Summary
Мы предлагаем подробные методы создания четырех типов тканей из мезенхимальных стволовых клеток человека, которые используются для рекапитуляции хряща, кости, жирового пакета и синовиальной оболочки коленного сустава человека. Эти четыре ткани интегрированы в индивидуальный биореактор и соединены с помощью микрофлюидики, создавая таким образом коленный сустав на чипе.
Abstract
Высокая распространенность изнурительных заболеваний суставов, таких как остеоартрит (ОА), представляет собой высокое социально-экономическое бремя. В настоящее время доступные препараты, нацеленные на заболевания суставов, в основном паллиативны. Неудовлетворенная потребность в эффективных препаратах ОА, модифицирующих болезнь (ДМОАД), была вызвана главным образом отсутствием соответствующих моделей для изучения механизмов заболевания и тестирования потенциальных ДМОАД. Здесь описано создание миниатюрной микрофизиологической системы, имитирующей синовиальный сустав (miniJoint), включающей компоненты жировой, фиброзной и остеохондральной ткани, полученные из мезенхимальных стволовых клеток (МСК) человека. Для получения трехмерных (3D) микротканей МСК инкапсулировали в фотосшиваемый метакрилированный желатин до или после дифференцировки. Затем тканевые конструкции, нагруженные клетками, были интегрированы в биореактор, напечатанный на 3D-принтере, образуя мини-соединение. Были введены отдельные потоки остеогенной, фиброгенной и адипогенной сред для поддержания соответствующих тканевых фенотипов. Общий поток перфузировался через хрящевую, синовиальную и жировую ткани, чтобы обеспечить перекрестные помехи тканей. Эта картина потока позволяет индукция возмущений в одном или нескольких тканевых компонентах для механистических исследований. Кроме того, потенциальные ДМОАД могут быть протестированы либо путем «системного введения» через все потоки среды, либо путем «внутрисуставного введения» путем добавления лекарств только к общему потоку, имитирующему «синовиальную жидкость». Таким образом, miniJoint может служить универсальной платформой in vitro для эффективного изучения механизмов заболевания и тестирования лекарств в персонализированной медицине.
Introduction
Заболевания суставов, такие как остеоартрит (ОА), широко распространены и изнурительны и представляют собой ведущую причину инвалидности во всем мире1. По оценкам, только в США ОА поражает 27 миллионов пациентов и встречается у 12,1% взрослых в возрасте 60 лет и старше2 лет. К сожалению, большинство препаратов, используемых в настоящее время для лечения заболеваний суставов, являются паллиативными, и нет эффективных препаратов, модифицирующих болезнь ОА (DMOAD)3. Эта неудовлетворенная медицинская потребность в первую очередь связана с отсутствием эффективной модели для изучения механизмов заболевания и разработки потенциальных DMOAD. Традиционная двумерная (2D) культура клеток не отражает 3D-природу тканей суставов, а культивированию тканевых эксплантатов часто препятствует значительная гибель клеток и обычно не удается воспроизвести динамические тканевые взаимосвязи4. Кроме того, генетические и анатомические различия значительно снижают физиологическую значимость животных моделей4.
Органы-на-чипах (OoC), или микрофизиологические системы, являются перспективной областью исследований на стыке инженерии, биологии и медицины. Эти платформы in vitro представляют собой минимальные функциональные единицы, которые воспроизводят определенные здоровые или патологические особенности их аналогов in vivo 5. Кроме того, эти миниатюрные системы могут содержать различные клетки и матрицы и имитировать биофизические и биохимические взаимодействия между различными тканями. Таким образом, микрофизиологическая система, которая может точно повторять нативный синовиальный сустав, обещает предложить эффективную платформу для моделирования заболеваний суставов и разработки потенциальных DMOAD.
Мезенхимальные стволовые клетки человека (МСК) могут быть выделены из многих тканей по всему телу и дифференцированы на остеогенные, хондрогенные и адипогенные линии6. МСК успешно используются для создания различных тканей, включая костную, хрящевую и жировую ткань6, что означает, что они представляют собой многообещающий источник клеток для инженерии тканевых компонентов коленного сустава. Недавно мы разработали миниатюрную микрофизиологическую систему, имитирующую суставы, под названием miniJoint, которая включает в себя костную, хрящевую, фиброзную и жировую ткани, полученные из МСК7. В частности, новая конструкция обеспечивает перекрестные помехи тканей за счет микрофлюидного потока или проникновения (рис. 1). Здесь мы представляем протоколы изготовления компонентов чипа, проектирования компонентов ткани, культивирования инженерных тканей в чипе и сбора тканей для последующего анализа.
Рисунок 1: Схема чипа miniJoint, показывающая расположение различных компонентов ткани и потоков среды. ОК = остеохондральная ткань. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Следующий протокол следует этическим принципам Университета Питтсбурга и комитета по этике исследований на людях Университета Питтсбурга. Информация о материалах, использованных в данном исследовании, приведена в Таблице материалов.
1. Производство биореакторов, напечатанных на 3D-принтере
- Используйте компьютерное программное обеспечение для проектирования остеохондральных (рис. 2A) и мини-биореакторов (рис. 2B), которые включают камеры, вставки и крышки. Информация о размерах каждой детали показана на рисунке S1.
- Перенесите дизайн на 3D-принтер и распечатайте фотополимерными чернилами.
- Промойте детали, напечатанные на 3D-принтере (рис. 2C-F), 15 мл 95% этанола три раза. Затем полностью сшивайте напечатанные детали в течение 200 с в устройстве полимеризации фонарика.
- Добавьте уплотнительные кольца к вкладышам и крышкам (рис. 2C, D) и проверьте, подходят ли детали (рис. 2G, H).
Рисунок 2: Изготовление различных компонентов для изготовления биореактора miniJoint. (A,B), 3D-модели биореакторов для создания (A) остеохондральных и (B) miniJoint чипов. (C, D) напечатанные на 3D-принтере крышки (C) и вкладыши (D) с установленным уплотнительным кольцом. (E, F) 3D-печатные камеры для (E) остеохондральной и (F) мини-суставной культуры тканей. (Г,Г) Сборка (G) остеохондральных и (H) мини-шарнирных чипов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
2. Проектирование тканевых компонентов
ПРИМЕЧАНИЕ: Процессы изготовления фенил-2,4,6-триметилбензоилфосфината лития (LAP) и метакрилированного желатина (GelMA) описаны в предыдущих исследованиях 8,9.
- Чтобы создать GelMA, выполните следующие действия.
- Добавьте 17 г желатина типа B в 500 мл дистиллированной воды, а затем перемешивайте на шейкере в течение 30 мин при 37 °C.
- Затем добавьте 13 мл метакрилового ангидрида, поместите обратно на шейкер с температурой 37 ° C и дайте встряхнуть в течение ночи.
- На следующий день аликвотируйте GelMA в отдельные диализные мешки, по ~ 60 мл в каждом пакетике.
- Поместите все пакеты для диализа в дистиллированную воду с помощью мешалки и оставьте на 7 дней диализа. Меняйте воду несколько раз в день и оставляйте пакеты при температуре 4 ° C на ночь.
- На 7-й день заморозьте GelMA при -80 °C. После полного застывания приступают к лиофилизации.
- Поместите GelMA в посуду в вакуумную камеру лиофилизатора и дайте ему высушиться. Убедитесь, что GelMA полностью высох, прежде чем удалять его из лиофилизатора.
- Растворите GelMA в сбалансированном солевом растворе Хэнка (HBSS с Ca 2+ и Mg2+) при 15% (мас./об.). Чтобы обеспечить рН на уровне 7,4, добавляйте NaOH в небольших количествах, пока рН не достигнет 7,4. Дополните раствор 1x антибиотиком-антимикотическим и 0,15% (мас./об.) LAP в зависимости от приобретенного объема. Храните 15% раствор GelMA при температуре -20 °C до использования и защищайте его от света.
- Поместите напечатанные на 3D-принтере двухпоточные биореакторные камеры, крышки и вкладыши в автоклавы и автоклавы при 121 °C на 20 минут с паром, а затем на 20 минут с сухим теплом.
- Внутри шкафа биологической безопасности замочите камеры, крышки и вкладыши биореактора в 15 мл стерильного фосфатно-буферного физиологического раствора на ночь, после чего дайте им высохнуть.
- Изолировать МСК, полученные из костного мозга человека, из хирургических отходов тотального эндопротезирования суставов с одобрения IRB (Университет Питтсбурга и Вашингтонский университет).
- В частности, вымывают костный мозг из трабекулярной кости шейки и головки бедренной кости и ресуспендируют его в модифицированной орлиной среде Дульбекко (DMEM).
- Отфильтруйте суспензию через сетчатый фильтр 40 мкм и центрифугируйте проточный поток при 300 x g в течение 5 мин.
- Удалите надосадочную жидкость, ресуспендируйте гранулы, используя питательную среду [DMEM, 10% фетальная бычья сыворотка (FBS) и 1x антибиотик-антимикотик], а затем поместите в колбы для культивирования тканей.
- Меняйте питательную среду каждые 3 дня до 4 дней. Прежде чем продолжить, убедитесь, что достигнуто слияние от 70% до 80%.
- Отделяют клетки путем инкубации с трипсином-ЭДТА в течение 2-3 мин и пассажа в соотношении 1 миллион клеток на колбу Т150.
- Разверните ячейки до P5. После трипсинизации суспендировать клетки, пересчитать их, а затем гранулировать центрифугированием при 300х г в течение 5 мин.
- С помощью пипетки объемом 1,000 мкл ресуспендируют клетки в дозе 20 x 106 клеток/мл в 15% растворе GelMA.
ПРИМЕЧАНИЕ: Выключите свет шкафа биологической безопасности. - Используя стерильные перчатки, прижмите стерильную сухую силиконовую форму к чашке Петри. Затем вставьте по одной вставке в каждое отверстие силиконовой формы щипцами стороной отверстия вставки вниз.
- Используя пипетку объемом 200 мкл, добавьте клеточную суспензию, чтобы заполнить вставку (~ 50 мкл на вкладыш).
- Используйте УФ-фонарик (светодиодный свет с длиной волны 395 нм), чтобы сшить верхнюю часть геля/вставки в течение 1,5 мин. Затем осветите другую сторону в течение 30 секунд. Сшивание происходит, когда фотоинициатор LAP подвергается воздействию ультрафиолетового света.
ПРИМЕЧАНИЕ: Клеточную суспензию можно хранить в инкубаторе в течение этого периода или защищать от света. - С помощью стерильных щипцов немедленно перенесите вкладыши в 8 мл питательной среды в 6-луночную пластину для нетканевой культуры (DMEM с добавлением 10% [v/v] FBS и 1x антибиотика-антимикотика), чтобы позволить клеткам восстановиться в течение ночи.
- Дифференцируйте клетки по четырем линиям.
- Чтобы сконструировать жировую ткань (АТ), перенесите вкладыши на 8 мл адипогенной среды (AM; Альфа-МЭМ, 10% FBS, 0,2 мМ индометацина, 1x инсулин-трансферрин-селен (ITS), 0,45 мМ 3-изобутил-1-метилксантин, 0,1 мкМ дексаметазона и 1x антибиотик-антимикотик) для инициации дифференцировки. В идеале четыре вкладыша помещают в одну лунку лунки для нетканевой культуры с 8 мл адипогенной среды. Культивируют клетки в лунке в течение 28 дней, при этом среда меняется через день.
- Чтобы спроектировать остеохондральные установки (ОС), поместите вставки в двухпоточные камеры биореактора, закройте скважины и вливайте два потока отдельно со скоростью потока 5 мкл / мин с 35 мл остеогенной среды (OM; DMEM, 10% FBS, 1x антибиотик-антимикотик, 0,1 мкМ дексаметазон, 0,01 М β-глицерофосфат, 100 нг/мл костного морфогенного белка 7 (BMP7), 50 мкг/мл аскорбиновой кислоты и 10 нМ витамина D3) и 35 мл хондрогенной среды (CM; DMEM, 1x антибиотик-антимикотик, 1x ITS, 0,1 мкМ дексаметазон, 40 мкг/мл пролина, 50 мкг/мл аскорбиновой кислоты и 10 нг/мл, трансформирующий фактор роста β3)10. Поддерживайте дифференцировку клеток в течение 28 дней, выполняя двухнедельную смену среды.
- Чтобы получить фибробласты, дифференцируйте МСК в 2D-культуре в течение 21 дня в колбе для культуры тканей T150 см2 , используя 20 мл фиброгенной среды (FM; расширенный DMEM, 5% FBS, 1x GlutaMAX, 1x антибиотик-антимикотик и 50 мкг / мл аскорбиновой кислоты). Меняйте носитель каждую неделю. Используйте 4 мл трипсина, чтобы отделить клетки и инкапсулировать 3D-гели во вставки, следуя протоколу, описанному выше, для получения синовиальной фиброзной ткани (SFT).
ПРИМЕЧАНИЕ: Составы всех дифференцирующих сред можно найти в таблице 1.
3. Установка чипа miniJoint
- Автоклав камеры биореактора 3D miniJoint, силиконовые трубки с внутренним диаметром 0,062 дюйма и внешним диаметром 0,125 дюйма, а также разъемы F 1/16 Luer-lock. Подсоедините силиконовую трубку к зазубрине биореактора miniJoint с одного конца и подсоедините замок Luer с другого конца.
- Подготовьте AM, OM (удаление BMP7) и FMCM, упомянутые на шаге 2.11. Кроме того, подготовьте общую общую среду (SM; ДМЭМ без фенола, 1x антибиотик-антимикотик, 1x Na-пируват, 1x ITS, 40 мкг/мл пролина, 50 мкг/мл аскорбиновой кислоты и 0,5 нг/мл трансформирующего фактора роста β3) для использования для мини-посева. Загрузите 35 мл каждой среды в резервуары для среды.
- Используйте прямые щипцы для переноса остеохондрального блока из двухпоточного биореактора в правую лунку биореактора miniJoint. Перенесите вставку жировой ткани и вставку фиброзной ткани в левую и среднюю лунки соответственно. Закройте все лунки стерилизованными крышками.
- Подсоедините входные отверстия микросхемы miniJoint к резервуарам для среды, а выпускные отверстия — к шприцам (рис. 3A-C).
- Установите шприцы на шприцевой насос (рис. 3C) и перенесите насос и стружку в инкубатор. Средние резервуары держат на льду вне инкубатора.
- Работайте с насосом в режиме отвода, втягивая среду из резервуара среды в камеру биореактора miniJoint. Этот процесс культивирования мини-суставов длится 28 дней.
- Чтобы смоделировать воспаление суставов и дегенерацию хряща, добавьте интерлейкин 1β (IL-1β) в поток фиброгенной среды в дозе 10 нг / мл. Замените шприцы на третий день лечения IL-1β и введите свежий IL-1β в фиброгенную среду. Лечение длится 7 дней.
- На этапе тестирования лекарственного средства, после 3 дней лечения IL-1β, вводите препарат либо в общую среду, имитируя «внутрисуставное введение» (рис. 3D), когда лекарство используется локально в коленном суставе, либо во всех типах среды, имитируя «системное введение» (рис. 3E), когда лекарство действует на коленный сустав через кровообращение.
- Соберите отдельные ткани для анализа после 7 дней лечения IL-1β, независимо от того, подвергались ли образцы медикаментозной обработке в течение предыдущих 4 дней.
Рисунок 3: Сборка мини-шарнира. (А, Б) Тканеспецифические среды вводятся из входных отверстий 1-3 (I1-3) и выводятся из выходов 1-3 (O1-3). Общая среда перфузируется от I4 до O4. (C) Полная настройка культуры miniJoint. Лекарственные средства (формы, похожие на зеленое солнце) могут быть введены либо в (D) только общую среду, либо (E) во все среды, чтобы соответственно имитировать «внутрисуставное введение» или «системное введение». Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
4. Индивидуальный забор тканей
- Используйте стерильные изогнутые щипцы для удаления вкладышей.
- Протолкните перфоратор для биопсии через центр вкладыша, чтобы удалить гель, и поместите гель в PBS.
- Разрежьте остеохондральные гели пополам при оценке экспрессии генов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку остеохондральный гель состоит из двух типов тканей, важно разделить остеогенные и хондрогенные клетки. - Собирайте кондиционированные среды и ткани для различных экспериментов.
- Соберите около 1,5 мл из каждого среднего источника.
- Заморозьте кондиционированную среду в жидком азоте после центрифугирования при 14 000 x g в течение 10 мин и удаления осадка.
- Для гистологического окрашивания и иммуноокрашивания сначала зафиксируйте образцы OC и SFT в 10% буферном формалине, обезвоживайте их в этаноле возрастающих концентраций, очистите их в ксилоле, вставьте в парафин и, наконец, разделите их на толщину 6 мкм.
- Для микротканей АТ зафиксируйте образцы в 10% буферном формалине и непосредственно окрашивайте их раствором Oil Red O или BODIPY.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Все ткани мини-сустава были собраны для анализа их фенотипов после 28 дней культивирования в мини-суставе (рис. 4А). Это было подробно описано в нашей предыдущей публикации7.
С помощью ОТ-кПЦР, иммуноокрашивания и гистологического окрашивания было подтверждено, что тканеспецифические фенотипы хорошо сохраняются для отдельных микротканей (рис. 4). Например, костный компонент микротканей ОК (ОК-О), но не другие компоненты ткани, экспрессировал высокий уровень остеокальцина (ОКН). Напротив, в хрящевой части остеохондральных тканей (OC-C) коллаген II типа (COL2) и аггрекан (ACAN) экспрессировались на значительно более высоких уровнях, чем в других тканях (рис. 4B). Уровни экспрессии адипонектина (ADIPOQ) и лептина (LEP), двух репрезентативных адипогенных генов, были намного выше в AT, чем в других тканях. Осаждение минералов кальция (рис. 4F, G), а также щелочной фосфатазы (ALP) и белков OCN (рис. 4D) в основном наблюдалось в OC-O, а OC-C показал хорошо удерживаемые гликозаминогликаны (GAG) (рис. 4C) и COL2 (рис. 4D). Кроме того, было обнаружено, что экспрессия двух маркеров, связанных с гипертрофией хондроцитов, коллагена типа X (COL10) и индийского ежа (IHH), которые были обнаружены в OC-C на 28-й день, была значительно снижена после 28 дней культивирования в miniJoint (рис. 4E).
Результаты ОТ-кПЦР, иммуноокрашивания и гистологии подтвердили, что фенотипы АТ и СФТ успешно сохранялись после 4 недель мини-совместного культивирования (рис. 4B,H,I). Используя окрашивание BODIPY и окрашивание Oil Red O, мы наблюдали обильное отложение липидных капель в AT (рис. 4H). Изображения иммунофлуоресцентного окрашивания на рисунке 4I показывают надежную экспрессию лубрицина и кадгерина 11 (CDH11) SFT после 4 недель культивирования miniJoint.
В совокупности эти результаты указывают на создание функциональной мультитканевой модели синовиального сустава в системе miniJoint.
Рисунок 4: Поддержание индивидуальных тканевых фенотипов микротканей после 4 недель совместного культивирования в чипе miniJoint. (A) График создания нормального чипа miniJoint с сохранением тканеспецифических фенотипов. (B) Результаты ОТ-кПЦР, показывающие ключевые маркерные гены во всех компонентах ткани. Данные OCN были нормализованы к значениям в OC-O, данные COL2 и ACAN - к значениям в OC-C, данные ADIPOQ и LEP - к значениям в AT, а данные TNC и COL1 - к значениям в SFT. Данные были проанализированы с помощью одностороннего ANOVA (N = 3 биологических репликатов). * p < 0,05; ** < 0,01; р < 0,001; p < 0,0001. (C) окрашивание Safranin O двухфазного блока OC. Масштабная линейка = 1 мм. (D) Гистологическое окрашивание и иммуноокрашивание изображений, подтверждающих наличие костно-специфических и хрящевых маркеров в соответствующих компонентах блока ОК. Шкала = 50 мкм. (E) Иммуноокрашивание, показывающее гораздо более низкую экспрессию двух маркеров гипертрофии, COLX и IHH, в OC-C на 56-й день, чем на 28-й день. Масштабная линейка = 50 мкм. (F) Ализарин Красное окрашивание блока ОК, показывающее наличие отложений кальция в основном в ОК-О. Масштабная линейка = 500 мкм. (G) Увеличенные виды изображения окрашивания Alizarin Red в (F). Масштабная линейка = 200 мкм. (H) Масляные красители O и изображения окрашивания BODIPY, показывающие удержание липидных капель в AT. Масштабная линейка = 50 мкм. (I) Изображения иммуноокрашивания, показывающие экспрессию лубрицина и CDH11 синовиально-подобной фиброзной тканью (SFT). Масштабная линейка = 50 мкм. Воспроизведено с разрешения Li et al.7. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Чтобы создать модель заболевания, интерлейкин 1β (IL-1β) был введен в поток FM после 28 дней совместной культуры (рис. 5A, B). Лечение IL-1β приводило к апоптозу клеток и повышению уровня MMP-13 в SFT (рис. 5C). Интересно, что мы наблюдали деградацию хряща в мини-суставе, обработанном IL-1β (рис. 5D), что свидетельствует о возникновении перекрестных помех между OC-C и SFT.
Рисунок 5: Моделирование воспаления и дегенерации сустава в мини-суставе . (A) Схема, показывающая индукцию «синовита» путем вызова SFT с помощью IL-1β. (B) График создания и анализа модели заболевания. (C) Анализ TUNEL и иммуноокрашивание MMP-13, показывающее патологические изменения в SFT. Фрагментация ДНК обозначена красными наконечниками стрелок. Масштабная линейка = 50 мкм. (D) Окрашивание сафранином O и иммуноокрашивание MMP-13, показывающее дегенерацию OC-C. Масштабная линейка = 50 мкм. Воспроизведено с разрешения Li et al.7. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Наконец, мы проверили терапевтическую эффективность напроксена (NPX) посредством «системного введения» (рис. 6A), который, как было показано, снижает деградацию хряща в мини-суставе, обработанном IL-1β (рис. 6B). Мы также изучили четыре других потенциальных DMOAD с помощью «внутрисуставного введения» (рис. 6A). Результаты ПЦР в реальном времени показали, что эти четыре соединения смогли частично обратить вспять потерю хряща (рис. 6C).
Рисунок 6: Тестирование лекарств «системным» и «внутрисуставным» путями в установленной модели заболевания. (A) Схема, показывающая два различных пути введения лекарственного средства, включая «системное введение» напроксена (NPX) и «внутрисуставное введение» фактора роста фибробластов 18 (FGF18), SM04690, склеростина (SOST) и антагониста рецептора IL-1 (IL-1RN). (B) Изображения окрашивания Safranin O и MMP-13, показывающие облегчение дегенерации OC-C после обработки NPX. Шкала = 50 мкм. (C) Экспрессия генов в OC-C после «внутрисуставного введения» четырех различных препаратов. Статистические различия между каждой группой, получавшей лекарственное средство, и контрольной группой обозначаются формулой * p < 0,05; ** < 0,01; p < 0,001; и **** < 0,0001. Данные были проанализированы с помощью t-критерия Стьюдента (N = 4 биологических репликатов). Воспроизведено с разрешения Li et al.7. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этой статье мы представляем протокол создания системы коленного сустава на чипе, в которой кости, хрящи, жировая ткань и синовиально-подобные ткани формируются из МСК и совместно культивируются в индивидуальном биореакторе. Эта многокомпонентная система на основе клеток человека с функцией plug-and-play представляет собой новый инструмент для изучения патогенеза заболеваний суставов и разработки лекарств.
Учитывая, что различные ткани благоприятствуют определенным питательным средам, крайне важно обеспечить соответствующую среду для каждой ткани и предотвратить обмен свободной средой между потоками. В частности, при генерации двухфазных остеохондральных тканей судьба наивных МСК определяется средой, которой они подвергаются. В текущей конструкции мы используем гидрогель на основе желатина в качестве каркаса, который обеспечивает шаблон для роста клеток и герметизирует потенциальный зазор между тканями и стенками вставок. Поэтому крайне важно фотосшивать гель in situ внутри вставок. Кроме того, факторы роста, такие как BMP7 и TGFβ3, дополняются в остеогенной среде и хондрогенной среде соответственно. Чтобы сохранить их биоактивность в течение нескольких дней, свежие среды должны храниться вне инкубатора перед введением в культуру чипов. Поэтому нам нужно использовать шприцы для извлечения среды из резервуаров вместо того, чтобы вливать среду в инкубатор.
Еще одним важным моментом при работе с биореактором является избегание ненужного давления. Ткани полагаются на физическое связывание со стенкой вставки, чтобы оставаться на месте. Поскольку они подвергаются воздействию верхнего и нижнего потоков среды, если одна фаза потока имеет более высокое давление, она может вытолкнуть ткани из вставок, что приведет к утечке. Поэтому во время процессов обработки, например, при удалении пузырьков, очень важно мягкое нажатие шприца. Если гидрогелевый каркас выталкивается, его можно положить обратно, нанести дополнительный неотвержденный гидрогель для заполнения зазора, и его можно отверждать, что обеспечивает надежное и прочное прилегание каркаса к вставке.
Учитывая доказанную биосовместимость, каркасы на основе желатина используются для создания всех четырех тканей в существующей системе. Следует отметить, что желатин может представлять собой не лучший материал для поддержания формирования тканей. Поэтому при необходимости для использования могут быть приспособлены и другие виды строительных лесов. Например, можно использовать пористый и жесткий каркас и комбинировать его с желатином для дальнейшего усиления остеогенеза МСК11. В этом случае необходимо убедиться, что между верхним и нижним потоками не происходит перерасхода свободной среды. Как обсуждалось выше, можно использовать биосовместимые гидрогели для герметизации потенциальных точек утечки. Кроме того, МСК используются в текущем тканевом чипе. Учитывая продемонстрированный ими потенциал дифференцировки в костно-мышечные ткани, индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК) также могут быть использованы в будущем для замены МСК. В качестве первого шага к этому исследованию мы недавно использовали ИПСК для создания остеохондральных тканей12.
Воспаление синовиальной оболочки, или синовит, является ключевым признаком ОА и многих других заболеваний суставов. Кроме того, Atukorala et al. обнаружили, что синовит является сильным предиктором последующего рентгенографического OA13. Таким образом, мы индуцировали воспаление SFT с помощью лечения IL-1β для создания ОА-подобных признаков в мини-суставе. Тем не менее, мы знаем, что этот метод индукции заболевания не может охватить все аспекты ОА. Таким образом, в наших будущих исследованиях мы изучим альтернативные подходы к моделированию ОА в мини-суставе, например, используя гиперфизиологическую нагрузку для индуцирования механического повреждения хрящевого компонента14. Для применения механической нагрузки потребуется адаптация конструкции miniJoint. Например, нижняя часть чипа miniJoint потенциально может быть модифицирована, чтобы сделать хрящевую ткань доступной для наконечника ударного элемента индивидуального подпружиненного ударного устройства, разработанного в нашей лаборатории15.
Насколько нам известно, коленный сустав на чипе, описанный здесь, является первой моделью in vitro , которая включает в себя несколько тканей в одной системе для имитации синовиального сустава. Новая технология plug-and-play позволяет исследовать роль одной ткани в прогрессировании заболевания и ее реакцию на различные методы лечения. Эта система также может быть использована для моделирования заболеваний суставов, отличных от ОА. Например, бактерии и другие патогены могут быть введены в SM для моделирования септического артрита16. Кроме того, конструкция позволяет в режиме реального времени создавать перекрестные помехи между тканями, тем самым преодолевая ограничения использования кондиционированной среды. В частности, жировая, синовиальная и хрящевая ткани могут взаимодействовать через общую среду, а кость и хрящ могут взаимодействовать посредством прямого физического связывания. Тем не менее, есть некоторые ограничения для текущего miniJoint. Во-первых, используются ткани, полученные из стволовых клеток, и вопрос о том, похожи ли их фенотип и функция на их аналоги в нативном коленном суставе, требует дальнейшего изучения. Во-вторых, иммунные клетки, такие как макрофаги, которые играют решающую роль в патогенезе ОА, не включены. Наше предыдущее исследование продемонстрировало возможность включения макрофагов в желатиновые каркасы17. Наконец, не включен механизм физического стресса для имитации механической нагрузки на ткани в нативном коленном суставе. Недавно Occhetta et al. разработали модель «хрящ на чипе», в которой для стимуляции сконструированной хрящевойткани применялась компрессия, контролируемая деформацией. Аналогичный метод может быть использован для обеспечения механической нагрузки в miniJoint.
Таким образом, miniJoint может служить уникальной платформой для изучения патогенеза ОА и связанных с ним состояний in vitro и обеспечить механизм для изучения потенциальных DMOAD и вмешательств для персонализированной медицины. Система miniJoint также может быть интегрирована с OoC, имитирующими другие органы, для создания систем «тело на чипе», которые можно использовать для изучения взаимодействия между различными имитаторами органов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.
Acknowledgments
Это исследование было в основном поддержано финансированием Национальных институтов здравоохранения (UG3 / UH3TR002136, UG3 / UH3TR003090). Кроме того, мы благодарим доктора Пола Маннера (Вашингтонский университет) за предоставление образцов тканей человека и доктора Цзянь Тана за помощь в изоляции МСК и создании пула клеток.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-isobutyl-1-methylxanthine | Sigma -Aldrich | I17018-1G | |
| 6 well non-tissue culture plate | Corning Falcon® Plates | 351146 | |
| 24 well non-tissue culture plate | Corning Falcon® Plates | 351147 | |
| 30 mL syringes | BD Syringe Luer Lock Cascade Health | 302832 | |
| Alcian blue stain | EK Industries | 1198 | 1% w/v, pH 1.0 |
| Advanced DMEM | Gibco | 12491-015 | |
| αMEM | Gibco | 12571-063 | |
| Antibiotic-antimycotic | Gibco | 15240-062 | |
| Biopsy punch | Integra Miltex | 12-460-407 | |
| BODIPY® fluorophore | Molecular Probes | ||
| Bone morphogenic protein 7 (BMP7) | Peprotech | ||
| Curved forceps | Fisher Brand | 16100110 | |
| DMEM | Gibco | 11995-065 | Dulbecco’s Modified Eagle Medium |
| Dexmethasome | Sigma -Aldrich | 02-05-2002 | |
| E-Shell 450 photopolymer in | EnvisionTec | RES-01-4022 | |
| Fetal Bovine Serum | Gemini-Bio Products | 900-208 | |
| GlutaMAX | Gibco | 3505-061 | |
| gelatin from bovine skin | Hyclone | 1003372809 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution | Sigma -Aldrich | SH30588.02 | |
| indomethacin | Sigma -Aldrich | I7378-56 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine (ITS) | Gibco | 51500-056 | |
| interleukin 1β | Peprotech | 200-01B | |
| Leur-loc connectors | Cole-Parmer Instruments | 45508-50 | |
| L-proline | Sigma -Aldrich | 115388-93-7 | |
| β-glycerophosphate | Sigma -Aldrich | 1003129352 | |
| Medium bags | KiYATEC | FC045 | |
| Methacrylic Anhydride | Sigma -Aldrich | 102378580 | |
| Phosphate buffered Saline | Corning | 21-040-CM | |
| Pointed forceps | Fisher Brand | 12000122 | |
| Silicon mold | McMaster-Carr | RC00114P | |
| Silicon o-rings | McMaster-Carr | ZMCCs1X5 | 1mm x 5mm |
| SolidWorks | Dassault Systèmes SE, Vélizy-Villacoublay, France | ||
| Surgical Blades | Integra Miltex | 4-122 | |
| Syringe pump | Lagato210P, KD Scientific | Z569631 | 10 syringe racks |
| T-182 tissue culture flasks | Fisher Brand | FB012939 | |
| Tissue Culture Dish 150 mm | Fisher Brand | FB012925 | |
| Transforming Growth Factor Beta (TGF-β3) | Peprotech | 100-36E | |
| Trypsin | Gibco | 25200-056 | |
| UV Flashlight | KBS | KB70109 | 395 nm |
| Vida Desktop 3D Printer | EnvisionTec | ||
| Vitamin D3 | Sigma -Aldrich | 32222-06-3 | 1,25-dihydroxyvitamin D3 |
References
- Safiri, S., et al. Global, regional and national burden of osteoarthritis 1990-2017: A systematic analysis of the Global Burden of Disease Study 2017. Annals of the Rheumatic Diseases. 79 (6), 819-828 (2020).
- Lawrence, R. C., et al. Estimates of the prevalence of arthritis and other rheumatic conditions in the United States: Part II. Arthritis and Rheumatism. 58 (1), 26-35 (2008).
- Makarczyk, M. J., et al. Current models for development of disease-modifying osteoarthritis drugs. Tissue Engineering. Part C, Methods. 27 (2), 124-138 (2021).
- He, Y., et al. Pathogenesis of osteoarthritis: risk factors, regulatory pathways in chondrocytes, and experimental models. Biology. 9 (8), 194 (2020).
- Ronaldson-Bouchard, K., Vunjak-Novakovic, G. Organs-on-a-chip: A fast track for engineered human tissues in drug development. Cell Stem Cell. 22 (3), 310-324 (2018).
- Lin, H., Sohn, J., Shen, H., Langhans, M. T., Tuan, R. S. Bone marrow mesenchymal stem cells: aging and tissue engineering applications to enhance bone healing. Biomaterials. 203, 96-110 (2019).
- Li, Z., et al. Human mesenchymal stem cell-derived miniature joint system for disease modeling and drug testing. Advanced Science. 9 (21), 2105909 (2022).
- Lin, H., Cheng, A. W., Alexander, P. G., Beck, A. M., Tuan, R. S. Cartilage tissue engineering application of injectable gelatin hydrogel with in situ visible-light-activated gelation capability in both air and aqueous solution. Tissue Engineering. Part A. 20 (17-18), 2402-2411 (2014).
- Fairbanks, B. D., Schwartz, M. P., Bowman, C. N., Anseth, K. S. Photoinitiated polymerization of PEG-diacrylate with lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate: polymerization rate and cytocompatibility. Biomaterials. 30 (35), 6702-6707 (2009).
- Lin, H., Lozito, T. P., Alexander, P. G., Gottardi, R., Tuan, R. S. Stem cell-based microphysiological osteochondral system to model tissue response to interleukin-1β. Molecular Pharmaceutics. 11 (7), 2203-2212 (2014).
- Yin, B., et al. Hybrid macro-porous titanium ornamented by degradable 3D gel/nHA micro-scaffolds for bone tissue regeneration. International Journal of Molecular Sciences. 17 (4), 575 (2016).
- Lin, Z., et al. Osteochondral tissue chip derived from iPSCs: Modeling OA pathologies and testing drugs. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 411 (2019).
- Atukorala, I., et al. Synovitis in knee osteoarthritis: A precursor of disease. Annals of the Rheumatic Diseases. 75 (2), 390-395 (2016).
- Occhetta, P., et al. Hyperphysiological compression of articular cartilage induces an osteoarthritic phenotype in a cartilage-on-a-chip model. Nature Biomedical Engineering. 3 (7), 545-557 (2019).
- He, C., et al. Modeling early changes associated with cartilage trauma using human-cell-laden hydrogel cartilage models. Stem Cell Research and Therapy. 13 (1), 400 (2022).
- Elsissy, J. G., et al. Bacterial septic arthritis of the adult native knee joint: A review. JBJS Reviews. 8 (1), 0059 (2020).
- Romero-Lopez, M., et al. Macrophage effects on mesenchymal stem cell osteogenesis in a three-dimensional in vitro bone model. Tissue Engineering. Part A. 26 (19-20), 1099-1111 (2020).
