Summary
We bieden gedetailleerde methoden voor het genereren van vier soorten weefsels uit menselijke mesenchymale stamcellen, die worden gebruikt om het kraakbeen, bot, vetkussen en synovium in het menselijke kniegewricht samen te vatten. Deze vier weefsels zijn geïntegreerd in een aangepaste bioreactor en verbonden via microfluïdica, waardoor een kniegewricht-op-een-chip wordt gegenereerd.
Abstract
De hoge prevalentie van slopende gewrichtsaandoeningen zoals artrose (OA) vormt een hoge sociaaleconomische last. Momenteel zijn de beschikbare medicijnen die zich richten op gewrichtsaandoeningen meestal palliatief. De onvervulde behoefte aan effectieve disease-modifying OA drugs (DMOADs) is voornamelijk veroorzaakt door het ontbreken van geschikte modellen voor het bestuderen van de ziektemechanismen en het testen van potentiële DMOADs. Hierin beschrijven we de oprichting van een miniatuur synoviaal gewricht-nabootsend microfysiologisch systeem (miniJoint) bestaande uit vet-, vezel- en osteochondrale weefselcomponenten afgeleid van menselijke mesenchymale stamcellen (MSC's). Om de driedimensionale (3D) microweefsels te verkrijgen, werden MSC's ingekapseld in fotocrosslinkable methacrylated gelatine voor of na differentiatie. De met cellen beladen weefselconstructies werden vervolgens geïntegreerd in een 3D-geprinte bioreactor, waardoor de miniJoint werd gevormd. Afzonderlijke stromen van osteogene, fibrogene en adipogene media werden geïntroduceerd om de respectieve weefselfenotypen te behouden. Een algemeen gedeelde stroom werd doordrenkt door het kraakbeen, synoviale en vetweefsels om weefseloverspraak mogelijk te maken. Dit stromingspatroon maakt de inductie van verstoringen in een of meer van de weefselcomponenten voor mechanistische studies mogelijk. Bovendien kunnen potentiële DMOADs worden getest via "systemische toediening" via alle mediumstromen of "intra-articulaire toediening" door de geneesmiddelen toe te voegen aan alleen de gedeelde "synoviale vloeistof" -simulerende stroom. Zo kan de miniJoint dienen als een veelzijdig in vitro platform voor het efficiënt bestuderen van ziektemechanismen en het testen van geneesmiddelen in gepersonaliseerde geneeskunde.
Introduction
Gewrichtsziekten zoals artrose (OA) komen veel voor en zijn slopend en vormen wereldwijd een belangrijke oorzaak van invaliditeit1. Geschat wordt dat artrose alleen al in de VS 27 miljoen patiënten treft en voorkomt bij 12,1% van de volwassenen van 60 jaar en ouderdan 2 jaar. Helaas zijn de meeste geneesmiddelen die momenteel worden gebruikt om gewrichtsaandoeningen te beheersen palliatief en zijn er geen effectieve ziektemodificerende OA-geneesmiddelen (DMOADs) beschikbaar3. Deze onvervulde medische behoefte komt voornamelijk voort uit het ontbreken van een effectief model voor het bestuderen van de ziektemechanismen en het ontwikkelen van potentiële DMOADs. De conventionele tweedimensionale (2D) celcultuur weerspiegelt niet de 3D-aard van gewrichtsweefsels en de kweek van weefselexplantaten wordt vaak belemmerd door aanzienlijke celdood en slaagt er meestal niet in om de dynamische weefselverbindingen te repliceren4. Bovendien verminderen genetische en anatomische verschillen de fysiologische relevantie van diermodellen aanzienlijk4.
Organs-on-chips (OoC's), of microfysiologische systemen, zijn een veelbelovend onderzoeksveld op het snijvlak van engineering, biologie en geneeskunde. Deze in vitro platforms zijn minimale functionele eenheden die gedefinieerde gezonde of pathologische kenmerken van hun in vivo tegenhangers repliceren5. Bovendien kunnen deze geminiaturiseerde systemen verschillende cellen en matrices hosten en de biofysische en biochemische interacties tussen verschillende weefsels simuleren. Daarom belooft een microfysiologisch systeem dat het inheemse synoviale gewricht getrouw kan samenvatten een effectief platform te bieden voor het modelleren van gewrichtsaandoeningen en het ontwikkelen van potentiële DMOADs.
Menselijke mesenchymale stamcellen (MSC's) kunnen worden geïsoleerd uit vele weefsels in het lichaam en worden gedifferentieerd in osteogene, chongene en adipogene afstammingslijnen6. MSC's zijn met succes gebruikt om verschillende weefsels te engineeren, waaronder bot, kraakbeen en vetweefsel6, wat betekent dat ze een veelbelovende celbron vormen voor het engineeren van de weefselcomponenten van het kniegewricht. We hebben onlangs een miniatuur gewricht-nabootsend microfysiologisch systeem ontwikkeld, genaamd miniJoint, dat bestaat uit MSC-afgeleide bot-, kraakbeen-, vezel- en vetweefsels7. In het bijzonder maakt het nieuwe ontwerp weefseloverspraak mogelijk door microfluïdische stroming of permeatie (figuur 1). Hierin presenteren we de protocollen voor de fabricage van de chipcomponenten, de engineering van de weefselcomponenten, de cultuur van de gemanipuleerde weefsels in de chip en de verzameling van weefsels voor downstream-analyses.
Figuur 1: Schema van de miniJoint chip met de rangschikking van de verschillende weefselcomponenten en medium flows. OC = osteochondraal weefsel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Het volgende protocol volgt de ethische richtlijnen van de Universiteit van Pittsburgh en de ethische commissie voor menselijk onderzoek van de Universiteit van Pittsburgh. Informatie over de materialen die in dit onderzoek zijn gebruikt, is opgenomen in de materiaaltabel.
1. Productie van 3D-geprinte bioreactoren
- Gebruik een computersoftware om osteochondrale (figuur 2A) en minijoint bioreactoren (figuur 2B) te ontwerpen die kamers, inzetstukken en deksels bevatten. De dimensie-informatie voor elk onderdeel wordt weergegeven in figuur S1.
- Breng het ontwerp over naar een 3D-printer en print met een fotopolymeerinkt.
- Spoel de 3D-geprinte onderdelen (figuur 2C-F) driemaal af met 15 ml 95% ethanol. Vervolgens kunt u de afgedrukte stukken gedurende 200 s volledig crosslinken in een zaklamppolymerisatieapparaat.
- Voeg O-ringen toe aan inzetstukken en deksels (figuur 2C, D) en test of de onderdelen passen (figuur 2G, H).
Figuur 2: Fabricage van de verschillende componenten om de miniJoint bioreactor te maken. (A,B), 3D modellen van bioreactoren voor het maken van (A) osteochondrale en (B) miniJoint chips. (C,D) 3D geprinte (C) deksels en (D) inserts met de O-ring geïnstalleerd. (E,F) 3D geprinte kamers voor (E) osteochondrale en (F) miniJoint weefselkweek. (G,H) Assemblage van (G) osteochondrale en (H) miniJoint chips. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
2. Engineering van de weefselcomponenten
OPMERKING: De processen voor de vervaardiging van lithiumfenyl-2,4,6-trimethylbenzoylfosfinaat (LAP) en methacrylaatgelatine (GelMA) zijn beschreven in eerdere studies 8,9.
- Volg de onderstaande stappen om GelMA te maken.
- Voeg 17 g gelatine type B toe aan 500 ml gedestilleerd water en meng vervolgens gedurende 30 minuten op een shaker bij 37 °C.
- Voeg vervolgens 13 ml methacrylzuuranhydride toe, plaats terug op de 37 °C shaker en laat een nacht schudden.
- De volgende dag, aliquot de GelMA in individuele dialysezakken, met ~ 60 ml in elke zak.
- Plaats alle dialysezakken in gedestilleerd water met een roerstaaf en laat 7 dagen dialyse toe. Ververs het water meerdere keren per dag en laat de zakken een nacht op 4 °C staan.
- Vries op dag 7 de GelMA in bij −80 °C. Eenmaal volledig bevroren, ga dan verder met lyofilisatie.
- Plaats de GelMA in een schaal in de vacuümkamer van een lyofilisator en laat het vriesdrogen. Zorg ervoor dat de GelMA volledig is gedroogd voordat u de lyofilisator verwijdert.
- Los de GelMA op in de uitgebalanceerde zoutoplossing van Hank (HBSS met Ca 2+ en Mg2+) bij 15% (m/v). Om ervoor te zorgen dat de pH op 7,4 is, voegt u NaOH in kleine hoeveelheden toe totdat de pH 7,4 bereikt. Vul de oplossing aan met 1x antibiotisch-antimycotisch en 0,15% (w/v) LAP op basis van het verkregen volume. Bewaar de 15% GelMA-oplossing bij −20 °C tot gebruik en bescherm deze tegen licht.
- Plaats 3D-geprinte dual-flow bioreactorkamers, deksels en inzetstukken in autoclaafzakken en autoclaaf bij 121 °C gedurende 20 minuten met stoom en vervolgens gedurende 20 minuten met droge hitte.
- Week in de biologische veiligheidskast de bioreactorkamers, deksels en inzetstukken een nacht in 15 ml steriele fosfaat-gebufferde zoutoplossing, waarna ze kunnen drogen.
- Isoleer van menselijk beenmerg afgeleide MSC's uit totaal chirurgisch afval van gewrichtsartroplastiek met IRB-goedkeuring (Universiteit van Pittsburgh en Universiteit van Washington).
- Spoel in het bijzonder het beenmerg uit het trabeculaire bot van de femurhals en -kop en resuspensie het in Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM).
- Filtreer de suspensie door een zeef van 40 μm en centrifugeer de doorstroming gedurende 5 minuten op 300 x g .
- Verwijder het supernatant, resuspensie van de pellets met behulp van groeimedium [DMEM, 10% foetaal runderserum (FBS) en 1x antibioticum-antimycoticum] en plaats het vervolgens in weefselkweekkolven.
- Verander het kweekmedium om de 3 dagen tot 4 dagen. Zorg ervoor dat een samenvloeiing van 70% tot 80% wordt bereikt voordat u verder gaat.
- Maak de cellen los door gedurende 2-3 minuten te incuberen met trypsine-EDTA en te passeren in een verhouding van 1 miljoen cellen per T150-kolf.
- Vouw de cellen uit tot P5. Na trypsinisatie, suspensie de cellen, tel ze en pellet vervolgens door centrifugeren op 300x g gedurende 5 minuten.
- Met een pipet van 1.000 μL resuspendeert u de cellen bij 20 x 106 cellen/ml in 15% GelMA-oplossing.
OPMERKING: Doe het licht van de biologische veiligheidskast uit. - Druk met steriele handschoenen een steriele, droge siliconen vorm tegen een petrischaaltje. Plaats vervolgens een inzetstuk in elk gat van de siliconenvorm met een tang, met de gatzijde van de insert naar beneden gericht.
- Voeg met behulp van een pipet van 200 μL de celsuspensie toe om de insert te vullen (~ 50 μL per insert).
- Gebruik een UV-zaklamp (LED-lampje met een golflengte van 395 nm) om de bovenkant van de gel/insert gedurende 1,5 minuut te crosslinken. Verlicht vervolgens de andere kant gedurende 30 s. Crosslinking treedt op wanneer de LAP-foto-initiator wordt blootgesteld aan UV-licht.
OPMERKING: De celsuspensie kan gedurende deze periode in de couveuse worden bewaard of tegen licht worden beschermd. - Breng met een steriele tang de inserts onmiddellijk over in 8 ml groeimedium in een niet-weefselkweek 6-well plaat (DMEM aangevuld met 10% [v / v] FBS en 1x antibioticum-antimycoticum) om de cellen 's nachts te laten herstellen.
- Differentieer de cellen in de richting van vier afstammingslijnen.
- Om vetweefsel (AT) te engineeren, brengt u de inserts over naar 8 ml adipogeen medium (AM; Alfa-MEM, 10% FBS, 0,2 mM indomethacine, 1x insuline-transferrine-selenium (ITS), 0,45 mM 3-isobutyl-1-methylxanthine, 0,1 μM dexamethason en 1x antibioticum-antimycoticum) om differentiatie te initiëren. Idealiter worden vier inserts geplaatst in een enkele put van een niet-weefselkweekputplaat met 8 ml adipogeen medium. Kweek de cellen in de putplaten gedurende 28 dagen, met mediumwisselingen om de andere dag.
- Om de osteochondrale eenheden (OC) te engineeren, plaatst u de inserts in bioreactorkamers met dubbele stroom, sluit u de putten af en infundeert u de twee stromen afzonderlijk met een stroomsnelheid van 5 μL / min met 35 ml osteogeen medium (OM; DMEM, 10% FBS, 1x antibioticum-antimycoticum, 0,1 μM dexamethason, 0,01 M β-glycerofosfaat, 100 ng/ml botmorfogeen eiwit 7 (BMP7), 50 μg/ml ascorbinezuur en 10 nM vitamine D3) en 35 ml chongeen medium (CM; DMEM, 1x antibiotisch-antimycotisch, 1x ITS, 0,1 μM dexamethason, 40 μg/ml proline, 50 μg/ml ascorbinezuur en 10 ng/ml transformerende groeifactor β3)10. Handhaaf celdifferentiatie gedurende 28 dagen door tweewekelijkse mediumveranderingen uit te voeren.
- Om de fibroblasten af te leiden, differentiëren de MSC's in 2D-cultuur gedurende 21 dagen in een T150 cm2 weefselkweekkolf met behulp van 20 ml fibrogeen medium (FM; geavanceerde DMEM, 5% FBS, 1x GlutaMAX, 1x antibioticum-antimycoticum en 50 μg / ml ascorbinezuur). Verander het medium elke week. Gebruik 4 ml trypsine om de cellen los te maken en de 3D-gels in de inserts in te kapselen, volgens het hierboven beschreven protocol, om synoviaal gelijk-vezelig weefsel (SFT) te verkrijgen.
OPMERKING: De samenstellingen van alle differentiatiemedia zijn te vinden in tabel 1.
3. Het opzetten van de miniJoint chip
- Autoclaaf de 3D miniJoint bioreactor kamers, siliconen buizen met een 0,062 inch binnendiameter en een 0,125 inch buitendiameter, en F 1/16 Luer-lock connectoren. Sluit de siliconenslang aan op de miniJoint bioreactor weerhaak aan het ene uiteinde en sluit het Luer-slot aan het andere uiteinde aan.
- Bereid de AM, OM (het verwijderen van BMP7) en FMCM voor die in stap 2.11 worden genoemd. Bereid bovendien het gemeenschappelijke gedeelde medium (SM; fenolroodvrije DMEM, 1x antibioticum-antimycoticum, 1x Na-pyruvaat, 1x ITS, 40 μg / ml proline, 50 μg / ml ascorbinezuur en 0,5 ng / ml transformerende groeifactor β3) voor voor gebruik voor de miniJoint-cultuur. Laad 35 ml van elk medium in de middelgrote reservoirs.
- Gebruik een rechte tang om de osteochondrale eenheid van de dual-flow bioreactor over te brengen naar de rechterput van de miniJoint bioreactor. Breng het inbrengen van vetweefsel en het inbrengen van vezelig weefsel over in respectievelijk het linker- en middenput. Sluit alle putjes af met gesteriliseerde deksels.
- Sluit de inlaten van de miniJoint-chip aan op de middelgrote reservoirs en de uitlaten op spuiten (figuur 3A-C).
- Monteer de spuiten op een spuitpomp (figuur 3C) en breng de pomp en chips over naar een couveuse. De middelgrote reservoirs worden buiten de incubator op ijs gehouden.
- Gebruik de pomp in de terugtrekkingsmodus en trek het medium uit het mediumreservoir in de miniJoint bioreactorkamer. Dit miniJoint kweekproces duurt 28 dagen.
- Om gewrichtsontsteking en kraakbeendegeneratie te modelleren, voegt u interleukine 1β (IL-1β) toe aan de fibrogene mediumstroom bij 10 ng / ml. Vervang de spuiten op de derde dag van de IL-1β-behandeling en geef vers IL-1β aan het fibrogene medium. De behandeling duurt 7 dagen.
- Tijdens de teststap van het geneesmiddel, na 3 dagen IL-1β-behandeling, dient u het geneesmiddel toe in het gedeelde medium, waarbij een "intra-articulaire toediening" (figuur 3D) wordt gesimuleerd wanneer het geneesmiddel lokaal in het kniegewricht wordt gebruikt, of in alle mediumtypen, waarbij een "systemische toediening" (figuur 3E) wordt gesimuleerd wanneer het geneesmiddel via de bloedsomloop op het kniegewricht inwerkt.
- Verzamel individuele weefsels voor analyse na 7 dagen IL-1β-behandeling, ongeacht of de monsters de afgelopen 4 dagen een medicamenteuze behandeling hebben ondergaan.
Figuur 3: Montage van de miniJoint. (A,B) Weefselspecifieke media worden ingebracht vanuit inlaten 1-3 (I1-3) en verplaatst uit uitgangen 1-3 (O1-3). Het gedeelde medium is doordrenkt van I4 naar O4. (C) De volledige opzet van de miniJoint cultuur. Geneesmiddelen (groene zonachtige vormen) kunnen worden ingebracht in (D) alleen het gedeelde medium of (E) alle mediums om respectievelijk "intra-articulaire toediening" of "systemische toediening" te simuleren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
4. Individuele weefselverzameling
- Gebruik een steriele gebogen tang om de inzetstukken te verwijderen.
- Duw een biopsiepons door het midden van de insert om de gel te verwijderen en plaats de gel in PBS.
- Snijd de osteochondrale gels doormidden bij het beoordelen van de genexpressie.
OPMERKING: Aangezien de osteochondrale gel uit twee weefseltypen bestaat, is het belangrijk om de osteogene en chongene cellen te scheiden. - Verzamel de geconditioneerde media en weefsels voor verschillende experimenten.
- Verzamel ongeveer 1,5 ml van elke mediumbron.
- Vries de geconditioneerde media in vloeibare stikstof in na centrifugeren bij 14.000 x g gedurende 10 minuten en het weggooien van het sediment.
- Voor histologische kleuring en immunostaining fixeert u eerst de OC- en SFT-monsters in 10% gebufferde formaline, droogt u ze uit in ethanol van oplopende concentraties, verwijdert u ze in xyleen, sluit u ze in paraffine in en snijdt u ze ten slotte met een dikte van 6 μm.
- Voor de AT-microtweefsels, fixeer de monsters in 10% gebufferde formaline en kleur ze direct met Oil Red O-oplossing of BODIPY.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Alle weefsels van de miniJoint werden verzameld om hun fenotypes te analyseren na 28 dagen kweek in de miniJoint (figuur 4A). Dit is gedetailleerd beschreven in onze vorige publicatie7.
Door het gebruik van RT-qPCR, immunostaining en histologische kleuring werd bevestigd dat de weefselspecifieke fenotypes goed werden onderhouden voor de individuele microtissues (figuur 4). Bijvoorbeeld, de botvormige component van de OC-microtweefsels (OC-O), maar niet de andere weefselcomponenten, bracht hoge niveaus van osteocalcine (OCN) tot expressie. In het kraakbeengedeelte van de osteochondrale weefsels (OC-C) daarentegen kwamen collageen type II (COL2) en aggrecan (ACAN) significant hogere concentraties tot expressie dan in de andere weefsels (figuur 4B). De expressieniveaus van adiponectine (ADIPOQ) en leptine (LEP), twee representatieve adipogene genen, waren veel hoger in de AT dan in de andere weefsels. De afzetting van calciummineralen (figuur 4F,G) en alkalische fosfatase (ALP) en OCN-eiwitten (figuur 4D) werd voornamelijk gezien in de OC-O, en de OC-C toonde goed vastgehouden glycosaminoglycaan (GAG) (figuur 4C) en COL2 (figuur 4D). Bovendien bleek de expressie van twee chondrocytenhypertrofie-geassocieerde markers, collageen type X (COL10) en Indiase egel (IHH), die op dag 28 in de OC-C werden gedetecteerd, significant te zijn gedownreguleerd na 28 dagen cultuur in de miniJoint (figuur 4E).
De resultaten van RT-qPCR, immunostaining en histologie bevestigden dat de fenotypes van AT en SFT met succes werden gehandhaafd na 4 weken miniJoint cultuur (Figuur 4B,H,I). Met behulp van BODIPY-kleuring en Oil Red O-kleuring zagen we overvloedige lipidedruppelafzetting in de AT (figuur 4H). De immunofluorescentiekleuringsbeelden in figuur 4I tonen robuuste smeer- en cadherine 11 (CDH11) expressie door de SFT na 4 weken miniJoint cultuur.
In combinatie wijzen deze resultaten op de creatie van een functioneel, multi-weefsel synoviaal gewrichtsmodel in het miniJoint-systeem.
Figuur 4: Onderhoud van de individuele weefselfenotypen van de microtweefsels na 4 weken co-cultuur in de miniJoint chip. (A) Tijdlijn van het genereren van een normale miniJoint-chip met behoud van de weefselspecifieke fenotypen. (B) RT-qPCR-resultaten die belangrijke markergenen in alle weefselcomponenten laten zien. De OCN-gegevens werden genormaliseerd naar de waarden in de OC-O, de COL2- en ACAN-gegevens naar de waarden in de OC-C, de ADIPOQ- en LEP-gegevens naar de waarden in de AT en de TNC- en COL1-gegevens naar de waarden in de SFT. De gegevens werden geanalyseerd door eenrichtings-ANOVA (N = 3 biologische replicaties). * p < 0,05; ** p < 0,01; p < 0,001; p < 0,0001. (C) Safranine O-kleuring van de bifasische overklokeenheid. Schaalbalk = 1 mm. (D) Histologische kleurings- en immunokleuringsbeelden die de aanwezigheid van botspecifieke en kraakbeenspecifieke markers in de overeenkomstige componenten van de OC-eenheid bevestigen. Schaalbalk = 50 μm. (E) Immunostaining met een veel lagere expressie van twee hypertrofiemarkers, COLX en IHH, in de OC-C op dag 56 dan op dag 28. Schaalbalk = 50 μm. (F) Alizarinerode kleuring van de OC-eenheid die de aanwezigheid van calciumafzettingen voornamelijk in de OC-O aantoont. Schaalbalk = 500 μm. (G) Vergrote weergaven van de Alizarin Red-kleuringsafbeelding in (F). Schaalbalk = 200 μm. (H) Oil Red O- en BODIPY-kleuringsafbeeldingen die het vasthouden van lipidedruppels in het AT laten zien. Schaalbalk = 50 μm. (I) Immunostainingbeelden die de expressie van smeermiddel en CDH11 door het synoviale vezelige weefsel (SFT) tonen. Schaalbalk = 50 μm. Gereproduceerd met toestemming van Li et al.7. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Om een ziektemodel te maken, werd interleukine 1β (IL-1β) na 28 dagen co-cultuur in de FM-stroom geïntroduceerd (figuur 5A,B). IL-1β-behandeling resulteerde in celapoptose en verhoogde MMP-13-niveaus in de SFT (figuur 5C). Interessant is dat we kraakbeenafbraak waarnamen in de miniJoint behandeld met IL-1β (figuur 5D), wat wijst op het optreden van overspraak tussen de OC-C en SFT.
Figuur 5: Modellering van gewrichtsontsteking en degeneratie in de miniJoint . (A) Schema dat de inductie van "synovitis" laat zien door de SFT uit te dagen met IL-1β. (B) Tijdlijn van het vaststellen en analyseren van het ziektemodel. (C) TUNEL-assay en MMP-13-immunostaining die de pathologische veranderingen in de SFT laten zien. DNA-fragmentatie wordt aangegeven door de rode pijlpunten. Schaalbalk = 50 μm. (D) Safranine O-kleuring en MMP-13 immunostainingbeelden die de degeneratie van de OC-C laten zien. Schaalbalk = 50 μm. Gereproduceerd met toestemming van Li et al.7. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Ten slotte testten we de therapeutische werkzaamheid van naproxen (NPX) door middel van "systemische toediening" (figuur 6A), waarvan werd aangetoond dat het de afbraak van kraakbeen in de met IL-1 β behandelde minijoint vermindert (figuur 6B). We onderzochten ook vier andere potentiële DMOADs via "intra-articulaire toediening" (figuur 6A). De resultaten van de real-time PCR gaven aan dat deze vier verbindingen in staat waren om het kraakbeenverlies gedeeltelijk om te keren (figuur 6C).
Figuur 6: Testen van geneesmiddelen via "systemische" en "intra-articulaire" routes in het gevestigde ziektemodel. (A) Schema met de twee verschillende toedieningsroutes voor geneesmiddelen, waaronder de "systemische toediening" van naproxen (NPX) en de "intra-articulaire toediening" van fibroblastgroeifactor 18 (FGF18), SM04690, sclerostine (SOST) en IL-1-receptorantagonist (IL-1RN). (B) Safranine O- en MMP-13-kleuringsbeelden die verlichte OC-C-degeneratie na NPX-behandeling laten zien. Schaalbalk = 50 μm. (C) Genexpressie in de OC-C na de "intra-articulaire toediening" van vier verschillende geneesmiddelen. De statistische verschillen tussen elke met geneesmiddelen behandelde groep en de controlegroep worden aangegeven met * p < 0,05; ** p < 0,01; p < 0,001; en **** p < 0,0001. De gegevens werden geanalyseerd door de Student t-test (N = 4 biologische replicaties). Gereproduceerd met toestemming van Li et al.7. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In dit artikel presenteren we een protocol voor het maken van een kniegewricht-op-een-chip-systeem, waarin bot, kraakbeen, vetweefsel en synoviumachtige weefsels worden gevormd uit MSC's en co-gekweekt in een aangepaste bioreactor. Dit multi-component, van menselijke cellen afgeleide systeem met plug-and-play-functies vertegenwoordigt een nieuw hulpmiddel voor het bestuderen van de pathogenese van gewrichtsziekten en het ontwikkelen van medicijnen.
Aangezien verschillende weefsels de voorkeur geven aan specifieke kweekmedia, is het van cruciaal belang om het respectieve medium voor elk weefsel te bieden en vrije mediumuitwisseling tussen stromen te voorkomen. Met name tijdens het genereren van bifasische osteochondrale weefsels wordt het lot van naïeve MSC's bepaald door het medium waaraan ze worden blootgesteld. In het huidige ontwerp gebruiken we een hydrogel op basis van gelatine als steiger, die een sjabloon biedt voor celgroei en de potentiële opening tussen de weefsels en de wanden van de inserts afdicht. Daarom is het van cruciaal belang om de gel in de inserts in situ te photocrosslinken. Bovendien worden groeifactoren zoals BMP7 en TGFβ3 aangevuld in respectievelijk het osteogene medium en het chongene medium. Om hun bio-activiteiten enkele dagen te behouden, moeten de verse media buiten de incubator worden bewaard voordat ze in de chipcultuur worden geïntroduceerd. Daarom moeten we spuiten gebruiken om de media uit de reservoirs te halen in plaats van de media in de couveuse te injecteren.
Een ander kritiek punt bij het hanteren van de bioreactor is het vermijden van onnodige druk. De weefsels vertrouwen op fysieke binding aan de insteekwand om in positie te blijven. Omdat ze worden blootgesteld aan de bovenste en onderste mediumstromen, kan een fase van de stroom een hogere druk hebben de weefsels uit de inserts duwen, wat resulteert in lekken. Daarom is tijdens de hanteringsprocessen, zoals bij het verwijderen van bubbels, een zachte druk op de spuit van cruciaal belang. Als de hydrogelsteiger naar buiten wordt geduwd, kan deze worden teruggeplaatst, kan extra niet-uitgeharde hydrogel worden aangebracht om de opening te vullen en kan deze worden uitgehard, waardoor een veilige en stevige steiger in de insert past.
Gezien de bewezen biocompatibiliteit worden steigers op basis van gelatine gebruikt om alle vier de weefsels in het huidige systeem te maken. Opgemerkt moet worden dat gelatine mogelijk niet het beste materiaal is voor het ondersteunen van weefselvorming. Daarom kunnen, indien nodig, andere soorten steigers worden aangepast voor gebruik. Men kan bijvoorbeeld een poreuze en stijve steiger gebruiken en deze combineren met gelatine om msc osteogenese11 verder te verbeteren. In dit geval moet men ervoor zorgen dat er geen vrije mediumverandering is tussen de bovenste en onderste stromen. Zoals hierboven besproken, kan men biocompatibele hydrogels gebruiken om de potentiële lekkende punten af te dichten. Daarnaast worden MSC's gebruikt in de huidige weefselchip. Gezien hun aangetoonde differentiatiepotentieel in musculoskeletale weefsels, kunnen geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's) in de toekomst ook worden gebruikt om MSC's te vervangen. Als eerste stap in de richting van dit onderzoek hebben we onlangs iPSC's gebruikt om osteochondrale weefselste maken 12.
Synoviumontsteking, of synovitis, is een belangrijk kenmerk van artrose en vele andere gewrichtsaandoeningen. Bovendien vonden Atukorala et al. dat synovitis een sterke voorspeller is van latere radiografische OA13. Daarom induceerden we SFT-ontsteking door IL-1β-behandeling om OA-achtige kenmerken in de miniJoint te genereren. We zijn ons er echter van bewust dat deze ziekte-inductiemethode niet alle facetten van artrose kan omvatten. Daarom zullen we in ons toekomstig onderzoek alternatieve benaderingen onderzoeken voor het modelleren van artrose in de minijoint door bijvoorbeeld hyperfysiologische belasting te gebruiken om mechanisch letsel van de kraakbeencomponent14 te induceren. Om mechanische belasting toe te passen, is de aanpassing van het miniJoint-ontwerp noodzakelijk. De onderkant van de miniJoint-chip kan bijvoorbeeld mogelijk worden aangepast om het kraakbeenweefsel toegankelijk te maken voor de impactorpunt van een aangepast veerbelast impactapparaat dat is ontwikkeld in ons lab15.
Voor zover bekend is het hier beschreven kniegewricht-op-een-chip het eerste in vitro model dat meerdere weefsels binnen één systeem omvat om een synoviaal gewricht te simuleren. De nieuwe plug-and-play-capaciteit maakt het mogelijk om de rol van een enkel weefsel in ziekteprogressie en de reactie op verschillende behandelingen te onderzoeken. Dit systeem kan ook worden gebruikt om andere gewrichtsaandoeningen dan artrose te modelleren. Bacteriën en andere ziekteverwekkers kunnen bijvoorbeeld mogelijk in de SM worden geïntroduceerd om septische artritis16 te modelleren. Bovendien maakt het ontwerp real-time overspraak tussen de weefsels mogelijk, waardoor de beperking van het gebruik van het geconditioneerde medium wordt overwonnen. In het bijzonder kunnen vet-, synoviale en kraakbeenweefsels communiceren via het gedeelde medium, en bot en kraakbeen kunnen interageren via directe fysieke binding. Er zijn echter enkele beperkingen aan de huidige miniJoint. Ten eerste worden van stamcellen afgeleide weefsels gebruikt en of hun fenotype en functie lijken op hun tegenhangers in het inheemse kniegewricht, moet verder worden onderzocht. Ten tweede zijn immuuncellen zoals macrofagen, die een cruciale rol spelen in de pathogenese van artrose, niet inbegrepen. Onze eerdere studie heeft de haalbaarheid aangetoond van het opnemen van macrofagen in gelatinesteigers17. Ten slotte is een fysiek stressmechanisme niet inbegrepen om de mechanische belasting van de weefsels in het oorspronkelijke kniegewricht te simuleren. Onlangs ontwikkelden Occhetta et al. een kraakbeen-op-een-chip-model, waarbij spanningsgestuurde compressie werd toegepast om het gemanipuleerde kraakbeenweefselte stimuleren 14. Een vergelijkbare methode kan worden toegepast om mechanische belasting in de miniJoint mogelijk te maken.
Samenvattend kan de miniJoint dienen als een uniek platform om de pathogenese van artrose en gerelateerde aandoeningen in vitro te onderzoeken en een mechanisme te bieden voor het verkennen van potentiële DMOADs en interventies voor gepersonaliseerde geneeskunde. Het miniJoint-systeem kan ook worden geïntegreerd met OoC's die andere organen nabootsen om body-on-a-chip-systemen op te zetten die kunnen worden gebruikt om de interacties tussen verschillende orgaannabootsingen te bestuderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen tegenstrijdige belangen te hebben.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd voornamelijk ondersteund door financiering van de National Institutes of Health (UG3/UH3TR002136, UG3/UH3TR003090). Daarnaast bedanken we Dr. Paul Manner (University of Washington) voor het verstrekken van de menselijke weefselmonsters en Dr. Jian Tan voor hun hulp bij het isoleren van de MSC's en het creëren van de celpool.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-isobutyl-1-methylxanthine | Sigma -Aldrich | I17018-1G | |
| 6 well non-tissue culture plate | Corning Falcon® Plates | 351146 | |
| 24 well non-tissue culture plate | Corning Falcon® Plates | 351147 | |
| 30 mL syringes | BD Syringe Luer Lock Cascade Health | 302832 | |
| Alcian blue stain | EK Industries | 1198 | 1% w/v, pH 1.0 |
| Advanced DMEM | Gibco | 12491-015 | |
| αMEM | Gibco | 12571-063 | |
| Antibiotic-antimycotic | Gibco | 15240-062 | |
| Biopsy punch | Integra Miltex | 12-460-407 | |
| BODIPY® fluorophore | Molecular Probes | ||
| Bone morphogenic protein 7 (BMP7) | Peprotech | ||
| Curved forceps | Fisher Brand | 16100110 | |
| DMEM | Gibco | 11995-065 | Dulbecco’s Modified Eagle Medium |
| Dexmethasome | Sigma -Aldrich | 02-05-2002 | |
| E-Shell 450 photopolymer in | EnvisionTec | RES-01-4022 | |
| Fetal Bovine Serum | Gemini-Bio Products | 900-208 | |
| GlutaMAX | Gibco | 3505-061 | |
| gelatin from bovine skin | Hyclone | 1003372809 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution | Sigma -Aldrich | SH30588.02 | |
| indomethacin | Sigma -Aldrich | I7378-56 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine (ITS) | Gibco | 51500-056 | |
| interleukin 1β | Peprotech | 200-01B | |
| Leur-loc connectors | Cole-Parmer Instruments | 45508-50 | |
| L-proline | Sigma -Aldrich | 115388-93-7 | |
| β-glycerophosphate | Sigma -Aldrich | 1003129352 | |
| Medium bags | KiYATEC | FC045 | |
| Methacrylic Anhydride | Sigma -Aldrich | 102378580 | |
| Phosphate buffered Saline | Corning | 21-040-CM | |
| Pointed forceps | Fisher Brand | 12000122 | |
| Silicon mold | McMaster-Carr | RC00114P | |
| Silicon o-rings | McMaster-Carr | ZMCCs1X5 | 1mm x 5mm |
| SolidWorks | Dassault Systèmes SE, Vélizy-Villacoublay, France | ||
| Surgical Blades | Integra Miltex | 4-122 | |
| Syringe pump | Lagato210P, KD Scientific | Z569631 | 10 syringe racks |
| T-182 tissue culture flasks | Fisher Brand | FB012939 | |
| Tissue Culture Dish 150 mm | Fisher Brand | FB012925 | |
| Transforming Growth Factor Beta (TGF-β3) | Peprotech | 100-36E | |
| Trypsin | Gibco | 25200-056 | |
| UV Flashlight | KBS | KB70109 | 395 nm |
| Vida Desktop 3D Printer | EnvisionTec | ||
| Vitamin D3 | Sigma -Aldrich | 32222-06-3 | 1,25-dihydroxyvitamin D3 |
References
- Safiri, S., et al. Global, regional and national burden of osteoarthritis 1990-2017: A systematic analysis of the Global Burden of Disease Study 2017. Annals of the Rheumatic Diseases. 79 (6), 819-828 (2020).
- Lawrence, R. C., et al. Estimates of the prevalence of arthritis and other rheumatic conditions in the United States: Part II. Arthritis and Rheumatism. 58 (1), 26-35 (2008).
- Makarczyk, M. J., et al. Current models for development of disease-modifying osteoarthritis drugs. Tissue Engineering. Part C, Methods. 27 (2), 124-138 (2021).
- He, Y., et al. Pathogenesis of osteoarthritis: risk factors, regulatory pathways in chondrocytes, and experimental models. Biology. 9 (8), 194 (2020).
- Ronaldson-Bouchard, K., Vunjak-Novakovic, G. Organs-on-a-chip: A fast track for engineered human tissues in drug development. Cell Stem Cell. 22 (3), 310-324 (2018).
- Lin, H., Sohn, J., Shen, H., Langhans, M. T., Tuan, R. S. Bone marrow mesenchymal stem cells: aging and tissue engineering applications to enhance bone healing. Biomaterials. 203, 96-110 (2019).
- Li, Z., et al. Human mesenchymal stem cell-derived miniature joint system for disease modeling and drug testing. Advanced Science. 9 (21), 2105909 (2022).
- Lin, H., Cheng, A. W., Alexander, P. G., Beck, A. M., Tuan, R. S. Cartilage tissue engineering application of injectable gelatin hydrogel with in situ visible-light-activated gelation capability in both air and aqueous solution. Tissue Engineering. Part A. 20 (17-18), 2402-2411 (2014).
- Fairbanks, B. D., Schwartz, M. P., Bowman, C. N., Anseth, K. S. Photoinitiated polymerization of PEG-diacrylate with lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate: polymerization rate and cytocompatibility. Biomaterials. 30 (35), 6702-6707 (2009).
- Lin, H., Lozito, T. P., Alexander, P. G., Gottardi, R., Tuan, R. S. Stem cell-based microphysiological osteochondral system to model tissue response to interleukin-1β. Molecular Pharmaceutics. 11 (7), 2203-2212 (2014).
- Yin, B., et al. Hybrid macro-porous titanium ornamented by degradable 3D gel/nHA micro-scaffolds for bone tissue regeneration. International Journal of Molecular Sciences. 17 (4), 575 (2016).
- Lin, Z., et al. Osteochondral tissue chip derived from iPSCs: Modeling OA pathologies and testing drugs. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 411 (2019).
- Atukorala, I., et al. Synovitis in knee osteoarthritis: A precursor of disease. Annals of the Rheumatic Diseases. 75 (2), 390-395 (2016).
- Occhetta, P., et al. Hyperphysiological compression of articular cartilage induces an osteoarthritic phenotype in a cartilage-on-a-chip model. Nature Biomedical Engineering. 3 (7), 545-557 (2019).
- He, C., et al. Modeling early changes associated with cartilage trauma using human-cell-laden hydrogel cartilage models. Stem Cell Research and Therapy. 13 (1), 400 (2022).
- Elsissy, J. G., et al. Bacterial septic arthritis of the adult native knee joint: A review. JBJS Reviews. 8 (1), 0059 (2020).
- Romero-Lopez, M., et al. Macrophage effects on mesenchymal stem cell osteogenesis in a three-dimensional in vitro bone model. Tissue Engineering. Part A. 26 (19-20), 1099-1111 (2020).
