Summary
Vi leverer detaljerede metoder til generering af fire typer væv fra humane mesenkymale stamceller, som bruges til at rekapitulere brusk, knogle, fedtpude og synovium i det menneskelige knæled. Disse fire væv er integreret i en tilpasset bioreaktor og forbundet via mikrofluidik, hvilket genererer et knæled-på-en-chip.
Abstract
Den høje forekomst af invaliderende ledsygdomme som slidgigt (OA) udgør en høj socioøkonomisk byrde. I øjeblikket er de tilgængelige lægemidler, der er målrettet mod ledlidelser, for det meste palliative. Det uopfyldte behov for effektive sygdomsmodificerende OA-lægemidler (DMOAD'er) skyldes primært manglen på passende modeller til undersøgelse af sygdomsmekanismerne og testning af potentielle DMOAD'er. Heri beskriver vi etableringen af et miniature synovialt led-efterlignende mikrofysiologisk system (miniJoint) bestående af fedt-, fibrøse og osteokondrale vævskomponenter afledt af humane mesenkymale stamceller (MSC'er). For at opnå de tredimensionelle (3D) mikrovæv blev MSC'er indkapslet i fototværbindende methacryleret gelatine før eller efter differentiering. De cellebelastede vævskonstruktioner blev derefter integreret i en 3D-printet bioreaktor, der dannede miniJoint. Separate strømme af osteogene, fibrogene og adipogene medier blev introduceret for at opretholde de respektive vævsfænotyper. En almindeligt delt strøm blev perfuseret gennem brusk, synoviale og fedtvæv for at muliggøre vævskrydstale. Dette strømningsmønster tillader induktion af forstyrrelser i en eller flere af vævskomponenterne til mekanistiske undersøgelser. Desuden kan potentielle DMOAD'er testes via enten "systemisk administration" gennem alle mediestrømme eller "intraartikulær administration" ved kun at tilføje lægemidlerne til det delte "synovialvæske"-simulerende flow. Således kan miniJoint fungere som en alsidig in vitro-platform til effektivt at studere sygdomsmekanismer og teste lægemidler i personlig medicin.
Introduction
Fælles sygdomme som slidgigt (OA) er meget udbredt og invaliderende og repræsenterer en førende årsag til handicap på verdensplan1. Det anslås, at OA alene i USA påvirker 27 millioner patienter og forekommer hos 12,1% af voksne i alderen 60 år og derover2. Desværre er de fleste lægemidler, der i øjeblikket bruges til at håndtere ledsygdomme, palliative, og der findes ingen effektive sygdomsmodificerende OA-lægemidler (DMOAD'er)3. Dette uopfyldte medicinske behov skyldes primært, at der ikke findes en effektiv model til undersøgelse af sygdomsmekanismerne og udvikling af potentielle DMOAD'er. Den konventionelle todimensionelle (2D) cellekultur afspejler ikke ledvævets 3D-natur, og kulturen af vævseksplanter hindres ofte af betydelig celledød og replikerer normalt ikke de dynamiske vævsforbindelser4. Derudover reducerer genetiske og anatomiske forskelle signifikant den fysiologiske relevans af dyremodeller4.
Organ-on-chips (OoC'er) eller mikrofysiologiske systemer er et lovende forskningsfelt i grænsefladen mellem teknik, biologi og medicin. Disse in vitro-platforme er minimale funktionelle enheder, der replikerer definerede sunde eller patologiske træk ved deres in vivo-modstykker 5. Desuden kan disse miniaturiserede systemer være vært for forskellige celler og matricer og simulere de biofysiske og biokemiske interaktioner mellem forskellige væv. Derfor lover et mikrofysiologisk system, der trofast kan rekapitulere det oprindelige synoviale led, at tilbyde en effektiv platform til modellering af ledsygdomme og udvikling af potentielle DMOAD'er.
Humane mesenkymale stamceller (MSC'er) kan isoleres fra mange væv i hele kroppen og differentieres til osteogene, kondrogene og adipogene slægter6. MSC'er er med succes blevet brugt til at konstruere forskellige væv, herunder knogle-, brusk- og fedtvæv6, hvilket betyder, at de repræsenterer en lovende cellekilde til konstruktion af knæleddets vævskomponenter. Vi har for nylig udviklet et mikrofysiologisk miniaturesystem, der efterligner leddene, kaldet miniJoint, der omfatter MSC-afledt knogle-, brusk-, fibrøst- og fedtvæv7. Især muliggør det nye design vævskrydstale ved mikrofluidisk strømning eller gennemtrængning (figur 1). Heri præsenterer vi protokollerne for fremstilling af chipkomponenterne, konstruktion af vævskomponenterne, kulturen af det manipulerede væv i chippen og indsamling af væv til downstream-analyser.
Figur 1: Skematisk oversigt over miniJoint-chippen, der viser arrangementet af de forskellige vævskomponenter og mediestrømme. OC = osteokondralt væv. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Følgende protokol følger de etiske retningslinjer fra University of Pittsburgh og den menneskelige forskningsetiske komité ved University of Pittsburgh. Oplysninger om de materialer, der anvendes i denne undersøgelse, er anført i materialetabellen.
1. Fremstilling af 3D-printede bioreaktorer
- Brug en computersoftware til at designe osteochondral (figur 2A) og miniJoint bioreaktorer (figur 2B), der omfatter kamre, indsatser og låg. Dimensionsoplysningerne for hver del er vist i figur S1.
- Overfør designet til en 3D-printer, og udskriv med en fotopolymerblæk.
- Skyl de 3D-printede dele (figur 2C-F) med 15 ml 95% ethanol tre gange. Derefter krydsbindes de trykte stykker fuldstændigt i 200 s i en lommelygtepolymerisationsanordning.
- Tilføj O-ringe til indsatser og låg (figur 2C, D), og test, om delene passer (figur 2G, H).
Figur 2: Fremstilling af de forskellige komponenter til fremstilling af miniJoint bioreaktoren. (A,B), 3D-modeller af bioreaktorer til fremstilling af (A) osteochondral og (B) miniJoint chips. (C,D) 3D-printede (C) låg og (D) indsatser med O-ringen installeret. (E,F) 3D-printede kamre til (E) osteochondral og (F) miniJoint vævskultur. (G,H) Samling af (G) osteochondral og (H) miniJoint chips. Klik her for at se en større version af denne figur.
2. Konstruktion af vævskomponenterne
BEMÆRK: Processerne til fremstilling af lithiumphenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinat (LAP) og methacryleret gelatine (GelMA) er beskrevet i tidligere undersøgelser 8,9.
- Følg nedenstående trin for at oprette GelMA.
- Der tilsættes 17 g gelatine type B til 500 ml destilleret vand, og blandes derefter på en ryster i 30 minutter ved 37 °C.
- Derefter tilsættes 13 ml methacrylsyreanhydrid, anbringes tilbage på 37 °C-rysteapparatet, og det omrystes natten over.
- Den følgende dag alikvote GelMA i individuelle dialyseposer med ~ 60 ml i hver pose.
- Læg alle dialyseposerne i destilleret vand med en omrøringsstang, og lad det være 7 dages dialyse. Skift vand flere gange om dagen, og lad poserne stå ved 4 °C natten over.
- På dag 7 fryses GelMA ved -80 °C. Når den er helt frosset, fortsæt til frysetørring.
- Anbring GelMA i en skål i vakuumkammeret på en lyofilisator, og lad den frysetørre. Sørg for, at GelMA er helt tørret, før det fjernes fra lyofilizeren.
- Opløs GelMA i Hanks afbalancerede saltopløsning (HBSS med Ca 2+ og Mg2+) ved 15% (w/v). For at sikre, at pH-værdien er på 7,4, tilsættes NaOH i små mængder, indtil pH-værdien når 7,4. Suppler opløsningen med 1x antibiotika-antimykotisk og 0,15% (w / v) LAP baseret på det erhvervede volumen. Opbevar 15% GelMA opløsningen ved -20 °C indtil brug, og beskyt den mod lys.
- Anbring 3D-printede dual-flow bioreaktorkamre, låg og indsatser i autoklaveposer, og autoklav ved 121 °C i 20 minutter med damp og derefter i 20 minutter med tør varme.
- Inde i det biologiske sikkerhedsskab blødlægges bioreaktorkamrene, lågene og indsatserne i 15 ml sterilt fosfatbufret saltvand natten over, hvorefter de tørrer.
- Isoler humane knoglemarvsafledte MSC'er fra det samlede ledartroplastikkirurgiske affald med IRB-godkendelse (University of Pittsburgh og University of Washington).
- Skyl specifikt knoglemarven ud af den trabekulære knogle i lårbenets hals og hoved og resuspender den i Dulbeccos modificerede ørnemedium (DMEM).
- Centrifuger suspensionen gennem en 40 μm si, og centrifuger gennemstrømningen ved 300 x g i 5 min.
- Supernatanten fjernes, pellets resuspenderes med vækstmedium [DMEM, 10% føtalt bovint serum (FBS) og 1x antibiotika-antimykotisk], og anbringes derefter i vævskulturkolber.
- Skift kulturmediet hver 3. dag til 4 dage. Sørg for, at der opnås et sammenløb på 70% til 80%, før du går videre.
- Afmonter cellerne ved at inkubere med trypsin-EDTA i 2-3 minutter og passere i et forhold på 1 million celler pr. T150-kolbe.
- Udvid cellerne til P5. Efter trypsinisering suspenderes cellerne, tælles og pelleteres derefter ved centrifugering ved 300x g i 5 min.
- Med en pipette på 1.000 μL resuspenderes cellerne ved 20 x 106 celler/ml i 15 % GelMA-opløsning.
BEMÆRK: Sluk lyset i det biologiske sikkerhedsskab. - Brug sterile handsker til at trykke en steril, tør silikoneform mod en petriskål. Sæt derefter en indsats i hvert hul i silikoneformen med tang, med hulsiden af indsatsen nedad.
- Brug en 200 μL pipette til at tilsætte cellesuspensionen for at fylde indsatsen (~50 μL pr. indsats).
- Brug en UV-lommelygte (LED-lys med en bølgelængde på 395 nm) til at krydsbinde toppen af gelen/indsatsen i 1,5 min. Oplys derefter den anden side i 30 s. Tværbinding opstår, når LAP-fotoinitiatoren udsættes for UV-lys.
BEMÆRK: Cellesuspensionen kan opbevares i inkubatoren i denne periode eller beskyttes mod lys. - Med sterile pincet overføres indsatserne straks til 8 ml vækstmedium i en ikke-vævskultur 6-brøndplade (DMEM suppleret med 10% [v / v] FBS og 1x antibiotika-antimykotisk) for at lade cellerne komme sig natten over.
- Differentier cellerne mod fire slægter.
- For at konstruere fedtvæv (AT) skal du overføre indsatserne til 8 ml adipogent medium (AM; Alfa-MEM, 10% FBS, 0,2 mM indomethacin, 1x insulin-transferrin-selen (ITS), 0,45 mM 3-isobutyl-1-methylxanthin, 0,1 μM dexamethason og 1x antibiotika-antimykotisk) for at initiere differentiering. Ideelt set placeres fire indsatser i en enkelt brønd i en ikke-vævskulturbrøndplade med 8 ml adipogent medium. Dyrk cellerne i brøndpladerne i 28 dage, med mellemstore ændringer hver anden dag.
- For at konstruere osteokondrale enheder (OC) skal du placere indsatserne i dobbeltstrøms bioreaktorkamre, dække brøndene og infundere de to strømme separat med en strømningshastighed på 5 μL / min med 35 ml osteogent medium (OM; DMEM, 10% FBS, 1x antibiotika-antimykotisk, 0,1 μM dexamethason, 0,01 M β-glycerophosphat, 100 ng / ml knoglemorfogent protein 7 (BMP7), 50 μg / ml ascorbinsyre og 10 nM vitamin D3) og 35 ml kondrogent medium (CM; DMEM, 1x antibiotika-antimykotikum, 1x ITS, 0,1 μM dexamethason, 40 μg/ml prolin, 50 μg/ml ascorbinsyre og 10 ng/ml transformerende vækstfaktor β3)10. Oprethold celledifferentiering i 28 dage ved at udføre medieændringer hver anden uge.
- For at udlede fibroblasterne differentieres MSC'erne i 2D-kultur over 21 dage i en T150 cm 2-vævskulturkolbe ved hjælp af 20 ml fibrogent medium (FM; avanceret DMEM, 5% FBS, 1x GlutaMAX, 1x antibiotika-antimykotisk og 50 μg / ml ascorbinsyre). Skift mediet hver uge. Brug 4 ml trypsin til at løsne cellerne og indkapsle 3D-gelerne i indsatserne efter protokollen beskrevet ovenfor for at opnå synovialt lignende fibrøst væv (SFT).
BEMÆRK: Sammensætningerne af alle differentieringsmedier findes i tabel 1.
3. Etablering af miniJoint chippen
- Autoklave 3D miniJoint bioreaktorkamre, silikonerør med en 0.062 tommer indvendig diameter og en 0.125 tommer ydre diameter og F 1/16 Luer-lock-stik. Tilslut silikoneslangen til miniJoint bioreaktormodhagen i den ene ende, og tilslut Luer-låsen i den anden ende.
- Forbered AM, OM (fjernelse af BMP7) og FMCM nævnt i trin 2.11. Derudover forberede det fælles delte medium (SM; phenol rødfri DMEM, 1x antibiotika-antimykotisk, 1x Na-pyruvat, 1x ITS, 40 μg / ml prolin, 50 μg / ml ascorbinsyre og 0,5 ng / ml transformerende vækstfaktor β3), der skal bruges til miniJoint kulturen. Læg 35 ml af hvert medium i mediumbeholderne.
- Brug lige tang til at overføre osteokondrale enhed fra dual-flow bioreaktoren til højre brønd i miniJoint bioreaktoren. Overfør fedtvævsindsatsen og fibrøst vævsindsats i henholdsvis venstre og midterste brønde. Sæt alle brøndene på med steriliserede låg.
- Tilslut indløbene på miniJoint-chippen til mediumbeholderne og udløbene til sprøjter (figur 3A-C).
- Monter sprøjterne på en sprøjtepumpe (figur 3C), og overfør pumpen og chipsene til en inkubator. De mellemstore reservoirer holdes på is uden for inkubatoren.
- Betjen pumpen i tilbagetrækningstilstand, træk mediet fra mediumbeholderen ind i miniJoint bioreaktorkammeret. Denne miniJoint kulturproces varer 28 dage.
- For at modellere ledbetændelse og bruskdegeneration tilsættes interleukin 1β (IL-1β) til den fibrogene mediestrøm ved 10 ng / ml. Udskift sprøjterne på den tredje dag af IL-1β-behandlingen, og giv frisk IL-1β til det fibrogene medium. Behandlingen varer i 7 dage.
- Under lægemiddeltesttrinnet, efter 3 dages IL-1β-behandling, skal du administrere lægemidlet enten i det delte medium, simulere en "intraartikulær administration" (figur 3D), når lægemidlet anvendes lokalt i knæleddet eller i alle medietyper, der simulerer en "systemisk administration" (figur 3E), når lægemidlet virker på knæleddet gennem cirkulationen.
- Saml individuelle væv til analyse efter 7 dages IL-1β-behandling, uanset om prøverne har gennemgået lægemiddelbehandling i de foregående 4 dage.
Figur 3: Samling af miniJoint. (A,B) Vævsspecifikke medier indføres fra indløb 1-3 (I1-3) og flyttes ud fra udløb 1-3 (O1-3). Det delte medium er perfuseret fra I4 til O4. (C) Den fulde opbygning af miniFælleskulturen. Lægemidler (grønne sollignende former) kan enten introduceres i (D) det delte medium kun eller (E) alle medier for henholdsvis at simulere "intraartikulær administration" eller "systemisk administration". Klik her for at se en større version af denne figur.
4. Individuel vævsindsamling
- Brug sterile buede tang til at fjerne indsatserne.
- Skub en biopsi stans gennem midten af indsatsen for at fjerne gelen, og læg gelen i PBS.
- Skær osteochondralgelerne i halve, når man vurderer genekspressionen.
BEMÆRK: Da osteochondral gel består af to vævstyper, er det vigtigt at adskille de osteogene og kondrogene celler. - Saml de konditionerede medier og væv til forskellige eksperimenter.
- Opsaml omkring 1,5 ml fra hver mediekilde.
- Flash-frys det konditionerede medie i flydende nitrogen efter centrifugering ved 14.000 x g i 10 minutter og kassering af sedimentet.
- Til histologisk farvning og immunfarvning fastgøres først OC- og SFT-prøverne i 10% bufret formalin, dehydreres i ethanol med stigende koncentrationer, ryddes i xylen, indlejres i paraffin, og til sidst skæres dem i en tykkelse på 6 μm.
- For AT-mikrovævene fastgøres prøverne i 10% bufret formalin og pletter dem direkte med Oil Red O-opløsning eller BODIPY.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Alle væv i miniJoint blev indsamlet for at analysere deres fænotyper efter 28 dages kultur i miniJoint (figur 4A). Dette er blevet beskrevet i vores tidligere publikation7.
Gennem brug af RT-qPCR, immunfarvning og histologisk farvning blev det bekræftet, at de vævsspecifikke fænotyper var godt vedligeholdt for de enkelte mikrovæv (figur 4). For eksempel udtrykte den osseøse komponent i OC-mikrovævene (OC-O), men ikke de andre vævskomponenter, høje niveauer af osteocalcin (OCN). I modsætning hertil blev kollagen type II (COL2) og aggrecan (ACAN) udtrykt i bruskdelen af osteokondrale væv (OC-C) i signifikant højere niveauer end i de andre væv (figur 4B). Ekspressionsniveauerne af adiponectin (ADIPOQ) og leptin (LEP), to repræsentative adipogene gener, var meget højere i AT end i de andre væv. Aflejringen af calciummineraler (figur 4F,G) samt alkalisk fosfatase (ALP) og OCN-proteiner (figur 4D) sås primært i OC-O, og OC-C viste velbevaret glycosaminoglycan (GAG) (figur 4C) og COL2 (figur 4D). Derudover viste ekspressionen af to chondrocythypertrofiassocierede markører, kollagen type X (COL10) og indisk pindsvin (IHH), som blev påvist i OC-C på dag 28, at være signifikant nedreguleret efter 28 dages kultur i miniJoint (figur 4E).
Resultaterne af RT-qPCR, immunfarvning og histologi bekræftede, at fænotyperne af AT og SFT med succes blev opretholdt efter 4 ugers miniJoint kultur (figur 4B, H, I). Ved hjælp af BODIPY-farvning og Oil Red O-farvning observerede vi rigelig lipiddråbeaflejring i AT (figur 4H). Immunofluorescensfarvningsbillederne i figur 4I viser robust lubricin og cadherin 11 (CDH11) ekspression af SFT efter 4 ugers miniJoint kultur.
I kombination indikerer disse resultater oprettelsen af en funktionel, multi-væv synovial fælles model i miniJoint systemet.
Figur 4: Vedligeholdelse af de enkelte vævsfænotyper i mikrovævene efter 4 ugers samkultur i miniJoint-chippen. (A) Tidslinje for generering af en normal miniJoint chip med de vævsspecifikke fænotyper opretholdt. B) RT-qPCR-resultater, der viser vigtige markørgener i alle vævskomponenterne. OCN-dataene blev normaliseret til værdierne i OC-O-, COL2- og ACAN-dataene til værdierne i OC-C, ADIPOQ- og LEP-dataene til værdierne i AT og TNC- og COL1-dataene til værdierne i SFT. Dataene blev analyseret af envejs ANOVA (N = 3 biologiske replikater). * p < 0,05; ** p < 0,01; p < 0,001; p < 0,0001. C) Safranin O-farvning af den bifasiske OC-enhed. Skalabjælke = 1 mm. (D) Histologiske farvnings- og immunfarvningsbilleder, der bekræfter tilstedeværelsen af knoglespecifikke og bruskspecifikke markører i de tilsvarende komponenter i OC-enheden. Skalabjælke = 50 μm. (E) Immunfarvning, der viser meget lavere ekspression af to hypertrofimarkører, COLX og IHH, i OC-C på dag 56 end på dag 28. Skalastang = 50 μm. (F) Alizarin Rød farvning af OC-enheden, der viser tilstedeværelsen af calciumaflejringer primært i OC-O. Skalabjælke = 500 μm. (G) Forstørrede visninger af Alizarin Red-farvningsbilledet i (F). Skalabjælke = 200 μm. (H) Oil Red O og BODIPY farvningsbilleder, der viser tilbageholdelsen af lipiddråber i AT. Skalabjælke = 50 μm. (I) Immunfarvningsbilleder, der viser ekspressionen af lubricin og CDH11 af det synoviallignende fibrøse væv (SFT). Skalabjælke = 50 μm. Gengivet med tilladelse fra Li et al.7. Klik her for at se en større version af denne figur.
For at skabe en sygdomsmodel blev interleukin 1β (IL-1β) introduceret til FM-strømmen efter 28 dages samkultur (figur 5A, B). IL-1β-behandling resulterede i celleapoptose og forhøjede MMP-13-niveauer i SFT (figur 5C). Interessant nok observerede vi nedbrydning af brusk i miniJoint behandlet af IL-1β (figur 5D), hvilket tyder på forekomsten af krydstale mellem OC-C og SFT.
Figur 5: Modellering af ledbetændelse og degeneration i miniJoint . (A) Skematisk visning af induktion af "synovitis" ved at udfordre SFT med IL-1β. (B) Tidslinje for etablering og analyse af sygdomsmodellen. C) TUNEL-assay og MMP-13-immunfarvning, der viser de patologiske forandringer i SFT. DNA-fragmentering er angivet med de røde pilespidser. Skalabjælke = 50 μm. (D) Safranin O-farvnings- og MMP-13-immunfarvningsbilleder, der viser degenerationen af OC-C. Skalabjælke = 50 μm. Gengivet med tilladelse fra Li et al.7. Klik her for at se en større version af denne figur.
Endelig testede vi den terapeutiske effekt af naproxen (NPX) gennem "systemisk administration" (figur 6A), hvilket viste sig at reducere brusknedbrydning i det IL-1β-behandlede miniJoint (figur 6B). Vi undersøgte også fire andre potentielle DMOAD'er gennem "intraartikulær administration" (figur 6A). Resultaterne fra PCR i realtid indikerede, at disse fire forbindelser var i stand til delvist at vende brusktabet (figur 6C).
Figur 6: Test af lægemidler via "systemiske" og "intraartikulære" ruter i den etablerede sygdomsmodel. (A) Skematisk visning af de to forskellige lægemiddeladministrationsveje, herunder "systemisk administration" af naproxen (NPX) og "intraartikulær administration" af fibroblastvækstfaktor 18 (FGF18), SM04690, sclerostin (SOST) og IL-1-receptorantagonist (IL-1RN). (B) Safranin O- og MMP-13-farvningsbilleder, der viser lindret OC-C-degeneration efter NPX-behandling. Skalabjælke = 50 μm. (C) Genekspression i OC-C efter "intraartikulær administration" af fire forskellige lægemidler. De statistiske forskelle mellem hver lægemiddelbehandlet gruppe og kontrolgruppen er angivet med * p < 0,05; ** p < 0,01; p < 0,001; og **** p < 0,0001. Dataene blev analyseret ved hjælp af elevens t-test (N = 4 biologiske replikater). Gengivet med tilladelse fra Li et al.7. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne artikel præsenterer vi en protokol til oprettelse af et knæled-på-en-chip-system, hvor knogler, brusk, fedtvæv og synoviumlignende væv dannes fra MSC'er og dyrkes sammen i en tilpasset bioreaktor. Dette multikomponent, humane celleafledte system med plug-and-play-funktioner repræsenterer et nyt værktøj til at studere patogenesen af ledsygdomme og udvikle lægemidler.
I betragtning af at forskellige væv favoriserer specifikke kulturmedier, er det afgørende at tilvejebringe det respektive medium for hvert væv og forhindre fri medieudveksling mellem strømme. Især under dannelsen af bifasiske osteochondralvæv bestemmes skæbnen for naive MSC'er af det medium, som de udsættes for. I det nuværende design bruger vi en gelatinebaseret hydrogel som stillads, som giver en skabelon til cellevækst og forsegler det potentielle mellemrum mellem vævene og skærets vægge. Derfor er det afgørende at in situ fototværbinde gelen i indsatserne. Derudover suppleres vækstfaktorer som BMP7 og TGFβ3 i henholdsvis det osteogene medium og chondrogenmediet. For at opretholde deres bioaktiviteter i flere dage skal de friske medier opbevares uden for inkubatoren, inden de introduceres til chipkulturen. Derfor er vi nødt til at bruge sprøjter til at trække medierne ud af reservoirerne i stedet for at infusere medierne i inkubatoren.
Et andet kritisk punkt under håndtering af bioreaktoren er at undgå unødvendigt pres. Vævene er afhængige af fysisk binding til indsatsvæggen for at forblive på plads. Da de udsættes for de øverste og nederste mediestrømme, hvis en fase af strømmen har et højere tryk, kan det skubbe vævene ud af indsatserne, hvilket resulterer i lækage. Derfor er et blidt tryk på sprøjten kritisk under håndteringsprocesserne, såsom ved fjernelse af bobler. Hvis hydrogelstilladset skubbes ud, kan det sættes tilbage, yderligere uhærdet hydrogel kan påføres for at udfylde hullet, og det kan helbredes, hvilket giver mulighed for en sikker og fast stilladspasning i indsatsen.
På grund af dets dokumenterede biokompatibilitet bruges gelatinebaserede stilladser til at skabe alle fire væv i det nuværende system. Det skal bemærkes, at gelatine muligvis ikke repræsenterer det bedste materiale til understøttelse af vævsdannelse. Derfor kan andre typer stilladser om nødvendigt tilpasses til brug. For eksempel kan man bruge et porøst og stift stillads og kombinere det med gelatine for yderligere at forbedre MSC osteogenese11. I dette tilfælde skal man sikre, at der ikke er nogen fri medium ændring mellem top og bund strømme. Som diskuteret ovenfor kan man bruge biokompatible hydrogeler til at forsegle de potentielle lækagepunkter. Derudover anvendes MSC'er i den nuværende vævschip. På grund af deres påviste differentieringspotentiale i muskuloskeletalt væv kan inducerede pluripotente stamceller (iPSC'er) også anvendes i fremtiden til at erstatte MSC'er. Som et første skridt i retning af denne undersøgelse har vi for nylig brugt iPSC'er til at skabe osteokondrale væv12.
Synoviumbetændelse, eller synovitis, er et centralt træk ved OA og mange andre ledsygdomme. Desuden fandt Atukorala et al., at synovitis er en stærk forudsigelse for efterfølgende radiografisk OA13. Derfor inducerede vi SFT-betændelse ved IL-1β-behandling for at generere OA-lignende funktioner i miniJoint. Vi er dog klar over, at denne sygdomsinduktionsmetode ikke kan fange alle facetter af OA. I vores fremtidige forskning vil vi således undersøge alternative tilgange til modellering af OA i miniJoint ved for eksempel at bruge hyperfysiologisk belastning til at fremkalde mekanisk skade på bruskkomponenten14. For at anvende mekanisk belastning vil tilpasningen af miniJoint design være nødvendig. For eksempel kan bunden af miniJoint-chippen potentielt modificeres for at gøre bruskvævet tilgængeligt for slagkraftspidsen på en tilpasset fjederbelastet slaganordning, der er udviklet i vores laboratorium15.
Så vidt vi ved, er knæleddet på en chip, der er beskrevet her, den første in vitro-model , der inkluderer flere væv i et system for at simulere et synovialt led. Den nye plug-and-play-kapacitet gør det muligt at undersøge rollen som et enkelt væv i sygdomsprogression og dets reaktion på forskellige behandlinger. Dette system kan også anvendes til at modellere andre ledsygdomme end OA. For eksempel kan bakterier og andre patogener muligvis indføres i SM for at modellere septisk arthritis16. Derudover muliggør designet krydstale i realtid mellem vævene og overvinder dermed begrænsningen ved at bruge det konditionerede medium. Specifikt kan fedt-, synovial- og bruskvæv kommunikere gennem det delte medium, og knogler og brusk kan interagere gennem direkte fysisk binding. Der er dog nogle begrænsninger for den nuværende miniJoint. For det første anvendes stamcelleafledte væv, og om deres fænotype og funktion ligner deres modstykker i det oprindelige knæled, skal undersøges nærmere. For det andet er immunceller såsom makrofager, som spiller en kritisk rolle i OA-patogenese, ikke inkluderet. Vores tidligere undersøgelse har vist muligheden for at inkludere makrofager i gelatinestilladser17. Endelig er en fysisk stressaktiveret mekanisme ikke inkluderet til at simulere den mekaniske belastning på vævene i det oprindelige knæled. For nylig udviklede Occhetta et al. en brusk-på-en-chip-model, hvor belastningskontrolleret kompression blev anvendt til at stimulere det konstruerede bruskvæv14. En lignende metode kan anvendes til at muliggøre mekanisk belastning i miniJoint.
Sammenfattende kan miniJoint tjene som en unik platform til at undersøge patogenesen af OA og relaterede tilstande in vitro og tilvejebringe en mekanisme til at udforske potentielle DMOAD'er og interventioner til personlig medicin. MiniJoint-systemet kan også integreres med OoC'er, der efterligner andre organer for at etablere body-on-a-chip-systemer, der kan bruges til at studere interaktionerne mellem forskellige organefterligninger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Denne forskning blev primært støttet af finansiering fra National Institutes of Health (UG3 / UH3TR002136, UG3 / UH3TR003090). Derudover takker vi Dr. Paul Manner (University of Washington) for at levere de humane vævsprøver og Dr. Jian Tan for deres hjælp med at isolere MSC'erne og skabe cellepuljen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-isobutyl-1-methylxanthine | Sigma -Aldrich | I17018-1G | |
| 6 well non-tissue culture plate | Corning Falcon® Plates | 351146 | |
| 24 well non-tissue culture plate | Corning Falcon® Plates | 351147 | |
| 30 mL syringes | BD Syringe Luer Lock Cascade Health | 302832 | |
| Alcian blue stain | EK Industries | 1198 | 1% w/v, pH 1.0 |
| Advanced DMEM | Gibco | 12491-015 | |
| αMEM | Gibco | 12571-063 | |
| Antibiotic-antimycotic | Gibco | 15240-062 | |
| Biopsy punch | Integra Miltex | 12-460-407 | |
| BODIPY® fluorophore | Molecular Probes | ||
| Bone morphogenic protein 7 (BMP7) | Peprotech | ||
| Curved forceps | Fisher Brand | 16100110 | |
| DMEM | Gibco | 11995-065 | Dulbecco’s Modified Eagle Medium |
| Dexmethasome | Sigma -Aldrich | 02-05-2002 | |
| E-Shell 450 photopolymer in | EnvisionTec | RES-01-4022 | |
| Fetal Bovine Serum | Gemini-Bio Products | 900-208 | |
| GlutaMAX | Gibco | 3505-061 | |
| gelatin from bovine skin | Hyclone | 1003372809 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution | Sigma -Aldrich | SH30588.02 | |
| indomethacin | Sigma -Aldrich | I7378-56 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine (ITS) | Gibco | 51500-056 | |
| interleukin 1β | Peprotech | 200-01B | |
| Leur-loc connectors | Cole-Parmer Instruments | 45508-50 | |
| L-proline | Sigma -Aldrich | 115388-93-7 | |
| β-glycerophosphate | Sigma -Aldrich | 1003129352 | |
| Medium bags | KiYATEC | FC045 | |
| Methacrylic Anhydride | Sigma -Aldrich | 102378580 | |
| Phosphate buffered Saline | Corning | 21-040-CM | |
| Pointed forceps | Fisher Brand | 12000122 | |
| Silicon mold | McMaster-Carr | RC00114P | |
| Silicon o-rings | McMaster-Carr | ZMCCs1X5 | 1mm x 5mm |
| SolidWorks | Dassault Systèmes SE, Vélizy-Villacoublay, France | ||
| Surgical Blades | Integra Miltex | 4-122 | |
| Syringe pump | Lagato210P, KD Scientific | Z569631 | 10 syringe racks |
| T-182 tissue culture flasks | Fisher Brand | FB012939 | |
| Tissue Culture Dish 150 mm | Fisher Brand | FB012925 | |
| Transforming Growth Factor Beta (TGF-β3) | Peprotech | 100-36E | |
| Trypsin | Gibco | 25200-056 | |
| UV Flashlight | KBS | KB70109 | 395 nm |
| Vida Desktop 3D Printer | EnvisionTec | ||
| Vitamin D3 | Sigma -Aldrich | 32222-06-3 | 1,25-dihydroxyvitamin D3 |
References
- Safiri, S., et al. Global, regional and national burden of osteoarthritis 1990-2017: A systematic analysis of the Global Burden of Disease Study 2017. Annals of the Rheumatic Diseases. 79 (6), 819-828 (2020).
- Lawrence, R. C., et al. Estimates of the prevalence of arthritis and other rheumatic conditions in the United States: Part II. Arthritis and Rheumatism. 58 (1), 26-35 (2008).
- Makarczyk, M. J., et al. Current models for development of disease-modifying osteoarthritis drugs. Tissue Engineering. Part C, Methods. 27 (2), 124-138 (2021).
- He, Y., et al. Pathogenesis of osteoarthritis: risk factors, regulatory pathways in chondrocytes, and experimental models. Biology. 9 (8), 194 (2020).
- Ronaldson-Bouchard, K., Vunjak-Novakovic, G. Organs-on-a-chip: A fast track for engineered human tissues in drug development. Cell Stem Cell. 22 (3), 310-324 (2018).
- Lin, H., Sohn, J., Shen, H., Langhans, M. T., Tuan, R. S. Bone marrow mesenchymal stem cells: aging and tissue engineering applications to enhance bone healing. Biomaterials. 203, 96-110 (2019).
- Li, Z., et al. Human mesenchymal stem cell-derived miniature joint system for disease modeling and drug testing. Advanced Science. 9 (21), 2105909 (2022).
- Lin, H., Cheng, A. W., Alexander, P. G., Beck, A. M., Tuan, R. S. Cartilage tissue engineering application of injectable gelatin hydrogel with in situ visible-light-activated gelation capability in both air and aqueous solution. Tissue Engineering. Part A. 20 (17-18), 2402-2411 (2014).
- Fairbanks, B. D., Schwartz, M. P., Bowman, C. N., Anseth, K. S. Photoinitiated polymerization of PEG-diacrylate with lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate: polymerization rate and cytocompatibility. Biomaterials. 30 (35), 6702-6707 (2009).
- Lin, H., Lozito, T. P., Alexander, P. G., Gottardi, R., Tuan, R. S. Stem cell-based microphysiological osteochondral system to model tissue response to interleukin-1β. Molecular Pharmaceutics. 11 (7), 2203-2212 (2014).
- Yin, B., et al. Hybrid macro-porous titanium ornamented by degradable 3D gel/nHA micro-scaffolds for bone tissue regeneration. International Journal of Molecular Sciences. 17 (4), 575 (2016).
- Lin, Z., et al. Osteochondral tissue chip derived from iPSCs: Modeling OA pathologies and testing drugs. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 411 (2019).
- Atukorala, I., et al. Synovitis in knee osteoarthritis: A precursor of disease. Annals of the Rheumatic Diseases. 75 (2), 390-395 (2016).
- Occhetta, P., et al. Hyperphysiological compression of articular cartilage induces an osteoarthritic phenotype in a cartilage-on-a-chip model. Nature Biomedical Engineering. 3 (7), 545-557 (2019).
- He, C., et al. Modeling early changes associated with cartilage trauma using human-cell-laden hydrogel cartilage models. Stem Cell Research and Therapy. 13 (1), 400 (2022).
- Elsissy, J. G., et al. Bacterial septic arthritis of the adult native knee joint: A review. JBJS Reviews. 8 (1), 0059 (2020).
- Romero-Lopez, M., et al. Macrophage effects on mesenchymal stem cell osteogenesis in a three-dimensional in vitro bone model. Tissue Engineering. Part A. 26 (19-20), 1099-1111 (2020).
