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Biology

Coleta e Manutenção a Longo Prazo de Formigas Cortadeiras (Atta) em Condições de Laboratório

Published: August 30, 2022 doi: 10.3791/64154
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Institute of Biosciences, Department of General and Applied Biology, Laboratory of Leaf-cutting Ants, São Paulo State University, 2Institute of Psychology, Laboratory Walter Hugo Cunha, São Paulo University

Summary

Aqui, um protocolo é descrito para coletar e manter com sucesso colônias de formigas Atta (Hymenoptera: Formicidae) saudáveis em condições de laboratório. Além disso, diferentes tipos e configurações de ninho são detalhados juntamente com possíveis procedimentos experimentais.

Abstract

As formigas são um dos grupos de animais mais biodiversos do planeta e habitam diferentes ambientes. A manutenção de colônias de formigas em ambientes controlados possibilita uma compreensão enriquecida de sua biologia que pode contribuir para a pesquisa aplicada. Essa prática é geralmente empregada em estudos de controle populacional de espécies que causam perdas econômicas, como as formigas Atta . Para cultivar seu fungo mutualístico, essas formigas cortadeiras coletam folhas e para isso são consideradas pragas agrícolas amplamente distribuídas por todo o continente americano. Eles são altamente organizados socialmente e habitam ninhos subterrâneos elaborados compostos por uma variedade de câmaras. Sua manutenção em um ambiente controlado depende de uma rotina diária de vários procedimentos e cuidados frequentes que são descritos aqui. Começa com a coleta de rainhas durante a estação reprodutiva (ou seja, voo nupcial), que são então transferidas individualmente para recipientes de plástico. Devido à alta taxa de mortalidade das rainhas, uma segunda coleta pode ser realizada cerca de 6 meses após o voo nupcial, quando ninhos incipientes com fungos desenvolvidos são escavados, escolhidos a dedo e colocados em recipientes plásticos. No laboratório, as folhas são fornecidas diariamente às colônias estabelecidas, e os resíduos produzidos por formigas são removidos semanalmente, juntamente com o material vegetal seco restante. À medida que o jardim de fungos continua crescendo, as colônias são transferidas para diferentes tipos de recipientes de acordo com o propósito experimental. As colônias de formigas cortadeiras são colocadas em recipientes interconectados, representando o sistema organizacional com câmaras funcionais construídas por esses insetos na natureza. Essa configuração é ideal para monitorar fatores como a quantidade de resíduos, a saúde do jardim de fungos e o comportamento das operárias e da rainha. A coleta de dados facilitada e observações mais detalhadas são consideradas a maior vantagem de manter as colônias de formigas em condições controladas.

Introduction

As formigas compõem um grupo diversificado de indivíduos que exercem influência na maioria dos ambientes terrestres1. Eles atuam como dispersores eficientes 2,3,4, predadores5 e engenheiros de ecossistemas 6,7,8,9,10, destacando sua importância e sucesso ecológico nos ecossistemas naturais. Todas as espécies de formigas são classificadas como insetos eussociais; no entanto, sua organização social varia muito entre os diferentes grupos de espécies, ou seja, sistemas de divisão do trabalho, grupos funcionais, comunicação entre indivíduos, organização da forragem, fundação da colônia e processo de reprodução11. Como um grupo altamente diversificado, eles recorrem a vários recursos alimentares e comportamentos alimentares especializados. De fato, a agricultura não foi apenas um grande passo para a civilização humana, mas também para as espécies de formigas. Aproximadamente 55 a 65 Ma atrás12, as formigas atinas começaram a cultivar fungos e incorporá-los em uma dieta quase exclusiva. Eles se tornaram tão especializados que desenvolveram interações estritas, dependentes e obrigatórias classificadas como simbiose, onde um indivíduo não sobrevive sem o outro.

Formigas de crescimento de fungos inferiores coletam e processam matéria orgânica morta, como fragmentos de folhas podres, para cultivar seu fungo mutualista; enquanto as formigas produtoras de fungos colhem material vegetal fresco, compondo um dos sistemas naturais simbióticos mais bem-sucedidos13. Esta técnica agrícola altamente especializada permitiu-lhes agarrar um novo nicho. As formigas attine superiores compreendem as formigas cortadeiras, um grupo monofilético que desperta entre 19 Ma (15-24 Ma) e 18 Ma (14-22 Ma)14,15,16 consistindo de quatro gêneros válidos: Atta Fabricius, Acromyrmex Mayr, Amoimyrmex Cristiano e Pseudoatta Gallardo. O sistema de agricultura cortadeiras realizado pelas formigas cortadeiras evoluiu a partir de sistemas agrícolas derivados17. A maioria dessas espécies explora exclusivamente a espécie de fungo mutualístico Leucoagaricus gongylophorus Singer 18 (também chamada de Leucocoprinus gongylophorus Heim19), marcando uma transição evolutiva significativa11. As cultivares fúngicas são transmitidas verticalmente, de ninhos originais para descendentes, sugerindo que são propagadas clonalmente20.

Notavelmente, as sociedades Atta desenvolveram uma estrutura organizacional complexa de enorme importância em seu ambiente e de grande interesse para os mirmecologistas. Sua população pode ser composta por milhões de indivíduos, a maioria deles operárias estéreis que apresentam um polimorfismo acentuado, ou seja, tamanho distinto e morfologia anatômica. A população é distinguida por castas de acordo com a idade, estado fisiológico, tipo morfológico, comportamentos e atividades especializadas na colônia21. Os trabalhadores podem ser discriminados em jardineiros e enfermeiros, generalistas dentro do ninho, coletores e escavadeiras, e defensores ou soldados21. Essa organização permite a realização de tarefas em cooperação e um sistema auto-organizado que pode produzir comportamentos coletivos altamente estruturados, permitindo-lhes responder de forma eficiente a distúrbios ambientais22.

O papel de renovação populacional é desempenhado por uma única rainha (ou seja, monógina), enquanto viver, constituindo a casta reprodutiva permanente22. Sabe-se que as rainhas Atta vivem há mais de 20 anos, colocando ovos ao longo de sua vida útil23. Como a rainha é insubstituível, sua resistência é crucial para a sobrevivência da colônia 13,20,23,24. No entanto, milhares de fêmeas e machos reprodutivos alados podem ser encontrados no ninho durante as estações de reprodução, mas nenhum permanece no ninho original, formando uma casta temporária22. Nas colônias de Atta sexdens, cerca de 3.000 fêmeas reprodutivas e 14.000 machos reprodutivos são produzidos25. Ocorre quando uma colônia atinge a maturidade sexual, aproximadamente 38 meses após sua implantação, e se repete anualmente desde então até ser extinta23,25. Novas colônias de Atta são estabelecidas através da haplometrose, onde uma rainha inicia um novo ninho.

Quando as condições ambientais são favoráveis, os reprodutores deixam o ninho subterrâneo para iniciar o voo nupcial. O período de sua ocorrência difere de acordo com a região, variando ao longo do ano em todo o território brasileiro, dependendo da espécie. No entanto, o evento parece ser precedido por chuvas e elevação da umidade26, o que pode estar relacionado à facilitação da escavação devido à umidade do solo22. Frequentemente, 1-5 semanas antes do voo nupcial, as entradas e canais do ninho são ampliados para facilitar a partida dos indivíduos reprodutivos. Antes de deixarem suas colônias-mães, as fêmeas aladas coletam e armazenam, em uma cavidade infrabucal, uma porção do fungo mutualístico20,27. Cópulas múltiplas são realizadas em pleno voo, e calcula-se que uma rainha pode ser inseminada por três a oito machos (ou seja, poliandria) em algumas espécies28, garantindo variabilidade genética29. Posteriormente, as rainhas seguem para o solo, dando preferência a locais com pouca ou nenhuma vegetação25, onde retiram suas asas e escavam sua primeira câmara de ninho. Este é o único período em que as rainhas podem ser vistas fora do ninho. Embora indivíduos da casta temporária tenham sido vistos em ninhos artificiais, não se sabe se alguma cópula bem-sucedida (ou seja, voo nupcial) foi realizada em condições de laboratório24.

A construção inicial do ninho corresponde ao período mais crucial da colônia, que pode durar de 6 h a 8 h23,25. Neste momento, a rainha enclausura-se na câmara inicial e, em questão de dias, começa a oviposição. Os primeiros ovos são alimentados ao micelial que a rainha regurgita, marcando o início do jardim de fungos da colônia. As primeiras larvas aparecem em aproximadamente 25 dias22 e, quase ao final do primeiro mês, a colônia consiste em um tapete de fungos em proliferação, onde nidificam imaturos (ovos, larvas e pupas), e a rainha, que cria sua prole inicial isoladamente23. Os ovos também são o recurso alimentar das primeiras larvas e altamente consumidos pela rainha13. Além disso, a rainha se sustenta com reservas de gordura corporal e catabolizando os músculos das asas que não são mais úteis13. A cultura inicial do fungo não é consumida, pois a sobrevivência da colônia depende de seu desenvolvimento e, durante esse período, a rainha a fertiliza com líquido fecal13. Dias após emergirem, as primeiras operárias abrem a entrada do ninho e iniciam uma atividade de forrageamento na área imediata do ninho13. Incorporam o material coletado como substrato da horta de fungos, que agora serve de alimento para os trabalhadores13,22. Antes de ser adicionado à cultura do fungo, o material vegetal transportado pelos trabalhadores é cortado em pequenos pedaços e umedecido com líquido fecal13. As formigas manipulam o inóculo do fungo para aumentar e controlar seu crescimento, que servirá para a partição de grandes câmaras escavadas no solo, especializadas em condicionar o jardim 13,22,25.

Cerca de 6 meses após o voo nupcial, os ninhos de A. sexdens contêm uma câmara de fungos e alguns canais. A grande especialização na construção de ninhos de formigas cortadeiras funciona como um mecanismo de defesa contra inimigos naturais e fatores ambientais desfavoráveis22. Sabe-se que as formigas cortadeiras fragmentam o jardim de fungos e o transpõem para câmaras com alta umidade quando as câmaras começam a secar13. Assim, apesar da escavação do ninho ter um custo energético considerável, a energia investida é revertida em benefícios para a própria colônia22. Com algumas exceções, as espécies de Atta também formam câmaras especializadas para os resíduos da colônia, feitas principalmente de substrato de fungos esgotados e corpos de formigas mortas, isolando-as do resto do ninho e estabelecendo uma importante estratégia de imunidade social30. Além disso, um grupo distinto de trabalhadores manipula o lixo diretamente, para evitar a contaminação de outros indivíduos. Os trabalhadores constantemente se alimentam para nutrir o fungo, que é o principal recurso nutricional da colônia. No entanto, eles também podem se alimentar de seiva de plantas enquanto cortam fragmentos. O material vegetal é cuidadosamente selecionado para a manutenção do jardim de fungos e influenciado por muitos fatores, como características foliares e propriedades do ecossistema13.

A estratégia de forrageamento de formigas cortadeiras para obtenção de material fresco é altamente complexa e, aliada à alta demanda de colheita das colônias estabelecidas, resulta em considerável perda econômica para os produtores agrícolas e compromete as áreas de restauração florestal22,31. Portanto, essas formigas podem ser categorizadas como pragas na maioria das áreas onde podem ser encontradas, desde o sul dos Estados Unidos até o nordeste da Argentina 11,13,22,32. A extinção de colônias problemáticas é desafiadora devido à série de adaptações inerentes à biologia desses insetos (ou seja, organização social, forrageamento, cultivo de fungos, higiene e estruturas complexas de ninhos)33. Assim, as estratégias de controle populacional são distintas daquelas geralmente aplicadas a outras insetos-praga, recorrendo principalmente a atraentes ofertas de iscas contaminadas33,34. No entanto, como essas formigas podem rejeitar substâncias nocivas tanto para o fungo quanto para os indivíduos da colônia, e comprometer os campos cultivados33, novos compostos naturais e alternativas de controle estão sendo constantemente testados 33,35,36. Como os resultados dos experimentos dificilmente podem ser monitorados em colônias testadas em campo, os ensaios preliminares são conduzidos em um ambiente controlado.

Assim, protocolos experimentais devem ser adaptados a grupos de interesse considerando o estilo de vida heterogêneo das formigas, subsidiando estudos em nível de espécie e contabilizando colônias como unidades operacionais, onde uma formiga é um elemento de um superorganismo complexo11. Os relatórios reunidos até agora sobre o gênero Atta tornaram possível coletar e manter com sucesso colônias em condições de laboratório e reconhecer suas necessidades básicas e funcionamento geral. Com base em seus processos naturais, como reprodução, fundação de colônias e comportamentos alimentares, foi desenvolvida uma rotina de práticas que permite o estabelecimento a longo prazo de colônias em diferentes tipos de ninhos. Aqui, um protocolo processual para manter formigas cortadeiras em laboratório é descrito e destaca possíveis pesquisas gerais com propósitos distintos de experimentação e divulgação científica.

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Protocol

1. Coleção de rainhas

  1. Pesquisa na literatura para o período da estação reprodutiva de Atta na região de interesse. A ocorrência da estação reprodutiva, a frequência e o horário diurno dos voos nupciais variam de acordo com as condições climáticas regionais (Tabela 1). Embora geralmente ocorra na primavera, essas informações devem ser coletadas para o local onde a coleta se destina a ocorrer 37,38,39,40,41,42,43,44,45,46.
  2. Identificar e marcar locais com ninhos de Atta considerados como possíveis áreas para coleta de rainhas e colônias jovens. Durante os voos nupciais, as rainhas são dispersas em torno dos locais dos ninhos; portanto, áreas com um maior número de colônias têm maiores chances de ter pontos de pouso de rainhas onde iniciam novas escavações de ninhos.
  3. Verifique as áreas selecionadas anteriormente para sinais de voo nupcial durante a estação reprodutiva das formigas Atta . Acompanhe as condições ambientais dos dias de voo nupcial, como o clima quente e chuvoso.
  4. Identifique ninhos de formigas cortadeiras nas áreas selecionadas anteriormente e procure características externas que indiquem a próxima partida de formigas reprodutivas aladas. As características do ninho incluem entradas de túneis alargadas (Figura 1), aumento do fluxo de trabalhadores mostrando comportamento mais agressivo em relação a possíveis predadores e formigas reprodutivas aladas aparecendo nas entradas do túnel (Figura 1). Cuidado com os dias de alta umidade que sucedem às chuvas, pois geralmente precedem os voos nupciais.
  5. Prepare recipientes com tampa de plástico com uma camada de gesso inferior para reter as rainhas individualmente. Certifique-se de que o volume do recipiente é de aproximadamente 200 mL, e a camada de gesso no fundo tem cerca de 1 cm de altura e é altamente absorvente para o controle da umidade.
    NOTA: Para preparar a base de gesso, siga as instruções do fabricante.
  6. Preparar um ambiente com temperatura constante de 23 ± 1 °C e aproximadamente 70% ± 10% de umidade relativa. Escolha um local sem atividades intensas e alto fluxo de pessoas para evitar vibrações e perturbações. Use produtos de limpeza de fragrância neutra para evitar qualquer interferência no comportamento das formigas.
    NOTA: Flutuações nas condições ambientais especificadas podem causar condensação de água ou perda de umidade e comprometer o jardim de fungos.
  7. Após o voo nupcial, colete rainhas sem asas que iniciaram a escavação do ninho e coloque-as cuidadosamente nos recipientes de plástico preparados com uma camada de gesso, individualmente. Evite tocar as rainhas com as mãos nuas e use luvas de látex ou pinças entomológicas.
    NOTA: A remoção das asas e o comportamento de escavação do solo indicam fêmeas reprodutivas que já copularam e, portanto, são capazes de iniciar uma nova colônia. A coleção Queens também é tratada como a primeira coleção desta obra.
  8. Mova os recipientes com as rainhas para o local com um ambiente controlado previamente selecionado. Realize o transporte das rainhas com a máxima cautela, evitando muita perturbação e mantendo uma temperatura mínima de constância.
  9. Não manipule ou mova as rainhas por aproximadamente 3 dias após a coleta para evitar o estresse.

Figure 1
Figura 1. Entrada do ninho alargada com reprodutores de formigas aladas e trabalhadores. As entradas alargadas do túnel são uma das características dos ninhos que indica a ocorrência de voos nupciais de Atta .  Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

2. Manutenção das rainhas

  1. Inicialmente, adicione 2,5 mL de água à camada de gesso do receptor a cada 2 dias com a ajuda de uma seringa de agulha.
    1. Em vez de abrir o recipiente, perfure cuidadosamente as tampas do recipiente com a agulha para evitar distúrbios devido à manipulação. O mesmo orifício pode ser usado durante este período. Certifique-se de que a água adicionada não mergulhe a camada de gesso. Evite regar diretamente a rainha, a esponja inicial do fungo e quaisquer imaturos. Enquanto o jardim de fungos exibir um aspecto seco com ausência de água, irrigue a camada de gesso.
  2. Duas semanas após a coleta, verifique se o fungo foi regurgitado pelas rainhas. Se não houver fungo, transfira aproximadamente 2 g de fungo obtido de uma colônia estabelecida. Além disso, execute esta etapa se o fungo não se desenvolver.
    NOTA: Para a transferência de fungos, é necessário coletar fungos saudáveis de uma colônia estabelecida e remover todas as formigas que possam estar nela. Use uma colher de sopa, pinça entomológica e luvas de látex para manipular o fungo.
  3. Após o aparecimento dos primeiros trabalhadores, comece a oferecer fragmentos de folhas jovens e finas regularmente, de acordo com a atividade de corte da colônia. Certifique-se de que as folhas oferecidas são saudáveis e as plantas não foram tratadas com inseticidas ou outras substâncias químicas. Nos estágios iniciais, certifique-se de que os fragmentos de folhas não tenham mais de 4 cm.
    NOTA: À medida que os primeiros trabalhadores iniciam o forrageamento foliar, o material vegetal deve ser oferecido após o seu aparecimento. A frequência de oferta depende da agilidade com que os trabalhadores incorporam o material vegetal no fungo, mas pode variar para 2-3 dias por semana. Flocos de aveia e flocos de milho também podem ser oferecidos, mas devem ser alternados com folhas para evitar a secura do fungo.
  4. Ao oferecer novas folhas, remova os resíduos da colônia e os fragmentos de folhas secas. Evite o uso de perfumes, hidratantes, cremes ou qualquer substância com odor forte ao manipular as rainhas. Além disso, use luvas de látex durante todos os processos.
  5. Siga o desenvolvimento da colônia e, quando o jardim de fungos atingir pelo menos metade do volume do recipiente, transfira a colônia para um ninho artificial perdurável.
    NOTA: Como a taxa de desenvolvimento é inerente a cada colônia, não há um tempo estimado para a transferência da colônia. Normalmente, as colônias da primeira coleção são transferidas para ninhos com câmara de jardim de fungos de 1L de volume máximo, devido ao pequeno jardim de fungos.

3. Coleção de colônias jovens

  1. Adquira recipientes plásticos de aproximadamente 500 mL de volume.
  2. Cerca de 6 meses após o voo nupcial, identificar montículos indicativos em forma de torre com partículas granuladas do solo (Figura 1) de ninhos incipientes de Atta (Figura 2) nos locais com ocorrência de formigas cortadeiras previamente marcadas.
    NOTA: Seis meses após o voo nupcial, estima-se que os ninhos de colônias jovens tenham até 1 m de profundidade no solo. Uma nova coleção é indicada neste período para alcançar maiores chances de colônias bem-sucedidas e duradouras em grandes quantidades.
  3. Com uma enxada de jardim, escava a entrada do ninho até chegar à câmara que contém a jovem colônia. Colete a rainha, o jardim de fungos, os imaturos e os jovens trabalhadores e coloque-os no recipiente de plástico. Execute o processo de coleta da forma mais suave possível.
    NOTA: Naturalmente, uma grande quantidade de solo também será coletada e deve ser removida gradualmente em futuros procedimentos de manutenção no laboratório.
  4. Mova os recipientes com tampa de plástico que seguram as colônias para o ambiente controlado designado. Realize o transporte de colônias jovens com a máxima cautela, evitando muita perturbação e mantendo uma constância de temperatura mínima. Abster-se de manipular ou mover as colônias por aproximadamente 3 dias para evitar o estresse. Se a sala tiver uma rotina ativa, um pano escuro pode ser colocado sobre as colônias.

Figure 2
Figura 2. Monte de solo em forma de torre. O monte característico em forma de torre indica a presença de colônias incipientes de Atta sexdens e Atta laevigata. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

4. Manutenção de colónias jovens

  1. Forneça folhas jovens e finas 3 vezes por semana.
    1. Certifique-se de que as folhas oferecidas são saudáveis e as plantas não foram tratadas com inseticidas ou outras substâncias químicas. Nesta fase, certifique-se de que os fragmentos foliares tenham pelo menos 7 cm de comprimento.
      NOTA: Flocos de aveia e flocos de milho também podem ser oferecidos, mas devem ser alternados com folhas para evitar a secura de fungos.
    2. A frequência de oferta depende da agilidade com que os trabalhadores incorporam o material vegetal no fungo. Com a atividade de corte sendo intensa, aumente a oferta duas vezes ao dia, três vezes por semana ou 5 dias por semana.
  2. Ao oferecer novas folhas, remova os resíduos da colônia, incluindo restos de solo, com a ajuda de uma colher. Use luvas de látex durante todos os processos. Ao manipular as colônias jovens, evite o uso de perfumes, hidratantes, cremes ou qualquer substância com odor forte.
    NOTA: Os próprios trabalhadores separarão o solo e os resíduos do fungo.
  3. Siga o desenvolvimento da colônia e, quando o jardim de fungos atingir pelo menos metade do volume do recipiente, transfira a colônia para um ninho artificial perdurável.
    NOTA: Como a taxa de desenvolvimento é inerente a cada colônia, não há um tempo estimado para a transferência da colônia.

Figure 3
Figura 3: Tipos de ninhos artificiais para abrigar colônias de Atta sexdens e Atta laevigata . Ilustração de ninhos artificiais perduráveis de formigas cortadeiras: configuração de ninho vertical de clausura, configuração de ninho horizontal de clausura e configuração de ninho de arena aberta. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

5. Ninhos artificiais perduráveis

  1. Prepare uma configuração de ninho vertical de clausura, conforme descrito abaixo (Figura 3 e Figura 4).
    NOTA: As configurações de ninho de clausura devem sempre ter recipientes diferentes para posar separadamente como (1) câmara de jardim de fungos, (2) câmara de eliminação de resíduos e (3) câmara de forrageamento. Inicialmente, deve começar com três recipientes, mas mais recipientes podem ser adicionados para aumentar o jardim de fungos. Os ninhos podem variar em tamanho e material de acordo com sua finalidade experimental, embora aqui seja descrito e recomendado o uso de materiais transparentes. Os recipientes devem estar sem aberturas, ou então as formigas escaparão. O tipo de ninho descrito abaixo pode ser utilizado para pesquisas gerais, mas não é bem recomendado para a coleta assertiva de formigas devido ao distúrbio causado ao retirar a tampa, resultando em grande agitação entre os indivíduos. No entanto, devido à transparência do material, é possível localizar a rainha e diferentes castas de formigas, mesmo quando o jardim de fungos encheu todo o recipiente. Por se tratar de uma tendência, assume-se sempre que os imaturos estão no centro do jardim de fungos quando este ocupa a maior parte do espaço disponível em recipientes verticais.
    1. Selecione um recipiente com tampa transparente de aproximadamente 1 L e adicione uma camada de 1 cm de base de gesso altamente absorvente. Esta será a câmara do jardim de fungos. Selecione dois recipientes transparentes com tampa de aproximadamente 500 mL cada para serem câmaras de eliminação de resíduos e forrageamento. As formigas escolherão qual câmara será cada uma e, depois disso, garantirão que elas não sejam trocadas.
      NOTA: Para preparar a base de gesso, siga as instruções do fabricante.
    2. Perfure e conecte os três recipientes com um tubo transparente ou uma mangueira. Se necessário, aplique fita adesiva na borda dos tubos para garantir uma conexão da coxa com os recipientes e evitar que as formigas escapem. Coloque o recipiente de base de gesso no meio e os outros recipientes em lados opostos.
    3. Transfira cuidadosamente a esponja de fungos de colônias selecionadas (ver etapa 2.5 e etapa 4.3) junto com a rainha, operárias e imaturas para o recipiente de base de gesso. Antes da transferência, certifique-se de que a base de gesso esteja regada. Use luvas de látex.
  2. Prepare uma configuração de ninho horizontal de clausura, conforme descrito abaixo (Figura 3 e Figura 4).
    NOTA: Ninhos com configuração horizontal permitem observar de perto o jardim de fungos e as atividades dos trabalhadores em direção a ele. Como porções mais jovens do jardim de fungos estão no topo, é possível observar substratos recentemente oferecidos sendo incorporados pelos trabalhadores. Novas porções do fungo podem ser manchadas por sua cor, que será semelhante à cor do último recurso oferecido, enquanto as porções mais antigas geralmente têm uma cor bege. Os filhotes e a rainha também podem ser facilmente localizados, pois em recipientes horizontais eles geralmente estão no topo do jardim de fungos, mesmo quando ocupou a maior parte do espaço. Essa configuração pode ser usada para fins de pesquisa focada no comportamento, amostragem focal e divulgação científica, pois dá percepção da organização dentro do ninho.
    1. Adquira um recipiente com tampa transparente com dimensões aproximadas de 31 cm x 21 cm x 4,5 cm e adicione uma camada de 1 cm de base de gesso altamente absorvente. Esta será a câmara do jardim de fungos. Selecione dois recipientes transparentes com tampa de aproximadamente 500 mL cada para serem câmaras de eliminação de resíduos e forrageamento. As formigas escolherão qual câmara será cada uma e, depois disso, garantirão que elas não sejam trocadas.
      NOTA: Para preparar a base de gesso, siga as instruções do fabricante. Se necessário, feche o pouco espaço entre a tampa e o recipiente com fita adesiva para evitar que as formigas escapem.
    2. Perfure e conecte os recipientes com um tubo transparente ou uma mangueira. Se necessário, aplique fita adesiva na borda dos tubos para garantir uma conexão da coxa com os recipientes e evitar que as formigas escapem. Coloque o recipiente de base de gesso no meio e os outros recipientes em lados opostos.
    3. Transfira cuidadosamente a esponja de fungos de colônias selecionadas (ver etapa 2.5 e etapa 4.3) junto com a rainha, operárias e imaturas para o recipiente de base de gesso. Antes da transferência, certifique-se de que a base de gesso esteja regada. Use luvas de látex.
  3. Prepare uma configuração de ninho de arena aberta, conforme descrito abaixo (Figura 3 e Figura 5).
    NOTA: Os ninhos de arena aberta permitem a coleta de formigas sem grande perturbação e análise do comportamento de forrageamento. Eles também podem fornecer uma representação confiável de uma colônia encontrada na natureza para fins de divulgação científica.
    1. Selecione um recipiente com tampa transparente de aproximadamente 1 L e adicione uma camada de 1 cm de base de camada de gesso altamente absorvente. Esta será a câmara do jardim de fungos.
      NOTA: Recomenda-se começar com recipientes de 1 L e gradualmente passar para recipientes com volumes mais altos para um jardim de fungos maior. No entanto, os recipientes não devem superar um volume de 5 L. Adicione quantos contêineres forem necessários.
    2. Selecione uma arena aberta. O tamanho da arena pode variar de acordo com os propósitos do estudo. Se uma grande arena for selecionada, coloque os recipientes que seguram o jardim de fungos em seu interior (Figura 5). No caso de uma pequena arena, conecte-a ao recipiente do jardim de fungos com uma mangueira ou tubo transparente (Figura 3). A arena servirá como uma câmara de forrageamento e eliminação de resíduos, portanto, certifique-se de que não seja muito pequena.
    3. Aplique uma camada de líquido de politetrafluoroetileno em um único movimento até a borda da arena para conter as formigas. Use um algodão embebido com o líquido e uma luva nitrílica.
      CUIDADO: Evite inalação e toque na pele ao usar líquido de politetrafluoroetileno.
    4. Transfira cuidadosamente a esponja de fungos de colônias selecionadas (ver etapa 2.5 e etapa 4.3) junto com a rainha, operárias e imaturas para o recipiente de base de gesso. Antes da transferência, certifique-se de que a base de gesso esteja regada. Use luvas de látex.

Figure 4
Figura 4: Ninhos artificiais de clausura das formigas cortadeiras Atta sexdens e Atta laevigata. Configuração vertical de clausura do ninho superior (A) e vista lateral (B); configuração do ninho horizontal de clausura superior (C) e vista lateral (D). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: Ninho artificial aberto das formigas cortadeiras Atta sexdens e Atta laevigata. Configuração de ninho de arena aberta de Atta sexdens superior (A) e vista lateral (B). 1) Câmaras de jardim de fungos; 2) Resíduos; 3) Fatias de laranja; 4) Vidro com camada de politetrafluoretileno (PTFE). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

6. Manutenção de colônias desenvolvidas

  1. Ofereça diariamente pelo menos uma folha grande na câmara de forrageamento por colônia com 1 L de jardim de fungos. Se a atividade de corte das formigas for intensa, aumente o número de folhas. Se o fungo estiver seco, pré-umedeça as folhas para fornecer umidade extra. Em ninhos de clausura, realize a oferenda rapidamente para evitar que as formigas escapem da câmara de forrageamento.
    NOTA: Aqui, as folhas são coletadas de espécies vegetais como amoreira (Morus nigra), manga (Mangifera indica), eucalipto (Eucalyptus sp.), jambolão (Syzygium cumini), hibisco (Hibiscus sp.), acalypha (Acalypha wilkesiana) e ligustrum (Ligustrum lucidum).
    1. Ofereça frutas como laranja e maçã, e flocos de aveia e milho para diversificar e complementar a dieta. Para grandes colônias com intensa atividade de forrageamento, ofereça flocos de aveia e flocos de milho diariamente, e frutas uma vez por semana. Se não for o caso, ofereça flocos alternadamente com folhas, mas não mais de três vezes por semana, e frutas uma ou duas vezes por mês. Ajuste a quantidade e a frequência de cada alimento de acordo com a atividade de forrageamento das formigas.
    2. Se as opções descritas acima não estiverem disponíveis, identifique a preferência de forrageamento das formigas entre folhas, flores e frutos de árvores e arbustos regionais, ou mesmo vegetais comercializados, grãos e outros flocos. Evite oferecer recursos com compostos químicos defensivos e pesticidas.
  2. Remova todo o conteúdo da câmara de resíduos a cada 2 semanas de todas as colônias. Remover trabalhadores também para fins de controle populacional. Se as operárias transferirem fungos saudáveis para a câmara de resíduos, certifique-se de que a rainha não esteja nela e remova-a. Se a quantidade de resíduos descartados for alta ou estiver muito úmida, remova-a uma vez por semana.
  3. Remova o material não retirado pelas formigas da câmara de forrageamento sempre que oferecer novas e certifique-se de que está sempre limpo.
    1. Se os trabalhadores transferirem fungos saudáveis para a câmara de forrageamento, perturbe-a, deixe a tampa do recipiente aberta e aplique pó de talco neutro na superfície da margem da câmara. Execute este procedimento apenas se ainda houver algum espaço na câmara do fungo, desta forma os trabalhadores transferirão o fungo de volta ao recipiente sem perdê-lo ou quaisquer imaturos.
  4. Se mais jardim de fungos for desejado, adicione outro recipiente rebocado e mova uma parte da esponja do fungo para ele. Até que o fungo atinja metade do recipiente, adicione folhas na câmara do fungo. O crescimento do jardim de fungos deve acontecer gradualmente para não comprometer o equilíbrio da colônia. Se um recipiente maior for desejado, certifique-se de deixar o fungo ocupar todo o espaço dos menores recipientes antes de transferi-lo. Resíduos de colônia e folhas secas não devem ser deixados se acumular na câmara do jardim de fungos.
  5. Verifique a base de gesso dos recipientes, pois com o tempo, ela pode adquirir uma cor marrom escura e se tornar ineficaz devido à excreção de formigas, transporte de resíduos e alta concentração de umidade. Além disso, algumas colônias podem cortar a camada e descartá-la. Nestes casos, transfira o jardim de fungos para um novo recipiente rebocado.

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Representative Results

Um fluxograma representando o processo de coleta de formigas é mostrado na Figura 6. Aqui, alguns resultados obtidos empregando o protocolo de coleta, manutenção e configurações de ninho descritos acima são mostrados.

Figure 6
Figura 6: Fluxograma para coleta de colônias de formigas cortadeiras. Seguindo o protocolo, a primeira coleta ocorre logo após o voo nupcial. As rainhas que removeram suas asas são coletadas e colocadas em um pequeno recipiente com uma base de gesso. Após 6 meses do voo nupcial, ocorre a segunda coleta. Rainhas que escavaram o solo e iniciaram com sucesso a fundação da colônia são coletadas. Depois que as colônias se desenvolvem, elas são transferidas para recipientes maiores e, opcionalmente, para diferentes configurações de ninho. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Influência do estado reprodutivo na resposta imune de rainhas-formiga-corta-folhas
Rainhas de diferentes espécies de formigas têm uma longa vida útil e, portanto, são mais propensas a serem expostas ao mesmo patógeno mais de uma vez47. Ao iniciar uma nova colônia, as rainhas Atta são isoladas e um trade-off entre reprodução e imunidade poderia reduzir o investimento nas defesas imunológicas dessas formigas fundadoras. Assim, sua resistência a patógenos pode estar relacionada ao seu estado reprodutivo47,48. Coletando rainhas em diferentes momentos de seu ciclo de vida inicial e introduzindo um fio de nylon no gaster dos indivíduos (Figura 7), foi possível avaliar a resposta de encapsulamento individual a patógenos e comparar a resistência imune entre rainhas virgens, rainhas recentemente acasaladas e rainhas que acasalaram há 6 meses no gaster dos indivíduos.

Figure 7
Figura 7: Ensaio de resposta de encapsulamento. Configuração do experimento que teve como objetivo avaliar a resposta imune individual da variação do encapsulamento de acordo com o estado de reprodução de rainhas Atta sexdens e Atta laevigata . Rainhas virgens, rainhas recém-acasaladas e rainhas que acasalaram há 6 meses receberam inserções de filamento de nylon entre o 4º e o 5º tergito do gaster para atuar como um antígeno. Os filamentos de nylon foram retirados após 24h e fotografados para quantificação da cobertura colorida. As rainhas foram coletadas antes do voo nupcial, logo após o voo nupcial e 6 meses após o voo nupcial, seguindo os passos dos tópicos 1, 2 e 3 do protocolo descrito. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Uma vez que as fêmeas não acasaladas aparecem apenas em eventos de voo nupcial, o estudo desses indivíduos nesse status de reprodução depende do conhecimento específico para prever a ocorrência do fenômeno particular e conhecer os protocolos de coleta e manutenção de formigas. Para garantir que os reprodutores ainda não haviam copular, os indivíduos foram coletados diretamente dos orifícios do ninho que tiveram suas entradas ampliadas para a saída dessas formigas (Figura 1). Como a identificação de reprodutores em nível de espécie é problemática, trabalhadores da mesma colônia foram coletados para validação. No caso dos indivíduos acasalados, as fêmeas que tiveram suas asas removidas e começaram a escavar o solo logo após o voo nupcial foram coletadas, assumindo que já haviam copular. Para ambas as etapas de reprodução, um elevado número de fêmeas foi coletado para garantir a quantidade de indivíduos testados, uma vez que a taxa de mortalidade neste momento é significativa. Uma vez que as formigas acasaladas se dispersaram da colônia original, as espécies foram identificadas por meio da comparação do perfil de hidrocarbonetos cuticulares49. Rainhas acasaladas por 6 meses desde o voo nupcial já iniciaram suas colônias, que neste momento consistem em um pequeno jardim de fungos, várias operárias e imaturas. Essas colônias do início da vida foram detectadas pelo distinto monte de solo em forma de torre (Figura 2). A coleta ocorreu seguindo as etapas descritas anteriormente na seção 3 "Coleção de colônias jovens". Para estudar as reprodutoras femininas nesta fase, era necessário manter a jovem colônia, uma vez que a rainha sozinha logo pereceria. A identificação foi feita utilizando-se os trabalhadores das colônias. Cerca de 200 rainhas foram coletadas no total, utilizando os protocolos descritos anteriormente.

Após cada coleta, as rainhas eram pesadas, medidas e logo recebiam as inserções de filamento de nylon, que eram retiradas 24 h depois para análise da capa colorida. Para as espécies de Atta laevigata , as rainhas que acasalaram há 6 meses apresentaram o filamento de nylon mais escuro, portanto, a maior taxa de encapsulamento e a defesa imunológica mais eficiente (Figura 8). No entanto, as rainhas recém-acasaladas coletadas logo após o voo nupcial, e as rainhas virgens coletadas antes do voo nupcial compartilharam aproximadamente a mesma taxa de encapsulamento (Figura 8). Assim, verificou-se que a defesa celular de encapsulamento em formigas Atta laevigata pode variar com o estado reprodutivo e o tempo decorrido após o acasalamento, mas não se altera com o peso e o comprimento da cabeça. Inicialmente, a pesquisa teve como objetivo coletar e comparar também as rainhas sexdens de Atta , mas não foi possível coletar rainhas virgens, uma vez que os ninhos identificados não tinham nenhuma atividade de reprodução nos buracos observados. Apesar da dificuldade, estudos gerais sobre os mecanismos de defesa celular dos reprodutores de formigas cortadeiras poderiam contribuir para o esclarecimento das respostas imunes dos insetos e para o aprimoramento dos métodos de controle atuais.

Preferência das formigas cortadeiras por subprodutos utilizados em iscas
Atualmente, o método de controle populacional mais aplicado das colônias de formigas cortadeiras é através da oferta de iscas tóxicas. Geralmente, estão associados a um atraente composto de origem vegetal, sendo a polpa cítrica a mais utilizada. No entanto, sabe-se que de alguma forma os trabalhadores podem associar a toxicidade da isca com o composto atraente após contato prévio e rejeitá-lo, tornando o método ineficiente. Portanto, propõe-se o uso de compostos atrativos alternativos como soja (100%), soja mais polpa cítrica (50%/50%) e caju mais polpa cítrica (50%/50%) para uma possível rotação entre iscas. Esses compostos foram selecionados após experimentos de preferência com colônias de Atta sexdens e Atta laevigata . Ninhos foram fixados com arenas de vidro e iscas livres de inseticida com diferentes composições foram oferecidas (Figura 9).

Figure 8
Figura 8: Taxa de encapsulamento de rainhas Atta sexdens e Atta laevigata em diferentes estágios reprodutivos. Os níveis de encapsulamento foram avaliados através do valor médio de cinza a partir de imagens dos filamentos de nylon inseridos no gaster dos indivíduos. Os fios mais escuros foram considerados como representando uma defesa celular eficiente, pois assumiu-se que mais hemócitos sobrepostos estavam revestindo o alvo, como mostrado no eixo X na figura. As rainhas acasaladas com Atta laevigata apresentaram o maior nível de encapsulamento (ANOVA, Tukey-Kramer, Desvio Padrão; p < 0,01; N=29), portanto, uma defesa imunológica individual eficaz. Observou-se que as rainhas recém-acasaladas e as rainhas virgens da mesma espécie apresentaram, da mesma forma, menores taxas de encapsulamento e, consequentemente, uma defesa imunológica individual menos eficaz. Os resultados obtidos sugerem que os eventos de acasalamento e estabelecimento de ninhos afetam as respostas imunes celulares de rainhas de Atta laevigata. As rainhas Atta sexdens apresentaram resultados contrários, e MQ apresentou o menor nível de encapsulamento (ANOVA, Tukey-Kramer, Desvio Padrão, P < 0,01; N = 46). No entanto, como as rainhas virgens da espécie não puderam ser coletadas, a comparação entre todos os grupos não foi possível. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 9
Figura 9: Ensaio de preferência das formigas cortadeiras por subprodutos de isca. Configuração de experimentos que tiveram como objetivo avaliar a preferência de Atta sexdens e Atta laevigata operária por iscas com diferentes subprodutos atrativos. Uma arena de vidro foi anexada à câmara de fungos para conter as diferentes iscas, que foram separadas por um divisor de vidro. 5 g de cada isca foram oferecidos em posições aleatórias, três de cada vez. As iscas foram pesadas após o término do experimento, o que ocorreu após 1 h de observação ou assim que uma isca foi completamente tomada pelos trabalhadores. A preferência foi avaliada pela atividade de carga, que foi estimada pela carga de isca removida da câmara de forrageamento. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

No total, foram utilizadas 32 colônias com aproximadamente 1 L de jardim de fungos. As colônias foram previamente coletadas e mantidas utilizando-se os protocolos descritos. Os tratamentos mais carregados de A. laevigata foram polpa cítrica, soja mais polpa cítrica (50%/50%) e caju mais polpa cítrica (50%/50%; Figura 10). Da mesma forma, os tratamentos mais carregados das formigas A. sexdens foram polpa cítrica, soja (100%) e soja mais polpa cítrica (50%/50%; Figura 10). Os resultados obtidos para as duas espécies mostraram que os subprodutos soja e caju foram os mais atrativos após a polpa cítrica, sugerindo que outras composições de iscas poderiam ser utilizadas para o controle químico populacional em formigas cortadeiras.

Figure 10
Figura 10: Porcentagem média de carga de iscas atraentes por trabalhadores de Atta laevigata e Atta sexdens . Da mesma forma, os tratamentos de polpa cítrica (100%), soja (100%) e soja mais polpa cítrica (50%/50%) foram os mais carregados para ambas as espécies. No entanto, o tratamento menos carregado para Atta sexdens (castanha de caju mais polpa cítrica) foi 60% carregado por trabalhadores de Atta laevigata . Ao longo do experimento, foram realizadas cinco repetições com cinco colônias de cada espécie. As iscas foram dispostas de forma diferente dentro das repetições; no entanto, a polpa cítrica esteve sempre presente como controle positivo. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Pesquisa e divulgação científica
Cerca de 350 rainhas e 100 colônias são coletadas anualmente para serem mantidas em laboratório desde o ano de 1990. Pelo menos três estagiários são designados para cuidar diariamente das formigas e, durante esse período, quase 250 colônias foram mantidas simultaneamente para fins experimentais e educacionais a cada ano. Durante os anos de 2016 a 2019, aproximadamente 2.020 alunos de cerca de 34 escolas puderam visitar o Laboratório de Formigas Cortadoras de Folhas (LAFC) e observar as colônias de formigas coletadas e mantidas usando os protocolos descritos anteriormente. As excursões tinham objetivos diferentes, da biologia geral à aprendizagem do comportamento social. Além da conhecida importância de insetos como formigas, as complexas estruturas físicas construídas por elas na natureza, também observadas em ninhos artificiais, são um exemplo de esforço coletivo e organização do trabalho que têm interesse educacional. Para cada nível de escolaridade (Figura 11) foi feita uma apresentação detalhada diferente, por vezes seguindo a abordagem sugerida pelos professores responsáveis pelos alunos. Para tanto, são mantidas duas colônias com a configuração de ninho de arena aberta, cada uma com aproximadamente 66 câmaras com 177 L de jardim de fungos (Figura 5). Infelizmente, as excursões foram canceladas durante a pandemia, mas é possível ver um interesse crescente entre os educadores, já que o número de alunos visitantes surgiu durante os últimos 4 anos relatados (Figura 12). No entanto, para manter o alcance científico durante a pandemia, foram feitas visitas virtuais por meio de plataformas de compartilhamento de vídeos. O vídeo50 que mostra como está dentro um ninho de formigas cortadeiras, feito em parceria com o canal Manual do Mundo, teve mais de 2,4 milhões de visualizações e mais de 3 mil comentários em menos de um ano. Lá, a biologia e a criação de formigas cortadeiras em laboratório foram abordadas.

Figure 11
Figura 11: Níveis de escolaridade dos alunos em excursões ao longo dos anos de 2016-2019. Número de alunos que estiveram presentes em excursões ao Laboratório de Formigas Cortadoras de Folhas durante o período de 2016-2019, de acordo com o nível de escolaridade. As excursões visaram diferentes abordagens envolvendo colônias de formigas cortadeiras que são mantidas no Laboratório de Formigas Cortadoras de Folhas. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 12
Figura 12: Número de alunos em excursões ao longo dos anos de 2016-2019. Número de alunos que estiveram presentes em excursões no Laboratório de Formigas Cortadoras de Folhas durante o período de 2016-2019. É possível ver um aumento no interesse das organizações educacionais pela realização de exposições de insetos vivos, como formigas, que permitem uma observação atenta pelos alunos. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Espécie Mês e Dia Ano Cidade Estado País Continente Latitude Longitude Referências
Atta bisphaerica 4 de novembro 1996 - - Brasil América do Sul - - 37
Atta capiguara 6 de outubro 2006 Botucatu São Paulo Brasil América do Sul 22° 50' 60" S 48° 26' 10" O 38
Atta capiguara 27 de outubro 2007 Botucatu São Paulo Brasil América do Sul 22° 50' 60" S 48° 26' 10" O 38
Atta capiguara Novembro 2008 Botucatu São Paulo Brasil América do Sul 22° 50' 60" S 48° 26' 10" O 39
Atta capiguara Novembro 2009 Botucatu São Paulo Brasil América do Sul 22° 50' 60" S 48° 26' 10" O 39
Atta cephalotes Março a Junho - Ilhéus Bahia Brasil América do Sul - - 40
Atta cephalotes Setembro - Ilhéus Bahia Brasil América do Sul - - 40
Atta colombica 4 de junho 1993 - Gamboa Panamá América Central - - 41
Atta colombica 7 de junho 1993 - Gamboa Panamá América Central - - 41
Atta colombica - 1998 - Gamboa Panamá América Central - - 42
Atta laevigata 6 de outubro 2006 Botucatu São Paulo Brasil América do Sul 22° 50' 60" S 48° 26' 10" O 39
Atta laevigata 27 de outubro 2007 Botucatu São Paulo Brasil América do Sul 22° 50' 60" S 48° 26' 10" O 39
Atta laevigata Novembro 2008 Botucatu São Paulo Brasil América do Sul 22° 50' 60" S 48° 26' 10" O 39
Atta laevigata Novembro 2009 Botucatu São Paulo Brasil América do Sul 22° 50' 60" S 48° 26' 10" O 39
Atta laevigata 15 de outubro 2016 Rio Claro São Paulo Brasil América do Sul - - Este trabalho
Atta laevigata 26 de outubro 2016 Rio Claro São Paulo Brasil América do Sul - - Este trabalho
Atta laevigata 31 de outubro 2017 Rio Claro São Paulo Brasil América do Sul - - Este trabalho
Atta laevigata 6 de novembro 2017 Rio Claro São Paulo Brasil América do Sul - - Este trabalho
Atta laevigata 22 de setembro 2018 Rio Claro São Paulo Brasil América do Sul - - Este trabalho
Atta laevigata 10 de outubro 2018 Rio Claro São Paulo Brasil América do Sul - - Este trabalho
Atta laevigata 10 de outubro 2019 Rio Claro São Paulo Brasil América do Sul - - Este trabalho
Atta laevigata * 21 de outubro 2020 Rio Claro São Paulo Brasil América do Sul - - Este trabalho
Atta laevigata 15 de novembro 2020 Rio Claro São Paulo Brasil América do Sul - - Este trabalho
Atta laevigata 20 de novembro 2020 Rio Claro São Paulo Brasil América do Sul - - Este trabalho
Atta laevigata 17 de outubro 2021 Rio Claro São Paulo Brasil América do Sul - - Este trabalho
Atta laevigata 25 de outubro 2021 Rio Claro São Paulo Brasil América do Sul - - Este trabalho
Atta opaciceps 8 de março 2022 Macaíba Rio Grande do Norte Brasil América do Sul - - **
Atta sexdens - 1986 até 1991 Viçosa Minas Gerais Brasil América do Sul 20,45° S 42,51° O 43
Atta sexdens 21 de outubro 2009 Botucatu São Paulo Brasil América do Sul 22° 49' 53,25" S 48° 25' 24.22" O 44
Atta sexdens 18 de setembro 2010 Rio Claro São Paulo Brasil América do Sul 22° 23' 70,50" S 47° 32' 54,40" O 45
Atta sexdens 31 de outubro 2010 Botucatu São Paulo Brasil América do Sul 22° 49' 53,25" S 48° 25' 24.22" O 44
Atta sexdens 10 de outubro 2011 Rio Claro São Paulo Brasil América do Sul 22° 23' 70,50" S 47° 32' 54,40" O 45
Atta sexdens 10 de outubro 2011 Botucatu São Paulo Brasil América do Sul 22° 23' 70,50" S 47° 32' 54,40" O 45
Atta sexdens 15 de outubro 2016 Rio Claro São Paulo Brasil América do Sul - - Este trabalho
Atta sexdens 26 de outubro 2016 Rio Claro São Paulo Brasil América do Sul - - Este trabalho
Atta sexdens 31 de outubro 2017 Rio Claro São Paulo Brasil América do Sul - - Este trabalho
Atta sexdens 6 de novembro 2017 Rio Claro São Paulo Brasil América do Sul - - Este trabalho
Atta sexdens 22 de setembro 2018 Rio Claro São Paulo Brasil América do Sul - - Este trabalho
Atta sexdens 10 de outubro 2018 Rio Claro São Paulo Brasil América do Sul - - Este trabalho
Atta sexdens 10 de outubro 2019 Rio Claro São Paulo Brasil América do Sul - - Este trabalho
Atta sexdens* 21 de outubro 2020 Rio Claro São Paulo Brasil América do Sul - - Este trabalho
Atta sexdens 15 de novembro 2020 Rio Claro São Paulo Brasil América do Sul - - Este trabalho
Atta sexdens 20 de novembro 2020 Rio Claro São Paulo Brasil América do Sul - - Este trabalho
Atta sexdens 17 de outubro 2021 Rio Claro São Paulo Brasil América do Sul - - Este trabalho
Atta sexdens 25 de outubro 2021 Rio Claro São Paulo Brasil América do Sul - - Este trabalho
Atta sexdens Novembro a Março - Ilhéus Bahia Brasil América do Sul - - 40
Atta texana | Maio 1992 Nacogdoche Texas EUA América do Norte 32° N 95° O 43
Atta vollenweideri - 2004 até 2010 - Formosa Argentina América do Sul 26° 18' S 58° 49' O 46
Atta vollenweideri 6 de outubro 2006 - Formosa Argentina América do Sul 26° 18' S 58° 49' O 46
Atta vollenweideri Outubro 2009 - Formosa Argentina América do Sul 25° 07' S 58° 10' O 46
Atta vollenweideri Novembro 2009 - Formosa Argentina América do Sul 25° 07' S 58° 10' O 46
Atta vollenweideri 8 de dezembro 2010 - Formosa Argentina América do Sul 26° 18' S 58° 49' O 46
Atta vollenweideri 24 de outubro - - Formosa Argentina América do Sul 26° 18' S 58° 49' O 46
* Apenas homens observados ** Mendonça, G. A., comunicação pessoal (dados não publicados)

Tabela 1: Registros dos períodos de voo nupcial de espécies de Atta. Os voos de acasalamento ocorrem em diferentes períodos e frequências de acordo com as regiões, porém geralmente ocorrem durante a primavera, conforme indicado em relatos coletados do território de ocorrência das formigas Atta 37,38,39,40,41,42,43,44,45,46. Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.

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Discussion

O protocolo aqui descrito para manter colônias de formigas cortadeiras vem sendo desenvolvido e aplicado há mais de três décadas de forma assertiva e replicável. Permitiu o desenvolvimento de pesquisas que seriam limitadas pelas condições de campo. Com isso, formigas e colônias saudáveis tornaram-se disponíveis para pesquisas em diversas áreas, como morfologia comparativa, toxicologia 51,52, histologia 53 e microbiologia54,55,56 no nível individual e de colônia. Sua manutenção no laboratório inclui vários procedimentos descritos aqui, que incluem a preparação do local sob condições abióticas favoráveis, coleta de rainhas e colônias jovens e cuidados contínuos.

Várias etapas são cruciais para o sucesso da manutenção de formigas cortadeiras em condições controladas. Rainhas e colônias nos estágios iniciais precisam de cuidados diferenciados e seguir os procedimentos iniciais detalhados pode garantir sua sobrevivência. Por exemplo, é necessário identificar o local onde as espécies são encontradas e o período em que os reprodutores alados iniciam o voo nupcial. Na América do Sul, a maioria dos voos de acasalamento ocorre durante a primavera (Tabela 1). Atualmente, a possibilidade de reprodução em cativeiro é extremamente baixa, pois é para registrar um voo nupcial em laboratório24. Além disso, as colônias de formigas cortadeiras na fase fértil são grandes e difíceis de escavar e, dada a arquitetura do ninho, é um desafio localizar e coletar a rainha6. Por exemplo, os ninhos de Atta laevigata podem ter até 67m2 de área de ninho e ocupar mais de 563 m2 de área de superfície interna dividida em 7.864 câmaras em 7 m de profundidade57.

A vantagem de coletar rainhas imediatamente após o voo nupcial é garantir um maior número de formas reprodutivas em um curto período de tempo e perto da superfície. A partir dessa primeira coleta, é possível desenvolver experimentos com formas reprodutivas (Figura 7), incluindo machos. Uma restrição técnica é a necessidade de coletar indivíduos reprodutivos em uma data incerta. Se a sobrevivência das rainhas é baixa, uma segunda coleção de colônias jovens torna-se necessária. Coletar colônias jovens alguns meses após o voo nupcial garante que a câmara da rainha não seja profunda na superfície. Nesta fase, restam apenas as rainhas com maior aptidão, pois suportaram a fase de escassez de alimentos e foram capazes de cuidar do fungo e das primeiras operárias durante a fase claustral 58,59,60,61. Em condições de laboratório, a taxa de sobrevivência das rainhas pode chegar a 14,5% nos meses iniciais, mesmo com fungos saudáveis transferidos para 90% das rainhas (dados não publicados). Dados semelhantes de sobrevida de Atta sexdens foram registrados por Mota-Filho62. Isso pode ser devido à falta de desenvolvimento de fungos ou contaminação natural com fungos entomopatogênicos63.

Uma das principais desvantagens da coleta de rainhas, ou colônias em estágios iniciais (Figura 6 e Figura 7) é a dificuldade na identificação taxonômica, pois pode ser feita mais facilmente por meio de grandes operárias12 que só emergem após alguns meses, quando há mais recursos para a alimentação larval. Algumas etapas críticas nesta técnica estão associadas a promover o crescimento do jardim de fungos, manter os ninhos limpos e evitar possíveis fugas. Algumas ações incluem a adição frequente de material vegetal fresco, que está constantemente sendo incorporado no fungo pelos trabalhadores. O fungo é utilizado como suprimento de glicose e amido para os trabalhadores, e como proteína para as larvas64. A remoção de materiais velhos e descartados, e a manutenção dos ninhos limpos, evita o aparecimento de possíveis microrganismos nocivos. Para evitar fugas, as conexões do tubo devem sempre ser verificadas e, no caso de arenas abertas, manter a camada de politetrafluoroetileno. A vantagem de manter colônias nas configurações de ninhos descritas para simular a estrutura real encontrada na natureza, com câmaras específicas para forrageamento e resíduos, e uma colônia com a organização social completa (ou seja, rainha, operárias e descendentes). Pesquisas realizadas com colônias sem rainha63,65 indicam que as operárias apresentam comportamentos distintos devido à ausência da rainha. Estudos comportamentais concluíram que a rainha é importante para a coesão da colônia, além da função reprodutiva66.

A implementação dos protocolos aqui abordados pode ser aplicada a outras espécies de interesse científico, como outras formigas produtoras de fungos do gênero Acromyrmex. Essas formigas cortadeiras também são consideradas pragas agrícolas em regiões específicas da América e, recentemente, atraíram mais interesse no desenvolvimento de colônias em estágio inicial67 e na interação de iscas tóxicas68 em pesquisas focadas. Embora este trabalho seja especificamente dirigido a formigas cortadeiras, o protocolo de manutenção e os diferentes tipos de ninhos descritos também podem ser aplicáveis a outros grupos de formigas. Cada seção do procedimento descreve as necessidades fundamentais das formigas que devem ser levadas em consideração ao preservá-las em condições controladas, tais como: identificar a dieta mais adequada; Oferecer alimentos a intervalos regulares numa câmara de forrageamento ou numa área específica; fornecer uma câmara de alto nível de umidade com base de gesso para manter a rainha e imaturos; evitar a fuga de formigas através de substâncias de contingência adicionadas às estruturas dos ninhos artificiais; remover materiais descartados pelas formigas dos ninhos; e transferir as colônias para outro ninho artificial quando necessário.

Ao longo da última década, universidades e pesquisadores têm se dedicado a ser mais inclusivos, convidando a sociedade a fazer parte dos laboratórios e de suas pesquisas69. Abraçando com grande determinação o propósito educacional, os laboratórios de formigas tornaram-se ferramentas para atrair a curiosidade das pessoas e conectar o mundo acadêmico com o conhecimento comum. Os tipos de ninhos apresentados neste trabalho podem ser utilizados em diferentes atividades dependendo do objetivo, como educação e exposições. Por exemplo, ninhos abertos (Figura 5) devem ser expostos aos visitantes da universidade, enquanto ninhos de clausura (Figura 4) são úteis para feiras de ciências e exposições itinerantes, devido à facilidade de transporte. Em todos os casos, o público em geral pode observar colônias de formigas, aprender sobre biologia básica e fatos divertidos e ser instigado a questionamentos. Em um nível mais expressivo, por meio de projetos de extensão como "Primeiros Passos na Ciência"69 os alunos podem, de fato, fazer parte das equipes de pesquisa. Consequentemente, os estudos de formigas com fins educacionais beneficiam o desenvolvimento do aluno, pois aprimoram a investigação e as experiências, incentivando um maior interesse na pesquisa científica.

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Disclosures

Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.

Acknowledgments

Dedicado a Mario Autuori (in memoriam) e Walter Hugo de Andrade Cunha que muito contribuíram para os estudos de formigas cortadeiras. Reconhecemos o apoio da Universidade Estadual Paulista e do Instituto de Biociências. Este estudo foi parcialmente financiado pela Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior-Brasil (CAPES) - Código Financeiro 001, Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) e Fundação para o Desenvolvimento da UNESP (Fundunesp).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Entomologic forceps N/A N/A N/A
Glass tank N/A N/A Tempered glass, custom made
Hose N/A N/A Transparent, PVC 1/2 Inch x 2,0 mm
Latex gloves Descarpack 550301 N/A
Nitrile gloves Descarpack 433301 N/A
Open arena N/A N/A Polypropylene crate
Plaster pouder N/A N/A Plaster pouder used in construction, must be absorbant
Plastic Containers for collection Prafesta Natural Cód.: 8231/Natural Cód.: 8262 Lidded, transparent , polypropylene
Plastic containers for nests Prafesta Discontinued Polystyrene, hermetic
Teflon Dupont N/A Polytetrafluoroethylene liquid (PTFE Dispertion 30)

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References

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Biologia Edição 186
Coleta e Manutenção a Longo Prazo de Formigas Cortadeiras (<em>Atta</em>) em Condições de Laboratório
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Nogueira, B. R., de Oliveira, A. A., … More

Nogueira, B. R., de Oliveira, A. A., da Silva, J. P., Bueno, O. C. Collection and Long-Term Maintenance of Leaf-Cutting Ants (Atta) in Laboratory Conditions. J. Vis. Exp. (186), e64154, doi:10.3791/64154 (2022).

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