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Biology

Recolección y mantenimiento a largo plazo de hormigas cortadoras de hojas (Atta) en condiciones de laboratorio

Published: August 30, 2022 doi: 10.3791/64154
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Institute of Biosciences, Department of General and Applied Biology, Laboratory of Leaf-cutting Ants, São Paulo State University, 2Institute of Psychology, Laboratory Walter Hugo Cunha, São Paulo University

Summary

Aquí, se describe un protocolo para recolectar y mantener con éxito colonias sanas de hormigas Atta (Hymenoptera: Formicidae) en condiciones de laboratorio. Además, se detallan diferentes tipos y configuraciones de nidos junto con posibles procedimientos experimentales.

Abstract

Las hormigas son uno de los grupos de animales con mayor biodiversidad del planeta y habitan en diferentes entornos. El mantenimiento de colonias de hormigas en ambientes controlados permite una comprensión enriquecida de su biología que puede contribuir a la investigación aplicada. Esta práctica se emplea generalmente en estudios de control de poblaciones de especies que causan pérdidas económicas, como las hormigas Atta . Para cultivar su hongo mutualista, estas hormigas cortadoras de hojas recolectan hojas y para ello se consideran plagas agrícolas ampliamente distribuidas por todo el continente americano. Están altamente organizados socialmente y habitan nidos subterráneos elaborados compuestos por una variedad de cámaras. Su mantenimiento en un ambiente controlado depende de una rutina diaria de varios procedimientos y cuidados frecuentes que se describen aquí. Comienza con la recolección de reinas durante la temporada reproductiva (es decir, el vuelo nupcial), que luego se transfieren individualmente a recipientes de plástico. Debido a la alta tasa de mortalidad de las reinas, se puede realizar una segunda recolección unos 6 meses después del vuelo nupcial, cuando los nidos incipientes con fajo de hongos desarrollados se excavan, se recogen a mano y se colocan en recipientes de plástico. En el laboratorio, las hojas se proporcionan diariamente a las colonias establecidas, y los desechos producidos por hormigas se eliminan semanalmente junto con el material vegetal seco restante. A medida que el jardín de hongos sigue creciendo, las colonias se transfieren a diferentes tipos de contenedores de acuerdo con el propósito experimental. Las colonias de hormigas cortadoras de hojas se colocan en contenedores interconectados, que representan el sistema organizativo con cámaras funcionales construidas por esos insectos en la naturaleza. Esta configuración es ideal para monitorear factores como la cantidad de desechos, la salud del jardín de hongos y el comportamiento de las obreras y la reina. La recopilación de datos facilitada y las observaciones más detalladas se consideran la mayor ventaja de mantener las colonias de hormigas en condiciones controladas.

Introduction

Las hormigas componen un grupo diverso de individuos que ejercen una influencia en la mayoría de los ambientes terrestres1. Actúan como dispersores eficientes 2,3,4, depredadores5 e ingenieros de ecosistemas 6,7,8,9,10, destacando su importancia y éxito ecológico en los ecosistemas naturales. Todas las especies de hormigas se clasifican como insectos eusociales; Sin embargo, su organización social varía mucho entre los diferentes grupos de especies, es decir, los sistemas de división del trabajo, los grupos funcionales, la comunicación entre individuos, la organización del forraje, la fundación de colonias y el proceso de reproducción11. Como grupo altamente diversificado, recurren a varios recursos alimenticios y comportamientos de alimentación especializados. De hecho, la agricultura no solo fue un gran paso para la civilización humana, sino también para las especies de hormigas. Hace aproximadamente 55 a 65 Ma12, las hormigas attine comenzaron a cultivar hongos e incorporarlos a una dieta casi exclusiva. Se especializaron tanto que desarrollaron interacciones estrictas, dependientes y obligatorias clasificadas como simbiosis, donde un individuo no sobrevive sin el otro.

Las hormigas productoras de hongos inferiores recolectan y procesan materia orgánica muerta, como fragmentos de hojas podridas, para cultivar su hongo mutualista; mientras que las hormigas productoras de hongos más altas cosechan material vegetal fresco, componiendo uno de los sistemas naturales simbióticos más exitosos13. Esta técnica agrícola altamente especializada les permitió aprovechar un nuevo nicho. Las hormigas attine más altas comprenden las hormigas cortadoras de hojas, un grupo monofilético que despierta entre 19 Ma (15-24 Ma) y 18 Ma (14-22 Ma)14,15,16 que consiste en cuatro géneros válidos: Atta Fabricius, Acromyrmex Mayr, Amoimyrmex Cristiano y Pseudoatta Gallardo. El sistema de agricultura cortadora de hojas realizado por las hormigas cortadoras de hojas, evolucionó a partir de sistemas agrícolas derivados17. La mayoría de estas especies explotan exclusivamente la especie de hongo mutualista Leucoagaricus gongylophorus Singer 18 (también llamada Leucocoprinus gongylophorus Heim19), marcando una transición evolutiva significativa11. Los cultivares fúngicos se transmiten verticalmente, desde los nidos originales hasta las crías, lo que sugiere que se propagan clonalmente20.

Sorprendentemente, las sociedades Atta desarrollaron una estructura organizativa compleja de enorme importancia en su entorno y de gran interés para los mirmecólogos. Su población puede estar compuesta por millones de individuos, la mayoría de ellos trabajadoras estériles que muestran un polimorfismo acentuado, es decir, tamaño y morfología anatómica distintos. La población se distingue por castas según edad, estado fisiológico, tipo morfológico, comportamientos y actividades especializadas en la colonia21. Los trabajadores pueden ser discriminados en jardineros y enfermeras, generalistas dentro del nido, recolectores y excavadores, y defensores o soldados21. Esta organización permite la realización de tareas en cooperación y un sistema de autoorganización que puede producir comportamientos colectivos altamente estructurados, permitiéndoles responder eficientemente a las perturbaciones ambientales22.

El papel de renovación de la población es desempeñado por una sola reina (es decir, monógina), mientras viva, constituyendo la casta reproductiva permanente22. Se sabe que las reinas Atta viven más de 20 años, poniendo huevos a lo largo de su vida23. Como la reina es insustituible, su resistencia es crucial para la supervivencia de la colonia 13,20,23,24. Sin embargo, miles de hembras y machos reproductores alados se pueden encontrar en el nido durante las temporadas de reproducción, pero ninguno permanece en el nido original, formando una casta temporal22. En las colonias de Atta sexdens, se producen cerca de 3.000 hembras reproductoras y 14.000 machos reproductivos25. Ocurre cuando una colonia alcanza la madurez sexual, aproximadamente 38 meses desde su implementación, y se repite anualmente desde entonces hasta que se extingue23,25. Las nuevas colonias de Atta se establecen a través de la haplometrosis, donde una reina comienza un nuevo nido.

Cuando las condiciones ambientales son favorables, los reproductores abandonan el nido subterráneo para comenzar el vuelo nupcial. El período de su ocurrencia difiere según la región, variando a lo largo del año en todo el territorio brasileño dependiendo de la especie. Sin embargo, el evento parece estar precedido por lluvias y humedad elevación26, que puede estar relacionada con la facilitación de la excavación debido a la humedad del suelo22. Con frecuencia, 1-5 semanas antes del vuelo nupcial, las entradas y los canales de los nidos se ensanchan para facilitar la salida de los individuos reproductivos. Antes de abandonar sus colonias madre, las hembras aladas recogen y almacenan, en una cavidad infrabucal, una porción del hongo mutualista20,27. Se realizan cópulas múltiples en pleno vuelo, y se calcula que una reina puede ser inseminada por tres a ocho machos (es decir, poliandria) en algunas especies28, asegurando la variabilidad genética29. Después, las reinas proceden al suelo, dando preferencia a lugares con poca o ninguna vegetación25, donde quitan sus alas y excavan su primera cámara de anidación. Este es el único período en el que se pueden ver reinas fuera del nido. A pesar de que individuos de la casta temporal fueron vistos en nidos artificiales, se desconoce si alguna cópula exitosa (es decir, vuelo nupcial) fue realizada en condiciones de laboratorio24.

La construcción inicial del nido corresponde al período más crucial de la colonia, que puede durar de 6 h a 8 h23,25. En este momento, la reina se enclaustra en la cámara inicial, y en cuestión de días, comienza la oviposición. Los primeros huevos se alimentan al micelio que la reina regurgita, marcando el inicio del jardín de hongos de la colonia. Las primeras larvas aparecen en aproximadamente 25 días22, y casi al final del primer mes, la colonia consiste en una estera de hongos proliferantes, donde se anidan los inmaduros (huevos, larvas y pupas), y la reina, que cría a su descendencia inicial en aislamiento23. Los huevos también son el recurso alimenticio de las primeras larvas y muy consumidos por la reina13. Además, la reina se sostiene con reservas corporales grasas y catabolizando los músculos de las alas que ya no son útiles13. El cultivo inicial de hongos no se consume ya que la supervivencia de la colonia depende de su desarrollo, y durante este período, la reina la fertiliza con líquido fecal13. Días después de emerger, las primeras obreras abren la entrada del nido y comienzan una actividad de forrajeo en el área inmediata del nido13. Incorporan el material recolectado como sustrato del jardín de hongos, que ahora está sirviendo como alimento para los trabajadores 13,22. Antes de ser agregado al cultivo de hongos, el material vegetal transportado por los trabajadores se corta en trozos pequeños y se humedece con líquido fecal13. Las hormigas manipulan el inóculo del hongo para aumentar y controlar su crecimiento, lo que servirá para dividir grandes cámaras excavadas de tierra, especializadas en acondicionar el jardín 13,22,25.

Aproximadamente 6 meses después del vuelo nupcial, los nidos de A. sexdens contienen una cámara de hongos y algunos canales. La gran especialización en la construcción de nidos de hormigas cortadoras de hojas funciona como un mecanismo de defensa contra enemigos naturales y factores ambientales desfavorables22. Se sabe que las hormigas cortadoras de hojas fragmentan el jardín de hongos y lo transponen a cámaras con alta humedad cuando las cámaras comienzan a secarse13. Así, a pesar de que la excavación del nido tiene un costo energético considerable, la energía invertida se invierte en beneficios para la propia colonia22. Con algunas excepciones, las especies de Atta también hacen cámaras especializadas para los desechos de la colonia, hechas principalmente de sustrato de hongo agotado y cuerpos de hormigas muertas, aislándola del resto del nido y estableciendo una importante estrategia de inmunidad social30. Además, un grupo distinto de trabajadores manipula la basura directamente, para evitar la contaminación de otros individuos. Las obreras se alimentan constantemente para nutrir el hongo, que es el principal recurso nutricional de la colonia. Sin embargo, también pueden alimentarse de la savia de la planta mientras cortan fragmentos. El material vegetal es cuidadosamente seleccionado para el mantenimiento del jardín de hongos e influenciado por muchos factores, como los rasgos de las hojas y las propiedades del ecosistema13.

La estrategia de forrajeo de las hormigas cortadoras de hojas para obtener material fresco es altamente compleja, y combinada con la alta demanda de cosecha de las colonias establecidas, resulta en una pérdida económica considerable para los productores agrícolas y pone en peligro las áreas de restauración forestal22,31. Por lo tanto, estas hormigas pueden clasificarse como plagas en la mayoría de las áreas donde se pueden encontrar, desde el sur de los Estados Unidos hasta el noreste de Argentina 11,13,22,32. La extinción de colonias problemáticas es un desafío debido a la serie de adaptaciones inherentes a la biología de estos insectos (es decir, organización social, búsqueda de alimento, cultivo de hongos, higiene y estructuras complejas de nidos)33. Así, las estrategias de control poblacional son distintas de las generalmente aplicadas a otras plagas de insectos, y recurren principalmente a atractivas ofertas de cebo contaminado33,34. Sin embargo, como estas hormigas pueden rechazar sustancias nocivas tanto para el hongo como para los individuos de la colonia, y comprometer los campos cultivados 33, constantemente se prueban nuevos compuestos naturales y alternativas de control33,35,36. Como los resultados de los experimentos difícilmente pueden ser monitoreados en colonias probadas en el campo, los ensayos preliminares se llevan a cabo en un ambiente controlado.

Por lo tanto, los protocolos experimentales deben adaptarse a los grupos de interés considerando el estilo de vida heterogéneo de las hormigas, apoyando estudios a nivel de especie y teniendo en cuenta las colonias como unidades operativas, donde una hormiga es un elemento de un superorganismo complejo11. Los informes recopilados hasta ahora sobre el género Atta permitieron recolectar y mantener con éxito colonias en condiciones de laboratorio y reconocer sus necesidades básicas y su funcionamiento general. A partir de sus procesos naturales como la reproducción, la fundación de colonias y los comportamientos de alimentación, se ha desarrollado una rutina de prácticas que permite el establecimiento a largo plazo de colonias en diferentes tipos de nidos. Aquí, se describe un protocolo de procedimiento para mantener a las hormigas cortadoras de hojas en el laboratorio y destaca la posible investigación general con distintos propósitos de experimentación y divulgación científica.

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Protocol

1. Colección de reinas

  1. Buscar en la literatura el período de la temporada reproductiva de Atta en la región de interés. La ocurrencia de la temporada reproductiva, la frecuencia y el horario diurno de los vuelos nupciales, varía de acuerdo con las condiciones climáticas regionales (Tabla 1). Aunque generalmente se lleva a cabo en primavera, esta información debe recopilarse para el lugar donde se pretende que ocurra la recolección 37,38,39,40,41,42,43,44,45,46.
  2. Identificar y marcar lugares con nidos de Atta considerados como posibles áreas para recolectar reinas y colonias jóvenes. Durante los vuelos nupciales, las reinas se dispersan alrededor de las ubicaciones de los nidos; Por lo tanto, las áreas con un mayor número de colonias tienen mayores posibilidades de tener lugares de desembarco de reinas donde inician nuevas excavaciones de nidos.
  3. Verifique las áreas seleccionadas previamente para detectar signos de vuelo nupcial durante la temporada reproductiva de las hormigas Atta . Lleve un registro de las condiciones ambientales de los días de vuelo nupcial, como el clima cálido y lluvioso.
  4. Identifique nidos de hormigas cortadoras de hojas en las áreas seleccionadas previamente y busque características externas que indiquen la próxima partida de las hormigas reproductivas aladas. Las características del nido incluyen entradas de túneles ensanchadas (Figura 1), aumento del flujo de obreras que muestran un comportamiento más agresivo hacia posibles depredadores y hormigas aladas reproductivas que aparecen en las entradas del túnel (Figura 1). Tenga cuidado con los días de alta humedad que siguen a la lluvia, ya que generalmente preceden a los vuelos nupciales.
  5. Prepare recipientes con tapa de plástico con una capa inferior de yeso para retener a las reinas individualmente. Asegúrese de que el volumen del contenedor sea de aproximadamente 200 ml, y que la capa de yeso en la parte inferior tenga alrededor de 1 cm de altura y sea altamente absorbente para el control de la humedad.
    NOTA: Para preparar la base de yeso, siga las instrucciones del fabricante.
  6. Prepare un ambiente con una temperatura constante de 23 ± 1 °C y aproximadamente 70% ± 10% de humedad relativa. Elija un lugar sin actividades intensas y alto flujo de personas para evitar vibraciones y molestias. Use productos de limpieza de fragancia neutra para evitar cualquier interferencia en el comportamiento de las hormigas.
    NOTA: Las fluctuaciones en las condiciones ambientales especificadas pueden causar condensación de agua o pérdida de humedad, y comprometer el jardín de hongos.
  7. Después del vuelo nupcial, recoja las reinas sin alas que hayan iniciado la excavación del nido y colóquelas cuidadosamente en los recipientes de plástico preparados con una capa de yeso, individualmente. Evite tocar a las reinas con las manos desnudas y use guantes de látex o pinzas entomológicas.
    NOTA: La eliminación de alas y el comportamiento de excavación del suelo indican hembras reproductivas que ya han copulado y, por lo tanto, pueden comenzar una nueva colonia. La colección Queens también se trata como la primera colección de este trabajo.
  8. Mueva los contenedores que llevan las reinas a la ubicación con un entorno controlado previamente seleccionado. Realice el transporte de las reinas con la máxima precaución, evitando demasiadas molestias y manteniendo una temperatura mínima constante.
  9. No manipule ni mueva a las reinas durante aproximadamente 3 días después de la recolección para evitar el estrés.

Figure 1
Figura 1. La entrada del nido se ensanchaba con reproductores y obreras de hormigas aladas. Las entradas ensanchadas del túnel son una de las características de los nidos que indica la ocurrencia de vuelos nupciales de Atta .  Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

2. Mantenimiento de las reinas

  1. Inicialmente, agregue 2.5 ml de agua a la capa de yeso del recipiente cada 2 días con la ayuda de una jeringa de aguja.
    1. En lugar de abrir el recipiente, perfore cuidadosamente las tapas del recipiente con la aguja para evitar molestias debido a la manipulación. El mismo orificio se puede utilizar durante este período. Asegúrese de que el agua añadida no empape la capa de yeso. Evite regar directamente a la reina, la esponja de hongo inicial y cualquier inmaduro. Mientras el jardín de hongos exhiba un aspecto seco con ausencia de agua, riegue la capa de yeso.
  2. Dos semanas después de la recolección, verifique si el hongo ha sido regurgitado por las reinas. Si no hay hongo, transfiera aproximadamente 2 g de hongo obtenido de una colonia establecida. Además, realice este paso si el hongo no se desarrolla.
    NOTA: Para la transferencia de hongos, es necesario recolectar hongos sanos de una colonia establecida y eliminar todas las hormigas que puedan estar en ella. Use una cucharada, pinzas entomológicas y guantes de látex para manipular el hongo.
  3. Después de la aparición de las primeras obreras, comience a ofrecer fragmentos de hojas jóvenes y delgadas regularmente, de acuerdo con la actividad de corte de la colonia. Asegúrese de que las hojas ofrecidas estén sanas y que las plantas no hayan sido tratadas con insecticidas u otras sustancias químicas. En las primeras etapas, asegúrese de que los fragmentos de hojas no superen los 4 cm.
    NOTA: Como las primeras obreras inician el forrajeo de hojas, se debe ofrecer material vegetal después de su aparición. La frecuencia de la oferta depende de la agilidad con la que los trabajadores incorporan el material vegetal en el hongo, pero puede variar de 2 a 3 días a la semana. También se pueden ofrecer copos de avena y copos de maíz, pero deben alternarse con hojas para evitar la sequedad de hongos.
  4. Al ofrecer hojas nuevas, elimine los desechos de la colonia y los fragmentos de hojas secas. Evita el uso de perfumes, cremas hidratantes, cremas o cualquier sustancia con un olor fuerte al manipular a las reinas. Además, use guantes de látex durante todos los procesos.
  5. Siga el desarrollo de la colonia, y cuando el jardín de hongos alcance al menos la mitad del volumen del contenedor, transfiera la colonia a un nido perdurable artificial.
    NOTA: Como la tasa de desarrollo es inherente a cada colonia, no hay un tiempo estimado para la transferencia de colonias. Por lo general, las colonias de la primera colección se transfieren a nidos con cámara de jardín de hongos de volumen máximo de 1L, debido al pequeño jardín de hongos.

3. Colección de colonias jóvenes

  1. Adquiera envases de plástico de aproximadamente 500 mL de volumen.
  2. Aproximadamente 6 meses después del vuelo nupcial, identifique montículos indicativos en forma de torre con partículas de suelo granuladas (Figura 1) de nidos incipientes de Atta (Figura 2) en los lugares con la aparición de hormigas cortadoras de hojas previamente marcadas.
    NOTA: Seis meses después del vuelo nupcial, se estima que los nidos de colonias jóvenes tienen hasta 1 m de profundidad en el suelo. Se indica una nueva colección en este período para lograr mayores posibilidades de colonias exitosas y duraderas en grandes cantidades.
  3. Con una azada de jardín, excava la entrada del nido hasta llegar a la cámara que sostiene la colonia joven. Recoja la reina, el jardín de hongos, los inmaduros y los trabajadores jóvenes, y colóquelos en el recipiente de plástico. Realice el proceso de recolección con la mayor delicadeza posible.
    NOTA: Naturalmente, también se recolectará una gran cantidad de tierra y debe eliminarse gradualmente en futuros procedimientos de mantenimiento en el laboratorio.
  4. Mueva los recipientes con tapa de plástico que contienen las colonias al entorno controlado designado. Realizar el transporte de colonias jóvenes con la máxima precaución, evitando demasiadas perturbaciones y manteniendo una temperatura mínima constante. Abstenerse de manipular o mover las colonias durante aproximadamente 3 días para evitar el estrés. Si la habitación tiene una rutina activa, se puede poner un paño oscuro sobre las colonias.

Figure 2
Figura 2. Montículo de tierra en forma de torre. El característico montículo en forma de torre indica la presencia de colonias incipientes de Atta sexdens y Atta laevigata. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

4. Mantenimiento de colonias jóvenes

  1. Proporcione hojas jóvenes delgadas 3 veces a la semana.
    1. Asegúrese de que las hojas ofrecidas estén sanas y que las plantas no hayan sido tratadas con insecticidas u otras sustancias químicas. En esta etapa, asegúrese de que los fragmentos de hojas tengan al menos 7 cm de longitud.
      NOTA: También se pueden ofrecer copos de avena y copos de maíz, pero deben alternarse con hojas para evitar la sequedad de hongos.
    2. La frecuencia de la oferta depende de la agilidad con la que los trabajadores incorporan el material vegetal sobre el hongo. Con la actividad de corte intensa, aumente la oferta dos veces al día tres veces a la semana o 5 días a la semana.
  2. Cuando ofrezca hojas nuevas, elimine los desechos de la colonia, incluidos los restos de tierra, con la ayuda de una cuchara. Use guantes de látex durante todos los procesos. Al manipular las colonias jóvenes evite el uso de perfumes, cremas hidratantes, cremas o cualquier sustancia con un olor fuerte.
    NOTA: Los propios trabajadores separarán el suelo y los desechos del hongo.
  3. Siga el desarrollo de la colonia, y cuando el jardín de hongos alcance al menos la mitad del volumen del contenedor, transfiera la colonia a un nido perdurable artificial.
    NOTA: Como la tasa de desarrollo es inherente a cada colonia, no hay un tiempo estimado para la transferencia de colonias.

Figure 3
Figura 3: Tipos de nidos artificiales para contener colonias de Atta sexdens y Atta laevigata . Ilustración de nidos artificiales perdurable de hormigas cortadoras de hojas: configuración de nido vertical enclaustrado, configuración de nido horizontal enclaustrado y configuración de nido de arena abierta. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

5. Nidos artificiales perdurables

  1. Prepare una configuración de nido vertical enclaustrado como se describe a continuación (Figura 3 y Figura 4).
    NOTA: Las configuraciones de nidos enclaustrados siempre deben tener diferentes recipientes para posar por separado como (1) cámara de jardín de hongos, (2) cámara de eliminación de desechos y (3) cámara de forrajeo. Inicialmente, debe comenzar con tres contenedores, pero se pueden agregar más recipientes para aumentar el jardín de hongos. Los nidos pueden variar en tamaño y material según su propósito experimental, aunque aquí se describe y recomienda el uso de materiales transparentes. Los contenedores deben estar sin aberturas, o de lo contrario las hormigas escaparán. El tipo de nido como se describe a continuación se puede utilizar para la investigación general, pero no está bien recomendado para la recolección asertiva de hormigas debido a la perturbación causada al quitar la tapa, lo que resulta en una gran agitación entre los individuos. Sin embargo, debido a la transparencia del material, es posible localizar a la reina y diferentes castas de hormigas incluso cuando el jardín de hongos ha llenado todo el contenedor. Como es una tendencia, siempre se asume que los inmaduros están en el centro del jardín de hongos cuando ha ocupado la mayor parte del espacio disponible en contenedores verticales.
    1. Seleccione un recipiente con tapa transparente de aproximadamente 1 L y agregue una capa de 1 cm de base de yeso altamente absorbente. Esta será la cámara de jardín de hongos. Seleccione dos contenedores transparentes con tapa de aproximadamente 500 ml cada uno para que sean cámaras de eliminación de desechos y forrajeo. Las hormigas elegirán qué cámara será cada una, y después de eso, se asegurarán de que no se intercambien.
      NOTA: Para preparar la base de yeso, siga las instrucciones del fabricante.
    2. Perfore y conecte los tres recipientes con un tubo transparente o una manguera. Si es necesario, aplique cinta adhesiva en el borde de los tubos para garantizar una conexión del muslo con los contenedores y evitar que las hormigas se escapen. Coloque el recipiente de base de yeso en el medio y los otros recipientes en lados opuestos.
    3. Transfiera cuidadosamente la esponja de hongos de las colonias seleccionadas (ver paso 2.5 y paso 4.3) junto con la reina, las obreras y los inmaduros al recipiente de la base de yeso. Antes de la transferencia, asegúrese de que la base de yeso esté regada. Use guantes de látex.
  2. Prepare una configuración de nido horizontal enclaustrado como se describe a continuación (Figura 3 y Figura 4).
    NOTA: Los nidos con configuración horizontal permiten observar de cerca el jardín de hongos y las actividades de los trabajadores hacia él. Como las porciones más jóvenes del jardín de hongos están en la parte superior, es posible observar sustratos recientemente ofrecidos incorporados por los trabajadores. Las nuevas porciones del hongo pueden ser detectadas por su color, que será similar al color del último recurso ofrecido, mientras que las porciones más antiguas generalmente tienen un color beige. Las crías y la reina también se pueden localizar fácilmente, ya que en contenedores horizontales suelen estar en la parte superior del jardín de hongos, incluso cuando ha ocupado la mayor parte del espacio. Esta configuración se puede utilizar para la investigación centrada en el comportamiento, el muestreo focal y la divulgación científica, ya que da una percepción de la organización dentro del nido.
    1. Adquiera un recipiente con tapa transparente con dimensiones aproximadas de 31 cm x 21 cm x 4,5 cm, y agregue una capa de 1 cm de base de yeso altamente absorbente. Esta será la cámara de jardín de hongos. Seleccione dos contenedores transparentes con tapa de aproximadamente 500 ml cada uno para que sean cámaras de eliminación de desechos y forrajeo. Las hormigas elegirán qué cámara será cada una, y después de eso, se asegurarán de que no se intercambien.
      NOTA: Para preparar la base de yeso, siga las instrucciones del fabricante. Si es necesario, cierre el poco espacio entre la tapa y el recipiente con cinta adhesiva para evitar que las hormigas se escapen.
    2. Perforar y conectar los recipientes con un tubo transparente o una manguera. Si es necesario, aplique cinta adhesiva en el borde de los tubos para garantizar una conexión del muslo con los contenedores y evitar que las hormigas se escapen. Coloque el recipiente de base de yeso en el medio y los otros recipientes en lados opuestos.
    3. Transfiera cuidadosamente la esponja de hongos de las colonias seleccionadas (ver paso 2.5 y paso 4.3) junto con la reina, las obreras y los inmaduros al recipiente de la base de yeso. Antes de la transferencia, asegúrese de que la base de yeso esté regada. Use guantes de látex.
  3. Prepare una configuración de nido de arena abierta como se describe a continuación (Figura 3 y Figura 5).
    NOTA: Los nidos de arena abierta permiten la recolección de hormigas sin grandes perturbaciones y análisis de comportamiento de alimentación. También pueden proporcionar una representación confiable de una colonia que se encuentra en la naturaleza con fines de divulgación científica.
    1. Seleccione un recipiente con tapa transparente de aproximadamente 1 L y agregue una capa de 1 cm de base de capa de yeso altamente absorbente. Esta será la cámara de jardín de hongos.
      NOTA: Se recomienda comenzar con recipientes de 1 L y pasar gradualmente a contenedores con volúmenes más altos para un jardín de hongos más grande. Sin embargo, los recipientes no deben superar un volumen de 5 L. Agregue tantos contenedores como sea necesario.
    2. Seleccione una arena abierta. El tamaño de la arena puede variar según los propósitos del estudio. Si se selecciona una arena grande, coloque los recipientes que contienen el jardín de hongos en su interior (Figura 5). En el caso de una arena pequeña, conéctela al recipiente del jardín de hongos con una manguera o tubo transparente (Figura 3). La arena servirá como una cámara de forrajeo y eliminación de desechos, por lo tanto, asegúrese de que no sea demasiado pequeña.
    3. Aplique una capa de politetrafluoroetileno líquido en un solo movimiento al borde de la arena para contener las hormigas. Use un algodón empapado con el líquido y un guante de nitrilo.
      PRECAUCIÓN: Evite la inhalación y el contacto con la piel mientras usa el líquido de politetrafluoroetileno.
    4. Transfiera cuidadosamente la esponja de hongos de las colonias seleccionadas (ver paso 2.5 y paso 4.3) junto con la reina, las obreras y los inmaduros al recipiente de la base de yeso. Antes de la transferencia, asegúrese de que la base de yeso esté regada. Use guantes de látex.

Figure 4
Figura 4: Nidos artificiales de clausura de las hormigas cortadoras de hojas Atta sexdens y Atta laevigata. Configuración de nido vertical enclaustrado superior (A) y vista lateral (B); enclaustrado horizontal de configuración de nido superior (C) y vista lateral (D). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Nido artificial de arena abierta de las hormigas cortadoras de hojas Atta sexdens y Atta laevigata. Configuración de nido de arena abierta de Atta sexdens superior (A) y vista lateral (B). 1) Cámaras de jardín de hongos; 2) Residuos; 3) rodajas de naranja; 4) Vidrio con capa de politetrafluoretileno (PTFE). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

6. Mantenimiento de colonias desarrolladas

  1. Ofrezca diariamente al menos una hoja grande en la cámara de forrajeo por colonia con 1 L de jardín de hongos. Si la actividad de corte de las hormigas es intensa, aumente el número de hojas. Si el hongo está seco, humedezca previamente las hojas para proporcionar humedad adicional. En los nidos de clausura, realice la ofrenda rápidamente para evitar que las hormigas escapen de la cámara de alimentación.
    NOTA: Aquí, las hojas se recolectan de especies de plantas como morera (Morus nigra), mango (Mangifera indica), eucalipto (Eucalyptus sp.), jambolan (Syzygium cumini), hibisco (Hibiscus sp.), acalypha (Acalypha wilkesiana) y ligustrum (Ligustrum lucidum).
    1. Ofrezca frutas como naranja y manzana, y copos de avena y maíz para diversificar y complementar la dieta. A las colonias grandes con intensa actividad de forrajeo, ofrezca copos de avena y copos de maíz diariamente, y frutas una vez a la semana. Si no es el caso, ofrezca copos alternativamente con hojas, pero no más de tres veces a la semana, y frutas una o dos veces al mes. Ajuste la cantidad y frecuencia de cada alimento de acuerdo con la actividad de forrajeo de las hormigas.
    2. Si las opciones descritas anteriormente no están disponibles, identifique la preferencia de alimentación de las hormigas entre hojas, flores y frutos de árboles y arbustos regionales, o incluso vegetales, granos y otros copos comercializados. Evite ofrecer recursos con compuestos químicos defensivos y pesticidas.
  2. Retire todo el contenido de la cámara de residuos cada 2 semanas de todas las colonias. Eliminar a los trabajadores también con fines de control de la población. Si las obreras transfieren hongos sanos a la cámara de desechos, asegúrese de que la reina no esté sobre ella y retírela. Si la cantidad de residuos desechados es alta o está demasiado húmeda, retírelos una vez por semana.
  3. Retire el material no tomado por las hormigas de la cámara de forrajeo cada vez que ofrezca otros nuevos y asegúrese de que siempre esté limpio.
    1. Si las obreras transfieren hongos sanos a la cámara de forrajeo, la perturban, dejan la tapa del recipiente abierta y aplican talco neutro a la superficie del margen de la cámara. Realice este procedimiento solo si todavía hay algo de espacio en la cámara de hongos, de esta manera los trabajadores transferirán el hongo nuevamente al recipiente sin perderlo ni inmaduros.
  4. Si se desea más jardín de hongos, agregue otro recipiente enlucido y mueva una porción de la esponja de hongos en él. Hasta que el hongo llegue a la mitad del recipiente, agregue hojas en la cámara del hongo. El crecimiento del jardín de hongos debe ocurrir gradualmente para no comprometer el equilibrio de la colonia. Si se desea un recipiente más grande, asegúrese de dejar que el hongo ocupe todo el espacio de los contenedores más pequeños antes de transferirlo. Los desechos de colonias y las hojas secas no deben acumularse en la cámara del jardín de hongos.
  5. Verifique la base de yeso de los contenedores, ya que con el tiempo, puede adquirir un color marrón oscuro y volverse ineficaz debido a la excreción de hormigas, el transporte de desechos y la alta concentración de humedad. Además, algunas colonias pueden cortar la capa y deshacerse de ella. En estos casos, transfiera el jardín de hongos a un nuevo recipiente enlucido.

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Representative Results

En la Figura 6 se muestra un diagrama de flujo que representa el proceso de recolección de hormigas. Aquí se muestran algunos resultados obtenidos empleando el protocolo de recolección, mantenimiento y configuraciones de anidación descritas anteriormente.

Figure 6
Figura 6: Diagrama de flujo para la recolección de colonias de hormigas cortadoras de hojas. Siguiendo el protocolo, la primera recogida tiene lugar justo después del vuelo nupcial. Las reinas que han quitado sus alas se recogen y se colocan en un pequeño recipiente con una base de yeso. Después de 6 meses del vuelo nupcial, se produce la segunda recolección. Se recolectan las reinas que excavaron el suelo y comenzaron con éxito la fundación de la colonia. Después de que las colonias se desarrollan, se transfieren a contenedores más grandes y, opcionalmente, a diferentes configuraciones de nidos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Influencia del estado reproductivo en la respuesta inmune de las hormigas cortadoras de hojas
Las reinas de diferentes especies de hormigas tienen una larga vida útil y, por lo tanto, tienen más probabilidades de estar expuestas al mismo patógeno más de una vez47. Al iniciar una nueva colonia, las reinas Atta están aisladas y una compensación entre reproducción e inmunidad podría reducir la inversión en las defensas inmunes de estas hormigas fundadoras. Así, su resistencia a patógenos puede estar relacionada a su estado reproductivo47,48. Al recolectar reinas en diferentes momentos de su ciclo de vida temprano e introducir un hilo de nylon en el gáster de los individuos (Figura 7), fue posible evaluar la respuesta de encapsulación individual a patógenos y comparar la resistencia inmune entre reinas vírgenes, reinas recientemente apareadas y reinas que se aparearon hace 6 meses en el gáster de los individuos.

Figure 7
Figura 7: Ensayo de respuesta de encapsulación. Configuración del experimento que tuvo como objetivo evaluar la respuesta inmune individual de la variación de encapsulación de acuerdo con el estado de reproducción de Atta sexdens y Atta laevigata queens. Las reinas vírgenes, reinas recién apareadas y reinas que se han apareado hace 6 meses recibieron inserciones de filamentos de nylon entre la 4ª y 5ª tergita del gáster para actuar como antígeno. Los filamentos de nylon se retiraron después de 24 horas y se fotografiaron para cuantificar la cubierta de color. Las reinas fueron recolectadas antes del vuelo nupcial, justo después del vuelo nupcial y 6 meses después del vuelo nupcial, siguiendo los pasos de los temas 1, 2 y 3 del protocolo descrito. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Una vez que las hembras no apareadas aparecen solo en eventos de vuelo nupcial, el estudio de estos individuos en este estado de reproducción se basa en el conocimiento específico para predecir la ocurrencia del fenómeno particular y conocer los protocolos de recolección y mantenimiento de hormigas. Para garantizar que los reproductores aún no habían copulado, los individuos fueron recolectados directamente de los agujeros de los nidos que tenían sus entradas ensanchadas para la salida de esas hormigas (Figura 1). Como la identificación de los reproductores a nivel de especie es problemática, se recolectaron obreras de la misma colonia para su validación. En el caso de los individuos apareados, las hembras a las que se les quitaron las alas y comenzaron a excavar el suelo justo después del vuelo nupcial fueron recolectadas, asumiendo que ya habían copular. Para ambas etapas de reproducción, se recolectó un alto número de hembras para asegurar la cantidad de individuos probados, ya que la tasa de mortalidad en este momento es significativa. Una vez que las hormigas apareadas se dispersaron de la colonia original, las especies fueron identificadas a través de la comparación del perfil de hidrocarburos cuticulares49. Las reinas se aparearon durante 6 meses desde el vuelo nupcial ya han iniciado sus colonias, que en este punto consisten en un pequeño jardín de hongos, varias obreras e inmaduras. Estas colonias de vida temprana fueron descubiertas por el montículo de suelo en forma de torre (Figura 2). La recogida se llevó a cabo siguiendo los pasos descritos anteriormente en el apartado 3 "Recogida de colonias jóvenes". Para estudiar a las reproductoras femeninas en esta etapa, era necesario mantener la colonia joven, ya que solo la reina pronto perecería. La identificación se hizo utilizando las obreras de las colonias. Alrededor de 200 reinas fueron recolectadas en total utilizando los protocolos descritos anteriormente.

Después de cada recolección, las reinas fueron pesadas, medidas y pronto recibieron las inserciones de filamentos de nylon, que se retiraron 24 h después para el análisis de la cubierta de color. Para las especies de Atta laevigata , las reinas que se aparearon hace 6 meses mostraron el filamento de nylon más oscuro, por lo tanto, la mayor tasa de encapsulación y una defensa inmune más eficiente (Figura 8). Sin embargo, las reinas recién apareadas recolectadas justo después del vuelo nupcial, y las reinas vírgenes recolectadas antes del vuelo nupcial compartieron aproximadamente la misma tasa de encapsulación (Figura 8). Así, se verificó que la defensa celular de encapsulación en hormigas Atta laevigata puede variar con el estado reproductivo y el tiempo transcurrido después del apareamiento, pero no se altera con el peso y la longitud de la cabeza. Inicialmente, la investigación también tenía como objetivo recolectar y comparar reinas Atta sexdens , pero no fue posible recolectar reinas vírgenes, ya que los nidos identificados no tenían ninguna actividad reproductora en los agujeros observados. A pesar de la dificultad, los estudios generales sobre los mecanismos de defensa celular de los reproductores de hormigas cortadoras de hojas podrían contribuir a la clarificación de las respuestas inmunes de los insectos y a la mejora de los métodos de control actuales.

Preferencia de las hormigas cortadoras de hojas a los subproductos utilizados en cebos
Actualmente, el método de control de población más aplicado de las colonias de hormigas cortadoras de hojas es a través de la oferta de cebo tóxico. Generalmente, se asocian a un atractivo compuesto de origen vegetal, siendo la pulpa cítrica la más utilizada. Sin embargo, se sabe que de alguna manera los trabajadores pueden asociar la toxicidad del cebo con el compuesto atractivo después del contacto previo y rechazarlo, lo que hace que el método sea ineficiente. Por lo tanto, se propone el uso de compuestos atractivos alternativos como la soja (100%), la soja más pulpa cítrica (50%/50%) y el anacardo más pulpa de cítricos (50%/50%) para una posible rotación entre cebos. Estos compuestos fueron seleccionados después de experimentos de preferencia con colonias de Atta sexdens y Atta laevigata . Los nidos se unieron con arenas de vidrio y se ofrecieron cebos libres de insecticidas con diferentes composiciones (Figura 9).

Figure 8
Figura 8: Tasa de encapsulación de las reinas Atta sexdens y Atta laevigata en diferentes etapas reproductivas. Los niveles de encapsulación se evaluaron a través del valor gris medio de las imágenes de los filamentos de nylon insertados en el gáster de los individuos. Se consideró que los hilos más oscuros representaban una defensa celular eficiente porque se suponía que más hemocitos superpuestos revestían el objetivo, como se muestra en el eje X de la figura. Las reinas apareadas de Atta laevigata mostraron el mayor nivel de encapsulación (ANOVA, Tukey-Kramer, desviación estándar; p < 0,01; N = 29), por lo tanto, una defensa inmune individual efectiva. Se observó que las reinas recién apareadas y las reinas vírgenes de la misma especie exhibían, de manera similar, tasas más bajas de encapsulación y, en consecuencia, una defensa inmune individual menos efectiva. Los resultados obtenidos sugieren que los eventos de apareamiento y establecimiento de nidos afectan las respuestas inmunes celulares de las reinas Atta laevigata. Las reinas Atta sexdens mostraron resultados contrarios, y MQ tuvo el nivel de encapsulación más bajo (ANOVA, Tukey-Kramer, desviación estándar, p < 0,01; N = 46). Sin embargo, como no se pudieron recolectar reinas vírgenes de la especie, la comparación entre todos los grupos no fue posible. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 9
Figura 9: Ensayo de la preferencia de las hormigas cortadoras de hojas por los subproductos de cebo. Configuración del experimento que tuvo como objetivo evaluar la preferencia de los sexdens Atta y el trabajador de Atta laevigata a los cebos con diferentes subproductos atractivos. Una arena de vidrio se unió a la cámara de hongos para contener los diferentes cebos, que estaban separados por un divisor de vidrio. Se ofrecieron 5 g de cada cebo en posiciones aleatorias, tres a la vez. Los cebos se pesaron después del final del experimento, que ocurrió después de 1 h de observación o tan pronto como los trabajadores tomaron un cebo por completo. La preferencia fue evaluada por la actividad de carga, que fue estimada por la carga de cebo retirada de la cámara de forrajeo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

En total, se utilizaron 32 colonias con aproximadamente 1 L de hongos de jardín. Las colonias fueron previamente recolectadas y mantenidas utilizando los protocolos descritos. Los tratamientos más cargados de A. laevigata fueron pulpa cítrica, soja más pulpa cítrica (50%/50%) y anacardo más pulpa cítrica (50%/50%; Figura 10). Del mismo modo, los tratamientos más cargados de las hormigas A. sexdens fueron pulpa cítrica, soja (100%) y soja más pulpa cítrica (50%/50%; Figura 10). Los resultados obtenidos para las dos especies mostraron que los subproductos de soja y anacardo eran los más atractivos después de la pulpa cítrica, lo que sugiere que otras composiciones de cebo podrían usarse para el control químico de la población en hormigas cortadoras de hojas.

Figure 10
Figura 10: Porcentaje medio de carga de cebos atractivos de los trabajadores de Atta laevigata y Atta sexdens . Del mismo modo, los tratamientos de pulpa cítrica (100%), soja (100%) y soja más pulpa cítrica (50%/50%) fueron los más cargados para ambas especies. Sin embargo, el tratamiento menos cargado para Atta sexdens (anacardo más pulpa cítrica) fue cargado en un 60% por los trabajadores de Atta laevigata . A lo largo del experimento, se realizaron cinco repeticiones con cinco colonias de cada especie. Los cebos estaban dispuestos de manera diferente dentro de las repeticiones; Sin embargo, la pulpa cítrica siempre estuvo presente como el control positivo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Investigación y divulgación científica
Alrededor de 350 reinas y 100 colonias se recolectan anualmente para ser mantenidas en el laboratorio desde el año de 1990. Al menos tres internos están designados para cuidar diariamente de las hormigas, y durante este período de tiempo, casi 250 colonias se mantuvieron simultáneamente con fines experimentales y educativos cada año. Durante los años 2016 a 2019, aproximadamente 2,020 estudiantes de alrededor de 34 escuelas pudieron visitar el Laboratorio de Hormigas Cortadoras de Hojas (LAFC) y observar las colonias de hormigas recolectadas y mantenidas utilizando los protocolos descritos anteriormente. Las excursiones tenían diferentes objetivos, desde la biología general hasta el aprendizaje del comportamiento social. Aparte de la conocida importancia de insectos como las hormigas, las complejas estructuras físicas construidas por ellas en la naturaleza, también observadas en nidos artificiales, son un ejemplo de esfuerzo colectivo y organización del trabajo que tienen interés educativo. A cada nivel educativo (Figura 11) se le dio una presentación detallada diferente, a veces siguiendo el enfoque sugerido por los profesores responsables de los estudiantes. Para ello se mantienen dos colonias con la configuración de nidos de arena abierta, cada una con aproximadamente 66 cámaras con 177 L de jardín de hongos (Figura 5). Desafortunadamente, las excursiones fueron canceladas durante la pandemia, pero es posible ver un creciente interés entre los educadores, ya que el número de estudiantes visitantes surgió durante los últimos 4 años reportados (Figura 12). Sin embargo, para mantener la divulgación científica durante la pandemia, se realizaron visitas virtuales a través de plataformas para compartir videos. El video50 que muestra cómo se encuentra un nido de hormigas cortadoras de hojas en su interior, realizado en asociación con el canal Manual do Mundo, tuvo más de 2.4 millones de visitas y más de 3,000 comentarios en menos de un año. Allí, se abordó la biología y la creación de hormigas cortadoras de hojas en el laboratorio.

Figure 11
Figura 11: Niveles de educación de los estudiantes en excursiones a través de los años 2016-2019. Número de estudiantes que estuvieron presentes en excursiones al Laboratorio de Hormigas Cortadoras de Hojas durante el período 2016-2019, según el nivel de educación. Las excursiones dirigidas a diferentes enfoques que involucran colonias de hormigas cortadoras de hojas que se mantienen en el Laboratorio de Hormigas Cortadoras de Hojas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 12
Figura 12: Número de estudiantes en excursiones durante los años 2016-2019. Número de estudiantes que estuvieron presentes en excursiones en el Laboratorio de Hormigas Cortadoras de Hojas durante el período de 2016-2019. Es posible ver un aumento en el interés de las organizaciones educativas para realizar exposiciones de insectos vivos, como las hormigas, que permiten una observación cercana por parte de los estudiantes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Especie Mes y día Año Ciudad Estado País Continente Latitud Longitud Referencias
Atta bisphaerica 4 de noviembre 1996 - - Brasil América del Sur - - 37
Atta capiguara 6 de octubre 2006 Botucatu São Paulo Brasil América del Sur 22° 50' 60" S 48° 26' 10" W 38
Atta capiguara 27 de octubre 2007 Botucatu São Paulo Brasil América del Sur 22° 50' 60" S 48° 26' 10" W 38
Atta capiguara Noviembre 2008 Botucatu São Paulo Brasil América del Sur 22° 50' 60" S 48° 26' 10" W 39
Atta capiguara Noviembre 2009 Botucatu São Paulo Brasil América del Sur 22° 50' 60" S 48° 26' 10" W 39
Atta cephalotes Marzo a Junio - Ilhéus Bahía Brasil América del Sur - - 40
Atta cephalotes Septiembre - Ilhéus Bahía Brasil América del Sur - - 40
Atta colombica 4 de junio 1993 - Gamboa Panamá América Central - - 41
Atta colombica 7 de junio 1993 - Gamboa Panamá América Central - - 41
Atta colombica - 1998 - Gamboa Panamá América Central - - 42
Atta laevigata 6 de octubre 2006 Botucatu São Paulo Brasil América del Sur 22° 50' 60" S 48° 26' 10" W 39
Atta laevigata 27 de octubre 2007 Botucatu São Paulo Brasil América del Sur 22° 50' 60" S 48° 26' 10" W 39
Atta laevigata Noviembre 2008 Botucatu São Paulo Brasil América del Sur 22° 50' 60" S 48° 26' 10" W 39
Atta laevigata Noviembre 2009 Botucatu São Paulo Brasil América del Sur 22° 50' 60" S 48° 26' 10" W 39
Atta laevigata 15 de octubre 2016 Río Claro São Paulo Brasil América del Sur - - Este trabajo
Atta laevigata 26 de octubre 2016 Río Claro São Paulo Brasil América del Sur - - Este trabajo
Atta laevigata 31 de octubre 2017 Río Claro São Paulo Brasil América del Sur - - Este trabajo
Atta laevigata 6 de noviembre 2017 Río Claro São Paulo Brasil América del Sur - - Este trabajo
Atta laevigata 22 de septiembre 2018 Río Claro São Paulo Brasil América del Sur - - Este trabajo
Atta laevigata 10 de octubre 2018 Río Claro São Paulo Brasil América del Sur - - Este trabajo
Atta laevigata 10 de octubre 2019 Río Claro São Paulo Brasil América del Sur - - Este trabajo
Atta laevigata * 21 de octubre 2020 Río Claro São Paulo Brasil América del Sur - - Este trabajo
Atta laevigata 15 de noviembre 2020 Río Claro São Paulo Brasil América del Sur - - Este trabajo
Atta laevigata 20 de noviembre 2020 Río Claro São Paulo Brasil América del Sur - - Este trabajo
Atta laevigata 17 de octubre 2021 Río Claro São Paulo Brasil América del Sur - - Este trabajo
Atta laevigata 25 de octubre 2021 Río Claro São Paulo Brasil América del Sur - - Este trabajo
Atta opaciceps 8 de marzo 2022 Macaíba Rio Grande do Norte Brasil América del Sur - - **
Atta sexdens - 1986 a 1991 Viçosa Minas Gerais Brasil América del Sur 20,45° S 42,51° W 43
Atta sexdens 21 de octubre 2009 Botucatu São Paulo Brasil América del Sur 22° 49' 53.25" S 48° 25' 24.22" W 44
Atta sexdens 18 de septiembre 2010 Río Claro São Paulo Brasil América del Sur 22° 23' 70.50" S 47° 32' 54.40" W 45
Atta sexdens 31 de octubre 2010 Botucatu São Paulo Brasil América del Sur 22° 49' 53.25" S 48° 25' 24.22" W 44
Atta sexdens 10 de octubre 2011 Río Claro São Paulo Brasil América del Sur 22° 23' 70.50" S 47° 32' 54.40" W 45
Atta sexdens 10 de octubre 2011 Botucatu São Paulo Brasil América del Sur 22° 23' 70.50" S 47° 32' 54.40" W 45
Atta sexdens 15 de octubre 2016 Río Claro São Paulo Brasil América del Sur - - Este trabajo
Atta sexdens 26 de octubre 2016 Río Claro São Paulo Brasil América del Sur - - Este trabajo
Atta sexdens 31 de octubre 2017 Río Claro São Paulo Brasil América del Sur - - Este trabajo
Atta sexdens 6 de noviembre 2017 Río Claro São Paulo Brasil América del Sur - - Este trabajo
Atta sexdens 22 de septiembre 2018 Río Claro São Paulo Brasil América del Sur - - Este trabajo
Atta sexdens 10 de octubre 2018 Río Claro São Paulo Brasil América del Sur - - Este trabajo
Atta sexdens 10 de octubre 2019 Río Claro São Paulo Brasil América del Sur - - Este trabajo
Atta sexdens* 21 de octubre 2020 Río Claro São Paulo Brasil América del Sur - - Este trabajo
Atta sexdens 15 de noviembre 2020 Río Claro São Paulo Brasil América del Sur - - Este trabajo
Atta sexdens 20 de noviembre 2020 Río Claro São Paulo Brasil América del Sur - - Este trabajo
Atta sexdens 17 de octubre 2021 Río Claro São Paulo Brasil América del Sur - - Este trabajo
Atta sexdens 25 de octubre 2021 Río Claro São Paulo Brasil América del Sur - - Este trabajo
Atta sexdens Noviembre a Marzo - Ilhéus Bahía Brasil América del Sur - - 40
Atta texana Mayo 1992 Nacogdoche Texas Estados Unidos América del Norte 32° N 95° W 43
Atta vollenweideri - 2004 a 2010 - Formosa Argentina América del Sur 26° 18' S 58° 49' O 46
Atta vollenweideri 6 de octubre 2006 - Formosa Argentina América del Sur 26° 18' S 58° 49' O 46
Atta vollenweideri Octubre 2009 - Formosa Argentina América del Sur 25° 07' S 58° 10' O 46
Atta vollenweideri Noviembre 2009 - Formosa Argentina América del Sur 25° 07' S 58° 10' O 46
Atta vollenweideri 8 de diciembre 2010 - Formosa Argentina América del Sur 26° 18' S 58° 49' O 46
Atta vollenweideri 24 de octubre - - Formosa Argentina América del Sur 26° 18' S 58° 49' O 46
* Sólo hombres observados ** Mendonça, G. A., comunicación personal (datos inéditos)

Tabla 1: Registros de los períodos de vuelo nupcial de las especies de Atta. Los vuelos de apareamiento ocurren en diferentes períodos y frecuencias según las regiones, sin embargo, generalmente ocurren durante la primavera, como se indica en los informes recopilados en el territorio de ocurrencia de las hormigas Atta 37,38,39,40,41,42,43,44,45,46. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

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Discussion

El protocolo descrito aquí para mantener colonias de hormigas cortadoras de hojas se ha desarrollado y aplicado durante más de tres décadas de manera asertiva y replicable. Permitió el desarrollo de investigaciones que estarían limitadas por las condiciones del campo. De este modo, las hormigas sanas y las colonias estuvieron disponibles para la investigación en varias áreas, como la morfología comparada, la toxicología 51,52, la histología53 y la microbiología54,55,56 a nivel individual y de colonia. Su mantenimiento en el laboratorio incluye varios procedimientos descritos aquí, que incluyen la preparación del sitio en condiciones abióticas favorables, la recolección de reinas y colonias jóvenes, y el cuidado continuo.

Varios pasos son cruciales para el éxito del mantenimiento de las hormigas cortadoras de hojas en condiciones controladas. Las reinas y colonias en las primeras etapas necesitan cuidados distinguidos y seguir los procedimientos iniciales detallados puede garantizar su supervivencia. Por ejemplo, es necesario identificar el lugar donde se encuentran las especies y el período en que los reproductores alados inician el vuelo nupcial. En América del Sur, la mayoría de los vuelos de apareamiento ocurren durante la primavera (Tabla 1). Actualmente, la posibilidad de cría en cautividad es extremadamente baja, ya que es registrar un vuelo nupcial en el laboratorio24. Además, las colonias de hormigas cortadoras de hojas en la fase fértil son grandes y difíciles de excavar, y dada la arquitectura del nido, es un desafío localizar y recolectar a la reina6. Por ejemplo, los nidos de Atta laevigata pueden tener hasta 67m2 de área de nido, y ocupar más de 563 m2 de superficie interna dividida en 7.864 cámaras en 7 m de profundidad57.

La ventaja de recolectar reinas inmediatamente después del vuelo nupcial es garantizar un mayor número de formas reproductivas en un corto período de tiempo y cerca de la superficie. A partir de esta primera colección, es posible desarrollar experimentos con formas reproductivas (Figura 7), incluyendo machos. Una restricción técnica es la necesidad de recolectar individuos reproductivos en una fecha incierta. Si la supervivencia de las reinas es baja, se hace necesaria una segunda colección de colonias jóvenes. La recolección de colonias jóvenes unos meses después del vuelo nupcial asegura que la cámara de la reina no esté profundamente en la superficie. En esta fase, solo quedan las reinas con más aptitud física, ya que soportaron la fase de escasez de alimentos y pudieron cuidar el hongo y las primeras obreras durante la fase claustral 58,59,60,61. En condiciones de laboratorio, la tasa de supervivencia de las reinas puede alcanzar el 14,5% en los primeros meses, incluso con hongos sanos transferidos al 90% de las reinas (datos no publicados). Datos de supervivencia similares de Atta sexdens fueron registrados por Mota-Filho62. Esto puede deberse a la falta de desarrollo de hongos o a la contaminación natural con hongos entomopatógenos63.

Una de las principales desventajas de recolectar reinas, o colonias en etapas tempranas (Figura 6 y Figura 7) es la dificultad en la identificación taxonómica, ya que se puede hacer más fácilmente a través de grandes obreras12 que solo emergen después de unos meses, cuando hay más recursos para la alimentación larvaria. Algunos pasos críticos en esta técnica están asociados con la promoción del crecimiento del jardín de hongos, mantener los nidos limpios y evitar posibles escapes. Algunas acciones incluyen la adición frecuente de material vegetal fresco, que los trabajadores incorporan constantemente al hongo. El hongo se utiliza como suministro de glucosa y almidón para los trabajadores, y como proteína para las larvas64. Eliminar los materiales viejos y desechados, y mantener los nidos limpios, evita la aparición de posibles microorganismos dañinos. Para evitar escapes, siempre se deben revisar las conexiones de los tubos y, en el caso de arenas abiertas, mantener la capa de politetrafluoroetileno. La ventaja de mantener colonias en las configuraciones de nidos descritas para simular la estructura real que se encuentra en la naturaleza, con cámaras específicas para forrajeo y desechos, y una colonia con la organización social completa (es decir, reina, obreras y crías). La investigación realizada con colonias sin reina63,65 indica que las obreras exhiben comportamientos distintos debido a la ausencia de la reina. Los estudios de comportamiento concluyeron que la reina es importante para la cohesión de la colonia además de la función reproductiva66.

La implementación de los protocolos aquí abordados se puede aplicar a otras especies de interés científico, como otras hormigas productoras de hongos del género Acromyrmex. Estas hormigas cortadoras de hojas también se consideran plagas agrícolas en regiones particulares de América, y recientemente han atraído más interés en el desarrollo de colonias en etapa temprana67 y la interacción de cebo tóxico68 investigación enfocada. Aunque este trabajo está dirigido específicamente a las hormigas cortadoras de hojas, el protocolo de mantenimiento y los diferentes tipos de nidos descritos también podrían ser aplicables a otros grupos de hormigas. Cada sección del procedimiento describe las necesidades fundamentales de las hormigas que deben tenerse en cuenta al conservarlas en condiciones controladas, tales como: identificar la dieta más adecuada; ofrecer alimentos a intervalos regulares en una cámara de forrajeo o área específica; proporcionar una cámara de alto nivel de humedad con base de yeso para mantener a la reina e inmaduras; evitar el escape de hormigas a través de sustancias de contingencia añadidas a las estructuras de los nidos artificiales; retirar los materiales desechados por las hormigas de los nidos; y transferir las colonias a otro nido artificial cuando sea necesario.

Durante la última década, las universidades y los investigadores se han dedicado a ser más inclusivos, invitando a la sociedad a ser parte de los laboratorios y sus investigaciones69. Abrazando con gran determinación el propósito educativo, los laboratorios de hormigas se convirtieron en herramientas para atraer la curiosidad de las personas y conectar el mundo académico con el conocimiento común. Los tipos de nidos presentados en este trabajo se pueden utilizar en diferentes actividades dependiendo del objetivo, como la educación y las exposiciones. Por ejemplo, los nidos abiertos (Figura 5) son para exhibir a los visitantes en la universidad, mientras que los nidos de clausura (Figura 4) son útiles para ferias de ciencias y exposiciones itinerantes, debido a la facilidad de transporte. En todos los casos, el público en general puede observar colonias de hormigas, aprender sobre biología básica y datos divertidos, y ser instigado a cuestionar. En un nivel más expresivo, a través de proyectos de extensión como "Primeiros Passos na Ciência" (Primeros Pasos en Ciencia)69 los estudiantes pueden formar parte de los equipos de investigación. En consecuencia, los estudios de hormigas con fines educativos benefician el desarrollo de los estudiantes, ya que mejoran la investigación y las experiencias al tiempo que fomentan un mayor interés en la investigación científica.

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Disclosures

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Acknowledgments

Dedicado a Mario Autuori (in memoriam) y Walter Hugo de Andrade Cunha que contribuyeron en gran medida a los estudios de hormigas cortadoras de hojas. Reconocemos el apoyo de la Universidad Estadual Paulista y del Instituto de Biociencias. Este estudio fue financiado en parte por la Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior-Brasil (CAPES) - Código de Finanzas 001, el Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), la Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) y la Fundação para o Desenvolvimento da UNESP (Fundunesp).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Entomologic forceps N/A N/A N/A
Glass tank N/A N/A Tempered glass, custom made
Hose N/A N/A Transparent, PVC 1/2 Inch x 2,0 mm
Latex gloves Descarpack 550301 N/A
Nitrile gloves Descarpack 433301 N/A
Open arena N/A N/A Polypropylene crate
Plaster pouder N/A N/A Plaster pouder used in construction, must be absorbant
Plastic Containers for collection Prafesta Natural Cód.: 8231/Natural Cód.: 8262 Lidded, transparent , polypropylene
Plastic containers for nests Prafesta Discontinued Polystyrene, hermetic
Teflon Dupont N/A Polytetrafluoroethylene liquid (PTFE Dispertion 30)

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References

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Biología Número 186
Recolección y mantenimiento a largo plazo de hormigas cortadoras de hojas (<em>Atta</em>) en condiciones de laboratorio
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Nogueira, B. R., de Oliveira, A. A., da Silva, J. P., Bueno, O. C. Collection and Long-Term Maintenance of Leaf-Cutting Ants (Atta) in Laboratory Conditions. J. Vis. Exp. (186), e64154, doi:10.3791/64154 (2022).

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