Summary
Vi tilbyr detaljerte metoder for å generere fire typer vev fra humane mesenkymale stamceller, som brukes til å rekapitulere brusk, bein, fettpute og synovium i det menneskelige kneleddet. Disse fire vevene er integrert i en tilpasset bioreaktor og koblet sammen gjennom mikrofluidikk, og genererer dermed et kneledd på en brikke.
Abstract
Den høye forekomsten av invalidiserende leddsykdommer som slitasjegikt (OA) utgjør en høy sosioøkonomisk belastning. For tiden er de tilgjengelige legemidlene som retter seg mot leddforstyrrelser for det meste palliative. Det udekkede behovet for effektive sykdomsmodifiserende OA-legemidler (DMOAD) har først og fremst vært forårsaket av fravær av egnede modeller for å studere sykdomsmekanismer og teste potensielle DMOADer. Her beskriver vi etableringen av et miniatyr synovialt leddlignende mikrofysiologisk system (miniJoint) som består av fett-, fibrøse og osteokondrale vevskomponenter avledet fra humane mesenkymale stamceller (MSC). For å oppnå de tredimensjonale (3D) mikrovevene ble MSC innkapslet i fotokryssbindbar metakryrylert gelatin før eller etter differensiering. De cellebelastede vevskonstruksjonene ble deretter integrert i en 3D-printet bioreaktor, som danner miniJoint. Separate strømmer av osteogene, fibrogene og adipogene medier ble introdusert for å opprettholde de respektive vevsfenotypene. En vanlig delt strøm ble perfusert gjennom brusk, synovial og fettvev for å muliggjøre vevskrysstale. Dette strømningsmønsteret tillater induksjon av forstyrrelser i en eller flere av vevskomponentene for mekanistiske studier. Videre kan potensielle DMOADer testes via enten "systemisk administrasjon" gjennom alle mediumstrømmene eller "intraartikulær administrasjon" ved å legge legemidlene til bare den delte "synovialvæsken" -simulerende strømning. Dermed kan miniJoint fungere som en allsidig in vitro-plattform for effektiv studier av sykdomsmekanismer og testing av legemidler i persontilpasset medisin.
Introduction
Leddsykdommer som slitasjegikt (OA) er svært utbredt og ødeleggende og representerer en ledende årsak til funksjonshemming over hele verden1. Det er anslått at i USA alene påvirker OA 27 millioner pasienter og forekommer hos 12.1% av voksne i alderen 60 og over2. Dessverre er de fleste legemidler som for tiden brukes til å håndtere leddsykdommer, palliative, og ingen effektive sykdomsmodifiserende OA-legemidler (DMOAD) er tilgjengelige3. Dette udekkede medisinske behovet stammer først og fremst fra fraværet av en effektiv modell for å studere sykdomsmekanismer og utvikle potensielle DMOADer. Den konvensjonelle todimensjonale (2D) cellekulturen reflekterer ikke 3D-naturen til leddvev, og kulturen av vevseksplanter hindres ofte av betydelig celledød og klarer vanligvis ikke å replikere de dynamiske vevsforbindelsene4. I tillegg reduserer genetiske og anatomiske forskjeller signifikant den fysiologiske relevansen av dyremodeller4.
Organs-on-chips (OoC), eller mikrofysiologiske systemer, er et lovende forskningsfelt i grensesnittet mellom ingeniørfag, biologi og medisin. Disse in vitro-plattformene er minimale funksjonelle enheter som replikerer definerte sunne eller patologiske trekk ved deres in vivo-kolleger 5. Videre kan disse miniatyriserte systemene være vert for forskjellige celler og matriser og simulere de biofysiske og biokjemiske interaksjonene mellom forskjellige vev. Derfor lover et mikrofysiologisk system som trofast kan rekapitulere det opprinnelige synovialleddet å tilby en effektiv plattform for modellering av leddsykdommer og utvikling av potensielle DMOADer.
Humane mesenkymale stamceller (MSC) kan isoleres fra mange vev i hele kroppen og differensieres i osteogene, kondrogene og adipogene linjer6. MSC har blitt brukt til å konstruere forskjellige vev, inkludert bein, brusk og fettvev6, noe som betyr at de representerer en lovende cellekilde for engineering av vevskomponentene i kneleddet. Vi har nylig utviklet et miniatyrleddlignende mikrofysiologisk system, kalt miniJoint, som består av MSC-avledet bein, brusk, fibrøst og fettvev7. Spesielt muliggjør den nye designen vevskrysstale ved mikrofluidisk strømning eller permeasjon (figur 1). Her presenterer vi protokollene for fremstilling av brikkekomponentene, konstruksjonen av vevskomponentene, kulturen til det konstruerte vevet i brikken og samlingen av vev for nedstrømsanalyser.
Figur 1: Skjematisk fremstilling av miniJoin-brikken som viser arrangementet av de forskjellige vevskomponentene og mediumstrømmene. OC = osteokondralt vev. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Følgende protokoll følger de etiske retningslinjene fra University of Pittsburgh og komiteen for menneskelig forskningsetikk ved University of Pittsburgh. Informasjon om materialene som ble brukt i denne studien er oppført i materialfortegnelsen.
1. Produksjon av 3D-printede bioreaktorer
- Bruk et dataprogram til å designe osteokondrale (figur 2A) og miniJoint bioreaktorer (figur 2B) som inkluderer kamre, innsatser og lokk. Dimensjonsinformasjonen for hver del er vist i figur S1.
- Overfør designet til en 3D-skriver, og skriv ut med en fotopolymerblekk.
- Skyll de 3D-printede delene (figur 2C-F) med 15 ml 95 % etanol tre ganger. Deretter kryssbinder du de trykte stykkene helt i 200 s i en lommelyktpolymerisasjonsenhet.
- Legg O-ringer til innlegg og lokk (figur 2C, D), og test om delene passer (figur 2G, H).
Figur 2: Fabrikasjon av de ulike komponentene for å lage miniJoint bioreaktor. (A,B), 3D-modeller av bioreaktorer for å lage (A) osteokondrale og (B) miniJoint chips. (C,D) 3D-printede (C) lokk og (D) innsatser med O-ringen installert. (E,F) 3D-printede kamre for (E) osteokondral og (F) miniJoint vevskultur. (G,H) Montering av (G) osteokondrale og (H) miniJoint chips. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
2. Konstruksjon av vevskomponentene
MERK: Prosessene for fremstilling av litiumfenyl-2,4,6-trimetylbenzoylfosfat (LAP) og metakrylert gelatin (GelMA) er beskrevet i tidligere studier 8,9.
- For å lage GelMA, følg trinnene nedenfor.
- Tilsett 17 g gelatin type B til 500 ml destillert vann, og bland deretter på en shaker i 30 minutter ved 37 °C.
- Tilsett deretter 13 ml metakrylanhydrid, sett tilbake på 37 °C shakeren, og la den riste over natten.
- Neste dag, aliquot GelMA i individuelle dialyseposer, med ~ 60 ml i hver pose.
- Legg alle dialyseposene i destillert vann med en rørestang, og la det gå 7 dager med dialyse. Skift vann flere ganger per dag, og la posene stå på 4 °C over natten.
- På dag 7, frys GelMA ved -80 °C. Når den er helt frossen, fortsett til lyofilisering.
- Plasser GelMA i en tallerken i vakuumkammeret til en lyofilisator, og tillat frysetørking. Forsikre deg om at GelMA er helt tørket før den fjernes fra lyofilisatoren.
- Løs opp GelMA i Hanks balanserte saltløsning (HBSS med Ca 2+ og Mg2+) ved 15 % (w/v). For å sikre at pH er på 7,4, tilsett NaOH i små mengder til pH når 7,4. Suppler oppløsningen med 1x antibiotika-antimykotikum og 0,15 % (w/v) LAP basert på oppnådd volum. Oppbevar 15 % GelMA-oppløsningen ved -20 °C til bruk, og beskytt den mot lys.
- Plasser 3D-printede bioreaktorkamre, lokk og innsatser i autoklavposer, og autoklav ved 121 °C i 20 minutter med damp og deretter i 20 minutter med tørr varme.
- Inne i det biologiske sikkerhetsskapet, suge bioreaktorkamrene, lokkene og innsatsene i 15 ml sterilt fosfatbufret saltvann over natten, hvoretter de kan tørke.
- Isoler humane benmargsavledede MSCer fra totalt leddprotesekirurgisk avfall med IRB-godkjenning (University of Pittsburgh og University of Washington).
- Spesielt, skyll ut benmargen fra trabekulært bein i lårhalsen og hodet, og resuspender det i Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM).
- Filtrer suspensjonen gjennom en 40 μm sil, og sentrifuger gjennomstrømningen ved 300 x g i 5 minutter.
- Fjern supernatanten, resuspender pellets ved hjelp av vekstmedium [DMEM, 10% føtalt bovint serum (FBS) og 1x antibiotika-antimykotisk], og legg deretter i vevskulturflasker.
- Endre kulturmediet hver 3. dag til 4. dag. Sørg for at et samløp på 70% til 80% er nådd før du fortsetter.
- Løsne cellene ved å inkubere med trypsin-EDTA i 2-3 minutter, og passasje i et forhold på 1 million celler per T150 kolbe.
- Utvid cellene til P5. Etter trypsinisering, suspendere cellene, telle dem, og deretter pellet ved sentrifugering ved 300x g i 5 minutter.
- Med en 1000 μL pipette, resuspender cellene ved 20 x 106 celler/ml i 15 % GelMA-oppløsning.
MERK: Slå av lyset på det biologiske sikkerhetsskapet. - Bruk sterile hansker til å presse en steril, tørr silikonform mot en petriskål. Sett deretter en innsats i hvert hull i silikonformen med tang, med hullsiden av innsatsen vendt ned.
- Bruk en 200 μL pipette til å legge til celleopphenget for å fylle opp innsatsen (~50 μL per innsats).
- Bruk en UV-lommelykt (LED-lys med en bølgelengde på 395 nm) for å kryssbinde toppen av gelen / innsatsen i 1,5 min. Deretter lyser du opp den andre siden i 30 s. Tverrbinding oppstår når LAP-fotoinitiatoren utsettes for UV-lys.
MERK: Cellesuspensjonen kan oppbevares i inkubatoren i denne perioden eller beskyttes mot lys. - Med steril tang, overfør umiddelbart innsatsene til 8 ml vekstmedium i en 6-brønnsplate uten vevskultur (DMEM supplert med 10% [v / v] FBS og 1x antibiotika-antimykotisk) for å la cellene komme seg over natten.
- Differensiere cellene mot fire linjer.
- For å konstruere fettvev (AT), overfør innsatsene til 8 ml adipogent medium (AM; Alfa-MEM, 10% FBS, 0,2 mM indometacin, 1x insulin-transferrin-selen (ITS), 0,45 mM 3-isobutyl-1-metylxantin, 0,1 μM deksametason og 1x antibiotika-antimykotisk) for å initiere differensiering. Ideelt sett plasseres fire innlegg i en enkelt brønn av en ikke-vevskulturbrønnplate med 8 ml adipogent medium. Dyrk cellene i brønnplatene i 28 dager, med middels endringer annenhver dag.
- For å konstruere osteokondrale enheter (OC), plasser innsatsene i bioreaktorkamre med dobbel strømning, kapp brønnene og tilfør de to strømmene separat med en strømningshastighet på 5 μL / min med 35 ml osteogent medium (OM; DMEM, 10% FBS, 1x antibiotika-antimykotiske, 0,1 μM deksametason, 0,01 M β-glycerofosfat, 100 ng / ml benmorfogenprotein 7 (BMP7), 50 μg / ml askorbinsyre og 10 nM vitamin D3) og 35 ml kondrogent medium (CM; DMEM, 1x antibiotika-antimykotisk, 1x ITS, 0,1 μM deksametason, 40 μg/ml prolin, 50 μg/ml askorbinsyre og 10 ng/ml transformerende vekstfaktor β3)10. Oppretthold celledifferensiering i 28 dager ved å utføre middelendringer annenhver uke.
- For å utlede fibroblastene, differensiere MSCene i 2D-kultur over 21 dager i en T150 cm2 vevskulturkolbe ved bruk av 20 ml fibrogent medium (FM; avansert DMEM, 5% FBS, 1x GlutaMAX, 1x antibiotika-antimykotisk og 50 μg / ml askorbinsyre). Bytt medium hver uke. Bruk 4 ml trypsin til å løsne cellene, og kapsle inn 3D-gelene i innsatsene, etter protokollen beskrevet ovenfor, for å oppnå synovialt lignende fibrøst vev (SFT).
MERK: Sammensetningene av alle differensieringsmediene finnes i tabell 1.
3. Etablering av miniJoin-brikken
- Autoklav 3D miniJoint bioreaktorkamre, silikonrør med en 0,062 tommers indre diameter og en 0,125 tommers ytre diameter, og F 1/16 Luer-lock-kontakter. Koble silikonrøret til miniJoint bioreaktorbarb i den ene enden, og koble Luer-låsen i den andre enden.
- Forbered AM, OM (fjerning av BMP7) og FMCM nevnt i trinn 2.11. I tillegg klargjør du det felles delte mediet (SM; fenolrødfri DMEM, 1x antibiotika-antimykotisk, 1x Na-pyruvat, 1x ITS, 40 μg / ml prolin, 50 μg / ml askorbinsyre og 0,5 ng / ml transformerende vekstfaktor β3) som skal brukes til miniJoint kultur. Legg 35 ml av hvert medium inn i de mellomstore reservoarene.
- Bruk rett tang for å overføre osteokondral enhet fra dual-flow bioreaktoren til høyre brønn i miniJoint bioreaktoren. Overfør fettvevsinnsatsen og fibrøst vevsinnlegg i henholdsvis venstre og midtre brønner. Dekk alle brønnene med steriliserte deksler.
- Koble innløpene til miniJoint chip til mediumreservoarene og uttakene til sprøyter (figur 3A-C).
- Monter sprøytene på en sprøytepumpe (figur 3C), og overfør pumpen og spon til en inkubator. De mellomstore reservoarene holdes på is utenfor inkubatoren.
- Bruk pumpen i uttaksmodus, og trekk mediet fra mediumreservoaret inn i miniJoint bioreaktorkammeret. Denne miniJoint kulturprosessen varer i 28 dager.
- For å modellere leddbetennelse og bruskdegenerasjon, legg til interleukin 1β (IL-1β) til den fibrogene mediumstrømmen ved 10 ng / ml. Bytt sprøytene på den tredje dagen av IL-1β-behandling, og gi frisk IL-1β til det fibrogene mediet. Behandlingen varer i 7 dager.
- Under medikamenttestingstrinnet, etter 3 dager med IL-1β-behandling, administrer legemidlet enten i det delte mediet, simulerer en "intraartikulær administrering" (figur 3D) når stoffet brukes lokalt i kneleddet, eller i alle mediumtypene, simulerer en "systemisk administrasjon" (figur 3E) når stoffet virker på kneleddet gjennom sirkulasjonen.
- Samle individuelle vev for analyse etter 7 dager med IL-1β-behandling, uansett om prøvene gjennomgikk medikamentell behandling de siste 4 dagene.
Figur 3: Montering av minileddet. (A,B) Vevsspesifikke medier innføres fra innløp 1-3 (I1-3) og flyttes ut fra utløp 1-3 (O1-3). Det delte mediet er perfundert fra I4 til O4. (C) Det fullstendige oppsettet av miniFelleskulturen. Legemidler (grønne sollignende former) kan enten innføres i (D) bare det delte mediet eller (E) alle mediene for å simulere henholdsvis "intraartikulær administrasjon" eller "systemisk administrasjon". Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
4. Individuell vevssamling
- Bruk steril buet tang for å fjerne innsatsene.
- Skyv en biopsi-stans gjennom midten av innsatsen for å fjerne gelen, og legg gelen i PBS.
- Klipp osteokondrale geler i halvparten når du vurderer genuttrykket.
MERK: Siden osteokondral gel består av to vevstyper, er det viktig å skille osteogene og kondrogene celler. - Samle kondisjonerte medier og vev for ulike eksperimenter.
- Samle rundt 1,5 ml fra hver mediumkilde.
- Flashfrys det kondisjonerte mediet i flytende nitrogen etter sentrifugering ved 14 000 x g i 10 minutter og forkasting av sedimentet.
- For histologisk farging og immunfarging, fest først OC- og SFT-prøvene i 10% bufret formalin, dehydrer dem i etanol med stigende konsentrasjoner, fjern dem i xylen, legg dem inn i paraffin og til slutt seksjoner dem i en tykkelse på 6 μm.
- For AT-mikrovev, fest prøvene i 10% bufret formalin, og flekk dem direkte med Oil Red O-løsning eller BODIPY.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Alle vevene i miniJoint ble samlet for å analysere fenotypene etter 28 dager med dyrkning i miniJoint (figur 4A). Dette er beskrevet i vår tidligere publikasjon7.
Ved bruk av RT-qPCR, immunfarging og histologisk farging ble det bekreftet at de vevsspesifikke fenotypene var godt vedlikeholdt for de enkelte mikrovevene (figur 4). For eksempel uttrykte den øseøse komponenten av OC-mikrovevene (OC-O), men ikke de andre vevskomponentene, høye nivåer av osteocalcin (OCN). I bruskdelen av osteokondralt vev (OC-C) ble kollagen type II (COL2) og aggrekan (ACAN) derimot uttrykt i signifikant høyere nivåer enn i de andre vevene (figur 4B). Ekspresjonsnivåene av adiponektin (ADIPOQ) og leptin (LEP), to representative adipogene gener, var mye høyere i AT enn i de andre vevene. Avsetning av kalsiummineraler (figur 4F,G) samt alkalisk fosfatase (ALP) og OCN-proteiner (figur 4D) ble primært sett i OC-O, og OC-C viste godt tilbakeholdt glykosaminoglykan (GAG) (figur 4C) og COL2 (figur 4D). I tillegg ble ekspresjonen av to kondrocytthypertrofiassosierte markører, kollagen type X (COL10) og indisk pinnsvin (IHH), som ble påvist i OC-C dag 28, funnet å være signifikant nedregulert etter 28 dagers dyrkning i minileddet (figur 4E).
Resultatene av RT-qPCR, immunfarging og histologi bekreftet at fenotypene av AT og SFT ble opprettholdt etter 4 uker med miniJoint kultur (figur 4B,H,I). Ved bruk av BODIPY-farging og Oil Red O-farging observerte vi rikelig lipiddråpeavleiring i AT (figur 4H). Immunfluorescensfargebildene i figur 4I viser robust smøremiddel og cadherin 11 (CDH11) uttrykk fra SFT etter 4 ukers miniJoint kultur.
I kombinasjon indikerer disse resultatene opprettelsen av en funksjonell, multi-vev synovial leddmodell i miniJoint systemet.
Figur 4: Vedlikehold av de enkelte vevsfenotypene til mikrovevene etter 4 ukers samkultur i miniJoint chip. (A) Tidslinje for generering av en normal miniJoint chip med de vevsspesifikke fenotypene opprettholdt. (B) RT-qPCR-resultater som viser nøkkelmarkørgener i alle vevskomponentene. OCN-dataene ble normalisert til verdiene i OC-O-, COL2- og ACAN-dataene til verdiene i OC-C-, ADIPOQ- og LEP-dataene til verdiene i AT, og TNC- og COL1-dataene til verdiene i SFT. Dataene ble analysert med enveis ANOVA (N = 3 biologiske replikater). * p < 0,05; ** p < 0,01; p < 0,001; p < 0,0001. (C) Safranin O-farging av den bifasiske OC-enheten. Skalastang = 1 mm. (D) Histologiske fargings- og immunfargingsbilder som bekrefter tilstedeværelsen av beinspesifikke og bruskspesifikke markører i de tilsvarende komponentene i OC-enheten. Skalalinje = 50 μm. (E) Immunfarging viser mye lavere uttrykk av to hypertrofimarkører, COLX og IHH, i OC-C på dag 56 enn på dag 28. Skala bar = 50 μm. (F) Alizarin Rød farging av OC-enheten som viser tilstedeværelse av kalkavleiringer primært i OC-O. Skala bar = 500 μm. (G) Forstørrede bilder av Alizarin Red fargebildet i (F). Skalastang = 200 μm. (H) Olje, rød, O- og BODIPY-fargebilder som viser retensjon av lipiddråper i AT. Skala bar = 50 μm. (I) Immunfargingsbilder som viser uttrykket av smøring og CDH11 av det synoviallignende fibrøse vevet (SFT). Skala bar = 50 μm. Gjengitt med tillatelse fra Li et al.7. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
For å lage en sykdomsmodell ble interleukin 1β (IL-1β) introdusert til FM-strømmen etter 28 dagers samkultur (figur 5A,B). IL-1β-behandling resulterte i celleapoptose og forhøyede MMP-13-nivåer i SFT (figur 5C). Interessant nok observerte vi brusknedbrytning i miniJoint behandlet av IL-1β (figur 5D), noe som tyder på forekomsten av crosstalk mellom OC-C og SFT.
Figur 5: Modellering av leddinflammasjon og degenerasjon i minileddet . (A) Skjematisk som viser induksjon av "synovitt" ved å utfordre SFT med IL-1β. (B) Tidslinje for etablering og analyse av sykdomsmodellen. (C) TUNEL analyse og MMP-13 immunfarging som viser de patologiske endringene i SFT. DNA-fragmentering indikeres av de røde pilspissene. Skalastang = 50 μm. (D) Safranin O-farging og MMP-13 immunfargingsbilder som viser degenerasjonen av OC-C. Skala bar = 50 μm. Gjengitt med tillatelse fra Li et al.7. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Til slutt testet vi den terapeutiske effekten av naproksen (NPX) gjennom "systemisk administrasjon" (figur 6A), som ble vist å redusere brusknedbrytning i det IL-1β-behandlede minileddet (figur 6B). Vi undersøkte også fire andre potensielle DMOADer gjennom "intraartikulær administrasjon" (figur 6A). Resultatene fra sanntids-PCR indikerte at disse fire forbindelsene delvis kunne reversere brusktapet (figur 6C).
Figur 6: Utprøving av legemidler via «systemiske» og «intraartikulære» ruter i den etablerte sykdomsmodellen. (A) Skjematisk visning av de to forskjellige legemiddeladministrasjonsveiene, inkludert "systemisk administrasjon" av naproksen (NPX) og "intraartikulær administrering" av fibroblastvekstfaktor 18 (FGF18), SM04690, sklerostin (SOST) og IL-1-reseptorantagonist (IL-1RN). (B) Safranin O- og MMP-13-fargebilder som viser lindret OC-C-degenerasjon etter NPX-behandling. Skala bar = 50 μm. (C) Genuttrykk i OC-C etter "intraartikulær administrering" av fire forskjellige legemidler. De statistiske forskjellene mellom hver narkotikabehandlet gruppe og kontrollgruppen er angitt med * p < 0,05; ** p < 0,01; p < 0,001; og **** p < 0,0001. Dataene ble analysert med Student t-test (N = 4 biologiske replikater). Gjengitt med tillatelse fra Li et al.7. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne artikkelen presenterer vi en protokoll for å lage et kneledd-on-a-chip-system, hvor bein, brusk, fettvev og synoviumlignende vev dannes fra MSC og dyrkes sammen i en tilpasset bioreaktor. Dette multikomponent, humane celleavledede systemet med plug-and-play-funksjoner representerer et nytt verktøy for å studere patogenesen av leddsykdommer og utvikle medisiner.
Gitt at forskjellige vev favoriserer spesifikke kulturmedier, er det avgjørende å gi det respektive mediet for hvert vev og forhindre fri mediumutveksling mellom strømmer. Spesielt under genereringen av bifasiske osteokondrale vev, bestemmes skjebnen til naive MSCer av mediet de blir utsatt for. I dagens design bruker vi en gelatinbasert hydrogel som stillas, som gir en mal for cellevekst og forsegler det potensielle gapet mellom vevet og veggene i innsatsene. Derfor er det viktig å in situ photocrosslink gelen i innsatsene. I tillegg er vekstfaktorer som BMP7 og TGFβ3 supplert i henholdsvis osteogent medium og kondrogent medium. For å opprettholde sine bioaktiviteter i flere dager, må de friske mediene holdes utenfor inkubatoren før de blir introdusert til chipkulturen. Derfor må vi bruke sprøyter for å trekke mediene ut av reservoarene i stedet for å infisere mediet i inkubatoren.
Et annet kritisk punkt under håndtering av bioreaktoren er å unngå unødvendig trykk. Vevet er avhengig av fysisk binding til innsatsveggen for å holde seg på plass. Siden de blir utsatt for topp- og bunnmediestrømmene, hvis en fase av strømmen har høyere trykk, kan det skyve vevet ut av innsatsene, noe som resulterer i lekkasje. Under håndteringsprosessene, for eksempel ved fjerning av bobler, er derfor et forsiktig trykk på sprøyten kritisk. Hvis hydrogelstillaset skyves ut, kan det settes tilbake, ytterligere uherdet hydrogel kan påføres for å fylle gapet, og det kan herdes, noe som gir en sikker og fast stillaspassform i innsatsen.
Gitt sin påviste biokompatibilitet, brukes gelatinbaserte stillaser til å lage alle fire vev i det nåværende systemet. Det skal bemerkes at gelatin kanskje ikke representerer det beste materialet for å støtte vevdannelse. Derfor kan andre typer stillaser om nødvendig tilpasses for bruk. For eksempel kan man bruke et porøst og stivt stillas og kombinere det med gelatin for ytterligere å forbedre MSC osteogenese11. I dette tilfellet må man sørge for at det ikke er fri middels endring mellom topp- og bunnstrømmen. Som diskutert ovenfor kan man bruke biokompatible hydrogeler for å forsegle potensielle lekkasjepunkter. I tillegg brukes MSC-er i dagens vevsbrikke. Gitt deres demonstrerte differensieringspotensial i muskel- og skjelettvev, kan induserte pluripotente stamceller (iPSCs) også brukes i fremtiden for å erstatte MSC. Som et første skritt mot denne undersøkelsen har vi nylig brukt iPSCs til å lage osteokondrale vev12.
Synoviumbetennelse, eller synovitt, er et sentralt trekk ved OA og mange andre felles sykdommer. Videre fant Atukorala et al. at synovitt er en sterk prediktor for påfølgende radiografisk OA13. Derfor induserte vi SFT-betennelse ved IL-1β-behandling for å generere OA-lignende trekk i minileddet. Vi er imidlertid klar over at denne sykdomsinduksjonsmetoden ikke kan fange opp alle fasetter av OA. I vår fremtidige forskning vil vi derfor utforske alternative tilnærminger til modellering av OA i miniJoint ved for eksempel å bruke hyperfysiologisk belastning for å indusere mekanisk skade på bruskkomponenten14. For å påføre mekanisk belastning vil tilpasningen av miniJoint design være nødvendig. For eksempel kan bunnen av miniJoin-brikken potensielt modifiseres for å gjøre bruskvevet tilgjengelig for slagorspissen til en tilpasset fjærbelastet slagenhet utviklet i vårt laboratorium15.
Så vidt vi vet, er kneleddet på en brikke beskrevet her den første in vitro-modellen som inkluderer flere vev i ett system for å simulere et synovialledd. Den nye plug-and-play-kapasiteten gjør det mulig å undersøke rollen til et enkelt vev i sykdomsprogresjon og dets respons på ulike behandlinger. Dette systemet kan også brukes til å modellere andre leddsykdommer enn OA. For eksempel kan bakterier og andre patogener muligens innføres i SM for å modellere septisk artritt16. I tillegg muliggjør designet sanntids crosstalk mellom vevene, og dermed overvinne begrensningen ved bruk av det betingede mediet. Spesielt kan fett-, synovial- og bruskvev kommunisere gjennom det delte mediet, og bein og brusk kan samhandle gjennom direkte fysisk binding. Det er imidlertid noen begrensninger for dagens miniledd. Først brukes stamcelleavledede vev, og om deres fenotype og funksjon ligner deres kolleger i det opprinnelige kneleddet trenger ytterligere undersøkelser. For det andre er immunceller som makrofager, som spiller en kritisk rolle i OA-patogenesen, ikke inkludert. Vår tidligere studie har vist at det er mulig å inkludere makrofager i gelatinstillas17. Til slutt er en fysisk stressaktivert mekanisme ikke inkludert for å simulere den mekaniske belastningen på vevet i det opprinnelige kneleddet. Nylig utviklet Occhetta et al. en brusk-on-a-chip-modell, der belastningskontrollert kompresjon ble påført for å stimulere det konstruerte bruskvevet14. En lignende metode kan tas i bruk for å muliggjøre mekanisk belastning i miniJoint.
Oppsummert kan miniJoint tjene som en unik plattform for å undersøke patogenesen av OA og relaterte tilstander in vitro og gi en mekanisme for å utforske potensielle DMOADer og intervensjoner for personlig medisin. MiniJoin-systemet kan også integreres med OoC-er som etterligner andre organer for å etablere body-on-a-chip-systemer som kan brukes til å studere interaksjonene mellom ulike organhermere.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne oppgir ingen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Denne forskningen ble primært støttet av finansiering fra National Institutes of Health (UG3 / UH3TR002136, UG3 / UH3TR003090). I tillegg takker vi Dr. Paul Manner (University of Washington) for å gi de menneskelige vevsprøvene og Dr. Jian Tan for deres hjelp med å isolere MSCene og skape cellebassenget.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-isobutyl-1-methylxanthine | Sigma -Aldrich | I17018-1G | |
| 6 well non-tissue culture plate | Corning Falcon® Plates | 351146 | |
| 24 well non-tissue culture plate | Corning Falcon® Plates | 351147 | |
| 30 mL syringes | BD Syringe Luer Lock Cascade Health | 302832 | |
| Alcian blue stain | EK Industries | 1198 | 1% w/v, pH 1.0 |
| Advanced DMEM | Gibco | 12491-015 | |
| αMEM | Gibco | 12571-063 | |
| Antibiotic-antimycotic | Gibco | 15240-062 | |
| Biopsy punch | Integra Miltex | 12-460-407 | |
| BODIPY® fluorophore | Molecular Probes | ||
| Bone morphogenic protein 7 (BMP7) | Peprotech | ||
| Curved forceps | Fisher Brand | 16100110 | |
| DMEM | Gibco | 11995-065 | Dulbecco’s Modified Eagle Medium |
| Dexmethasome | Sigma -Aldrich | 02-05-2002 | |
| E-Shell 450 photopolymer in | EnvisionTec | RES-01-4022 | |
| Fetal Bovine Serum | Gemini-Bio Products | 900-208 | |
| GlutaMAX | Gibco | 3505-061 | |
| gelatin from bovine skin | Hyclone | 1003372809 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution | Sigma -Aldrich | SH30588.02 | |
| indomethacin | Sigma -Aldrich | I7378-56 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine (ITS) | Gibco | 51500-056 | |
| interleukin 1β | Peprotech | 200-01B | |
| Leur-loc connectors | Cole-Parmer Instruments | 45508-50 | |
| L-proline | Sigma -Aldrich | 115388-93-7 | |
| β-glycerophosphate | Sigma -Aldrich | 1003129352 | |
| Medium bags | KiYATEC | FC045 | |
| Methacrylic Anhydride | Sigma -Aldrich | 102378580 | |
| Phosphate buffered Saline | Corning | 21-040-CM | |
| Pointed forceps | Fisher Brand | 12000122 | |
| Silicon mold | McMaster-Carr | RC00114P | |
| Silicon o-rings | McMaster-Carr | ZMCCs1X5 | 1mm x 5mm |
| SolidWorks | Dassault Systèmes SE, Vélizy-Villacoublay, France | ||
| Surgical Blades | Integra Miltex | 4-122 | |
| Syringe pump | Lagato210P, KD Scientific | Z569631 | 10 syringe racks |
| T-182 tissue culture flasks | Fisher Brand | FB012939 | |
| Tissue Culture Dish 150 mm | Fisher Brand | FB012925 | |
| Transforming Growth Factor Beta (TGF-β3) | Peprotech | 100-36E | |
| Trypsin | Gibco | 25200-056 | |
| UV Flashlight | KBS | KB70109 | 395 nm |
| Vida Desktop 3D Printer | EnvisionTec | ||
| Vitamin D3 | Sigma -Aldrich | 32222-06-3 | 1,25-dihydroxyvitamin D3 |
References
- Safiri, S., et al. Global, regional and national burden of osteoarthritis 1990-2017: A systematic analysis of the Global Burden of Disease Study 2017. Annals of the Rheumatic Diseases. 79 (6), 819-828 (2020).
- Lawrence, R. C., et al. Estimates of the prevalence of arthritis and other rheumatic conditions in the United States: Part II. Arthritis and Rheumatism. 58 (1), 26-35 (2008).
- Makarczyk, M. J., et al. Current models for development of disease-modifying osteoarthritis drugs. Tissue Engineering. Part C, Methods. 27 (2), 124-138 (2021).
- He, Y., et al. Pathogenesis of osteoarthritis: risk factors, regulatory pathways in chondrocytes, and experimental models. Biology. 9 (8), 194 (2020).
- Ronaldson-Bouchard, K., Vunjak-Novakovic, G. Organs-on-a-chip: A fast track for engineered human tissues in drug development. Cell Stem Cell. 22 (3), 310-324 (2018).
- Lin, H., Sohn, J., Shen, H., Langhans, M. T., Tuan, R. S. Bone marrow mesenchymal stem cells: aging and tissue engineering applications to enhance bone healing. Biomaterials. 203, 96-110 (2019).
- Li, Z., et al. Human mesenchymal stem cell-derived miniature joint system for disease modeling and drug testing. Advanced Science. 9 (21), 2105909 (2022).
- Lin, H., Cheng, A. W., Alexander, P. G., Beck, A. M., Tuan, R. S. Cartilage tissue engineering application of injectable gelatin hydrogel with in situ visible-light-activated gelation capability in both air and aqueous solution. Tissue Engineering. Part A. 20 (17-18), 2402-2411 (2014).
- Fairbanks, B. D., Schwartz, M. P., Bowman, C. N., Anseth, K. S. Photoinitiated polymerization of PEG-diacrylate with lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate: polymerization rate and cytocompatibility. Biomaterials. 30 (35), 6702-6707 (2009).
- Lin, H., Lozito, T. P., Alexander, P. G., Gottardi, R., Tuan, R. S. Stem cell-based microphysiological osteochondral system to model tissue response to interleukin-1β. Molecular Pharmaceutics. 11 (7), 2203-2212 (2014).
- Yin, B., et al. Hybrid macro-porous titanium ornamented by degradable 3D gel/nHA micro-scaffolds for bone tissue regeneration. International Journal of Molecular Sciences. 17 (4), 575 (2016).
- Lin, Z., et al. Osteochondral tissue chip derived from iPSCs: Modeling OA pathologies and testing drugs. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 411 (2019).
- Atukorala, I., et al. Synovitis in knee osteoarthritis: A precursor of disease. Annals of the Rheumatic Diseases. 75 (2), 390-395 (2016).
- Occhetta, P., et al. Hyperphysiological compression of articular cartilage induces an osteoarthritic phenotype in a cartilage-on-a-chip model. Nature Biomedical Engineering. 3 (7), 545-557 (2019).
- He, C., et al. Modeling early changes associated with cartilage trauma using human-cell-laden hydrogel cartilage models. Stem Cell Research and Therapy. 13 (1), 400 (2022).
- Elsissy, J. G., et al. Bacterial septic arthritis of the adult native knee joint: A review. JBJS Reviews. 8 (1), 0059 (2020).
- Romero-Lopez, M., et al. Macrophage effects on mesenchymal stem cell osteogenesis in a three-dimensional in vitro bone model. Tissue Engineering. Part A. 26 (19-20), 1099-1111 (2020).
