Summary
ヒト間葉系幹細胞から4種類の組織を作製し、ヒト膝関節の軟骨、骨、脂肪パッド、滑膜を再現するための詳細な方法を提供します。これらの4つの組織は、カスタマイズされたバイオリアクターに統合され、マイクロ流体工学を介して接続されるため、膝関節オンチップが生成されます。
Abstract
変形性関節症(OA)のような衰弱性関節疾患の高い有病率は、高い社会経済的負担をもたらします。現在、関節障害を標的とする利用可能な薬はほとんどが緩和的です。効果的な疾患修飾OA薬(DMOAD)の満たされていないニーズは、主に疾患メカニズムを研究し、潜在的なDMOADをテストするための適切なモデルがないことによって引き起こされてきました。ここでは、ヒト間葉系幹細胞(MSC)に由来する脂肪、線維、および骨軟骨組織成分を含むミニチュア滑膜関節模倣微生物生理学的システム(miniJoint)の確立について説明します。三次元(3D)微小組織を得るために、MSCを、分化前または分化後に光架橋可能なメタクリレートゼラチンに封入した。次に、細胞を含む組織構築物を3Dプリントされたバイオリアクターに統合し、miniJointを形成しました。骨形成性、線維形成性、および脂肪生成性媒体の別々の流れを導入して、それぞれの組織表現型を維持した。一般的に共有される流れは、軟骨、滑膜、および脂肪組織を介して灌流され、組織のクロストークを可能にしました。このフローパターンにより、機構研究のための1つまたは複数の組織成分における摂動の誘導が可能になります。さらに、潜在的なDMOADは、すべての媒体ストリームを介した「全身投与」、または共有された「滑液」シミュレーションフローのみに薬物を添加することによる「関節内投与」のいずれか を介して テストできます。したがって、miniJointは、個別化医療における疾患メカニズムを効率的に研究し、薬物をテストするための汎用性の高い in vitro プラットフォームとして機能します。
Introduction
変形性関節症(OA)のような関節疾患は非常に蔓延しており、衰弱させ、世界中の障害の主な原因となっています1。米国だけでも、OAは2,700万人の患者に影響を及ぼし、60歳以上の成人の12.1%に発生していると推定されています2。残念ながら、現在関節疾患の管理に使用されているほとんどの薬は緩和薬であり、効果的な疾患修飾OA薬(DMOAD)は入手できません3。この満たされていない医療ニーズは、主に、疾患メカニズムを研究し、潜在的なDMOADを開発するための効果的なモデルがないことに起因しています。従来の2次元(2D)細胞培養は、関節組織の3D特性を反映しておらず、組織外植片の培養は、著しい細胞死によって妨げられることが多く、通常、動的な組織相互接続を再現できません4。さらに、遺伝的および解剖学的差異は、動物モデルの生理学的関連性を有意に低下させる4。
臓器チップ(OoC)、または微小生理学的システムは、工学、生物学、および医学のインターフェースにおける有望な研究分野です。これらのインビトロプラットフォームは、それらのインビボ対応物の定義された健康的または病理学的特徴を複製する最小の機能単位である5。さらに、これらの小型化されたシステムは、多様な細胞およびマトリックスをホストし、異なる組織間の生物物理学的および生化学的相互作用をシミュレートすることができる。したがって、天然の滑膜関節を忠実に再現できる微生物生理学的システムは、関節疾患をモデル化し、潜在的なDMOADを開発するための効果的なプラットフォームを提供することを約束します。
ヒト間葉系幹細胞(MSC)は、全身の多くの組織から単離され、骨形成性、軟骨形成性、および脂肪生成性系統に分化することができます6。MSCは、骨、軟骨、脂肪組織を含むさまざまな組織のエンジニアリングに成功しており6、膝関節の組織コンポーネントを設計するための有望な細胞源であることを意味します。私たちは最近、MSC由来の骨、軟骨、線維、脂肪組織で構成されるminiJointという名前のミニチュア関節模倣微生物生理学的システムを開発しました7。特に、この斬新な設計により、マイクロ流体の流れや透過による組織クロストークが可能になります(図1)。ここでは、チップコンポーネントの製造、組織コンポーネントのエンジニアリング、チップ内の操作された組織の培養、および下流の分析のための組織の収集のためのプロトコルを示します。
図1:さまざまな組織コンポーネントと媒体の流れの配置を示すminiJointチップの概略図。OC =骨軟骨組織。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Protocol
以下のプロトコルは、ピッツバーグ大学およびピッツバーグ大学の人間研究倫理委員会の倫理ガイドラインに従います。この研究で使用された材料に関する情報は、 材料表に記載されています。
1. 3Dプリントされたバイオリアクターの製造
- コンピュータソフトウェアを使用して、チャンバー、インサート、および蓋を含む骨軟骨(図2A)およびminiJointバイオリアクター(図2B)を設計します。各部品の寸法情報を 図 S1 に示します。
- デザインを3Dプリンターに転写し、フォトポリマーインクで印刷します。
- 3Dプリントされた部品(図2C-F)を15 mLの95%エタノールで3回すすぎます。次に、印刷片を懐中電灯重合装置で200秒間完全に架橋します。
- インサートと蓋にOリングを追加し(図2C、D)、部品がはまるかどうかをテストします(図2G、H)。
図2:ミニジョイントバイオリアクターを作るためのさまざまなコンポーネントの製造。 (A、B)、(A)骨軟骨および(B)ミニジョイントチップを作成するためのバイオリアクターの3Dモデル。(C、D)3Dプリントされた(C)蓋と(D)Oリングが取り付けられたインサート。(E、F)(E)骨軟骨および(F)ミニジョイント組織培養用の3Dプリントチャンバー。(G,H)(G)骨軟骨および(H)ミニジョイントチップの組み立て。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
2.組織コンポーネントのエンジニアリング
注:フェニル-2,4,6-トリメチルベンゾイルホスフィン酸リチウム(LAP)およびメタクリレート化ゼラチン(GelMA)の製造プロセスは、以前の研究8,9に記載されています。
- GelMAを作成するには、以下の手順に従ってください。
- ゼラチンB型17 gを蒸留水500 mLに加え、シェーカーで37°Cで30分間混合します。
- その後、無水メタクリル酸13mLを加え、37°Cの振とう機に戻し、一晩振とうする。
- 翌日、GelMAを個々の透析バッグに分注し、各バッグに~60 mLを入れます。
- すべての透析バッグを攪拌子付きの蒸留水に入れ、7日間の透析を可能にします。1日に複数回水を交換し、バッグを4°Cで一晩放置します。
- 7日目に、GelMAを-80°Cで凍結します。 完全に凍結したら、凍結乾燥に進みます。
- GelMAを凍結乾燥機の真空チャンバー内の皿に入れ、凍結乾燥させます。凍結乾燥機から取り出す前に、GelMAが完全に乾燥していることを確認してください。
- GelMAをハンクの平衡塩溶液(Ca2+およびMg2+を含むHBSS)に15%(w / v)で溶解します。pHが7.4であることを確認するには、pHが7.4に達するまでNaOHを少量加えます。取得した量に基づいて、1x抗生物質抗真菌薬と0.15%(w / v)LAPで溶液を補います。.15%GelMA溶液は、使用するまで-20°Cで保存し、光から保護してください。
- 3Dプリントされたデュアルフローバイオリアクターチャンバー、蓋、インサートをオートクレーブバッグに入れ、オートクレーブを121°Cで蒸気で20分間、次に乾熱で20分間オートクレーブします。
- 生物学的安全キャビネット内で、バイオリアクターチャンバー、蓋、およびインサートを15 mLの滅菌リン酸緩衝生理食塩水に一晩浸した後、乾燥させます。
- IRBの承認を得て、関節形成術の全手術廃棄物からヒト骨髄由来のMSCを分離します(ピッツバーグ大学およびワシントン大学)。
- 具体的には、大腿骨頸部と頭部の骨梁から骨髄を洗い流し、ダルベッコの改変イーグル培地(DMEM)に再懸濁します。
- 懸濁液を40 μmのストレーナーでろ過し、フロースルーを300 x g で5分間遠心分離します。
- 上清を除去し、増殖培地[DMEM、10%ウシ胎児血清(FBS)、および1x抗生物質抗真菌剤]を使用してペレットを再懸濁し、組織培養フラスコに入れます。
- 3日から4日ごとに培地を交換してください。先に進む前に、70%から80%の合流点に達していることを確認してください。
- トリプシン-EDTAと2〜3分間インキュベートして細胞を剥離し、T150フラスコあたり100万細胞の割合で継代した。
- セルを P5 まで展開します。トリプシン処理後、細胞を懸濁し、カウントし、300x g で5分間遠心分離してペレット化します。
- 1,000 μLピペットで、細胞を15%GelMA溶液に20 x 106 細胞/mLで再懸濁します。
注意: 生物学的安全キャビネットのライトをオフにします。 - 滅菌手袋を使用して、滅菌済みの乾燥したシリコン型をペトリ皿に押し付けます。次に、インサートの穴側を下に向けて、鉗子でシリコンモールドの各穴に1つのインサートを入れます。
- 200 μLのピペットを使用して、細胞懸濁液を添加してインサートを満たします(インサートあたり~50 μL)。
- UV懐中電灯(波長395nmのLEDライト)を使用して、ゲル/インサートの上部を1.5分間架橋します。次に、反対側を30秒間照らします。架橋は、LAP光開始剤がUV光にさらされると発生します。
注:細胞懸濁液は、この期間中インキュベーターに保管するか、光から保護することができます。 - 滅菌鉗子を使用して、インサートを非組織培養6ウェルプレート(DMEMに10%[v/v] FBSおよび1x抗生物質抗真菌薬を添加した)の8 mLの成長培地に直ちに移し、細胞を一晩回復させます。
- 細胞を4つの系統に分化させます。
- 脂肪組織(AT)を設計するには、インサートを8 mLの脂肪生成培地(AM;α-MEM、10%FBS、0.2 mMインドメタシン、1xインスリン-トランスフェリン-セレン(ITS)、0.45 mM 3-イソブチル-1-メチルキサンチン、0.1 μMデキサメタゾン、および1x抗生物質抗真菌薬)を分化を開始します。理想的には、4つのインサートを、8mLの脂肪生成培地と共に非組織培養ウェルプレートの1つのウェルに入れる。ウェルプレート内の細胞を28日間培養し、培地を1日おきに交換します。
- 骨軟骨ユニット(OC)を設計するには、インサートをデュアルフローバイオリアクターチャンバーに配置し、ウェルに蓋をし、35 mLの骨形成培地(OM;DMEM、10%FBS、1x抗生物質抗真菌剤、0.1 μMデキサメタゾン、0.01 M β-グリセロリン酸、100 ng / mL骨形成タンパク質7(BMP7)、50 μg/mLアスコルビン酸、および10 nMビタミンD3)および35 mLの軟骨形成培地(CM;DMEM、1x 抗生物質抗真菌剤、1x ITS、0.1 μMデキサメタゾン、40 μg/mL プロリン、50 μg/mL アスコルビン酸、および10 ng/mL形質転換成長因子β3)10。隔週の培地交換を行うことにより、細胞分化を28日間維持します。
- 線維芽細胞を誘導するには、20 mLの線維形成培地(FM;アドバンスドDMEM、5%FBS、1x GlutaMAX、1x抗生物質抗真菌剤、および50 μg/mLアスコルビン酸)を使用して、T150 cm2 組織培養フラスコで21日間にわたって2D培養でMSCを分化させます。毎週培地を交換してください。4 mLのトリプシンを使用して細胞を剥離し、上記のプロトコルに従って3Dゲルをインサート内にカプセル化して、滑膜様線維組織(SFT)を取得します。
注:すべての分化培地の組成を 表1に示します。
3. ミニジョイントチップの確立
- 3D miniJointバイオリアクターチャンバー、内径0.062インチ、外径0.125インチのシリコンチューブ、F 1/16ルアーロックコネクタをオートクレーブします。シリコンチューブを一方の端でminiJointバイオリアクターバーブに接続し、もう一方の端でルアーロックを接続します。
- 手順 2.11 で説明した AM、OM(BMP7 の削除)、および FMCM を準備します。さらに、ミニジョイント培養に使用する共通の共有培地(SM;フェノールレッドフリーDMEM、1x抗生物質抗真菌剤、1xNa-ピルビン酸、1x ITS、40 μg/mLプロリン、50 μg/mLアスコルビン酸、および0.5 ng/mL形質転換成長因子β3)を準備します。各培地35 mLを培地リザーバーに投入します。
- ストレート鉗子を使用して、骨軟骨ユニットをデュアルフローバイオリアクターからminiJointバイオリアクターの右側のウェルに移します。脂肪組織インサートと線維性組織インサートをそれぞれ左と中央のウェルに移します。滅菌した蓋ですべてのウェルに蓋をします。
- miniJointeチップの入口を培地リザーバーに接続し、出口をシリンジに接続します(図3A-C)。
- シリンジをシリンジポンプに取り付け(図3C)、ポンプとチップをインキュベーターに移します。培地リザーバーはインキュベーターの外側の氷の上に保たれます。
- ポンプを引き出しモードで操作し、培地リザーバーからミニジョイントバイオリアクターチャンバーに培地を引き込みます。このミニジョイント培養プロセスは28日間続きます。
- 関節の炎症と軟骨変性をモデル化するには、インターロイキン1β(IL-1β)を線維形成性培地流に10 ng/mLで加えます。IL-1β治療の3日目にシリンジを交換し、線維形成培地に新鮮なIL-1βを供給します。治療は7日間続きます。
- 薬物試験ステップの間、IL−1β治療の3日後、薬物が膝関節において局所的に使用される場合の「関節内投与」(図3D)をシミュレートする共有培地中のいずれかで薬物を投与するか、またはすべての培地タイプにおいて、薬物が循環を介して膝関節に作用する場合の「全身投与」(図3E)をシミュレートする。
- サンプルが過去4日間薬物治療を受けたかどうかにかかわらず、IL-1β治療の7日後に分析のために個々の組織を収集します。
図3:ミニジョイントの組み立て 。 (A、B)組織特異的培地は、入口1〜3(I1-3)から導入され、出口1〜3(O1-3)から移動されます。共有メディアは I4 から O4 に灌流されます。(C)ミニジョイント文化の完全なセットアップ。薬物(緑色の太陽様形状)は、(D)共有培地のみまたは(E)「関節内投与」または「全身投与」をそれぞれシミュレートするために全ての培地に導入することができる。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
4.個々の組織収集
- 滅菌した湾曲した鉗子を使用してインサートを取り外します。
- 生検パンチをインサートの中央に押し込んでゲルを取り除き、ゲルをPBSに入れます。
- 遺伝子発現を評価する際には、骨軟骨ゲルを半分にカットします。
注:骨軟骨ゲルは2つの組織タイプで構成されているため、骨形成細胞と軟骨形成細胞を分離することが重要です。 - さまざまな実験のために調整された培地と組織を収集します。
- 各培地源から約1.5 mLを収集します。
- 14,000 x g で10分間遠心分離し、沈殿物を廃棄した後、液体窒素中で調整された培地を瞬間凍結します。
- 組織学的染色および免疫染色では、まずOCおよびSFTサンプルを10%緩衝ホルマリンで固定し、昇順濃度のエタノールで脱水し、キシレンで透明化し、パラフィンに包埋し、最後に厚さ6μmで切片化します。
- AT微小組織の場合は、サンプルを10%緩衝ホルマリンで固定し、オイルレッドO溶液またはBODIPYで直接染色します。
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Representative Results
ミニジョイントのすべての組織を収集し、ミニジョイントで28日間の培養後に表現型を分析しました(図4A)。これについては、以前の出版物7で詳しく説明されています。
RT-qPCR、免疫染色、組織学的染色により、個々の微小組織について組織特異的な表現型が良好に維持されていることが確認されました(図4)。例えば、OC微小組織の骨成分(OC−O)は、他の組織成分ではなく、高レベルのオステオカルシン(OCN)を発現した。対照的に、骨軟骨組織の軟骨部分(OC-C)では、コラーゲンII型(COL2)とアグリカン(ACAN)が他の組織よりも有意に高いレベルで発現していました(図4B)。代表的な脂肪遺伝子であるアディポネクチン(ADIPOQ)とレプチン(LEP)の発現レベルは、ATで他の組織よりもはるかに高かった。カルシウムミネラル(図4F,G)ならびにアルカリホスファターゼ(ALP)およびOCNタンパク質(図4D)の沈着は、主にOC-Oで見られ、OC-Cはグリコサミノグリカン(GAG)(図4C)およびCOL2(図4D)の良好な保持を示した。さらに、28日目にOC-Cで検出された2つの軟骨細胞肥大関連マーカーであるコラーゲンタイプX(COL10)とインドハリネズミ(IHH)の発現は、miniJointでの培養28日後に有意にダウンレギュレーションされることがわかりました(図4E)。
RT-qPCR、免疫染色、および組織学の結果、ATおよびSFTの表現型は、4週間のミニジョイント培養後も正常に維持されることが確認されました(図4B、H、I)。BODIPY染色とオイルレッドO染色を用いて、ATに豊富な脂肪滴沈着を観察しました(図4H)。 図4の 免疫蛍光染色像は、ミニジョイント培養の4週間後のSFTによる堅牢なルブリシンおよびカドヘリン11(CDH11)発現を示す。
組み合わせて、これらの結果は、miniJointシステムにおける機能的な多組織滑膜関節モデルの作成を示しています。
図4:miniJointチップでの4週間の共培養後の微小組織の個々の組織表現型の維持。 (A)組織特異的表現型が維持された正常なminiJointチップを生成するタイムライン。(B)RT-qPCRの結果は、すべての組織成分における主要なマーカー遺伝子を示す。OCNデータはOC-Oの値に、COL2とACANのデータはOC-Cの値に、ADIPOQとLEPのデータはATの値に、TNCとCOL1のデータはSFTの値に正規化されました。データは、一元配置分散分析(N = 3生物学的反復)によって分析された。* p < 0.05;** p < 0.01;p < 0.001;p < 0.0001.(c)二相性OCユニットのサフラニンO染色。スケールバー = 1 mm。 (D)OCユニットの対応する成分における骨特異的および軟骨特異的マーカーの存在を確認する組織学的染色および免疫染色画像。スケールバー = 50 μm。 (E)免疫染色では、28日目よりも56日目のOC-Cにおける2つの肥大マーカー、COLXおよびIHHの発現がはるかに低いことが示された。スケールバー = 50 μm。 (f)OCユニットのアリザリンレッド染色は、主にOC−Oにおけるカルシウム沈着の存在を示す。スケールバー = 500 μm。 (G)(F)におけるアリザリンレッド染色像の拡大図。スケールバー = 200 μm。 (h)オイルレッドOおよびBODIPY染色像は、ATにおける脂肪滴の保持を示す。スケールバー = 50 μm。 (i)滑膜様線維組織(SFT)によるルブリシンおよびCDH11の発現を示す免疫染色像。スケールバー = 50 μm。Liらの許可を得て複製7。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
疾患モデルを作成するために、インターロイキン1β(IL-1β)を共培養の28日後にFMストリームに導入しました(図5A、B)。IL-1β処理は、SFTにおける細胞アポトーシスおよびMMP-13レベルの上昇をもたらした(図5C)。興味深いことに、IL-1βで処理したミニジョイントでは軟骨の分解が見られ(図5D)、OC-CとSFTの間にクロストークが発生していることが示唆されました。
図5:ミニジョイントにおける関節の炎症と変性のモデリング 。 (A)IL-1βでSFTに挑戦することによる「滑膜炎」の誘導を示す模式図。(B)疾患モデルの確立と分析のタイムライン。(c)SFTの病理学的変化を示すTUNELアッセイおよびMMP-13免疫染色。DNA断片化は赤い矢印で示されています。スケールバー = 50 μm。 (D)サフラニンO染色およびMMP-13OC-Cの変性を示す免疫染色像。スケールバー = 50 μm。Liらの許可を得て複製7。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
最後に、IL-1βで処理したミニジョイントの軟骨分解を減少させることが示された「全身投与」(図6A)によるナプロキセン(NPX)の治療効果を試験しました(図6B)。また、「関節内投与」による他の4つの潜在的なDMOADについても検討しました(図6A)。リアルタイムPCRの結果は、これら4つの化合物が軟骨喪失を部分的に逆転させることができたことを示しました(図6C)。
図6:確立された疾患モデルにおける「全身」および「関節内」経路 を介した 薬物の試験 。 (A)ナプロキセン(NPX)の「全身投与」と線維芽細胞増殖因子18(FGF18)、SM04690、スクレロスチン(SOST)、およびIL-1受容体拮抗薬(IL-1RN)の「関節内投与」を含む2つの異なる薬物投与経路を示す概略図。(B)NPX処理後に緩和されたOC-C変性を示すサフラニンOおよびMMP-13染色像。スケールバー = 50 μm。 (C)4つの異なる薬物の「関節内投与」後のOC-Cにおける遺伝子発現。各薬物治療群と対照群との間の統計的差は、* p < 0.05で示される。** p < 0.01; p < 0.001;および **** p < 0.0001。データはスチューデントのt検定(N = 4生物学的反復)によって分析された。Liらの許可を得て複製7。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
本稿では、骨、軟骨、脂肪組織、滑膜様組織を間葉系幹細胞から形成し、カスタマイズされたバイオリアクター内で共培養する膝関節オンチップシステムを作成するためのプロトコルを紹介します。プラグアンドプレイ機能を備えたこの多成分ヒト細胞由来システムは、関節疾患の病因を研究し、医薬品を開発するための新しいツールです。
異なる組織が特定の培地を好むことを考えると、各組織にそれぞれの培地を提供し、フロー間の自由な培地交換を防ぐことが重要です。特に、二相性骨軟骨組織の生成中、ナイーブMSCの運命は、それらが曝露される媒体によって決定される。現在の設計では、足場としてゼラチンベースのヒドロゲルを使用しており、細胞増殖のテンプレートを提供し、組織とインサートの壁との間の潜在的なギャップをシールします。したがって、インサート内のゲルを in situ で光架橋することが重要です。さらに、BMP7およびTGFβ3などの成長因子は、それぞれ骨形成培地および軟骨形成培地に補充される。それらの生物活性を数日間維持するために、新鮮な培地はチップ培養物に導入される前にインキュベーターの外に保たれなければならない。したがって、インキュベーターに培地を注入するのではなく、シリンジを使用して培地をリザーバーから引き出す必要があります。
バイオリアクターを取り扱う際のもう一つの重要なポイントは、不必要な圧力を避けることです。組織は、所定の位置に留まるためにインサート壁への物理的な結合に依存しています。それらは上部と下部の媒体の流れにさらされるため、流れの1つの相の圧力が高い場合、組織がインサートから押し出され、漏れが発生する可能性があります。したがって、気泡を除去するときなどの取り扱いプロセス中は、シリンジを軽く押すことが重要です。ヒドロゲルの足場が押し出された場合、それを元に戻すことができ、追加の未硬化のヒドロゲルを適用してギャップを埋めることができ、硬化させることができるため、インサート内に安全でしっかりとした足場を収めることができます。
その証明された生体適合性を考えると、ゼラチンベースの足場は、現在のシステムで4つの組織すべてを作成するために使用されています。ゼラチンは、組織形成を支持するための最良の材料を表さないかもしれないことに留意すべきである。したがって、必要に応じて、他のタイプの足場を用途に適合させることができる。例えば、多孔質で硬い足場を使用し、それをゼラチンと組み合わせてMSC骨形成をさらに増強することができる11。この場合、上部と下部の流れの間に自由な媒体の変化がないことを確認する必要があります。上で論じたように、生体適合性のヒドロゲルを使用して潜在的な漏出点をシールすることができる。さらに、現在の組織チップにはMSCが使用されています。筋骨格組織への分化の可能性が実証されていることを考えると、人工多能性幹細胞(iPSC)は、将来、MSCの代わりに使用することもできます。この研究の第一歩として、最近、iPS細胞を用いて骨軟骨組織を作製しました12。
滑膜炎症、または滑膜炎は、OAおよび他の多くの関節疾患の重要な特徴です。さらに、Atukoralaらは、滑膜炎がその後のX線撮影OA13の強力な予測因子であることを見出した。そこで、IL-1β処理によりSFT炎症を誘導し、ミニジョイントにOA様の特徴を生じさせた。しかし、この疾患誘発法ではOAのすべての側面を捉えることはできないことは認識しています。したがって、私たちの将来の研究では、例えば、軟骨コンポーネント14の機械的損傷を誘発するために過生理学的負荷を使用することによって、miniJointにおけるOAをモデル化するための代替アプローチを模索する。機械的負荷をかけるには、ミニジョイント設計の適応が必要になります。たとえば、miniJointチップの底部を変更して、軟骨組織をラボ15で開発されたカスタマイズされたバネ仕掛けの衝撃装置のインパクターチップにアクセスできるようにすることができます。
私たちの知る限り、ここで説明する膝関節オンチップは、滑膜関節をシミュレートするために1つのシステム内に複数の組織を含む最初の in vitro モデルです。新しいプラグアンドプレイ機能により、疾患の進行における単一組織の役割と、さまざまな治療に対するその反応を調査することができます。このシステムは、OA以外の関節疾患のモデル化にも使用できます。例えば、細菌および他の病原体は、敗血症性関節炎をモデル化するためにSMに導入され得る可能性がある16。さらに、この設計により、組織間のリアルタイムのクロストークが可能になり、馴化培地の使用制限が克服されます。具体的には、脂肪、滑膜、および軟骨組織は共有媒体を介して通信でき、骨と軟骨は直接的な物理的結合を介して相互作用できます。ただし、現在のミニジョイントにはいくつかの制限があります。まず、幹細胞由来の組織が使用され、それらの表現型と機能が天然の膝関節の対応物に似ているかどうかは、さらなる調査が必要です。第二に、OAの病態形成に重要な役割を果たすマクロファージなどの免疫細胞は含まれていません。私たちの以前の研究は、ゼラチン足場にマクロファージを含めることの実現可能性を実証しました17。最後に、ネイティブの膝関節の組織への機械的負荷をシミュレートするための物理的ストレス対応メカニズムは含まれていません。最近、Occhettaらは、操作された軟骨組織を刺激するためにひずみ制御された圧縮が適用された軟骨オンチップモデルを開発しました14。同様の方法を採用して、miniJointに機械的負荷をかけることができます。
要約すると、miniJointは、 in vitro でOAおよび関連する状態の病因を調査し、個別化医療のための潜在的なDMOADおよび介入を探索するためのメカニズムを提供するための独自のプラットフォームとして機能することができます。miniJointシステムは、他の臓器を模倣するOoCと統合して、さまざまな臓器模倣物間の相互作用を研究するために使用できるボディオンチップシステムを確立することもできます。
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Disclosures
著者は、競合する利益を宣言しません。
Acknowledgments
この研究は主に国立衛生研究所(UG3/UH3TR002136、UG3/UH3TR003090)からの資金提供を受けて行われた。さらに、ヒト組織サンプルを提供してくれたPaul Manner博士(ワシントン大学)と、MSCの単離と細胞プールの作成に協力してくれたJian Tan博士に感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-isobutyl-1-methylxanthine | Sigma -Aldrich | I17018-1G | |
| 6 well non-tissue culture plate | Corning Falcon® Plates | 351146 | |
| 24 well non-tissue culture plate | Corning Falcon® Plates | 351147 | |
| 30 mL syringes | BD Syringe Luer Lock Cascade Health | 302832 | |
| Alcian blue stain | EK Industries | 1198 | 1% w/v, pH 1.0 |
| Advanced DMEM | Gibco | 12491-015 | |
| αMEM | Gibco | 12571-063 | |
| Antibiotic-antimycotic | Gibco | 15240-062 | |
| Biopsy punch | Integra Miltex | 12-460-407 | |
| BODIPY® fluorophore | Molecular Probes | ||
| Bone morphogenic protein 7 (BMP7) | Peprotech | ||
| Curved forceps | Fisher Brand | 16100110 | |
| DMEM | Gibco | 11995-065 | Dulbecco’s Modified Eagle Medium |
| Dexmethasome | Sigma -Aldrich | 02-05-2002 | |
| E-Shell 450 photopolymer in | EnvisionTec | RES-01-4022 | |
| Fetal Bovine Serum | Gemini-Bio Products | 900-208 | |
| GlutaMAX | Gibco | 3505-061 | |
| gelatin from bovine skin | Hyclone | 1003372809 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution | Sigma -Aldrich | SH30588.02 | |
| indomethacin | Sigma -Aldrich | I7378-56 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine (ITS) | Gibco | 51500-056 | |
| interleukin 1β | Peprotech | 200-01B | |
| Leur-loc connectors | Cole-Parmer Instruments | 45508-50 | |
| L-proline | Sigma -Aldrich | 115388-93-7 | |
| β-glycerophosphate | Sigma -Aldrich | 1003129352 | |
| Medium bags | KiYATEC | FC045 | |
| Methacrylic Anhydride | Sigma -Aldrich | 102378580 | |
| Phosphate buffered Saline | Corning | 21-040-CM | |
| Pointed forceps | Fisher Brand | 12000122 | |
| Silicon mold | McMaster-Carr | RC00114P | |
| Silicon o-rings | McMaster-Carr | ZMCCs1X5 | 1mm x 5mm |
| SolidWorks | Dassault Systèmes SE, Vélizy-Villacoublay, France | ||
| Surgical Blades | Integra Miltex | 4-122 | |
| Syringe pump | Lagato210P, KD Scientific | Z569631 | 10 syringe racks |
| T-182 tissue culture flasks | Fisher Brand | FB012939 | |
| Tissue Culture Dish 150 mm | Fisher Brand | FB012925 | |
| Transforming Growth Factor Beta (TGF-β3) | Peprotech | 100-36E | |
| Trypsin | Gibco | 25200-056 | |
| UV Flashlight | KBS | KB70109 | 395 nm |
| Vida Desktop 3D Printer | EnvisionTec | ||
| Vitamin D3 | Sigma -Aldrich | 32222-06-3 | 1,25-dihydroxyvitamin D3 |
References
- Safiri, S., et al. Global, regional and national burden of osteoarthritis 1990-2017: A systematic analysis of the Global Burden of Disease Study 2017. Annals of the Rheumatic Diseases. 79 (6), 819-828 (2020).
- Lawrence, R. C., et al. Estimates of the prevalence of arthritis and other rheumatic conditions in the United States: Part II. Arthritis and Rheumatism. 58 (1), 26-35 (2008).
- Makarczyk, M. J., et al. Current models for development of disease-modifying osteoarthritis drugs. Tissue Engineering. Part C, Methods. 27 (2), 124-138 (2021).
- He, Y., et al. Pathogenesis of osteoarthritis: risk factors, regulatory pathways in chondrocytes, and experimental models. Biology. 9 (8), 194 (2020).
- Ronaldson-Bouchard, K., Vunjak-Novakovic, G. Organs-on-a-chip: A fast track for engineered human tissues in drug development. Cell Stem Cell. 22 (3), 310-324 (2018).
- Lin, H., Sohn, J., Shen, H., Langhans, M. T., Tuan, R. S. Bone marrow mesenchymal stem cells: aging and tissue engineering applications to enhance bone healing. Biomaterials. 203, 96-110 (2019).
- Li, Z., et al. Human mesenchymal stem cell-derived miniature joint system for disease modeling and drug testing. Advanced Science. 9 (21), 2105909 (2022).
- Lin, H., Cheng, A. W., Alexander, P. G., Beck, A. M., Tuan, R. S. Cartilage tissue engineering application of injectable gelatin hydrogel with in situ visible-light-activated gelation capability in both air and aqueous solution. Tissue Engineering. Part A. 20 (17-18), 2402-2411 (2014).
- Fairbanks, B. D., Schwartz, M. P., Bowman, C. N., Anseth, K. S. Photoinitiated polymerization of PEG-diacrylate with lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate: polymerization rate and cytocompatibility. Biomaterials. 30 (35), 6702-6707 (2009).
- Lin, H., Lozito, T. P., Alexander, P. G., Gottardi, R., Tuan, R. S. Stem cell-based microphysiological osteochondral system to model tissue response to interleukin-1β. Molecular Pharmaceutics. 11 (7), 2203-2212 (2014).
- Yin, B., et al. Hybrid macro-porous titanium ornamented by degradable 3D gel/nHA micro-scaffolds for bone tissue regeneration. International Journal of Molecular Sciences. 17 (4), 575 (2016).
- Lin, Z., et al. Osteochondral tissue chip derived from iPSCs: Modeling OA pathologies and testing drugs. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 411 (2019).
- Atukorala, I., et al. Synovitis in knee osteoarthritis: A precursor of disease. Annals of the Rheumatic Diseases. 75 (2), 390-395 (2016).
- Occhetta, P., et al. Hyperphysiological compression of articular cartilage induces an osteoarthritic phenotype in a cartilage-on-a-chip model. Nature Biomedical Engineering. 3 (7), 545-557 (2019).
- He, C., et al. Modeling early changes associated with cartilage trauma using human-cell-laden hydrogel cartilage models. Stem Cell Research and Therapy. 13 (1), 400 (2022).
- Elsissy, J. G., et al. Bacterial septic arthritis of the adult native knee joint: A review. JBJS Reviews. 8 (1), 0059 (2020).
- Romero-Lopez, M., et al. Macrophage effects on mesenchymal stem cell osteogenesis in a three-dimensional in vitro bone model. Tissue Engineering. Part A. 26 (19-20), 1099-1111 (2020).
