Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Insamling och långsiktigt underhåll av bladskärande myror (Atta) under laboratorieförhållanden

Published: August 30, 2022 doi: 10.3791/64154
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Institute of Biosciences, Department of General and Applied Biology, Laboratory of Leaf-cutting Ants, São Paulo State University, 2Institute of Psychology, Laboratory Walter Hugo Cunha, São Paulo University

Summary

Här beskrivs ett protokoll för att framgångsrikt samla in och upprätthålla friska Atta (Hymenoptera: Formicidae) myrkolonier under laboratorieförhållanden. Dessutom beskrivs olika nesttyper och konfigurationer tillsammans med möjliga experimentella procedurer.

Abstract

Myror är en av de mest biologiska mångfaldsgrupperna av djur på planeten och bor i olika miljöer. Underhållet av myrkolonier i kontrollerade miljöer möjliggör en berikad förståelse av deras biologi som kan bidra till tillämpad forskning. Denna praxis används vanligtvis i populationskontrollstudier av arter som orsakar ekonomisk förlust, såsom Atta-myror . För att odla sin mutualistiska svamp samlar dessa bladskärande myror löv och för detta betraktas som jordbruksskadedjur som är utbredda över hela den amerikanska kontinenten. De är mycket socialt organiserade och bor i utarbetade underjordiska bon som består av en mängd olika kamrar. Deras underhåll i en kontrollerad miljö beror på en daglig rutin med flera procedurer och frekvent vård som beskrivs här. Det börjar med samlingen av drottningar under reproduktionssäsongen (dvs bröllopsflygning), som sedan överförs individuellt till plastbehållare. På grund av den höga dödligheten hos drottningar kan en andra samling utföras cirka 6 månader efter bröllopsflygningen, när begynnande bon med utvecklad svampvadd grävs ut, handplockas och placeras i plastbehållare. I laboratoriet tillhandahålls löv dagligen till etablerade kolonier, och myrproducerat avfall avlägsnas varje vecka tillsammans med återstående torrt växtmaterial. När svampträdgården fortsätter att växa överförs kolonier till olika typer av behållare enligt experimentsyftet. Bladskärande myrkolonier placeras i sammankopplade behållare, som representerar organisationssystemet med funktionella kamrar byggda av dessa insekter i naturen. Denna inställning är idealisk för att övervaka faktorer som avfallsmängd, svampträdgårdshälsa och arbetarnas och drottningens beteende. Underlättad datainsamling och mer detaljerade observationer anses vara den största fördelen med att hålla myrkolonier under kontrollerade förhållanden.

Introduction

Myror utgör en mångsidig grupp individer som påverkar de flesta markmiljöer1. De fungerar som effektiva spridare 2,3,4, rovdjur5 och ekosystemingenjörer 6,7,8,9,10, vilket belyser deras betydelse och ekologiska framgång på naturliga ekosystem. Alla myrarter klassificeras som eusociala insekter; deras sociala organisation varierar dock mycket mellan olika artgrupper, dvs. arbetsdelningssystem, funktionella grupper, kommunikation mellan individer, foderorganisation, kolonifundament och reproduktionsprocess11. Som en mycket diversifierad grupp tillgriper de flera matresurser och specialiserade utfodringsbeteenden. Faktum är att jordbruket inte bara var ett stort steg för den mänskliga civilisationen utan också för myrarter. Cirka 55 till 65 Ma sedan12 började attinmyror odla svampar och införliva dem i en nästan exklusiv diet. De blev så specialiserade att de utvecklade strikta, beroende och obligatoriska interaktioner klassificerade som symbios, där en individ inte överlever utan den andra.

Lägre svampväxande myror samlar och bearbetar dött organiskt material, såsom fragment av ruttnande blad, för att odla sin mutualistiska svamp; medan högre svampväxande myror skördar färskt växtmaterial och komponerar ett av de mest framgångsrika symbiotiska naturliga systemen13. Denna högspecialiserade jordbruksteknik gjorde det möjligt för dem att gripa en ny nisch. De högre attinmyrorna består av bladskärande myror, en monofyletisk grupp som väcker mellan 19 Ma (15-24 Ma) och 18 Ma (14-22 Ma)14,15,16 bestående av fyra giltiga släkten: Atta Fabricius, Acromyrmex Mayr, Amoimyrmex Cristiano och Pseudoatta Gallardo. Bladskärarjordbrukssystemet som utfördes av bladskärande myror, utvecklades från härledda jordbrukssystem17. De flesta av dessa arter utnyttjar uteslutande den mutualistiska svamparten Leucoagaricus gongylophorus Singer18 (även kallad Leucocoprinus gongylophorus Heim19), vilket markerar en betydande evolutionär övergång11. Svampsorterna överförs vertikalt, från ursprungliga bon till avkommor, vilket tyder på att de är klonalt förökade20.

Anmärkningsvärt utvecklade Atta-samhällen en komplex organisationsstruktur av enorm betydelse i sin miljö och av stort intresse för myrmekologer. Deras befolkning kan bestå av miljontals individer, de flesta av dem sterila kvinnliga arbetare som uppvisar en accentuerad polymorfism, dvs distinkt storlek och anatomisk morfologi. Befolkningen kännetecknas av kaster beroende på ålder, fysiologiskt tillstånd, morfologisk typ, beteenden och specialiserade aktiviteter i kolonin21. Arbetare kan diskrimineras till trädgårdsmästare och sjuksköterskor, generalister inom boet, födosökare och grävmaskiner och försvarare eller soldater21. Denna organisation möjliggör utförandet av uppgifter i samarbete och ett självorganiserande system som kan producera mycket strukturerade kollektiva beteenden, så att de kan reagera effektivt på miljöstörningar22.

Befolkningsförnyelsens roll spelas av en enda drottning (dvs. monogyn), så länge hon lever, som utgör den permanenta reproduktiva kasten22. Atta drottningar är kända för att leva i mer än 20 år och lägger ägg under hela sin livslängd23. Eftersom drottningen är oersättlig är dess uthållighet avgörande för kolonins överlevnad 13,20,23,24. Ändå kan tusentals bevingade reproduktiva honor och män hittas i boet under häckningssäsonger, men ingen stannar i det ursprungliga boet och bildar en tillfällig kast22. I Atta sexdens kolonier produceras nästan 3 000 reproduktiva honor och 14 000 reproduktiva hanar25. Det inträffar när en koloni når sexuell mognad, cirka 38 månader från dess genomförande, och upprepas årligen sedan dess tills den släcks23,25. Nya Attakolonier etableras genom haplometros, där en drottning påbörjar ett nytt bo.

När miljöförhållandena är gynnsamma lämnar reproducenterna det underjordiska boet för att börja bröllopsflygningen. Perioden för dess förekomst skiljer sig från region, som sträcker sig längs året över hela det brasilianska territoriet beroende på arten. Händelsen verkar dock föregås av regn och fukthöjning26, vilket kan relateras till utgrävningsunderlättande på grund av markfuktighet22. Ofta, 1-5 veckor före bröllopsflygningen, breddas boingångar och kanaler för att underlätta för de reproduktiva individerna att avgå. Innan de lämnar sina moderkolonier samlar de bevingade kvinnorna och lagrar, i ett infrabuccalt hålrum, en del av den mutualistiska svampen20,27. Flera kopulationer utförs mitt i flygningen, och det beräknas att en drottning kan insemineras av tre till åtta män (dvs. polyandri) hos vissa arter28, vilket säkerställer genetisk variation29. Därefter fortsätter drottningarna till jorden och föredrar platser med ingen eller få vegetation25, där de tar bort sina vingar och gräver ut sin första bokammare. Detta är den enda perioden där drottningar kan ses utanför boet. Även om individer i den tillfälliga kasten sågs i konstgjorda bon, är det okänt om någon framgångsrik kopulation (dvs. bröllopsflygning) utfördes under laboratorieförhållanden24.

Den ursprungliga bokonstruktionen motsvarar kolonins mest avgörande period, som kan variera från 6 h till 8 h23,25. För närvarande kloster drottningen sig i den första kammaren, och om några dagar börjar ovipositionen. De första äggen matas till mycelialen som drottningen regurgitates, vilket markerar början på kolonins svampträdgård. De första larverna uppträder på cirka 25 dagar22, och nästan i slutet av den första månaden består kolonin av en matta av prolifererande svamp, där omogna (ägg, larver och puppar) är kapslade och drottningen, som höjer sin första avkomma isolerat23. Ägg är också matresursen för de första larverna och konsumeras mycket av drottningen13. Dessutom försörjer sig drottningen med fettkroppsreserver och kataboliserande vingmuskler som inte längre är till nytta13. Den ursprungliga svampkulturen konsumeras inte eftersom koloniöverlevnaden beror på dess utveckling, och under denna period befruktar drottningen den med fekalvätska13. Dagar efter uppkomsten öppnar de första arbetarna boets ingång och börjar en födosöksaktivitet i boets närområde13. De införlivar materialet som samlats in som substrat för svampträdgården, som nu fungerar som mat för arbetarna13,22. Innan det läggs till svampkulturen skärs växtmaterialet som bärs in av arbetarna i små bitar och fuktas med fekalvätska13. Myrorna manipulerar svampinokulum för att öka och kontrollera dess tillväxt, vilket kommer att tjäna till att dela upp stora jordgrävda kamrar, specialiserade på konditionering av trädgården 13,22,25.

Cirka 6 månader efter bröllopsflygningen innehåller A. sexdens bon en svampkammare och några kanaler. Den stora specialiseringen i byggandet av bladskärande myrbon fungerar som en försvarsmekanism mot naturliga fiender och ogynnsamma miljöfaktorer22. Bladskärande myror är kända för att fragmentera svampträdgården och överföra den till kamrar med hög luftfuktighet när kamrarna börjar torka ut13. Således, trots att utgrävningen av boet har en betydande energikostnad, är den investerade energin omvänd i fördelar för kolonin själv22. Med några få undantag gör Atta-arter också specialiserade kamrar för kolonins avfall, mestadels gjorda av utarmat svampsubstrat och kroppar av döda myror, isolerar det från resten av boet och upprättar en viktig social immunitetsstrategi30. Dessutom manipulerar en distinkt grupp arbetare avfallet direkt för att undvika kontaminering av andra individer. Arbetare födosöker ständigt för att vårda svampen, som är kolonins huvudsakliga näringsresurs. De kan dock också mata på växtsaft när de skär fragment. Växtmaterialet är noga utvalt för svampträdgårdens skötsel och påverkas av många faktorer som bladegenskaper och ekosystemets egenskaper13.

Födosöksstrategin för bladskärande myror för att få färskt material är mycket komplex och i kombination med den höga skördeefterfrågan hos etablerade kolonier resulterar det i betydande ekonomiska förluster för jordbruksproducenter och äventyrar skogsrestaureringsområden22,31. Därför kan dessa myror kategoriseras som skadedjur i de flesta områden där de kan påträffas, allt från södra USA till nordöstra Argentina 11,13,22,32. Släckningen av problematiska kolonier är utmanande på grund av den serie anpassningar som är inneboende i dessa insekters biologi (dvs. social organisation, födosök, svampodling, hygien och komplexa bostrukturer)33. Populationsbekämpningsstrategierna skiljer sig därför från dem som vanligtvis tillämpas på andra skadeinsekter och tillgriper främst attraktiva förorenade beteserbjudanden33,34. Men eftersom dessa myror kan avvisa skadliga ämnen för både svampen och koloniindividerna och kompromissa med odlade fält 33, testas ständigt nya naturliga föreningar och kontrollalternativ33,35,36. Eftersom experimentresultat knappast kan övervakas på fälttestade kolonier utförs preliminära uppsatser i en kontrollerad miljö.

Således måste experimentella protokoll anpassas till intressegrupper med tanke på myrornas heterogena livsstil, stödja studier på artnivå och redovisa kolonier som operativa enheter, där en myra är ett element i en komplex superorganism11. De rapporter som hittills samlats in om Atta -släktet gjorde det möjligt att framgångsrikt samla in och underhålla kolonier under laboratorieförhållanden och erkänna deras grundläggande behov och allmänna funktion. Baserat på deras naturliga processer som reproduktion, kolonigrundande och utfodringsbeteenden har en rutin av metoder utvecklats som möjliggör långsiktig etablering av kolonier i olika typer av bon. Här beskrivs ett procedurprotokoll för att upprätthålla bladskärande myror i laboratoriet och belyser möjlig allmän forskning med distinkta experimentändamål och vetenskaplig uppsökande verksamhet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Samling av drottningar

  1. Sök i litteraturen för perioden av Atta reproduktionssäsong i regionen av intresse. Förekomsten av reproduktionssäsong, frekvensen och dagtid för bröllopsflygningar varierar beroende på regionala klimatförhållanden (tabell 1). Även om det vanligtvis äger rum på våren, måste denna information samlas in för den plats där samlingen är avsedd att ske 37,38,39,40,41,42,43,44,45,46.
  2. Identifiera och markera platser med Atta bon betraktas som möjliga områden för att samla drottningar och unga kolonier. Under bröllopsflygningar sprids drottningar runt boplatser; Därför har områden med ett större antal kolonier större chanser att ha drottninglandningsplatser där de initierar nya boutgrävningar.
  3. Kontrollera de områden som valts tidigare för tecken på bröllopsflygning under attamyrornas reproduktionssäsong. Håll koll på miljöförhållandena under bröllopsdagar, till exempel varmt och regnväder.
  4. Identifiera bladskärande myrbon i de områden som valts tidigare och leta efter externa funktioner som indikerar den kommande avgången av bevingade reproduktiva myror. Nest-funktioner inkluderar tunnelingångar breddade (figur 1), ökat flöde av arbetare som visar mer aggressivt beteende mot möjliga rovdjur och bevingade reproduktiva myror som uppträder vid tunnelingångar (figur 1). Se upp för dagar med hög luftfuktighet som efterträder nederbörd, eftersom de i allmänhet föregår bröllopsflygningar.
  5. Förbered plastlockbehållare med ett bottengipsskikt för att behålla drottningarna individuellt. Se till att behållarens volym är cirka 200 ml och att gipsskiktet längst ner är cirka 1 cm högt och är mycket absorberande för fuktkontroll.
    OBS: För att förbereda gipsbasen, följ tillverkarens instruktioner.
  6. Förbered en miljö med en konstant temperatur på 23 ± 1 °C och cirka 70 % ± 10 % av den relativa luftfuktigheten. Välj en plats utan intensiva aktiviteter och högt flöde av människor för att undvika vibrationer och störningar. Använd rengöringsprodukter med neutral doft för att förhindra störningar i myrbeteende.
    OBS: Fluktuationer i specificerade miljöförhållanden kan orsaka vattenkondens eller fuktförlust och äventyra svampträdgården.
  7. Efter bröllopsflygningen, samla vinglösa drottningar som har initierat boutgrävning och placera dem försiktigt i plastbehållarna förberedda med ett gipsskikt, individuellt. Undvik att röra drottningarna med bara händer och använd latexhandskar eller entomologisk pincett.
    OBS: Vingavlägsnande och markutgrävningsbeteende indikerar reproduktiva kvinnor som redan har kopulerat och därför kan starta en ny koloni. Queens samling behandlas också som den första samlingen i detta verk.
  8. Flytta behållarna med drottningarna till platsen med en kontrollerad miljö som tidigare valts. Utför drottningarnas transport med största försiktighet, undvik för mycket störningar och håll en lägsta temperaturbeständighet.
  9. Manipulera eller flytta inte drottningarna i cirka 3 dagar efter insamling för att undvika stress.

Figure 1
Figur 1. Nestingången breddades med bevingade myrreproducerare och arbetare. Breddade tunnelingångar är en av boets funktioner som indikerar atta bröllopsflygningar förekomst.  Klicka här för att se en större version av denna siffra.

2. Queens underhåll

  1. Tillsätt initialt 2,5 ml vatten till mottagarens gipsskikt var 2: e dag med hjälp av en nålspruta.
    1. Istället för att öppna mottagaren, punktera försiktigt behållarlocken med nålen för att undvika störningar på grund av manipulation. Samma hål kan användas under denna period. Se till att det tillsatta vattnet inte suger gipsskiktet. Undvik att direkt vattna drottningen, den ursprungliga svampsvampen och eventuella omogenheter. Så länge svampträdgården uppvisar en torr aspekt med vattenfrånvaro, bevattna gipsskiktet.
  2. Två veckor efter insamlingen, kontrollera om svampen har regurgitated av drottningarna. Om det inte finns någon svamp, överför cirka 2 g svamp erhållen från en etablerad koloni. Utför också detta steg om svampen inte utvecklas.
    OBS: För svampöverföring är det nödvändigt att samla frisk svamp från en etablerad koloni och ta bort alla myror som kan finnas på den. Använd en matsked, entomologisk pincett och latexhandskar för att manipulera svampen.
  3. Efter utseendet av de första arbetarna, börja erbjuda fragment av unga och tunna löv regelbundet, enligt kolonins snittaktivitet. Se till att de erbjudna bladen är friska och att växterna inte har behandlats med insekticider eller andra kemiska ämnen. I ett tidigt skede, se till att bladfragmenten inte är över 4 cm.
    OBS: När de första arbetarna påbörjar bladföda måste växtmaterial erbjudas efter deras utseende. Erbjudandefrekvensen beror på den smidighet med vilken arbetarna införlivar växtmaterialet på svampen men kan sträcka sig till 2-3 dagar i veckan. Havreflingor och majsflingor kan också erbjudas men bör alterneras med löv för att undvika svamptorrhet.
  4. När du erbjuder nya löv, ta bort koloniavfall och torra bladfragment. Undvik användning av parfymer, fuktgivare, krämer eller något ämne med stark lukt när du manipulerar drottningarna. Använd dessutom latexhandskar under alla processer.
  5. Följ kolonins utveckling, och när svampträdgården når minst hälften av behållarvolymen, överför kolonin till ett konstgjort varaktigt bo.
    OBS: Eftersom utvecklingstakten är inneboende för varje koloni finns det ingen beräknad tid för koloniöverföring. Vanligtvis överförs kolonier från den första samlingen till bon med svampträdgårdskammare på maximalt 1L volym på grund av den lilla svampträdgården.

3. Samling av unga kolonier

  1. Skaffa plastbehållare med en volym på cirka 500 ml.
  2. Cirka 6 månader efter bröllopsflygningen, identifiera indikativa tornformade högar med granulerade jordpartiklar (figur 1) av begynnande Atta-bon (figur 2) på platserna med bladskärande myror som tidigare markerats.
    OBS: Sex månader efter bröllopsflygningen beräknas de unga koloniernas bon vara upp till 1 m djupa i jorden. En ny samling indikeras vid denna period för att uppnå högre chanser till framgångsrika och varaktiga kolonier i stora mängder.
  3. Med en trädgårdshacka gräver du ut boingången tills du når kammaren som håller den unga kolonin. Samla drottningen, svampträdgården, omogna och unga arbetare och placera dem i plastbehållaren. Utför insamlingsprocessen så försiktigt som möjligt.
    OBS: Naturligtvis kommer en stor mängd jord också att samlas in och bör tas bort gradvis i framtida underhållsprocedurer i laboratoriet.
  4. Flytta plastlocksbehållarna som håller kolonierna till den utsedda kontrollerade miljön. Utför transport av unga kolonier med yttersta försiktighet, undvik för mycket störningar och upprätthålla en lägsta temperaturbeständighet. Avstå från att manipulera eller flytta kolonierna i cirka 3 dagar för att undvika stress. Om rummet har en aktiv rutin kan en mörk trasa läggas över kolonierna.

Figure 2
Figur 2. Tornformad jordhög. Den karakteristiska tornformade högen indikerar närvaron av begynnande kolonier av Atta sexdens och Atta laevigata. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

4. Underhåll av unga kolonier

  1. Ge tunna unga löv 3 gånger i veckan.
    1. Se till att bladen som erbjuds är friska och att växterna inte har behandlats med insekticider eller andra kemiska ämnen. Se till att bladfragmenten i detta skede är minst 7 cm långa.
      OBS: Havreflingor och majsflingor kan också erbjudas men bör alterneras med löv för att undvika svamptorrhet.
    2. Erbjudandefrekvensen beror på den smidighet med vilken arbetarna införlivar växtmaterialet på svampen. Eftersom snittaktiviteten är intensiv, öka erbjudandet två gånger om dagen tre gånger i veckan eller 5 dagar i veckan.
  2. När du erbjuder nya löv, ta bort koloniavfall, inklusive jordrester, med hjälp av en sked. Använd latexhandskar under alla processer. När du manipulerar de unga kolonierna undviker du att använda parfymer, fuktgivare, krämer eller något ämne med stark lukt.
    OBS: Arbetarna själva kommer att separera jorden och avfallet från svampen.
  3. Följ kolonins utveckling, och när svampträdgården når minst hälften av behållarvolymen, överför kolonin till ett konstgjort varaktigt bo.
    OBS: Eftersom utvecklingstakten är inneboende för varje koloni finns det ingen beräknad tid för koloniöverföring.

Figure 3
Figur 3: Typer av konstgjorda bon för att hålla Atta sexdens och Atta laevigata kolonier. Illustration av perdurable konstgjorda bon av bladskärande myror: kloster vertikal bouppsättning, kloster horisontell boinställning och öppen arena boet setup. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

5. Perdurable konstgjorda bon

  1. Förbered en lodrät boinställning enligt beskrivningen nedan (bild 3 och bild 4).
    OBS: Klosterbokonfigurationer bör alltid ha olika mottagare för att separat utgöra som (1) svampträdgårdskammare, (2) avfallshanteringskammare och (3) födosökskammare. Ursprungligen bör det börja med tre behållare, men fler mottagare kan läggas till för att öka svampträdgården. Boet kan variera i storlek och material beroende på deras experimentella syfte, men här beskrivs och rekommenderas användning av genomskinliga material. Behållarna måste vara utan öppningar, annars kommer myrorna att fly. Den typ av bo som beskrivs nedan kan användas för allmän forskning, men det rekommenderas inte väl för assertiv myrsamling på grund av den störning som orsakas vid borttagning av locket, vilket resulterar i stor agitation bland individerna. På grund av materialets transparens är det dock möjligt att lokalisera drottningen och olika myrkaster även när svampträdgården har fyllt hela behållaren. Eftersom det är en tendens antas det alltid att omoget är i mitten av svampträdgården när den har upptagit det mesta av det tillgängliga utrymmet i vertikala behållare.
    1. Välj en transparent lockbehållare på cirka 1 L och lägg till ett 1 cm lager av mycket absorberande gipsbas. Detta kommer att vara svampens trädgårdskammare. Välj två genomskinliga behållare med lock på cirka 500 ml vardera för att vara avfallshanterings- och födosökskammare. Myrorna kommer att välja vilken kammare som ska vara var och en, och därefter se till att de inte byts ut.
      OBS: För att förbereda gipsbasen, följ tillverkarens instruktioner.
    2. Perforera och anslut de tre behållarna med ett transparent rör eller en slang. Applicera vid behov maskeringstejp på rörgränsen för att garantera en låranslutning med behållarna och undvika att myror flyr. Placera gipsbasbehållaren i mitten och de andra behållarna på motsatta sidor.
    3. Överför försiktigt svampsvampen från utvalda kolonier (se steg 2.5 och steg 4.3) tillsammans med drottningen, arbetarna och omogenheterna till gipsbasbehållaren. Innan överföringen, se till att gipsbasen vattnas. Använd latexhandskar.
  2. Förbered en vågrät uppsättning med ett klisterkors enligt beskrivningen nedan (bild 3 och bild 4).
    OBS: Bon med horisontell konfiguration möjliggör noggrann observation av svampträdgården och arbetarnas aktiviteter mot den. Eftersom yngre delar av svampträdgården ligger högst upp är det möjligt att observera nyligen erbjudna substrat som införlivas av arbetarna. Nya delar av svampen kan upptäckas av dess färg, som kommer att likna färgen på den senaste resursen som erbjuds, medan de äldre delarna vanligtvis har en beige färg. Avkommor och drottningen kan också lätt placeras, som i horisontella behållare är de vanligtvis högst upp i svampträdgården, även när den har ockuperat det mesta av utrymmet. Denna konfiguration kan användas för beteendefokuserad forskning, fokusprovtagning och vetenskaplig uppsökande ändamål, eftersom den ger uppfattning om organisationen inuti boet.
    1. Skaffa en transparent lockbehållare med cirka 31 cm x 21 cm x 4,5 cm dimensioner och lägg till ett 1 cm lager av mycket absorberande gipsbas. Detta kommer att vara svampens trädgårdskammare. Välj två genomskinliga behållare med lock på cirka 500 ml vardera för att vara avfallshanterings- och födosökskammare. Myrorna kommer att välja vilken kammare som ska vara var och en, och därefter se till att de inte byts ut.
      OBS: För att förbereda gipsbasen, följ tillverkarens instruktioner. Stäng vid behov det lilla utrymmet mellan locket och behållaren med maskeringstejp för att förhindra att myrorna flyr.
    2. Perforera och anslut behållarna med ett transparent rör eller en slang. Applicera vid behov maskeringstejp på rörgränsen för att garantera en låranslutning med behållarna och undvika att myror flyr. Placera gipsbasbehållaren i mitten och de andra behållarna på motsatta sidor.
    3. Överför försiktigt svampsvampen från utvalda kolonier (se steg 2.5 och steg 4.3) tillsammans med drottningen, arbetarna och omogenheterna till gipsbasbehållaren. Innan överföringen, se till att gipsbasen vattnas. Använd latexhandskar.
  3. Förbered en uppställning av ett öppet arenabo enligt beskrivningen nedan (bild 3 och bild 5).
    OBS: Öppna arenabon möjliggör insamling av myror utan större störningar och födosöksbeteendeanalys. De kan också ge en tillförlitlig representation av en koloni som finns i naturen för vetenskapliga uppsökande ändamål.
    1. Välj en transparent lockbehållare på cirka 1 L och lägg till ett 1 cm lager av mycket absorberande gipsskiktsbas. Detta kommer att vara svampens trädgårdskammare.
      OBS: Det rekommenderas att börja med 1 L behållare och gradvis vidarebefordra till behållare med högre volymer för en större svampträdgård. Behållarna bör emellertid inte övervinna en 5 L volym. Lägg till så många behållare som behövs.
    2. Välj en öppen arena. Storleken på arenan kan variera beroende på studieändamål. Om en stor arena väljs, placera behållarna som håller svampträdgården i sitt inre (figur 5). Vid en liten arena, anslut den till svampträdgårdsbehållaren med en transparent slang eller rör (figur 3). Arenan kommer att fungera som en födosöks- och avfallshanteringskammare, så se till att den inte är för liten.
    3. Applicera ett lager polytetrafluoretylenvätska i en enda rörelse på arenagränsen för att innehålla myrorna. Använd en bomull blöt med vätskan och en nitrilhandske.
      VARNING: Undvik inandning och hudberöring när du använder polytetrafluoretylenvätska.
    4. Överför försiktigt svampsvampen från utvalda kolonier (se steg 2.5 och steg 4.3) tillsammans med drottningen, arbetarna och omogenheterna till gipsbasbehållaren. Innan överföringen, se till att gipsbasen vattnas. Använd latexhandskar.

Figure 4
Figur 4: Konstgjorda klosterbon av bladskärande myror Atta sexdens och Atta laevigata. Lodrät boinställning topp (A) och sidovy (B); infälld vågrät boinställning topp (C) och sidovy (D). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: Konstgjort öppet arenabo av bladskärande myror Atta sexdens och Atta laevigata. Öppen arenabouppsättning av Atta sexdens topp (A) och sidovy (B). 1) Svamp trädgårdskammare; 2) Avfall; 3) Orange skivor; 4) Glas med polytetrafluoretylen (PTFE) skikt. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

6. Underhåll av utvecklade kolonier

  1. Dagligen erbjuder minst ett stort blad in i födosökskammaren per koloni med 1 liter svampträdgård. Om myrans snittaktivitet är intensiv, öka antalet blad. Om svampen är torr, fukta bladen för att ge extra fuktighet. I klosterbon, utför erbjudandet snabbt för att undvika att myrorna flyr från födosökskammaren.
    OBS: Här samlas blad från växtarter som mullbär (Morus nigra), mango (Mangifera indica), eukalyptus (Eucalyptus sp.), jambolan (Syzygium cumini), hibiskus (Hibiscus sp.), akalypha (Acalypha wilkesiana) och ligustrum (Ligustrum lucidum).
    1. Erbjud frukter som apelsin och äpple och havre- och majsflingor för att diversifiera och komplettera kosten. Till stora kolonier med intensiv födosöksaktivitet, erbjuda havreflingor och majsflingor dagligen och frukt en gång i veckan. Om det inte är fallet, erbjuda flingor växelvis med löv, men inte mer än tre gånger i veckan och frukter en eller två gånger i månaden. Justera mängden och frekvensen för varje mat enligt myrans födosöksaktivitet.
    2. Om alternativen som beskrivs ovan inte är tillgängliga, identifiera myrornas födosökspreferens bland löv, blommor och frukter av regionala träd och buskar, eller till och med kommersialiserade grönsaker, korn och andra flingor. Undvik att erbjuda resurser med defensiva kemiska föreningar och bekämpningsmedel.
  2. Ta bort allt innehåll i avfallskammaren var 2: e vecka från alla kolonier. Ta bort arbetare också för befolkningskontrolländamål. Om arbetarna överför hälsosam svamp till avfallskammaren, se till att drottningen inte är på den och ta bort den. Om mängden avfall som bortskaffas är hög eller det är för fuktigt, ta bort det en gång i veckan.
  3. Ta bort materialet som inte tagits av myrorna från foderkammaren när du erbjuder nya och se till att det alltid är rent.
    1. Om arbetarna överför frisk svamp till födosökskammaren, stör den, lämna behållarlocket öppet och applicera neutralt talkpulver på kammarens marginalyta. Utför denna procedur endast om det fortfarande finns lite utrymme på svampkammaren, på så sätt kommer arbetarna att överföra svampen tillbaka till behållaren utan att förlora den eller några omogenheter.
  4. Om mer svampträdgård önskas, lägg till en annan plasterad behållare och flytta en del av svampsvampen in i den. Tills svampen når hälften av behållaren, lägg till löv i svampkammaren. Tillväxten av svampträdgården bör ske gradvis för att inte äventyra kolonibalansen. Om en större behållare önskas, se till att låta svampen uppta hela utrymmet i de minsta behållarna innan du överför den. Koloniavfall och torra löv bör inte tillåtas ackumuleras i svampens trädgårdskammare.
  5. Kontrollera gipsbasen från behållarna, som med tiden kan den få en mörkbrun färg och bli ineffektiv på grund av myrutsöndring, transport av avfallsmaterial och hög luftfuktighet. Vissa kolonier kan också skära skiktet och kassera det. I dessa fall överför svampträdgården till en ny plasterad behållare.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Ett flödesschema som visar processen för myruppsamling visas i figur 6. Här visas några resultat som erhållits med hjälp av protokollet för insamling, underhåll och nestinställningar som beskrivs ovan.

Figure 6
Figur 6: Flödesschema för insamling av bladskärande myrors kolonier. Efter protokollet sker den första insamlingen direkt efter bröllopsflygningen. Drottningarna som har tagit bort sina vingar samlas in och läggs i en liten behållare med en gipsbas. Efter 6 månader av bröllopsflygningen sker den andra samlingen. Drottningar som grävde ut jorden och framgångsrikt började kolonifundamentet samlas in. När kolonierna har utvecklats överförs de till större behållare och eventuellt till olika boinställningar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Påverkan av reproduktiv status i immunsvaret hos bladskärande myrdrottningar
Drottningar av olika arter av myror har en lång livslängd och är därför mer benägna att utsättas för samma patogen mer änen gång 47. Genom att initiera en ny koloni isoleras Atta-drottningar och en avvägning mellan reproduktion och immunitet kan minska investeringarna i immunförsvaret hos dessa grundande myror. Därför kan deras resistens mot patogener relateras till deras reproduktionsstatus47,48. Genom att samla drottningar i olika ögonblick av deras tidiga livscykel och införa en nylontråd i individernas gaster (figur 7) var det möjligt att utvärdera individuellt inkapslingssvar på patogener och jämföra immunresistensen mellan jungfrudrottningar, nyligen parade drottningar och drottningar som parade sig för 6 månader sedan i individernas gaster.

Figure 7
Figur 7: Inkapslingssvarsuppsats. Experimentupplägg som syftade till att utvärdera individuellt immunsvar av inkapslingsvariation enligt reproduktionsstatusen för Atta sexdens och Atta laevigata queens. Jungfrudrottningar, nyparade drottningar och drottningar som har parat sig för 6 månader sedan fick nylonfilamentinsättningar mellan den 4: e och 5: e tergiten i gaster för att fungera som ett antigen. Nylonfilamenten togs bort efter 24 timmar och fotograferades för att färga omslagskvantifieringen. Drottningarna samlades in före bröllopsflygningen, direkt efter bröllopsflygningen och 6 månader efter bröllopsflygningen, enligt stegen från ämnena 1, 2 och 3 i det beskrivna protokollet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

När de omogna honorna endast uppträder i bröllopsflyghändelser, är studien av dessa individer vid denna reproduktionsstatus beroende av den specifika kunskapen för att förutsäga förekomsten av det specifika fenomenet och att känna till myrsamlings- och underhållsprotokoll. För att garantera att reproducerarna ännu inte hade kopulerat samlades individerna direkt från bohålen som fick sina poster vidgade för att dessa myror skulle lämna (figur 1). Eftersom identifieringen av reproducerare på artnivå är besvärlig samlades arbetare från samma koloni in för validering. När det gäller parade individer samlades kvinnor som fick sina vingar borttagna och började gräva jorden direkt efter bröllopsflygningen, förutsatt att de redan hade kopulerat. För båda reproduktionsstadierna samlades ett stort antal honor för att säkerställa mängden individer som testades, eftersom dödligheten just nu är signifikant. När de parade myrorna hade spridit sig från den ursprungliga kolonin identifierades arter genom jämförelse av kutikulär kolväteprofil49. Drottningar parade i 6 månader sedan bröllopsflygningen har redan initierat sina kolonier, som vid denna tidpunkt består av en liten svampträdgård, flera arbetare och omogenheter. Dessa tidiga livskolonier upptäcktes av den distinkta tornformade jordhögen (figur 2). Insamlingen ägde rum enligt de steg som beskrivits tidigare i avsnitt 3 "Samling av unga kolonier". För att studera kvinnliga reproducerare i detta skede var det nödvändigt att behålla den unga kolonin, eftersom drottningen ensam snart skulle förgås. Identifieringen gjordes med hjälp av koloniernas arbetare. Cirka 200 drottningar samlades totalt med hjälp av de protokoll som tidigare beskrivits.

Efter varje samling vägdes drottningarna, mättes och fick snart nylonfilamentinsättningarna, som togs bort 24 timmar senare för analys av färgomslag. För Atta laevigata -arter visade drottningar som parade sig för 6 månader sedan det mörkaste nylonfilamentet, alltså den högre inkapslingshastigheten och effektivare immunförsvar (figur 8). Nyligen parade drottningar samlades dock strax efter bröllopsflygningen, och jungfrudrottningar som samlades in före bröllopsflygningen delade ungefär samma inkapslingshastighet (figur 8). Således verifierades att inkapslingscellförsvaret i Atta laevigata-myror kan variera med reproduktionsstatusen och tiden som gått efter parningen, men det förändras inte med vikt och huvudlängd. Inledningsvis syftade forskningen till att samla in och jämföra Atta sexdens drottningar också, men det var inte möjligt att samla jungfrudrottningar, eftersom de identifierade bonarna inte hade några reproducerande aktiviteter vid de observerade hålen. Trots svårigheten kan allmänna studier om de cellulära försvarsmekanismerna hos bladskärande myrreproducerare bidra till att klargöra insekternas immunsvar och till förbättringen av nuvarande kontrollmetoder.

Bladskärande myrors preferens framför delprodukter som används i beten
För närvarande är den mest tillämpade befolkningskontrollmetoden för bladskärande myrkolonier genom giftigt bete. I allmänhet är de associerade med en attraktiv vegetabilisk ursprungsförening, med citronmassa som den mest använda. Det är emellertid känt att arbetare på något sätt kan associera betetoxiciteten med den attraktiva föreningen efter tidigare kontakt och avvisa den, vilket gör metoden ineffektiv. Därför föreslås användning av alternativa attraktiva föreningar som sojabönor (100%), sojabönor plus citronmassa (50% / 50%) och cashewnötter plus citrusmassa (50% / 50%) för en möjlig rotation mellan beten. Dessa föreningar valdes ut efter preferensexperiment med Atta sexdens och Atta laevigata kolonier. Bosna fästes med glasarenor och insekticidfria beten med olika kompositioner erbjöds (Figur 9).

Figure 8
Figur 8: Inkapslingshastighet för Atta sexdens och Atta laevigata drottningar i olika reproduktionsstadier. Inkapslingsnivåerna utvärderades genom det genomsnittliga gråvärdet från bilder av nylonfilamenten som sattes in i individernas gaster. De mörkaste trådarna ansågs representera ett effektivt cellulärt försvar eftersom det antogs att mer överlappande hemocyter fodrade målet, som visas på X-axeln i figuren. Atta laevigata parade drottningar visade den högsta inkapslingsnivån (ANOVA, Tukey-Kramer, Standard Deviation; p < 0,01; N=29), därav ett effektivt individuellt immunförsvar. Det observerades att de nyligen parade drottningarna och jungfrudrottningarna av samma art uppvisade på samma sätt lägre inkapslingshastigheter och följaktligen ett mindre effektivt individuellt immunförsvar. De erhållna resultaten tyder på att parnings- och boetableringshändelser påverkar cellulära immunsvar hos Atta laevigata -drottningar. Atta sexdens queens visade motsatta resultat, och MQ hade den lägsta inkapslingsnivån (ANOVA, Tukey-Kramer, Standard Deviation, P < 0,01; N = 46). Men eftersom jungfrudrottningar av arten inte kunde samlas in var jämförelsen mellan alla grupper inte möjlig. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 9
Figur 9: Bladskärande myrors preferens för betesunderprodukter. Experimentupplägg som syftade till att utvärdera preferensen hos Atta sexdens och Atta laevigata-arbetare till beten med olika attraktiva delprodukter. En glasarena fästes på svampkammaren för att hålla de olika betena, som separerades av en glasdelare. 5 g av varje bete erbjöds i slumpmässiga positioner, tre åt gången. Beten vägdes efter experimentets slut, som inträffade antingen efter 1 timmes observation eller så snart ett bete helt togs av arbetarna. Preferensen utvärderades av lastaktiviteten, som uppskattades av betesbelastningen som avlägsnades från födosökskammaren. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Totalt användes 32 kolonier med cirka 1 L svampträdgård. Kolonierna samlades tidigare in och upprätthölls med hjälp av de beskrivna protokollen. De mest laddade behandlingarna av A. laevigata var citronmassa, sojabönor plus citronmassa (50%/50%) och cashewnötter plus citronmassa (50%/50%; Figur 10). På samma sätt var A. sexdens-myrornas mest laddade behandlingar citronmassa, sojabönor (100%) och sojabönor plus citronmassa (50%/50%; Figur 10). Resultaten för de två arterna visade att soja- och cashew-delprodukterna var de mest attraktiva efter citronmassa, vilket tyder på att andra beteskompositioner kan användas för kemisk populationskontroll i bladskärande myror.

Figure 10
Figur 10: Attraktiva beten betyder belastningsprocent av Atta laevigata och Atta sexdens arbetare. På samma sätt var citronmassan (100%), sojabönor (100%) och sojabönor plus citronmassa (50% / 50%) behandlingar de mest laddade för båda arterna. Den minst belastade behandlingen för Atta sexdens (cashew plus citronmassa) var dock 60% laddad av Atta laevigata -arbetare. Under hela experimentet utfördes fem repetitioner med fem kolonier av varje art. Betena var olika ordnade inom repetitionerna; Citronmassan var dock alltid närvarande som den positiva kontrollen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Forskning och vetenskaplig samverkan
Cirka 350 drottningar och 100 kolonier samlas årligen för att underhållas i laboratoriet sedan år 1990. Minst tre praktikanter utses för att dagligen ta hand om myrorna, och genom denna tidsram hölls nästan 250 kolonier samtidigt för experimentella och pedagogiska ändamål varje år. Under åren 2016 till 2019 kunde cirka 2 020 elever från cirka 34 skolor besöka Laboratoriet för bladskärande myror (LAFC) och observera myrkolonierna som samlats in och underhållits med hjälp av de protokoll som beskrivits tidigare. Utflykterna hade olika syften, från allmän biologi till socialt beteendeinlärning. Bortsett från den kända betydelsen av insekter som myror, är de komplexa fysiska strukturerna som byggts av dem i naturen, som också observerats i konstgjorda bon, ett exempel på kollektiv ansträngning och arbetsorganisation som har pedagogiskt intresse. För varje utbildningsnivå (figur 11) gavs en annan detaljerad presentation, ibland enligt det tillvägagångssätt som föreslagits av de lärare som ansvarar för eleverna. Två kolonier med den öppna arenabouppsättningen upprätthålls för sådana ändamål, var och en med cirka 66 kamrar med 177 L svampträdgård (figur 5). Tyvärr ställdes utflykterna in under pandemin, men det går att se ett växande intresse bland pedagoger, då antalet elever som besökte uppstod under de senaste 4 åren som rapporterats (figur 12). För att upprätthålla vetenskaplig uppsökande verksamhet under pandemin gjordes dock virtuella besök via videodelningsplattformar. Videon50 som visar hur ett bo av bladskärande myror är inuti, gjord i samarbete med kanalen Manual do Mundo, hade mer än 2,4 miljoner visningar och mer än 3 000 kommentarer på mindre än ett år. Där närmade sig biologin och skapandet av bladskärande myror i laboratoriet.

Figure 11
Diagram 11: Elevernas utbildningsnivåer på utflykter under åren 2016–2019. Antal studenter som var närvarande i utflykter till laboratoriet för bladskärande myror under perioden 2016-2019, beroende på utbildningsnivå. Exkursionerna syftade till olika tillvägagångssätt som involverar bladskärande myrkolonier som upprätthålls i laboratoriet för bladskärande myror. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 12
Diagram 12: Antal studenter på utflykter under åren 2016–2019. Antal studenter som var närvarande vid exkursioner vid Laboratoriet för bladskärande myror under perioden 2016-2019. Det är möjligt att se en ökning av utbildningsorganisationernas intresse för att genomföra utställningar av levande insekter, såsom myror, som möjliggör en nära observation av eleverna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Art Månad och dag År Stad Stat Land Kontinent Breddgrad Longitud Referenser
Atta bisphaerica 4 november 1996 - - Brasilien Sydamerika - - 37
Atta capiguara 6 oktober 2006 Botucatu São Paulo Brasilien Sydamerika 22° 50' 60" S 48° 26' 10" V 38
Atta capiguara 27 oktober 2007 Botucatu São Paulo Brasilien Sydamerika 22° 50' 60" S 48° 26' 10" V 38
Atta capiguara November 2008 Botucatu São Paulo Brasilien Sydamerika 22° 50' 60" S 48° 26' 10" V 39
Atta capiguara November 2009 Botucatu São Paulo Brasilien Sydamerika 22° 50' 60" S 48° 26' 10" V 39
Atta cephalotes Mars till juni - Ilhéus Bahia Brasilien Sydamerika - - 40
Atta cephalotes September - Ilhéus Bahia Brasilien Sydamerika - - 40
Atta colombica Juni 4 1993 - Gamboa Panamá Centralamerika - - 41
Atta colombica Juni 7 1993 - Gamboa Panamá Centralamerika - - 41
Atta colombica - 1998 - Gamboa Panamá Centralamerika - - 42
Atta laevigata 6 oktober 2006 Botucatu São Paulo Brasilien Sydamerika 22° 50' 60" S 48° 26' 10" V 39
Atta laevigata 27 oktober 2007 Botucatu São Paulo Brasilien Sydamerika 22° 50' 60" S 48° 26' 10" V 39
Atta laevigata November 2008 Botucatu São Paulo Brasilien Sydamerika 22° 50' 60" S 48° 26' 10" V 39
Atta laevigata November 2009 Botucatu São Paulo Brasilien Sydamerika 22° 50' 60" S 48° 26' 10" V 39
Atta laevigata 15 oktober 2016 Rio Claro São Paulo Brasilien Sydamerika - - Detta arbete
Atta laevigata 26 oktober 2016 Rio Claro São Paulo Brasilien Sydamerika - - Detta arbete
Atta laevigata 31 oktober 2017 Rio Claro São Paulo Brasilien Sydamerika - - Detta arbete
Atta laevigata 6 november 2017 Rio Claro São Paulo Brasilien Sydamerika - - Detta arbete
Atta laevigata 22 september 2018 Rio Claro São Paulo Brasilien Sydamerika - - Detta arbete
Atta laevigata 10 oktober 2018 Rio Claro São Paulo Brasilien Sydamerika - - Detta arbete
Atta laevigata 10 oktober 2019 Rio Claro São Paulo Brasilien Sydamerika - - Detta arbete
Atta laevigata * 21 oktober 2020 Rio Claro São Paulo Brasilien Sydamerika - - Detta arbete
Atta laevigata 15 november 2020 Rio Claro São Paulo Brasilien Sydamerika - - Detta arbete
Atta laevigata 20 november 2020 Rio Claro São Paulo Brasilien Sydamerika - - Detta arbete
Atta laevigata 17 oktober 2021 Rio Claro São Paulo Brasilien Sydamerika - - Detta arbete
Atta laevigata 25 oktober 2021 Rio Claro São Paulo Brasilien Sydamerika - - Detta arbete
Atta opaciceps 8 mars 2022 Macaíba Rio Grande do Norte Brasilien Sydamerika - - **
Atta sexdens - 1986 till 1991 Viçosa Minas Gerais Brasilien Sydamerika 20,45° S 42,51° V 43
Atta sexdens 21 oktober 2009 Botucatu São Paulo Brasilien Sydamerika 22° 49' 53,25" S 48° 25' 24.22" V 44
Atta sexdens 18 september 2010 Rio Claro São Paulo Brasilien Sydamerika 22° 23' 70,50" S 47° 32' 54.40" V 45
Atta sexdens 31 oktober 2010 Botucatu São Paulo Brasilien Sydamerika 22° 49' 53,25" S 48° 25' 24.22" V 44
Atta sexdens 10 oktober 2011 Rio Claro São Paulo Brasilien Sydamerika 22° 23' 70,50" S 47° 32' 54.40" V 45
Atta sexdens 10 oktober 2011 Botucatu São Paulo Brasilien Sydamerika 22° 23' 70,50" S 47° 32' 54.40" V 45
Atta sexdens 15 oktober 2016 Rio Claro São Paulo Brasilien Sydamerika - - Detta arbete
Atta sexdens 26 oktober 2016 Rio Claro São Paulo Brasilien Sydamerika - - Detta arbete
Atta sexdens 31 oktober 2017 Rio Claro São Paulo Brasilien Sydamerika - - Detta arbete
Atta sexdens 6 november 2017 Rio Claro São Paulo Brasilien Sydamerika - - Detta arbete
Atta sexdens 22 september 2018 Rio Claro São Paulo Brasilien Sydamerika - - Detta arbete
Atta sexdens 10 oktober 2018 Rio Claro São Paulo Brasilien Sydamerika - - Detta arbete
Atta sexdens 10 oktober 2019 Rio Claro São Paulo Brasilien Sydamerika - - Detta arbete
Atta sexdens* 21 oktober 2020 Rio Claro São Paulo Brasilien Sydamerika - - Detta arbete
Atta sexdens 15 november 2020 Rio Claro São Paulo Brasilien Sydamerika - - Detta arbete
Atta sexdens 20 november 2020 Rio Claro São Paulo Brasilien Sydamerika - - Detta arbete
Atta sexdens 17 oktober 2021 Rio Claro São Paulo Brasilien Sydamerika - - Detta arbete
Atta sexdens 25 oktober 2021 Rio Claro São Paulo Brasilien Sydamerika - - Detta arbete
Atta sexdens November till mars - Ilhéus Bahia Brasilien Sydamerika - - 40
Atta texana Maj 1992 Nacogdoche Texas USA Nordamerika 32° N 95° V 43
Atta vollenweideri - 2004 till 2010 - Formosa Argentina Sydamerika 26° 18' S 58° 49' V 46
Atta vollenweideri 6 oktober 2006 - Formosa Argentina Sydamerika 26° 18' S 58° 49' V 46
Atta vollenweideri Oktober 2009 - Formosa Argentina Sydamerika 25° 07' S 58° 10' V 46
Atta vollenweideri November 2009 - Formosa Argentina Sydamerika 25° 07' S 58° 10' V 46
Atta vollenweideri Den 8 december 2010 - Formosa Argentina Sydamerika 26° 18' S 58° 49' V 46
Atta vollenweideri 24 oktober - - Formosa Argentina Sydamerika 26° 18' S 58° 49' V 46
* Endast män observerade ** Mendonça, G. A., personlig kommunikation (data opublicerad)

Tabell 1: Register över bröllopsperioder för Atta-arter. Parningsflygningar förekommer i olika perioder och frekvenser beroende på regioner, men de sker i allmänhet under våren, vilket anges i rapporter som samlats in från Atta myrornas territorium av förekomst 37,38,39,40,41,42,43,44,45,46. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Protokollet som beskrivs här för att upprätthålla bladskärande myrkolonier har utvecklats och tillämpats i över tre decennier på ett självsäkert och replikerbart sätt. Det möjliggjorde utvecklingen av forskning som skulle begränsas av fältförhållanden. Därmed blev friska myror och kolonier tillgängliga för forskning inom flera områden som jämförande morfologi, toxikologi 51,52, histologi53 och mikrobiologi54,55,56 på individ- och koloninivå. Deras underhåll i laboratoriet innehåller flera förfaranden som beskrivs här, som inkluderar platsberedning under gynnsamma abiotiska förhållanden, insamling av drottningar och unga kolonier och fortsatt vård.

Flera steg är avgörande för framgången för underhåll av bladskärande myror under kontrollerade förhållanden. Drottningar och kolonier i de tidiga stadierna behöver framstående vård och att följa de första procedurerna som beskrivs kan garantera deras överlevnad. Det är till exempel nödvändigt att identifiera den plats där arten finns och den period då de bevingade reproducerarna initierar bröllopsflygningen. I Sydamerika sker majoriteten av parningsflygningarna under våren (tabell 1). För närvarande är möjligheten till fångenskapsuppfödning extremt låg, eftersom det är att spela in en bröllopsflygning i laboratoriet24. Dessutom är bladskärande myrkolonier i den bördiga fasen stora och svåra att gräva ut, och med tanke på boarkitekturen är det en utmaning att hitta och samla drottningen6. Till exempel kan Atta laevigata bon vara upp till 67 m 2 av boytan och uppta mer än 563 m2 av den inre ytan uppdelad i 7 864 kamrar på 7 m djup57.

Fördelen med att samla drottningar omedelbart efter bröllopsflygningen är att garantera ett större antal reproduktiva former på kort tid och nära ytan. Från denna första samling är det möjligt att utveckla experiment med reproduktiva former (Figur 7), inklusive män. En teknikbegränsning är behovet av att samla reproduktiva individer vid ett osäkert datum. Om drottningarnas överlevnad är låg blir en andra samling unga kolonier nödvändig. Att samla unga kolonier några månader efter bröllopsflygningen säkerställer att drottningens kammare inte är djupt in i ytan. I denna fas återstår bara drottningarna med mer kondition, eftersom de uthärdade matbristfasen och kunde ta hand om svampen och de första arbetarna under claustralfasen 58,59,60,61. Under laboratorieförhållanden kan drottningarnas överlevnad nå 14,5% under de första månaderna, även med frisk svamp överförd till 90% av drottningarna (data opublicerade). Liknande överlevnadsdata för Atta sexdens registrerades av Mota-Filho62. Detta kan bero på brist på svamputveckling eller naturlig förorening med entomopatogena svampar63.

En av de största nackdelarna med att samla drottningar eller kolonier i tidiga skeden (figur 6 och figur 7) är svårigheten med taxonomisk identifiering, eftersom det lättare kan göras genom stora arbetare12 som bara dyker upp efter några månader, när det finns mer resurs för larvmatning. Några kritiska steg i denna teknik är förknippade med att främja tillväxten av svampträdgården, hålla boet rent och undvika eventuella flykt. Vissa åtgärder inkluderar den frekventa tillsatsen av färskt vegetabiliskt material, som ständigt införlivas i svampen av arbetarna. Svampen används som en tillförsel av glukos och stärkelse för arbetarna och som protein för larverna64. Att ta bort gamla och kasserade material och hålla boet rent, förhindrar uppkomsten av eventuella skadliga mikroorganismer. För att undvika rymningar bör röranslutningar alltid kontrolleras, och vid öppna arenor, underhåll polytetrafluoretylenskiktet. Fördelen med att upprätthålla kolonier i de bonkonfigurationer som beskrivs för att simulera den verkliga strukturen som finns i naturen, med specifika kamrar för födosök och avfall, och en koloni med den sociala organisationen komplett (dvs. drottning, arbetare och avkommor). Forskning utförd med drottninglösa kolonier63,65 indikerar att arbetare uppvisar distinkta beteenden på grund av drottningens frånvaro. Beteendestudier drog slutsatsen att drottningen är viktig för kolonisammanhållning utöver reproduktiv funktion66.

Genomförandet av de protokoll som behandlas här kan tillämpas på andra arter av vetenskapligt intresse, såsom andra svampväxande myror från släktet Acromyrmex. Dessa bladskärande myror betraktas också som jordbruksskadegörare i vissa regioner i Amerika och har nyligen väckt mer intresse för koloniutveckling i tidigt skede67 och giftig beteinteraktion68 fokuserad forskning. Även om detta arbete är specifikt inriktat på bladskärande myror, kan underhållsprotokollet och de olika typerna av bon som beskrivs också vara tillämpliga på andra grupper av myror. Varje avsnitt av förfarandet beskriver grundläggande myrbehov som måste beaktas vid bevarande av dem under kontrollerade förhållanden, såsom: identifiera den lämpligaste kosten; erbjuda mat med jämna mellanrum i en födosökskammare eller ett specifikt område; tillhandahålla en kammare med hög luftfuktighet med gipsbas för att hålla drottningen och omogenheter; undvik myrflykt genom beredskapsämnen som läggs till strukturerna hos de konstgjorda bonarna; ta bort material som bortskaffas av myrorna från boet; och överföra kolonierna till ett annat konstgjort bo vid behov.

Under det senaste decenniet har universitet och forskare ägnat sig åt att vara mer inkluderande och bjudit in samhället att vara en del av laboratorierna och deras forskning69. Genom att med stor beslutsamhet omfamna det pedagogiska syftet blev myrlaboratorier verktyg för att locka människors nyfikenhet och ansluta den akademiska världen med allmän kunskap. De typer av bon som presenteras i detta arbete kan användas i olika aktiviteter beroende på målet, såsom utbildning och utställningar. Till exempel ska öppna bon (figur 5) visas för besökare på universitetet, medan klosterbon (figur 4) är användbara för vetenskapsmässa och ambulerande utställningar på grund av enkel transport. I alla fall kan allmänheten observera myrkolonier, lära sig om grundläggande biologi och roliga fakta och initieras till ifrågasättande. På ett mer uttrycksfullt plan kan studenterna genom förlängningsprojekt som "Primeiros Passos na Ciência" (First Steps in Science)69 faktiskt vara en del av forskargrupperna. Följaktligen gynnar myrstudier med utbildningsändamål studentutveckling eftersom det förbättrar undersökningar och erfarenheter samtidigt som det uppmuntrar till större intresse för vetenskaplig forskning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inga intressekonflikter att avslöja.

Acknowledgments

Tillägnad Mario Autuori (in memoriam) och Walter Hugo de Andrade Cunha som starkt bidrog till bladskärande myrstudier. Vi erkänner stödet från São Paulo State University och Institute of Biosciences. Denna studie finansierades delvis av Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior-Brasil (CAPES) - Finance Code 001, Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) och Fundação para o Desenvolvimento da UNESP (Fundunesp).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Entomologic forceps N/A N/A N/A
Glass tank N/A N/A Tempered glass, custom made
Hose N/A N/A Transparent, PVC 1/2 Inch x 2,0 mm
Latex gloves Descarpack 550301 N/A
Nitrile gloves Descarpack 433301 N/A
Open arena N/A N/A Polypropylene crate
Plaster pouder N/A N/A Plaster pouder used in construction, must be absorbant
Plastic Containers for collection Prafesta Natural Cód.: 8231/Natural Cód.: 8262 Lidded, transparent , polypropylene
Plastic containers for nests Prafesta Discontinued Polystyrene, hermetic
Teflon Dupont N/A Polytetrafluoroethylene liquid (PTFE Dispertion 30)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wilson, E. O. The Insect Societies. , Harvard University Press. Cambridge, Massachusetts, USA. (1971).
  2. Ortiz, D. P., Elizalde, L., Pirk, G. I. Role of ants as dispersers of native and exotic seeds in an understudied dryland. Ecological Entomology. 46 (3), 626-636 (2021).
  3. Christianini, A. V., Oliveira, P. S. Birds and ants provide complementary seed dispersal in a neotropical savanna. Journal of Ecology. 98 (3), 573-582 (2010).
  4. Camargo, P. H. S. A., Martins, M. M., Feitosa, R. M., Christianini, A. V. Bird and ant synergy increases the seed dispersal effectiveness of an ornithochoric shrub. Oecologia. 181 (2), 507-518 (2016).
  5. Sanders, D., van Veen, F. J. F. Ecosystem engineering and predation: the multi-trophic impact of two ant species. Journal of Animal Ecology. 80 (3), 569-576 (2011).
  6. Swanson, A. C., et al. Welcome to the Atta world: A framework for understanding the effects of leaf-cutter ants on ecosystem functions. Functional Ecology. 33 (8), 1386-1399 (2019).
  7. Meyer, S. T., et al. Leaf-cutting ants as ecosystem engineers: topsoil and perturbations around Atta cephalotes nests reduce nutrient availability. Ecological Entomology. 38 (5), 497-504 (2013).
  8. Sosa, B., Brazeiro, A. Positive ecosystem engineering effects of the ant Atta vollenweideri on the shrub Grabowskia duplicata. Journal of Vegetation Science. 21 (3), 597-605 (2010).
  9. De Almeida, T., et al. Above- and below-ground effects of an ecosystem engineer ant in Mediterranean dry grasslands. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 287 (1935), 20201840 (2020).
  10. Folgarait, P. J. Ant biodiversity and its relationship to ecosystem functioning: a review. Biodiversity & Conservation. 7 (9), 1221-1244 (1998).
  11. Hölldobler, B., Wilson, E. O. The Ants. , Harvard University Press. (1990).
  12. Barrera, C. A., Sosa-Calvo, J., Schultz, T. R., Rabeling, C., Bacci, M. Phylogenomic reconstruction reveals new insights into the evolution and biogeography of Atta leaf-cutting ants (Hymenoptera: Formicidae). Systematic Entomology. 47 (1), 13-35 (2021).
  13. Hölldobler, B., Wilson, E. O. The Leafcutter Ants: Civilization By Instinct. , WW Norton & Company. (2011).
  14. Branstetter, M. G., et al. Dry habitats were crucibles of domestication in the evolution of agriculture in ants. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 284 (1852), 20170095 (2017).
  15. Solomon, S. E., et al. The molecular phylogenetics of Trachymyrmex Forel ants and their fungal cultivars provide insights into the origin and coevolutionary history of ‘higher-attine’ ant agriculture. Systematic Entomology. 44 (4), 939-956 (2019).
  16. Cristiano, M. P., Cardoso, D. C., Sandoval-Gómez, V. E., Simões-Gomes, F. C. Amoimyrmex Cristiano, Cardoso & Sandoval, gen. nov. (Hymenoptera: Formicidae): a new genus of leaf-cutting ants revealed by multilocus molecular phylogenetic and morphological analyses. Austral Entomology. 59 (4), 643-676 (2020).
  17. Schultz, T. R., Brady, S. G. Major evolutionary transitions in ant agriculture. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (14), 5435-5440 (2008).
  18. Mueller, U. G., et al. Phylogenetic patterns of ant–fungus associations indicate that farming strategies, not only a superior fungal cultivar, explain the ecological success of leafcutter ants. Molecular Ecology. 27 (10), 2414-2434 (2018).
  19. Mueller, U. G., et al. Biogeography of mutualistic fungi cultivated by leafcutter ants. Molecular Ecology. 26 (24), 6921-6937 (2017).
  20. Weber, N. A. The fungus-culturing behavior of ants. American Zoologist. 12 (3), 577-587 (1972).
  21. Wilson, E. O. Caste and division of labor in leaf-cutter ants (Hymenoptera: Formicidae: Atta). Behavioral Ecology and Sociobiology. 7 (2), 157-165 (1980).
  22. Della Lucia, T. M. C. Formigas cortadeiras: da bioecologia ao manejo. Viçosa Editora UFV. 421, University of Viçosa Press. Viçosa, Minas Gerais, Brazil. (2011).
  23. Autuori, M. Contribuição para o conhecimento da saúva (Atta spp). I. Evolução do sauveiro (Atta sex dens rubolpilosa Forel, 1908). Arquivos do Instituto Biologico Saul Paulo. 12, 197-228 (1941).
  24. Bueno, O. C., Hebling, M. J. A., Schneider, M. O., Pagnocca, F. C. Ocorrência de formas aladas de Atta sexdens rubropilosa Forel (Hymenoptera: Formicidae) em colônias de laboratório. Neotropical Entomology. 31 (3), 469-473 (2002).
  25. Mariconi, F. A. M. Biologo. As Saúvas. , Ceres Press. Piracicaba, São Paulo, Agronômica. (2021).
  26. Bento, J. M. S. Condições climáticas para o vôo nupcial e reconhecimento dos indivíduos em Atta sexdens rubropilosa (Hymenoptera: Formicidae). , Viçosa. Minas Gerais, Brazil. Master's dissertation (1993).
  27. Little, A. E. F., Murakami, T., Mueller, U. G., Currie, C. R. The infrabuccal pellet piles of fungus-growing ants. Naturwissenschaften. 90 (12), 558-562 (2003).
  28. Kerr, W. E. Acasalamento de rainhas com vários machos em duas espécies da tribo Attini. Revista Brasileira de Biologia. 21, 45-48 (1961).
  29. Kerr, W. E. Tendências evolutivas na reprodução dos himenópteros sociais. Arquivos do Museu Nacional. 52, (1962).
  30. Cremer, S., Armitage, S. A. O., Schmid-Hempel, P. Social immunity. Current Biology. 17 (16), 693-702 (2007).
  31. Hernández, J. V., Jaffé, K. Dano econômico causado por populações de formigas Atta laevigata (F. Smith) em plantações de Pinus caribaea (Mor.) e elementos para o manejo da praga. Anais da Sociedade Entomológica do Brasil. 24 (2), 287-298 (1995).
  32. Kempf, W. W. Catálogo abreviado das formigas da Região Neotropical Studia Entomologica. antbase.org. 15, 3 (1972).
  33. Della Lucia, T. M. C., Gandra, L. C., Guedes, R. N. C. Managing leaf-cutting ants: peculiarities, trends and challenges. Pest Management Science. 70 (1), 14-23 (2013).
  34. Boaretto, M. A. C., Forti, L. C. Perspectivas no controle de formigas-cortadeiras. Série Técnica IPEF. 11 (30), 31-46 (1997).
  35. Folgarait, P. J., Goffré, D. Conidiobolus lunulus, a newly discovered entomophthoralean species, pathogenic and specific to leaf-cutter ants. Journal of Invertebrate Pathology. 186, 107685 (2021).
  36. Cardoso, S. R. S., Rodrigues, A., Forti, L. C., Nagamoto, N. S. Pathogenicity of filamentous fungi towards Atta sexdens rubropilosa (Hymenoptera: Formicidae). International Journal of Tropical Insect Science. 42 (2), 1215-1223 (2022).
  37. Ichinose, K., Rinaldi, I., Forti, L. C. Winged leaf-cutting ants on nuptial flights used as transport by Attacobius spiders for dispersal. Ecological Entomology. 29 (5), 628-631 (2004).
  38. Pagnocca, F. C., Rodrigues, A., Nagamoto, N. S., Bacci, M. Yeasts and filamentous fungi carried by the gynes of leaf-cutting ants. Antonie Van Leeuwenhoek. 94 (4), 517-526 (2008).
  39. Attili-Angelis, D., et al. Novel Phialophora species from leaf-cutting ants (tribe Attini). Fungal Diversity. 65 (1), 65-75 (2014).
  40. Delabie, J. H. C., do Nascimento, I. C., Mariano, C. S. F. Estratégias de reprodução e dispersão em formigas attines, com exemplos do sul da Bahia. XIX Congresso Brasileiro de Entomologia. , 16-21 (2002).
  41. Fjerdingstad, E. J., Boomsma, J. J. Variation in size and sperm content of sexuals in the leafcutter ant Atta colombica. Insectes Sociaux. 44 (3), 209-218 (1997).
  42. Currie, C. R., Mueller, U. G., Malloch, D. The agricultural pathology of ant fungus gardens. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (14), 7998-8002 (1999).
  43. Moser, J. C., et al. Eye size and behaviour of day-and night-flying leafcutting ant alates. Journal of Zoology. 264 (1), 69-75 (2004).
  44. Moreira, S. M., Rodrigues, A., Forti, L. C., Nagamoto, N. S. Absence of the parasite Escovopsis in fungus garden pellets carried by gynes of Atta sexdens. Sociobiology. 62 (1), 34-38 (2015).
  45. Arcuri, S. L., et al. Yeasts found on an ephemeral reproductive caste of the leaf-cutting ant Atta sexdens rubropilosa. Antonie Van Leeuwenhoek. 106 (3), 475-487 (2014).
  46. Staab, M., Kleineidam, C. J. Initiation of swarming behavior and synchronization of mating flights in the leaf-cutting ant Atta vollenweideri FOREL, 1893 (Hymenoptera: Formicidae). Myrmecol. News. 19, 93-102 (2014).
  47. Gálvez, D., Chapuisat, M. Immune priming and pathogen resistance in ant queens. Ecology and Evolution. 4 (10), 1761-1767 (2014).
  48. Baer, B., Armitage, S. A. O., Boomsma, J. J. Sperm storage induces an immunity cost in ants. Nature. 441 (7095), 872-875 (2006).
  49. Carlos, A. A. Semioquímicos e comunicação sonora em formigas cortadeiras (Hymenoptera: Formicidae). , Rio Claro, São Paulo, Brazil. Doctoral's thesis (2013).
  50. do Mundo, M. Veja um FORMIGUEIRO por DENTRO. Boravê. , Available from: https://youtu.be/sN99x_Rjf90 (2021).
  51. Ortiz, G., Vieira, A. S., Bueno, O. C. Toxicological and morphological comparative studies of insecticides action in leaf-cutting ants. International Journal of Agriculture Innovations and Research. 6 (3), 516-522 (2017).
  52. Decio, P., Silva-Zacarin, E. C. M., Bueno, F. C., Bueno, O. C. Toxicological and histopathological effects of hydramethylnon on Atta sexdens rubropilosa (Hymenoptera: Formicidae) workers. Micron. 45, 22-31 (2013).
  53. Vieira, A. S., Morgan, E. D., Drijfhout, F. P., Camargo-Mathias, M. I. Chemical composition of metapleural gland secretions of fungus-growing and non-fungus-growing ants. Journal of Chemical Ecology. 38 (10), 1289-1297 (2012).
  54. Vieira, A. S., Ramalho, M. O., Martins, C., Martins, V. G., Bueno, O. C. Microbial communities in different tissues of Atta sexdens rubropilosa leaf-cutting ants. Current Microbiology. 74 (10), 1216-1225 (2017).
  55. Ramalho, M. deO., Martins, C., Morini, M. S. C., Bueno, O. C. What can the bacterial community of Atta sexdens (Linnaeus, 1758) tell us about the habitats in which this ant species evolves. Insects. 11 (6), 332 (2020).
  56. Machado, L. M., et al. Attractivity or repellence: relation between the endophytic fungi of Acalypha, Colocasia and the leaf-cutting ants—Atta sexdens. Advances in Entomology. 9 (2), 85-99 (2021).
  57. Moreira, A., Forti, L. C., Andrade, A. P., Boaretto, M. A., Lopes, J. Nest architecture of Atta laevigata (F. Smith, 1858) (Hymenoptera: Formicidae). Studies on Neotropical Fauna and Environment. 39 (2), 109-116 (2004).
  58. Della Lucia, T. M. C., Moreira, D. D. O., Oliveira, M. A., Araújo, M. S. Perda de peso de rainhas de Atta durante a fundação e o estabelecimento das colônias. Revista Brasileira de Biologia. 55 (4), 533-536 (1995).
  59. Fujihara, R. T., Camargo, R. daS., Forti, L. C. Lipid and energy contents in the bodies of queens of Atta sexdens rubropilosa Forel (Hymenoptera, Formicidae): pre-and post-nuptial flight. Revista Brasileira de Entomologia. 56 (1), 73-75 (2012).
  60. da Silva Camargo, R., Forti, L. C. Queen lipid content and nest growth in the leaf cutting ant (Atta sexdens rubropilosa) (Hymenoptera: Formicidae). Journal of Natural History. 47, 65-73 (2013).
  61. Camargo, R. S., Forti, L. C., Fujihara, R. T., Roces, F. Digging effort in leaf-cutting ant queens (Atta sexdens rubropilosa) and its effects on survival and colony growth during the claustral phase. Insectes Sociaux. 58 (1), 17-22 (2011).
  62. Mota Filho, T. M. M., Garcia, R. D. M., Camargo, R. S., Stefanelli, L. E. P., Forti, L. C. Observations about founding queens (Atta sexdens) and their unusual behavior. International Journal of Agriculture Innovations and Research. 9, 352-357 (2021).
  63. Barcoto, M. O., Pedrosa, F., Bueno, O. C., Rodrigues, A. Pathogenic nature of Syncephalastrum in Atta sexdens rubropilosa fungus gardens. Pest Management Science. 73 (5), 999-1009 (2017).
  64. Silva, A., Bacci, M., Pagnocca, F. C., Bueno, O. C., Hebling, M. J. A. Production of polysaccharidases in different carbon sources by Leucoagaricus gongylophorus Möller (Singer), the symbiotic fungus of the leaf-cutting ant Atta sexdens Linnaeus. Curr. Microbiology. 53 (1), 68-71 (2006).
  65. Majoe, M., Libbrecht, R., Foitzik, S., Nehring, V. Queen loss increases worker survival in leaf-cutting ants under paraquat-induced oxidative stress. Philosophical Transactions of the Royal Society B. 376 (1823), 20190735 (2021).
  66. Della Lucia, T. M. C., Peternelli, E. F. O., Lacerda, F. G., Peternelli, L. A., Moreira, D. D. O. Colony behavior of Atta sexdens rubropilosa (Hymenoptera: Formicidae) in the absence of the queen under laboratory conditions. Behavioural Processes. 64 (1), 49-55 (2003).
  67. Sales, T. A., Toledo, A. M. O., Zimerer, A., Lopes, J. F. S. Foraging for the fungus: why do Acromyrmex subterraneus (Formicidae) queens need to forage during the nest foundation phase. Ecological Entomology. 46 (6), 1364-1372 (2021).
  68. Forti, L. C., et al. Do workers from subspecies Acromyrmex subterraneus prepare leaves and toxic baits in similar ways for their fungus garden. Neotropical Entomology. 49 (1), 12-23 (2020).
  69. Dorigo, A. S., et al. Projeto Primeiros Passos na Ciência: rompendo barreiras sociais e estreitando laços entre a comunidade acadêmica e o ensino médio público. Revista Brasileira de Extensão Universitária. 11 (1), 47-59 (2020).

Tags

Biologi utgåva 186
Insamling och långsiktigt underhåll av bladskärande myror (<em>Atta</em>) under laboratorieförhållanden
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nogueira, B. R., de Oliveira, A. A., … More

Nogueira, B. R., de Oliveira, A. A., da Silva, J. P., Bueno, O. C. Collection and Long-Term Maintenance of Leaf-Cutting Ants (Atta) in Laboratory Conditions. J. Vis. Exp. (186), e64154, doi:10.3791/64154 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter