strategia di immunità sociale30. Inoltre, un gruppo distinto di lavoratori manipola direttamente i rifiuti, per evitare la contaminazione di altri individui. I lavoratori si nutrono costantemente del fungo, che è la principale risorsa nutrizionale della colonia. Tuttavia, possono nutrirsi anche di linfa delle piante mentre tagliano frammenti. Il materiale vegetale è accuratamente selezionato per la manutenzione del giardino dei funghi e influenzato da molti fattori come i tratti fogliari e le proprietà dell'ecosistema13.

La strategia di foraggiamento delle formiche tagliafoglie per ottenere materiale fresco è molto complessa e, combinata con l'elevata domanda di raccolto delle colonie stabilite, comporta notevoli perdite economiche per i produttori agricoli e mette a repentaglio le aree di ripristino forestale22,31. Pertanto, queste formiche possono essere classificate come parassiti nella maggior parte delle aree in cui possono essere incontrate, che vanno dagli Stati Uniti meridionali all'Argentina nord-orientale 11,13,22,32. L'estinzione delle colonie problematiche è difficile a causa della serie di adattamenti inerenti alla biologia di questi insetti (cioè organizzazione sociale, foraggiamento, coltivazione di funghi, igiene e strutture complesse del nido)33. Pertanto, le strategie di controllo della popolazione sono distinte da quelle generalmente applicate ad altri insetti nocivi e ricorrono principalmente a interessanti offerte di esche contaminate33,34. Tuttavia, poiché queste formiche possono respingere le sostanze nocive sia per il fungo che per gli individui della colonia e compromettere i campi coltivati 33, nuovi composti naturali e alternative di controllo vengono costantemente testati33,35,36. Poiché i risultati degli esperimenti difficilmente possono essere monitorati su colonie testate sul campo, i saggi preliminari sono condotti in un ambiente controllato.

Pertanto, i protocolli sperimentali devono essere adattati ai gruppi di interesse considerando lo stile di vita eterogeneo delle formiche, sostenendo studi a livello di specie e tenendo conto delle colonie come unità operative, dove una formica è un elemento di un superorganismo complesso11. I rapporti raccolti finora riguardanti il genere Atta hanno reso possibile raccogliere e mantenere con successo le colonie in condizioni di laboratorio e riconoscere i loro bisogni di base e il loro funzionamento generale. Sulla base dei loro processi naturali come la riproduzione, la fondazione di colonie e i comportamenti alimentari, è stata sviluppata una routine di pratiche che consente la creazione a lungo termine di colonie in diversi tipi di nidi. Qui, viene descritto un protocollo procedurale per mantenere le formiche tagliafoglie in laboratorio ed evidenzia possibili ricerche generali con scopi di sperimentazione distinti e divulgazione scientifica.

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Protocol

1. Collezione di regine

  1. Cerca in letteratura il periodo della stagione riproduttiva di Atta nella regione di interesse. La frequenza della stagione riproduttiva, la frequenza e l'ora diurna dei voli nuziali variano a seconda delle condizioni climatiche regionali (Tabella 1). Sebbene si svolga generalmente in primavera, queste informazioni devono essere raccolte per il luogo in cui è prevista la raccolta 37,38,39,40,41,42,43,44,45,46.
  2. Identificare e contrassegnare i luoghi con i nidi di Atta considerati come possibili aree per la raccolta di regine e giovani colonie. Durante i voli nuziali, le regine sono disperse intorno ai luoghi del nido; Pertanto, le aree con un numero maggiore di colonie hanno maggiori possibilità di avere punti di atterraggio della regina dove iniziare nuovi scavi di nidi.
  3. Controllare le aree selezionate in precedenza per segni di volo nuziale durante la stagione riproduttiva delle formiche Atta . Tieni traccia delle condizioni ambientali dei giorni di volo nuziale, come il caldo e il tempo piovoso.
  4. Identificare i nidi di formiche tagliafoglie nelle aree selezionate in precedenza e cercare caratteristiche esterne che indichino l'imminente partenza delle formiche riproduttive alate. Le caratteristiche del nido includono ingressi del tunnel allargati (Figura 1), aumento del flusso di lavoratori che mostrano un comportamento più aggressivo nei confronti di possibili predatori e formiche riproduttive alate che appaiono agli ingressi del tunnel (Figura 1). Attenzione ai giorni di alta umidità che seguono le precipitazioni, poiché generalmente precedono i voli nuziali.
  5. Preparare contenitori con coperchio di plastica con uno strato di intonaco inferiore per trattenere le regine individualmente. Assicurarsi che il volume del contenitore sia di circa 200 ml e che lo strato di gesso nella parte inferiore sia alto circa 1 cm e sia altamente assorbente per il controllo dell'umidità.
    NOTA: Per preparare la base in gesso, seguire le istruzioni del produttore.
  6. Preparare un ambiente con una temperatura costante di 23 ± 1 °C e circa il 70% ± il 10% di umidità relativa. Scegli una location senza attività intense e un elevato flusso di persone per evitare vibrazioni e disturbi. Utilizzare prodotti per la pulizia di fragranza neutra per evitare interferenze nel comportamento delle formiche.
    NOTA: Le fluttuazioni delle condizioni ambientali specificate possono causare condensa dell'acqua o perdita di umidità e compromettere il giardino dei funghi.
  7. Dopo il volo nuziale, raccogli le regine senza ali che hanno iniziato lo scavo del nido e mettile con cura nei contenitori di plastica preparati con uno strato di gesso, individualmente. Evitare di toccare le regine a mani nude e utilizzare guanti in lattice o pinzette entomologiche.
    NOTA: La rimozione delle ali e il comportamento di scavo del suolo indicano femmine riproduttive che hanno già copulato e, quindi, sono in grado di iniziare una nuova colonia. Anche la collezione Queens è considerata la prima collezione di questo lavoro.
  8. Spostare i contenitori contenenti le regine nella posizione con un ambiente controllato precedentemente selezionato. Eseguire il trasporto delle regine con la massima cautela, evitando troppi disturbi e mantenendo una temperatura minima di costanza.
  9. Non manipolare o spostare le regine per circa 3 giorni dopo la raccolta per evitare lo stress.

Figure 1
Figura 1. Ingresso del nido allargato con riproduttori di formiche alate e operaie. Gli ingressi dei tunnel allargati sono una delle caratteristiche del nido che indica l'occorrenza dei voli nuziali di Atta .  Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

2. Manutenzione delle regine

  1. Inizialmente, aggiungere 2,5 ml di acqua allo strato di gesso del destinatario ogni 2 giorni con l'aiuto di una siringa ad ago.
    1. Invece di aprire il recipiente, forare accuratamente i coperchi del contenitore con l'ago per evitare disturbi dovuti alla manipolazione. Lo stesso foro può essere utilizzato durante questo periodo. Assicurarsi che l'acqua aggiunta non impregni lo strato di intonaco. Evitare di annaffiare direttamente la regina, la spugna fungina iniziale e gli eventuali immaturi. Finché il giardino dei funghi presenta un aspetto secco con assenza di acqua, irrigare lo strato di intonaco.
  2. Due settimane dopo la raccolta, controlla se il fungo è stato rigurgitato dalle regine. Se non ci sono funghi, trasferire circa 2 g di fungo ottenuto da una colonia stabilita. Inoltre, eseguire questo passaggio se il fungo non si sviluppa.
    NOTA: Per il trasferimento di funghi, è necessario raccogliere funghi sani da una colonia stabilita e rimuovere tutte le formiche che potrebbero essere su di esso. Usa un cucchiaio, pinzette entomologiche e guanti in lattice per manipolare il fungo.
  3. Dopo la comparsa dei primi operai, inizia a offrire regolarmente frammenti di foglie giovani e sottili, secondo l'attività di taglio della colonia. Assicurarsi che le foglie offerte siano sane e che le piante non siano state trattate con insetticidi o altre sostanze chimiche. Nelle fasi iniziali, assicurarsi che i frammenti fogliari non superino i 4 cm.
    NOTA: Quando i primi lavoratori iniziano il foraggiamento delle foglie, il materiale vegetale deve essere offerto dopo la loro comparsa. La frequenza dell'offerta dipende dall'agilità con cui i lavoratori incorporano il materiale vegetale sul fungo, ma può variare fino a 2-3 giorni alla settimana. Possono essere offerti anche fiocchi d'avena e fiocchi di mais, ma dovrebbero essere alternati con foglie per evitare la secchezza dei funghi.
  4. Quando offri nuove foglie, rimuovi i rifiuti di colonia e i frammenti di foglie secche. Evitare l'uso di profumi, creme idratanti, creme o qualsiasi sostanza con un forte odore quando si manipolano le regine. Inoltre, utilizzare guanti in lattice durante tutti i processi.
  5. Segui lo sviluppo della colonia e quando il giardino dei funghi raggiunge almeno la metà del volume del contenitore, trasferisci la colonia in un nido perresistente artificiale.
    NOTA: Poiché il tasso di sviluppo è inerente a ciascuna colonia, non esiste un tempo stimato per il trasferimento della colonia. Di solito, le colonie della prima raccolta vengono trasferite in nidi con camera da giardino fungina di massimo 1 L, a causa del piccolo giardino dei funghi.

3. Raccolta di giovani colonie

  1. Acquistare contenitori di plastica di circa 500 ml di volume.
  2. Circa 6 mesi dopo il volo nuziale, identificare i tumuli indicativi a forma di torre con particelle di terreno granulato (Figura 1) dei nidi incipienti di Atta (Figura 2) sui luoghi con presenza di formiche tagliafoglie precedentemente marcate.
    NOTA: Sei mesi dopo il volo nuziale, si stima che i nidi delle giovani colonie siano profondi fino a 1 m nel terreno. Una nuova collezione è indicata in questo periodo per ottenere maggiori possibilità di colonie di successo e durature in grandi quantità.
  3. Con una zappa da giardino, scavare l'ingresso del nido fino a raggiungere la camera che ospita la giovane colonia. Raccogli la regina, il giardino dei funghi, gli immaturi e i giovani lavoratori e mettili nel contenitore di plastica. Eseguire il processo di raccolta nel modo più delicato possibile.
    NOTA: Naturalmente, verrà raccolta anche una grande quantità di terreno che dovrebbe essere rimossa gradualmente nelle future procedure di manutenzione in laboratorio.
  4. Spostare i contenitori con coperchio di plastica che contengono le colonie nell'ambiente controllato designato. Eseguire il trasporto di giovani colonie con la massima cautela, evitando troppi disturbi e mantenendo una costanza termica minima. Astenersi manipolando o spostando le colonie per circa 3 giorni per evitare lo stress. Se la stanza ha una routine attiva, un panno scuro può essere messo sopra le colonie.

Figure 2
Figura 2. Tumulo di terra a forma di torre. Il caratteristico tumulo a forma di torre indica la presenza di colonie incipienti di Atta sexdens e Atta laevigata. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

4. Mantenimento di giovani colonie

  1. Fornire foglie giovani sottili 3 volte a settimana.
    1. Assicurarsi che le foglie offerte siano sane e che le piante non siano state trattate con insetticidi o altre sostanze chimiche. In questa fase, assicurarsi che i frammenti fogliari siano lunghi almeno 7 cm.
      NOTA: Possono essere offerti anche fiocchi d'avena e fiocchi di mais, ma devono essere alternati con foglie per evitare la secchezza dei funghi.
    2. La frequenza di offerta dipende dall'agilità con cui i lavoratori incorporano il materiale vegetale sul fungo. Con l'attività di taglio intensa, aumentare l'offerta due volte al giorno tre volte alla settimana o 5 giorni alla settimana.
  2. Quando offri nuove foglie, rimuovi i rifiuti della colonia, compresi i resti del suolo, con l'aiuto di un cucchiaio. Utilizzare guanti in lattice durante tutti i processi. Quando si manipolano le giovani colonie evitare l'uso di profumi, creme idratanti, creme o qualsiasi sostanza con un forte odore.
    NOTA: I lavoratori stessi separeranno il terreno e i rifiuti dal fungo.
  3. Segui lo sviluppo della colonia e quando il giardino dei funghi raggiunge almeno la metà del volume del contenitore, trasferisci la colonia in un nido perresistente artificiale.
    NOTA: Poiché il tasso di sviluppo è inerente a ciascuna colonia, non esiste un tempo stimato per il trasferimento della colonia.

Figure 3
Figura 3: Tipi di nidi artificiali per contenere le colonie di Atta sexden e Atta laevigata . Illustrazione di nidi artificiali perdurevoli di formiche tagliafoglie: configurazione del nido verticale di clausura, configurazione del nido orizzontale di clausura e configurazione del nido dell'arena aperta. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

5. Nidi artificiali perdurevoli

  1. Preparare una configurazione verticale di clausura del nido come descritto di seguito (Figura 3 e Figura 4).
    NOTA: Le configurazioni di nido di clausura dovrebbero sempre avere destinatari diversi per posare separatamente come (1) camera da giardino dei funghi, (2) camera di smaltimento dei rifiuti e (3) camera di foraggiamento. Inizialmente, dovrebbe iniziare con tre contenitori, ma è possibile aggiungere più destinatari per aumentare il giardino dei funghi. I nidi possono variare per dimensioni e materiale in base al loro scopo sperimentale, anche se qui è descritto e raccomandato l'uso di materiali trasparenti. I contenitori devono essere senza aperture, altrimenti le formiche sfuggiranno. Il tipo di nido descritto di seguito può essere utilizzato per la ricerca generale, ma non è ben raccomandato per la raccolta di formiche assertive a causa del disturbo causato durante la rimozione del coperchio, con conseguente grande agitazione tra gli individui. Tuttavia, a causa della trasparenza del materiale, è possibile individuare la regina e le diverse caste di formiche anche quando il giardino dei funghi ha riempito l'intero contenitore. Poiché si tratta di una tendenza, si presume sempre che gli immaturi siano al centro del giardino dei funghi quando ha occupato la maggior parte dello spazio disponibile in contenitori verticali.
    1. Selezionare un contenitore con coperchio trasparente di circa 1 L e aggiungere uno strato di 1 cm di base in gesso altamente assorbente. Questa sarà la camera del giardino dei funghi. Selezionare due contenitori trasparenti con coperchio di circa 500 ml ciascuno come camere di smaltimento dei rifiuti e di foraggiamento. Le formiche sceglieranno quale camera sarà ciascuna e, successivamente, si assicureranno che non siano scambiate.
      NOTA: Per preparare la base in gesso, seguire le istruzioni del produttore.
    2. Forare e collegare i tre contenitori con un tubo trasparente o un tubo. Se necessario, applicare del nastro adesivo sul bordo dei tubi per garantire un collegamento della coscia con i contenitori ed evitare la fuoriuscita delle formiche. Posizionare il contenitore di base in gesso al centro e gli altri contenitori sui lati opposti.
    3. Trasferire con cautela la spugna fungina di colonie selezionate (vedi punto 2.5 e punto 4.3) insieme alla regina, alle operaie e agli immaturi nel contenitore della base di gesso. Prima del trasferimento, assicurarsi che la base di gesso sia annaffiata. Utilizzare guanti in lattice.
  2. Preparare una configurazione orizzontale di clausura del nido come descritto di seguito (Figura 3 e Figura 4).
    NOTA: I nidi con configurazione orizzontale consentono un'attenta osservazione del giardino dei funghi e delle attività dei lavoratori verso di esso. Poiché le porzioni più giovani del giardino dei funghi sono in cima, è possibile osservare i substrati recentemente offerti incorporati dai lavoratori. Nuove porzioni del fungo possono essere individuate dal suo colore, che sarà simile al colore dell'ultima risorsa offerta, mentre le porzioni più vecchie di solito portano un colore beige. Anche i figli e la regina possono essere facilmente individuati, poiché nei contenitori orizzontali di solito si trovano nella parte superiore del giardino dei funghi, anche quando ha occupato la maggior parte dello spazio. Questa configurazione può essere utilizzata per la ricerca focalizzata sul comportamento, il campionamento focale e scopi di divulgazione scientifica, in quanto fornisce la percezione dell'organizzazione all'interno del nido.
    1. Acquistare un contenitore con coperchio trasparente con dimensioni di circa 31 cm x 21 cm x 4,5 cm e aggiungere uno strato di 1 cm di base in gesso altamente assorbente. Questa sarà la camera del giardino dei funghi. Selezionare due contenitori trasparenti con coperchio di circa 500 ml ciascuno come camere di smaltimento dei rifiuti e di foraggiamento. Le formiche sceglieranno quale camera sarà ciascuna e, successivamente, si assicureranno che non siano scambiate.
      NOTA: Per preparare la base in gesso, seguire le istruzioni del produttore. Se necessario, chiudere il poco spazio tra il coperchio e il contenitore con del nastro adesivo per evitare che le formiche fuoriescano.
    2. Perforare e collegare i contenitori con un tubo trasparente o un tubo. Se necessario, applicare del nastro adesivo sul bordo dei tubi per garantire un collegamento della coscia con i contenitori ed evitare la fuoriuscita delle formiche. Posizionare il contenitore di base in gesso al centro e gli altri contenitori sui lati opposti.
    3. Trasferire con cautela la spugna fungina di colonie selezionate (vedi punto 2.5 e punto 4.3) insieme alla regina, alle operaie e agli immaturi nel contenitore della base di gesso. Prima del trasferimento, assicurarsi che la base di gesso sia annaffiata. Utilizzare guanti in lattice.
  3. Preparare una configurazione di nido dell'arena aperta come descritto di seguito (Figura 3 e Figura 5).
    NOTA: I nidi dell'arena aperta consentono la raccolta di formiche senza grandi disturbi e l'analisi del comportamento di foraggiamento. Possono anche fornire una rappresentazione affidabile di una colonia trovata in natura per scopi di divulgazione scientifica.
    1. Selezionare un contenitore con coperchio trasparente di circa 1 L e aggiungere uno strato di 1 cm di base di intonaco altamente assorbente. Questa sarà la camera del giardino dei funghi.
      NOTA: Si consiglia di iniziare con contenitori da 1 litro e passare gradualmente a contenitori con volumi più elevati per un giardino di funghi più grande. Tuttavia, i contenitori non devono superare un volume di 5 L. Aggiungere tutti i contenitori necessari.
    2. Seleziona un'arena aperta. Le dimensioni dell'arena possono variare in base agli scopi di studio. Se viene selezionata un'arena di grandi dimensioni, posizionare i contenitori che contengono il giardino dei funghi al suo interno (Figura 5). Nel caso di una piccola arena, collegarla al contenitore del giardino dei funghi con un tubo o un tubo trasparente (Figura 3). L'arena fungerà da camera di foraggiamento e smaltimento dei rifiuti, quindi assicurati che non sia troppo piccola.
    3. Applicare uno strato di liquido in politetrafluoroetilene in un unico movimento sul bordo dell'arena per contenere le formiche. Utilizzare un cotone imbevuto di liquido e un guanto di nitrile.
      ATTENZIONE: Evitare l'inalazione e il contatto con la pelle durante l'utilizzo di liquido di politetrafluoroetilene.
    4. Trasferire con cautela la spugna fungina di colonie selezionate (vedi punto 2.5 e punto 4.3) insieme alla regina, alle operaie e agli immaturi nel contenitore della base di gesso. Prima del trasferimento, assicurarsi che la base di gesso sia annaffiata. Utilizzare guanti in lattice.

Figure 4
Figura 4: Nidi artificiali di clausura delle formiche tagliafoglie Atta sexdens e Atta laevigata. Allestimento verticale del nido di clausura superiore (A) e vista laterale (B); nido orizzontale di clausura superiore (C) e vista laterale (D). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 5
Figura 5: Nido artificiale ad arena aperta delle formiche tagliafoglie Atta sexdens e Atta laevigata. Configurazione del nido dell'arena aperta della parte superiore (A) e della vista laterale (B) dei sexden di Atta. 1) Camere da giardino fungine; 2) Rifiuti; 3) Fette d'arancia; 4) Vetro con strato di politetrafluoretilene (PTFE). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

6. Mantenimento delle colonie sviluppate

  1. Offri quotidianamente almeno una foglia grande nella camera di foraggiamento per colonia con 1 L di giardino di funghi. Se l'attività di taglio delle formiche è intensa, aumentare il numero di foglie. Se il fungo è secco, pre-inumidire le foglie per fornire umidità extra. Nei nidi di clausura, eseguire rapidamente l'offerta per evitare che le formiche fuoriescano dalla camera di foraggiamento.
    NOTA: Qui, le foglie sono raccolte da specie vegetali come gelso (Morus nigra), mango (Mangifera indica), eucalipto (Eucalyptus sp.), jambolan (Syzygium cumini), ibisco (Hibiscus sp.), acalypha (Acalypha wilkesiana) e ligustrum (Ligustrum lucidum).
    1. Offri frutta come arancia e mela, avena e corn flakes per diversificare e completare la dieta. Alle grandi colonie con intensa attività di foraggiamento, offri fiocchi d'avena e fiocchi di mais ogni giorno e frutta una volta alla settimana. Se non è il caso, offri fiocchi alternativamente con foglie, ma non più di tre volte a settimana e frutta una o due volte al mese. Regolare la quantità e la frequenza di ciascun alimento in base all'attività di foraggiamento delle formiche.
    2. Se le opzioni sopra descritte non sono disponibili, identificare la preferenza di foraggiamento delle formiche tra foglie, fiori e frutti di alberi e arbusti regionali, o anche verdure, cereali e altri fiocchi commercializzati. Evita di offrire risorse con composti chimici difensivi e pesticidi.
  2. Rimuovere tutto il contenuto della camera di scarico ogni 2 settimane da tutte le colonie. Rimuovere anche i lavoratori per scopi di controllo della popolazione. Se i lavoratori trasferiscono funghi sani nella camera dei rifiuti, assicurarsi che la regina non sia su di esso e rimuoverlo. Se la quantità di rifiuti smaltiti è elevata o è troppo umida, rimuoverla una volta alla settimana.
  3. Rimuovere il materiale non prelevato dalle formiche dalla camera di foraggiamento ogni volta che ne offrono di nuovi e assicurarsi che sia sempre pulito.
    1. Se i lavoratori trasferiscono funghi sani nella camera di foraggiamento, disturbarla, lasciare aperto il coperchio del contenitore e applicare talco neutro sulla superficie del margine della camera. Eseguire questa procedura solo se c'è ancora spazio sulla camera del fungo, in questo modo i lavoratori trasferiranno il fungo nel contenitore senza perderlo o eventuali immaturi.
  4. Se si desidera più giardino di funghi, aggiungere un altro contenitore intonacato e spostare una parte della spugna fungina in esso. Fino a quando il fungo raggiunge la metà del contenitore, aggiungere foglie nella camera del fungo. La crescita del giardino dei funghi dovrebbe avvenire gradualmente per non compromettere l'equilibrio della colonia. Se si desidera un contenitore più grande, assicurarsi di lasciare che il fungo occupi l'intero spazio dei contenitori più piccoli prima di trasferirlo. I rifiuti di colonia e le foglie secche non devono essere lasciati accumulare nella camera del giardino dei funghi.
  5. Controllare la base di gesso dai contenitori, poiché con il tempo potrebbe acquisire un colore marrone scuro e diventare inefficace a causa dell'escrezione delle formiche, del trasporto di materiali di scarto e dell'alta concentrazione di umidità. Inoltre, alcune colonie possono tagliare lo strato e smaltirlo. In questi casi, trasferire il giardino dei funghi in un nuovo contenitore intonacato.

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Representative Results

Un diagramma di flusso che illustra il processo di raccolta delle formiche è mostrato nella Figura 6. Qui vengono mostrati alcuni risultati ottenuti utilizzando il protocollo di raccolta, manutenzione e configurazioni del nido sopra descritto.

Figure 6
Figura 6: Diagramma di flusso per la raccolta delle colonie di formiche tagliafoglie. Seguendo il protocollo, la prima raccolta avviene subito dopo il volo nuziale. Le regine che hanno rimosso le ali vengono raccolte e messe in un piccolo contenitore con una base di gesso. Dopo 6 mesi dal volo nuziale, si verifica la seconda raccolta. Vengono raccolte le regine che hanno scavato il terreno e avviato con successo la fondazione della colonia. Dopo che le colonie si sviluppano, vengono trasferite in contenitori più grandi e, facoltativamente, in diverse configurazioni di nido. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Influenza dello stato riproduttivo nella risposta immunitaria delle regine delle formiche tagliafoglie
Le regine di diverse specie di formiche hanno una lunga durata e, quindi, hanno maggiori probabilità di essere esposte allo stesso agente patogeno più di una volta47. Avviando una nuova colonia, le regine di Atta sono isolate e un compromesso tra riproduzione e immunità potrebbe ridurre gli investimenti nelle difese immunitarie di queste formiche fondatrici. Quindi, la loro resistenza agli agenti patogeni può essere correlata al loro stato riproduttivo47,48. Raccogliendo le regine in diversi momenti del loro primo ciclo di vita e introducendo un filo di nylon nel gaster degli individui (Figura 7), è stato possibile valutare la risposta individuale di incapsulamento ai patogeni e confrontare la resistenza immunitaria tra regine vergini, regine recentemente accoppiate e regine che si sono accoppiate 6 mesi fa nel gaster degli individui.

Figure 7
Figura 7: Saggio di risposta all'incapsulamento. Impostazione dell'esperimento che mirava a valutare la risposta immunitaria individuale della variazione dell'incapsulamento in base allo stato di riproduzione delle regine di Atta sexden e Atta laevigata . Le regine vergini, le regine appena accoppiate e le regine che si sono accoppiate 6 mesi fa hanno ricevuto inserzioni di filamenti di nylon tra il 4 ° e il 5 ° tergite del gaster per agire come antigene. I filamenti di nylon sono stati rimossi dopo 24 ore e fotografati per la quantificazione della copertura a colori. Le regine sono state raccolte prima del volo nuziale, subito dopo il volo nuziale e 6 mesi dopo il volo nuziale, seguendo i passaggi degli argomenti 1, 2 e 3 del protocollo descritto. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Una volta che le femmine non accoppiate appaiono solo in eventi di volo nuziale, lo studio di questi individui a questo stato di riproduzione si basa sulle conoscenze specifiche per prevedere l'insorgenza del particolare fenomeno e per conoscere i protocolli di raccolta e mantenimento delle formiche. Per garantire che i riproduttori non avessero ancora copulato, gli individui sono stati raccolti direttamente dai buchi del nido che avevano le loro entrate allargate per la partenza di quelle formiche (Figura 1). Poiché l'identificazione dei riproduttori a livello di specie è problematica, i lavoratori della stessa colonia sono stati raccolti per la convalida. Nel caso di individui accoppiati, le femmine a cui sono state rimosse le ali e hanno iniziato a scavare il terreno subito dopo il volo nuziale sono state raccolte, supponendo che avessero già copulato. Per entrambe le fasi di riproduzione, è stato raccolto un numero elevato di femmine per assicurare la quantità di individui testati, poiché il tasso di mortalità in questo momento è significativo. Una volta che le formiche accoppiate si sono disperse dalla colonia originale, le specie sono state identificate attraverso il confronto del profilo degli idrocarburi cuticolari49. Le regine accoppiate da 6 mesi dal volo nuziale hanno già iniziato le loro colonie, che a questo punto consistono in un piccolo giardino di funghi, diverse operaie e immaturi. Queste prime colonie di vita sono state individuate dal distinto tumulo di terreno a forma di torre (Figura 2). La raccolta è avvenuta seguendo le fasi descritte in precedenza nella sezione 3 "Raccolta di giovani colonie". Per studiare i riproduttori femminili in questa fase, era necessario mantenere la giovane colonia, poiché solo la regina sarebbe presto perita. L'identificazione è stata effettuata utilizzando i lavoratori delle colonie. Circa 200 regine sono state raccolte in totale utilizzando i protocolli precedentemente descritti.

Dopo ogni collezione, le regine sono state pesate, misurate e presto hanno ricevuto gli inserimenti di filamenti di nylon, che sono stati rimossi 24 ore dopo per l'analisi della copertina a colori. Per le specie di Atta laevigata , le regine che si sono accoppiate 6 mesi fa hanno mostrato il filamento di nylon più scuro, quindi il più alto tasso di incapsulamento e una difesa immunitaria più efficiente (Figura 8). Tuttavia, le regine appena accoppiate raccolte subito dopo il volo nuziale e le regine vergini raccolte prima del volo nuziale condividevano approssimativamente lo stesso tasso di incapsulamento (Figura 8). Pertanto, è stato verificato che la difesa cellulare di incapsulamento nelle formiche Atta laevigata può variare con lo stato riproduttivo e il tempo trascorso dopo l'accoppiamento, ma non cambia con il peso e la lunghezza della testa. Inizialmente, la ricerca mirava a raccogliere e confrontare anche le regine di Atta sexdens , ma non è stato possibile raccogliere regine vergini, poiché i nidi identificati non avevano alcuna attività di riproduzione nei fori osservati. Nonostante la difficoltà, studi generali sui meccanismi di difesa cellulare dei riproduttori di formiche tagliafoglie potrebbero contribuire alla chiarificazione delle risposte immunitarie degli insetti e al miglioramento degli attuali metodi di controllo.

Preferenza delle formiche tagliafoglie rispetto ai sottoprodotti utilizzati nelle esche
Attualmente, il metodo di controllo della popolazione più applicato delle colonie di formiche tagliafoglie è attraverso l'offerta di esche tossiche. Generalmente, sono associati a un composto di origine vegetale attraente, con la polpa citrica che è la più utilizzata. Tuttavia, è noto che in qualche modo i lavoratori possono associare la tossicità dell'esca con il composto attraente dopo il contatto precedente e rifiutarlo, rendendo il metodo inefficiente. Pertanto, l'uso di composti attraenti alternativi come soia (100%), soia più polpa citrica (50% / 50%) e anacardi più polpa di agrumi (50% / 50%) sono proposti per una possibile rotazione tra le esche. Questi composti sono stati selezionati dopo esperimenti di preferenza con le colonie di Atta sexden e Atta laevigata . I nidi sono stati attaccati con arene di vetro e sono state offerte esche prive di insetticidi con composizioni diverse (Figura 9).

Figure 8
Figura 8: Tasso di incapsulamento di Atta sexden e Atta laevigata queens in diversi stadi riproduttivi. I livelli di incapsulamento sono stati valutati attraverso il valore medio di grigio dalle immagini dei filamenti di nylon inseriti nel gaster degli individui. I fili più scuri sono stati considerati rappresentare un'efficiente difesa cellulare perché si presumeva che più emociti sovrapposti stessero allineando il bersaglio, come mostrato sull'asse X nella figura. Le regine accoppiate di Atta laevigata hanno mostrato il più alto livello di incapsulamento (ANOVA, Tukey-Kramer, Standard Deviation; p < 0,01; N=29), quindi un'efficace difesa immunitaria individuale. È stato osservato che le regine appena accoppiate e le regine vergini della stessa specie mostravano, allo stesso modo, tassi più bassi di incapsulamento e di conseguenza una difesa immunitaria individuale meno efficace. I risultati ottenuti suggeriscono che gli eventi di accoppiamento e di creazione del nido influenzano le risposte immunitarie cellulari delle regine di Atta laevigata. Le regine di Atta sexdens hanno mostrato risultati contrari e la MQ ha avuto il livello di incapsulamento più basso (ANOVA, Tukey-Kramer, Standard Deviation, P < 0,01; N = 46). Tuttavia, poiché non è stato possibile raccogliere regine vergini della specie, il confronto tra tutti i gruppi non è stato possibile. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 9
Figura 9: Saggio sulla preferenza delle formiche tagliafoglie per i sottoprodotti dell'esca. Impostazione dell'esperimento che mirava a valutare la preferenza dei sexden Atta e dei lavoratori di Atta laevigata alle esche con diversi sottoprodotti attraenti. Un'arena di vetro era attaccata alla camera dei funghi per contenere le diverse esche, che erano separate da un divisorio di vetro. 5 g di ogni esca sono stati offerti in posizioni casuali, tre alla volta. Le esche sono state pesate dopo la fine dell'esperimento, che si è verificato dopo 1 ora di osservazione o non appena un'esca è stata completamente presa dai lavoratori. La preferenza è stata valutata dall'attività di carico, che è stata stimata dal carico di esche rimosso dalla camera di foraggiamento. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

In totale, sono state utilizzate 32 colonie con circa 1 litro di giardino fungino. Le colonie sono state precedentemente raccolte e mantenute utilizzando i protocolli descritti. I trattamenti più carichi di A. laevigata sono stati polpa citrica, soia più polpa citrica (50%/50%) e anacardi più polpa citrica (50%/50%; Figura 10). Allo stesso modo, i trattamenti più carichi delle formiche A. sexdens erano polpa citrica, soia (100%) e soia più polpa citrica (50% / 50%; Figura 10). I risultati ottenuti per le due specie hanno mostrato che i sottoprodotti di soia e anacardi erano i più attraenti dopo la polpa citrica, suggerendo che altre composizioni di esche potrebbero essere utilizzate per il controllo chimico della popolazione nelle formiche tagliafoglie.

Figure 10
Figura 10: Percentuale media di carico delle esche attraenti da parte dei lavoratori di Atta laevigata e Atta sexdens. Allo stesso modo, i trattamenti con polpa citrica (100%), soia (100%) e soia più polpa citrica (50% / 50%) sono stati i più caricati per entrambe le specie. Tuttavia, il trattamento meno caricato per i sexden di Atta (anacardi più polpa citrica) è stato caricato al 60% dai lavoratori di Atta laevigata. Durante l'esperimento, sono state eseguite cinque ripetizioni con cinque colonie di ogni specie. Le esche erano disposte in modo diverso all'interno delle ripetizioni; Tuttavia, la polpa citrica era sempre presente come controllo positivo. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Ricerca e divulgazione scientifica
Circa 350 regine e 100 colonie vengono raccolte ogni anno per essere mantenute in laboratorio dall'anno 1990. Almeno tre stagisti sono designati per prendersi cura quotidianamente delle formiche, e durante questo lasso di tempo, quasi 250 colonie sono state tenute contemporaneamente per scopi sperimentali ed educativi ogni anno. Durante gli anni dal 2016 al 2019, circa 2.020 studenti provenienti da circa 34 scuole hanno potuto visitare il Laboratorio delle formiche tagliafoglie (LAFC) e osservare le colonie di formiche raccolte e mantenute utilizzando i protocolli descritti in precedenza. Le escursioni avevano diversi obiettivi, dalla biologia generale all'apprendimento del comportamento sociale. A parte la nota importanza di insetti come le formiche, le complesse strutture fisiche da loro costruite in natura, osservate anche nei nidi artificiali, sono un esempio di sforzo collettivo e organizzazione del lavoro che hanno interesse educativo. Per ogni livello educativo (figura 11) è stata fornita una presentazione dettagliata diversa, talvolta seguendo l'approccio suggerito dagli insegnanti responsabili degli studenti. Due colonie con la configurazione del nido dell'arena aperta sono mantenute per tali scopi, ciascuna con circa 66 camere con 177 L di giardino dei funghi (Figura 5). Sfortunatamente, le escursioni sono state annullate durante la pandemia, ma è possibile vedere un crescente interesse tra gli educatori, poiché il numero di studenti in visita è emerso negli ultimi 4 anni riportato (Figura 12). Tuttavia, per mantenere la portata della scienza durante la pandemia, le visite virtuali sono state effettuate attraverso piattaforme di condivisione video. Il video50 che mostra come si trova un nido di formiche tagliafoglie, realizzato in collaborazione con il canale Manual do Mundo, ha avuto più di 2,4 milioni di visualizzazioni e più di 3.000 commenti in meno di un anno. Lì, sono state affrontate la biologia e la creazione di formiche tagliafoglie in laboratorio.

Figure 11
Figura 11: Livelli di istruzione degli studenti durante le escursioni negli anni 2016-2019. Numero di studenti che erano presenti nelle escursioni al Laboratorio delle formiche tagliafoglie durante il periodo 2016-2019, in base al livello di istruzione. Le escursioni miravano a diversi approcci che coinvolgono colonie di formiche tagliafoglie che vengono mantenute nel Laboratorio delle formiche tagliafoglie. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 12
Figura 12: Numero di studenti in escursione negli anni 2016-2019. Numero di studenti che sono stati presenti nelle escursioni presso il Laboratorio delle formiche tagliafoglie nel periodo 2016-2019. È possibile vedere un aumento dell'interesse delle organizzazioni educative per la conduzione di mostre di insetti vivi, come le formiche, che consentono un'osservazione ravvicinata da parte degli studenti. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Specie Mese e giorno Anno Città Stato Paese Continente Latitudine Longitudine Referenze
Atta bisphaerica 4 novembre 1996 - - Brasile America del Sud - - 37
Atta capiguara 6 ottobre 2006 Botucatu San Paolo Brasile America del Sud 22° 50' 60" S 48° 26' 10" O 38
Atta capiguara 27 ottobre 2007 Botucatu San Paolo Brasile America del Sud 22° 50' 60" S 48° 26' 10" O 38
Atta capiguara Novembre 2008 Botucatu San Paolo Brasile America del Sud 22° 50' 60" S 48° 26' 10" O 39
Atta capiguara Novembre 2009 Botucatu San Paolo Brasile America del Sud 22° 50' 60" S 48° 26' 10" O 39
Atta cefaloti Da marzo a giugno - Ilhéus Bahia Brasile America del Sud - - 40
Atta cefaloti Settembre - Ilhéus Bahia Brasile America del Sud - - 40
Atta colombica 4 giugno 1993 - Gamboa Panamá America centrale - - 41
Atta colombica 7 giugno 1993 - Gamboa Panamá America centrale - - 41
Atta colombica - 1998 - Gamboa Panamá America centrale - - 42
Atta laevigata 6 ottobre 2006 Botucatu San Paolo Brasile America del Sud 22° 50' 60" S 48° 26' 10" O 39
Atta laevigata 27 ottobre 2007 Botucatu San Paolo Brasile America del Sud 22° 50' 60" S 48° 26' 10" O 39
Atta laevigata Novembre 2008 Botucatu San Paolo Brasile America del Sud 22° 50' 60" S 48° 26' 10" O 39
Atta laevigata Novembre 2009 Botucatu San Paolo Brasile America del Sud 22° 50' 60" S 48° 26' 10" O 39
Atta laevigata 15 ottobre 2016 Rio Claro San Paolo Brasile America del Sud - - Questo lavoro
Atta laevigata 26 ottobre 2016 Rio Claro San Paolo Brasile America del Sud - - Questo lavoro
Atta laevigata 31 ottobre 2017 Rio Claro San Paolo Brasile America del Sud - - Questo lavoro
Atta laevigata 6 novembre 2017 Rio Claro San Paolo Brasile America del Sud - - Questo lavoro
Atta laevigata 22 settembre 2018 Rio Claro San Paolo Brasile America del Sud - - Questo lavoro
Atta laevigata 10 ottobre 2018 Rio Claro San Paolo Brasile America del Sud - - Questo lavoro
Atta laevigata 10 ottobre 2019 Rio Claro San Paolo Brasile America del Sud - - Questo lavoro
Atta laevigata * 21 ottobre 2020 Rio Claro San Paolo Brasile America del Sud - - Questo lavoro
Atta laevigata 15 nov 2020 Rio Claro San Paolo Brasile America del Sud - - Questo lavoro
Atta laevigata 20 novembre 2020 Rio Claro San Paolo Brasile America del Sud - - Questo lavoro
Atta laevigata 17 ottobre 2021 Rio Claro San Paolo Brasile America del Sud - - Questo lavoro
Atta laevigata 25 ottobre 2021 Rio Claro San Paolo Brasile America del Sud - - Questo lavoro
Atta opaciceps 8 marzo 2022 Macaíba Rio Grande do Norte Brasile America del Sud - - **
Atta sexdens - Dal 1986 al 1991 Viçosa Minas Gerais Brasile America del Sud 20,45° S 42.51° W 43
Atta sexdens 21 ottobre 2009 Botucatu San Paolo Brasile America del Sud 22° 49' 53.25" S 48° 25' 24.22" W 44
Atta sexdens 18 settembre 2010 Rio Claro San Paolo Brasile America del Sud 22° 23' 70.50" S 47° 32' 54.40" W 45
Atta sexdens 31 ottobre 2010 Botucatu San Paolo Brasile America del Sud 22° 49' 53.25" S 48° 25' 24.22" W 44
Atta sexdens 10 ottobre 2011 Rio Claro San Paolo Brasile America del Sud 22° 23' 70.50" S 47° 32' 54.40" W 45
Atta sexdens 10 ottobre 2011 Botucatu San Paolo Brasile America del Sud 22° 23' 70.50" S 47° 32' 54.40" W 45
Atta sexdens 15 ottobre 2016 Rio Claro San Paolo Brasile America del Sud - - Questo lavoro
Atta sexdens 26 ottobre 2016 Rio Claro San Paolo Brasile America del Sud - - Questo lavoro
Atta sexdens 31 ottobre 2017 Rio Claro San Paolo Brasile America del Sud - - Questo lavoro
Atta sexdens 6 novembre 2017 Rio Claro San Paolo Brasile America del Sud - - Questo lavoro
Atta sexdens 22 settembre 2018 Rio Claro San Paolo Brasile America del Sud - - Questo lavoro
Atta sexdens 10 ottobre 2018 Rio Claro San Paolo Brasile America del Sud - - Questo lavoro
Atta sexdens 10 ottobre 2019 Rio Claro San Paolo Brasile America del Sud - - Questo lavoro
Atta sexdens* 21 ottobre 2020 Rio Claro San Paolo Brasile America del Sud - - Questo lavoro
Atta sexdens 15 nov 2020 Rio Claro San Paolo Brasile America del Sud - - Questo lavoro
Atta sexdens 20 novembre 2020 Rio Claro San Paolo Brasile America del Sud - - Questo lavoro
Atta sexdens 17 ottobre 2021 Rio Claro San Paolo Brasile America del Sud - - Questo lavoro
Atta sexdens 25 ottobre 2021 Rio Claro San Paolo Brasile America del Sud - - Questo lavoro
Atta sexdens Da novembre a marzo - Ilhéus Bahia Brasile America del Sud - - 40
Atta texana Maggio 1992 Nacogdoche Texas USA Nord America 32° N 95° W 43
Atta vollenweideri - Dal 2004 al 2010 - Formosa Argentina America del Sud 26° 18' S 58° 49' O 46
Atta vollenweideri 6 ottobre 2006 - Formosa Argentina America del Sud 26° 18' S 58° 49' O 46
Atta vollenweideri Ottobre 2009 - Formosa Argentina America del Sud 25° 07' S 58° 10' O 46
Atta vollenweideri Novembre 2009 - Formosa Argentina America del Sud 25° 07' S 58° 10' O 46
Atta vollenweideri 8 dicembre 2010 - Formosa Argentina America del Sud 26° 18' S 58° 49' O 46
Atta vollenweideri 24 ottobre - - Formosa Argentina America del Sud 26° 18' S 58° 49' O 46
* Solo maschi osservati ** Mendonça, G. A., comunicazione personale (dati non pubblicati)

Tabella 1: Registrazioni dei periodi di volo nuziale delle specie Atta. I voli di accoppiamento avvengono in periodi e frequenze diversi a seconda delle regioni, tuttavia avvengono generalmente durante la primavera, come indicato nei rapporti raccolti dal territorio di occorrenza delle Attaformiche 37,38,39,40,41,42,43,44,45,46. Clicca qui per scaricare questa tabella.

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Discussion

Il protocollo qui descritto per mantenere le colonie di formiche tagliafoglie è stato sviluppato e applicato per oltre tre decenni in modo assertivo e replicabile. Ha permesso lo sviluppo di ricerche che sarebbero state limitate dalle condizioni del campo. In tal modo, formiche e colonie sane sono diventate disponibili per la ricerca in diverse aree come morfologia comparativa, tossicologia 51,52, istologia53 e microbiologia54,55,56 a livello individuale e di colonia. La loro manutenzione in laboratorio comprende diverse procedure qui descritte, che includono la preparazione del sito in condizioni abiotiche favorevoli, la raccolta di regine e giovani colonie e la cura continua.

Diversi passaggi sono cruciali per il successo della manutenzione delle formiche tagliafoglie in condizioni controllate. Le regine e le colonie nelle fasi iniziali hanno bisogno di cure distinte e seguire le procedure iniziali dettagliate può garantire la loro sopravvivenza. Ad esempio, è necessario identificare il luogo in cui si trovano le specie e il periodo in cui i riproduttori alati iniziano il volo nuziale. In Sud America, la maggior parte dei voli di accoppiamento avviene durante la primavera (Tabella 1). Attualmente, la possibilità di allevamento in cattività è estremamente bassa, in quanto è per registrare un volo nuziale nel laboratorio24. Inoltre, le colonie di formiche tagliafoglie nella fase fertile sono grandi e difficili da scavare e, data l'architettura del nido, è una sfida individuare e raccogliere la regina6. Ad esempio, i nidi di Atta laevigata possono essere fino a 67 m 2 di area di nido e occupare più di 563 m2 di superficie interna divisa in 7.864 camere in 7 m di profondità57.

Il vantaggio di raccogliere le regine subito dopo il volo nuziale è quello di garantire un maggior numero di forme riproduttive in un breve periodo di tempo e vicino alla superficie. Da questa prima collezione, è possibile sviluppare esperimenti con forme riproduttive (Figura 7), compresi i maschi. Una restrizione tecnica è la necessità di raccogliere individui riproduttivi in una data incerta. Se la sopravvivenza delle regine è bassa, diventa necessaria una seconda collezione di giovani colonie. La raccolta di giovani colonie pochi mesi dopo il volo nuziale assicura che la camera della regina non sia in profondità nella superficie. In questa fase, rimangono solo le regine con più forma fisica, poiché hanno sopportato la fase di carenza di cibo e sono state in grado di prendersi cura del fungo e delle prime operaie durante la fase claustrale 58,59,60,61. In condizioni di laboratorio, il tasso di sopravvivenza delle regine può raggiungere il 14,5% nei primi mesi, anche con funghi sani trasferiti al 90% delle regine (dati non pubblicati). Dati di sopravvivenza simili di Atta sexden sono stati registrati da Mota-Filho62. Ciò può essere dovuto alla mancanza di sviluppo di funghi o alla contaminazione naturale con funghi entomopatogeni63.

Uno dei principali svantaggi della raccolta di regine o colonie nelle fasi iniziali (Figura 6 e Figura 7) è la difficoltà nell'identificazione tassonomica, in quanto può essere fatta più facilmente attraverso le grandi operaie12 che emergono solo dopo pochi mesi, quando c'è più risorsa per l'alimentazione larvale. Alcuni passaggi critici in questa tecnica sono associati alla promozione della crescita del giardino dei funghi, mantenendo puliti i nidi ed evitando possibili fughe. Alcune azioni includono la frequente aggiunta di materiale vegetale fresco, che viene costantemente incorporato nel fungo dai lavoratori. Il fungo è usato come fonte di glucosio e amido per i lavoratori e come proteina per le larve64. La rimozione di materiali vecchi e smaltiti e il mantenimento pulito dei nidi prevengono la comparsa di possibili microrganismi dannosi. Per evitare fughe, i collegamenti dei tubi dovrebbero sempre essere controllati e, nel caso di arene aperte, mantenere lo strato di politetrafluoroetilene. Il vantaggio di mantenere le colonie nelle configurazioni dei nidi descritte per simulare la struttura reale trovata in natura, con camere specifiche per il foraggiamento e lo scarto, e una colonia con l'organizzazione sociale completa (cioè regina, operaie e prole). La ricerca condotta con colonie senza regina63,65 indica che le operaie mostrano comportamenti distinti a causa dell'assenza della regina. Studi comportamentali hanno concluso che la regina è importante per la coesione della colonia oltre alla funzione riproduttiva66.

L'attuazione dei protocolli qui affrontati può essere applicata ad altre specie di interesse scientifico, come altre formiche che crescono funghi del genere Acromyrmex. Queste formiche tagliafoglie sono anche considerate parassiti agricoli in particolari regioni dell'America e recentemente hanno attirato più interesse nello sviluppo delle colonie in fase iniziale67 e nell'interazione delle esche tossiche68 ricerca mirata. Sebbene questo lavoro sia specificamente indirizzato alle formiche tagliafoglie, il protocollo di manutenzione e i diversi tipi di nidi descritti potrebbero essere applicabili anche ad altri gruppi di formiche. Ogni sezione della procedura delinea le necessità fondamentali che devono essere prese in considerazione quando le si conserva in condizioni controllate, come ad esempio: identificare la dieta più appropriata; offrire cibo a intervalli regolari in una camera di foraggiamento o in un'area specifica; fornire una camera ad alto livello di umidità con base in gesso per mantenere la regina e immaturi; evitare la fuga delle formiche attraverso sostanze di emergenza aggiunte alle strutture dei nidi artificiali; rimuovere i materiali smaltiti dalle formiche dai nidi; e trasferendo le colonie in un altro nido artificiale quando necessario.

Negli ultimi dieci anni, le università e i ricercatori si sono dedicati ad essere più inclusivi, invitando la società a far parte dei laboratori e della loro ricerca69. Abbracciando con grande determinazione lo scopo didattico, i laboratori di formiche sono diventati strumenti per attirare la curiosità delle persone e connettere il mondo accademico con la conoscenza comune. I tipi di nidi presentati in questo lavoro possono essere utilizzati in diverse attività a seconda dell'obiettivo, come l'educazione e le esposizioni. Ad esempio, i nidi aperti (Figura 5) sono da esporre ai visitatori dell'università, mentre i nidi di clausura (Figura 4) sono utili per fiere scientifiche e mostre itineranti, a causa della facilità di trasporto. In tutti i casi, il pubblico in generale può osservare le colonie di formiche, conoscere la biologia di base e fatti divertenti ed essere istigato a fare domande. A un livello più espressivo, attraverso progetti di estensione come "Primeiros Passos na Ciência" (Primi passi nella scienza)69 gli studenti possono effettivamente far parte dei gruppi di ricerca. Di conseguenza, gli studi sulle formiche con scopi educativi avvantaggiano lo sviluppo degli studenti in quanto migliorano l'indagine e le esperienze, incoraggiando al contempo un maggiore interesse per la ricerca scientifica.

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Disclosures

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

Acknowledgments

Dedicato a Mario Autuori (in memoriam) e Walter Hugo de Andrade Cunha che hanno contribuito notevolmente agli studi sulle formiche tagliafoglie. Riconosciamo il sostegno dell'Università Statale di San Paolo e dell'Istituto di Bioscienze. Questo studio è stato in parte finanziato dal Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior-Brasil (CAPES) - Codice finanziario 001, Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) e Fundação para o Desenvolvimento da UNESP (Fundunesp).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Entomologic forceps N/A N/A N/A
Glass tank N/A N/A Tempered glass, custom made
Hose N/A N/A Transparent, PVC 1/2 Inch x 2,0 mm
Latex gloves Descarpack 550301 N/A
Nitrile gloves Descarpack 433301 N/A
Open arena N/A N/A Polypropylene crate
Plaster pouder N/A N/A Plaster pouder used in construction, must be absorbant
Plastic Containers for collection Prafesta Natural Cód.: 8231/Natural Cód.: 8262 Lidded, transparent , polypropylene
Plastic containers for nests Prafesta Discontinued Polystyrene, hermetic
Teflon Dupont N/A Polytetrafluoroethylene liquid (PTFE Dispertion 30)

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References

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  3. Christianini, A. V., Oliveira, P. S. Birds and ants provide complementary seed dispersal in a neotropical savanna. Journal of Ecology. 98 (3), 573-582 (2010).
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Biologia Numero 186
Raccolta e mantenimento a lungo termine delle formiche tagliafoglie (<em>Atta</em>) in condizioni di laboratorio
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Nogueira, B. R., de Oliveira, A. A., … More

Nogueira, B. R., de Oliveira, A. A., da Silva, J. P., Bueno, O. C. Collection and Long-Term Maintenance of Leaf-Cutting Ants (Atta) in Laboratory Conditions. J. Vis. Exp. (186), e64154, doi:10.3791/64154 (2022).

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