Summary
हम मानव मेसेनकाइमल स्टेम कोशिकाओं से चार प्रकार के ऊतकों को उत्पन्न करने के लिए विस्तृत तरीके प्रदान करते हैं, जिनका उपयोग मानव घुटने के जोड़ में उपास्थि, हड्डी, वसा पैड और सिनोवियम को पुन: उत्पन्न करने के लिए किया जाता है। इन चार ऊतकों को एक अनुकूलित बायोरिएक्टर में एकीकृत किया जाता है और माइक्रोफ्लुइडिक्स के माध्यम से जोड़ा जाता है, इस प्रकार घुटने के संयुक्त-ऑन-ए-चिप उत्पन्न होते हैं।
Abstract
ऑस्टियोआर्थराइटिस (ओए) जैसे दुर्बल जोड़ों की बीमारियों का उच्च प्रसार एक उच्च सामाजिक आर्थिक बोझ पैदा करता है। वर्तमान में, उपलब्ध दवाएं जो संयुक्त विकारों को लक्षित करती हैं, ज्यादातर उपशामक हैं। प्रभावी रोग-संशोधित ओए दवाओं (डीएमओएडी) की अपूरित आवश्यकता मुख्य रूप से रोग तंत्र का अध्ययन करने और संभावित डीएमओएडी के परीक्षण के लिए उपयुक्त मॉडल की अनुपस्थिति के कारण हुई है। यहां, हम मानव मेसेनकाइमल स्टेम कोशिकाओं (एमएससी) से प्राप्त वसा, रेशेदार और ओस्टियोकॉन्ड्रल ऊतक घटकों से युक्त एक लघु श्लेष संयुक्त-नकल माइक्रोफिजियोलॉजिकल सिस्टम (मिनीजॉइंट) की स्थापना का वर्णन करते हैं। त्रि-आयामी (3 डी) सूक्ष्म ऊतकों को प्राप्त करने के लिए, एमएससी को भेदभाव से पहले या बाद में फोटोक्रॉसलिंक करने योग्य मेथैक्रिलेटेड जिलेटिन में समझाया गया था। सेल से भरे ऊतक संरचनाओं को तब 3 डी-मुद्रित बायोरिएक्टर में एकीकृत किया गया था, जिससे मिनीजॉइंट का निर्माण हुआ। संबंधित ऊतक फेनोटाइप को बनाए रखने के लिए ओस्टोजेनिक, फाइब्रोजेनिक और एडिपोजेनिक मीडिया के अलग-अलग प्रवाह पेश किए गए थे। ऊतक क्रॉसस्टॉक को सक्षम करने के लिए उपास्थि, श्लेष और वसा ऊतकों के माध्यम से एक सामान्य रूप से साझा धारा को प्रवाहित किया गया था। यह प्रवाह पैटर्न यांत्रिक अध्ययन के लिए एक या अधिक ऊतक घटकों में गड़बड़ी के प्रेरण की अनुमति देता है। इसके अलावा, संभावित डीएमओएडी का परीक्षण सभी मध्यम धाराओं के माध्यम से "प्रणालीगत प्रशासन" या "इंट्राआर्टिकुलर प्रशासन" के माध्यम से किया जा सकता है, जिसमें दवाओं को केवल साझा "श्लेष द्रव" -अनुकरण प्रवाह में जोड़ा जाता है। इस प्रकार, मिनीजॉइंट रोग तंत्र का कुशलतापूर्वक अध्ययन करने और व्यक्तिगत चिकित्सा में दवाओं का परीक्षण करने के लिए एक बहुमुखी इन विट्रो प्लेटफॉर्म के रूप में काम कर सकता है।
Introduction
ऑस्टियोआर्थराइटिस (ओए) जैसे संयुक्त रोग अत्यधिक प्रचलित और दुर्बल करने वाले हैंऔर दुनिया भर में विकलांगता का एक प्रमुख कारण का प्रतिनिधित्व करते हैं। यह अनुमान लगाया गया है कि अकेले अमेरिका में, ओए 27 मिलियन रोगियों को प्रभावित करता है और 60 वर्ष औरउससे अधिक आयु के 12.1% वयस्कों में होता है। दुर्भाग्य से, वर्तमान में संयुक्त रोगों का प्रबंधन करने के लिए उपयोग की जाने वाली अधिकांश दवाएं उपशामक हैं, और कोई प्रभावी रोग-संशोधित ओए दवाएं (डीएमओएडी) उपलब्ध नहीं हैं। यह अपूर्ण चिकित्सा आवश्यकता मुख्य रूप से रोग तंत्र का अध्ययन करने और संभावित डीएमओएडी विकसित करने के लिए एक प्रभावी मॉडल की अनुपस्थिति से उपजी है। पारंपरिक दो-आयामी (2 डी) सेल संस्कृति संयुक्त ऊतकों की 3 डी प्रकृति को प्रतिबिंबित नहीं करती है, और ऊतक खोजों की संस्कृति अक्सर महत्वपूर्ण कोशिका मृत्यु से बाधित होती है और आमतौर पर गतिशील ऊतक अंतर्संबंधको दोहराने में विफल रहती है। इसके अलावा, आनुवंशिक और शारीरिक अंतर पशु मॉडल4 की शारीरिक प्रासंगिकता को काफी कम करते हैं।
ऑर्गन्स-ऑन-चिप्स (ओओसी), या माइक्रोफिजियोलॉजिकल सिस्टम, इंजीनियरिंग, जीव विज्ञान और चिकित्सा के इंटरफ़ेस पर एक आशाजनक शोध क्षेत्र हैं। ये इन विट्रो प्लेटफ़ॉर्म न्यूनतम कार्यात्मक इकाइयाँ हैं जो विवो समकक्षोंमें उनके परिभाषित स्वस्थ या पैथोलॉजिकल विशेषताओं को दोहराती हैं। इसके अलावा, ये लघु प्रणालियां विविध कोशिकाओं और मैट्रिक्स की मेजबानी कर सकती हैं और विभिन्न ऊतकों के बीच बायोफिज़िकल और जैव रासायनिक बातचीत का अनुकरण कर सकती हैं। इसलिए, एक माइक्रोफिजियोलॉजिकल सिस्टम जो मूल श्लेष संयुक्त को ईमानदारी से पुन: उत्पन्न कर सकता है, संयुक्त रोगों के मॉडलिंग और संभावित डीएमओएडी विकसित करने के लिए एक प्रभावी मंच प्रदान करने का वादा करता है।
मानव मेसेनकाइमल स्टेम कोशिकाओं (एमएससी) को पूरे शरीर में कई ऊतकों से अलग किया जा सकता है और ओस्टोजेनिक, चोंड्रोजेनिक और एडिपोजेनिकवंशावली में विभेदित किया जा सकता है। एमएससी का उपयोग हड्डी, उपास्थि और वसा ऊतक6 सहित विभिन्न ऊतकों को इंजीनियर करने के लिए सफलतापूर्वक किया गया है, इस प्रकार इसका अर्थ है कि वे घुटने के जोड़ के ऊतक घटकों को इंजीनियरिंग के लिए एक आशाजनक सेल स्रोत का प्रतिनिधित्व करते हैं। हमने हाल ही में एक लघु संयुक्त-नकल माइक्रोफिजियोलॉजिकल सिस्टम विकसित किया है, जिसका नाम मिनीजॉइंट है, जिसमें एमएससी-व्युत्पन्न हड्डी, उपास्थि, रेशेदार और वसा ऊतकशामिल हैं। विशेष रूप से, उपन्यास डिजाइन माइक्रोफ्लुइडिक प्रवाह या पारगम्यता द्वारा ऊतक क्रॉसस्टॉक को सक्षम बनाता है (चित्रा 1)। यहां, हम चिप घटकों के निर्माण, ऊतक घटकों की इंजीनियरिंग, चिप में इंजीनियर ऊतकों की संस्कृति और डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए ऊतकों के संग्रह के लिए प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं।
चित्रा 1: विभिन्न ऊतक घटकों और मध्यम प्रवाह की व्यवस्था दिखाने वाले मिनीजॉइंट चिप का योजनाबद्ध। ओसी = ओस्टियोकॉन्ड्रल ऊतक। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
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Protocol
निम्नलिखित प्रोटोकॉल पिट्सबर्ग विश्वविद्यालय और पिट्सबर्ग विश्वविद्यालय की मानव अनुसंधान नैतिकता समिति के नैतिक दिशानिर्देशों का पालन करता है। इस अध्ययन में उपयोग की जाने वाली सामग्रियों की जानकारी सामग्री की तालिका में सूचीबद्ध है।
1. 3 डी मुद्रित बायोरिएक्टर का निर्माण
- ओस्टियोकॉन्ड्रल (चित्रा 2 ए) और मिनीजॉइंट बायोरिएक्टर (चित्रा 2 बी) को डिजाइन करने के लिए एक कंप्यूटर सॉफ्टवेयर का उपयोग करें जिसमें कक्ष, सम्मिलित और ढक्कन शामिल हैं। प्रत्येक भाग के लिए आयाम जानकारी चित्रा S1 में दिखाया गया है।
- डिज़ाइन को 3 डी प्रिंटर में स्थानांतरित करें, और फोटोपॉलिमर स्याही के साथ प्रिंट करें।
- 3 डी-मुद्रित भागों (चित्रा 2 सी-एफ) को 15 मिलीलीटर 95% इथेनॉल के साथ तीन बार कुल्ला करें। फिर, एक टॉर्च पोलीमराइजेशन डिवाइस में 200 सेकंड के लिए मुद्रित टुकड़ों को पूरी तरह से क्रॉसलिंक करें।
- सम्मिलित और ढक्कन (चित्रा 2 सी, डी) में ओ-रिंग जोड़ें, और परीक्षण करें कि क्या भाग फिट हैं (चित्रा 2 जी, एच)।
चित्रा 2: मिनीजॉइंट बायोरिएक्टर बनाने के लिए विभिन्न घटकों का निर्माण। (ए, बी), (ए) ओस्टियोकॉन्ड्रल और (बी) मिनीजॉइंट चिप्स बनाने के लिए बायोरिएक्टर के 3 डी मॉडल। (सी, डी) 3 डी मुद्रित (सी) ढक्कन और (डी) ओ-रिंग स्थापित के साथ सम्मिलित करें। (ई, एफ) (ई) ओस्टियोकॉन्ड्रल और (एफ) मिनीजॉइंट ऊतक संस्कृति के लिए 3 डी मुद्रित कक्ष। (जी, एच) (जी) ओस्टियोकॉन्ड्रल और (एच) मिनीजॉइंट चिप्स की असेंबली। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
2. ऊतक घटकों की इंजीनियरिंग।
नोट: लिथियम फिनाइल-2,4,6-ट्राइमिथाइलबेंजोइलफॉस्फीनेट (एलएपी) और मेथैक्रिलेटेड जिलेटिन (गेलएमए) के निर्माण की प्रक्रियाओं कोपिछले अध्ययनों 8,9 में वर्णित किया गया है।
- GelMA बनाने के लिए, नीचे दिए गए चरणों का पालन करें।
- 500 एमएल आसुत जल में 17 ग्राम जिलेटिन टाइप बी जोड़ें, और फिर 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए शेकर पर मिलाएं।
- फिर, मेथैक्रिलिक एनहाइड्राइड के 13 एमएल जोड़ें, 37 डिग्री सेल्सियस शेकर पर वापस रखें, और रात भर हिलाने की अनुमति दें।
- अगले दिन, प्रत्येक बैग में ~ 60 एमएल के साथ गेलएमए को व्यक्तिगत डायलिसिस बैग में शामिल करें।
- सभी डायलिसिस बैग को स्टिर बार के साथ आसुत पानी में रखें, और डायलिसिस के 7 दिनों के लिए अनुमति दें। प्रति दिन कई बार पानी बदलें, और बैग को रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर छोड़ दें।
- दिन 7 पर, गेलएमए को -80 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज करें। एक बार पूरी तरह से जमे हुए, लियोफिलाइजेशन के लिए आगे बढ़ें।
- गेलएमए को लियोफिलाइज़र के वैक्यूम चैंबर में एक डिश में रखें, और फ्रीज-सुखाने की अनुमति दें। सुनिश्चित करें कि लियोफिलाइज़र से हटाने से पहले जेलएमए पूरी तरह से सूख गया है।
- हैंक के संतुलित नमक समाधान (सीए2 + और एमजी2 + के साथ एचबीएसएस) में 15% (डब्ल्यू / वी) पर गेलएमए को घोलें। यह सुनिश्चित करने के लिए कि पीएच 7.4 पर है, पीएच 7.4 तक पहुंचने तक थोड़ी मात्रा में एनएओएच जोड़ें। प्राप्त मात्रा के आधार पर 1x एंटीबायोटिक-एंटीमाइकोटिक और 0.15% (w/v) LAP के साथ समाधान को पूरक करें। उपयोग तक -20 डिग्री सेल्सियस पर 15% जेलएमए समाधान स्टोर करें, और इसे प्रकाश से बचाएं।
- 3 डी-मुद्रित दोहरे प्रवाह वाले बायोरिएक्टर कक्ष, ढक्कन और आटोक्लेव बैग में डालें, और आटोक्लेव को भाप के साथ 20 मिनट के लिए 121 डिग्री सेल्सियस पर और फिर सूखी गर्मी के साथ 20 मिनट के लिए रखें।
- जैविक सुरक्षा कैबिनेट के अंदर, बायोरिएक्टर कक्षों, ढक्कन ों को भिगोएं, और रात भर बाँझ फॉस्फेट-बफर्ड खारा के 15 मिलीलीटर में डालें, जिसके बाद उन्हें सूखने दें।
- आईआरबी अनुमोदन (पिट्सबर्ग विश्वविद्यालय और वाशिंगटन विश्वविद्यालय) के साथ कुल संयुक्त आर्थ्रोप्लास्टी सर्जिकल कचरे से मानव अस्थि मज्जा-व्युत्पन्न एमएससी को अलग करें।
- विशेष रूप से, ऊरु गर्दन और सिर की त्रिकोणीय हड्डी से अस्थि मज्जा को बाहर निकालें, और इसे डलबेकको के संशोधित ईगल ्स मीडियम (डीएमईएम) में फिर से निलंबित करें।
- निलंबन को 40 μm छन्नी के माध्यम से फ़िल्टर करें, और 5 मिनट के लिए 300 x g पर प्रवाह-थ्रू को सेंट्रीफ्यूज करें।
- सतह पर तैरने वाले को हटा दें, विकास माध्यम [डीएमईएम, 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस), और 1 एक्स एंटीबायोटिक-एंटीमाइकोटिक का उपयोग करके छर्रों को फिर से निलंबित करें, और फिर ऊतक संस्कृति फ्लास्क में रखें।
- हर 3 दिन से 4 दिन में संस्कृति माध्यम बदलें। सुनिश्चित करें कि आगे बढ़ने से पहले 70% से 80% का संगम हो जाए।
- 2-3 मिनट के लिए ट्रिप्सिन-ईडीटीए के साथ इंक्यूबेट करके कोशिकाओं को अलग करें, और प्रति टी 150 फ्लास्क में 1 मिलियन कोशिकाओं के अनुपात में पारित करें।
- P5 के लिए कोशिकाओं का विस्तार करें। ट्रिप्सिनाइजेशन के बाद, कोशिकाओं को निलंबित करें, उन्हें गिनें, और फिर 5 मिनट के लिए 300x g पर सेंट्रीफ्यूजिंग करके गोली चलाएं।
- 1,000 μL पिपेट के साथ, 15% GelMA समाधान में 20 x 106 कोशिकाओं / mL पर कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें।
नोट: जैविक सुरक्षा कैबिनेट की रोशनी बंद करें। - बाँझ दस्ताने का उपयोग करके, पेट्री डिश के खिलाफ एक बाँझ, सूखी सिलिकॉन मोल्ड दबाएं। फिर, सिलिकॉन मोल्ड के प्रत्येक छेद में एक डालें, जिसमें डालने का छेद पक्ष नीचे की ओर हो।
- 200 μL पिपेट का उपयोग करके, सम्मिलित करने के लिए सेल निलंबन जोड़ें (~ 50 μL प्रति सम्मिलित)।
- 1.5 मिनट के लिए जेल के शीर्ष को क्रॉसलिंक करने के लिए यूवी फ्लैशलाइट (395 एनएम की तरंग दैर्ध्य के साथ एलईडी प्रकाश) का उपयोग करें। फिर, 30 सेकंड के लिए दूसरी तरफ रोशन करें। क्रॉसलिंकिंग तब होती है जब एलएपी फोटोसर्जक यूवी प्रकाश के संपर्क में आता है।
नोट: सेल निलंबन इस अवधि के दौरान इनक्यूबेटर में रखा जा सकता है या प्रकाश से संरक्षित किया जा सकता है। - बाँझ बल के साथ, कोशिकाओं को रातोंरात ठीक होने की अनुमति देने के लिए तुरंत एक गैर-ऊतक संस्कृति 6-वेल प्लेट (डीएमईएम 10% [वी / वी] एफबीएस और 1 एक्स एंटीबायोटिक-एंटीमाइकोटिक के साथ पूरक) में 8 एमएल विकास माध्यम में प्रवेश करें।
- कोशिकाओं को चार वंशों की ओर विभेदित करें।
- वसा ऊतक (एटी) को इंजीनियर करने के लिए, आवेषण को 8 एमएल एडिपोजेनिक माध्यम (एएम) में स्थानांतरित करें; अल्फा-एमईएम, 10% एफबीएस, 0.2 एमएम इंडोमेथासिन, 1 एक्स इंसुलिन-ट्रांसफरिन-सेलेनियम (आईटीएस), 0.45 एमएम 3-आइसोब्यूटिल-1-मिथाइलक्सैंथिन, 0.1 μM डेक्सामेथासोन, और 1x एंटीबायोटिक-एंटीमाइकोटिक) भेदभाव शुरू करने के लिए। आदर्श रूप से, चार आवेषण ों को एक गैर-ऊतक संस्कृति वेल प्लेट के एक कुएं में 8 मिलीलीटर एडिपोजेनिक माध्यम के साथ रखा जाता है। 28 दिनों के लिए अच्छी तरह से प्लेटों में कोशिकाओं को कल्चर करें, हर दूसरे दिन मध्यम परिवर्तन के साथ।
- ओस्टियोकॉन्ड्रल इकाइयों (ओसी) को इंजीनियर करने के लिए, आवेषण को दोहरे प्रवाह वाले बायोरिएक्टर कक्षों में रखें, कुओं को कैप करें, और 35 एमएल ओस्टोजेनिक माध्यम (ओएम) के साथ 5 μL / min की प्रवाह दर पर दो धाराओं को अलग-अलग डालें। डीएमईएम, 10% एफबीएस, 1 एक्स एंटीबायोटिक-एंटीमाइकोटिक, 0.1 μM डेक्सामेथासोन, 0.01 M β-ग्लिसरोफॉस्फेट, 100 ng / mL बोन मॉर्फोजेनिक प्रोटीन 7 (BMP7), 50 μg / mL एस्कॉर्बिक एसिड, और 10 nM विटामिन D3) और 35 मिलीलीटर चोंड्रोजेनिक माध्यम (सीएम; डीएमईएम, 1x एंटीबायोटिक-एंटीमाइकोटिक, 1x ITS, 0.1 μM डेक्सामेथासोन, 40 μg / mL प्रोलाइन, 50 μg / mL एस्कॉर्बिक एसिड, और 10 ng / mL ट्रांसफॉर्मिंग ग्रोथ फैक्टर 3)10। द्विसाप्ताहिक मध्यम परिवर्तन करके 28 दिनों के लिए सेल भेदभाव बनाए रखें।
- फाइब्रोब्लास्ट ्स को प्राप्त करने के लिए, 20 एमएल फाइब्रोजेनिक माध्यम (एफएम; उन्नत डीएमईएम, 5% एफबीएस, 1 एक्स ग्लूटामैक्स, 1 एक्स एंटीबायोटिक-एंटीमाइकोटिक, और 50 μg / mL एस्कॉर्बिक एसिड) का उपयोग करके टी 150 सेमी 2 टिशू कल्चर फ्लास्क में 21 दिनों में2 डी कल्चर में एमएससी को अलग करें। हर हफ्ते माध्यम बदलें। कोशिकाओं को अलग करने के लिए ट्रिप्सिन के 4 एमएल का उपयोग करें, और ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल का पालन करते हुए, श्लेष जैसे-रेशेदार ऊतक (एसएफटी) प्राप्त करने के लिए 3 डी जैल को समाहित करें।
नोट: सभी भेदभाव मीडिया की रचनाएँ तालिका 1 में पाई जा सकती हैं।
3. मिनीजॉइंट चिप की स्थापना
- आटोक्लेव 3 डी मिनीज्वाइंट बायोरिएक्टर कक्ष, 0.062 इंच आंतरिक व्यास और 0.125 इंच बाहरी व्यास के साथ सिलिकॉन टयूबिंग, और एफ 1/16 लुएर-लॉक कनेक्टर। सिलिकॉन टयूबिंग को एक छोर पर मिनीज्वाइंट बायोरिएक्टर बार्ब से कनेक्ट करें, और दूसरे छोर पर ल्यूर लॉक को कनेक्ट करें।
- चरण 2.11 में उल्लिखित एएम, ओएम (बीएमपी 7 को हटाना), और एफएमसीएम तैयार करें। इसके अतिरिक्त, मिनीजॉइंट कल्चर के लिए उपयोग किए जाने वाले सामान्य साझा माध्यम (एसएम; फिनोल रेड-फ्री डीएमईएम, 1 एक्स एंटीबायोटिक-एंटीमाइकोटिक, 1 एक्स ना-पाइरूवेट, 1 एक्स आईटीएस, 40 μg / mL प्रोलाइन, 50 μg / mL एस्कॉर्बिक एसिड, और 0.5 ng / mL ट्रांसफॉर्मिंग ग्रोथ फैक्टर 3) तैयार करें। मध्यम जलाशयों में प्रत्येक माध्यम के 35 एमएल लोड करें।
- ओस्टियोकॉन्ड्रल इकाई को दोहरे प्रवाह वाले बायोरिएक्टर से मिनीजॉइंट बायोरिएक्टर के दाईं ओर स्थानांतरित करने के लिए सीधे बल का उपयोग करें। वसा ऊतक डालने और रेशेदार ऊतक डालने को क्रमशः बाएं और मध्य कुओं में स्थानांतरित करें। सभी कुओं को निष्फल ढक्कन ों से ढक दें।
- मिनीजॉइंट चिप के इनलेट्स को मध्यम जलाशयों से और आउटलेट को सिरिंज से कनेक्ट करें (चित्रा 3 ए-सी)।
- सिरिंज को एक सिरिंज पंप (चित्रा 3 सी) पर माउंट करें, और पंप और चिप्स को इनक्यूबेटर में स्थानांतरित करें। मध्यम जलाशयों को इनक्यूबेटर के बाहर बर्फ पर रखा जाता है।
- पंप को निकासी मोड में संचालित करें, माध्यम को मध्यम जलाशय से मिनीजॉइंट बायोरिएक्टर कक्ष में खींचें। यह मिनीज्वाइंट कल्चर प्रक्रिया 28 दिनों तक चलती है।
- संयुक्त सूजन और उपास्थि अध: पतन को मॉडल करने के लिए, 10 एनजी / एमएल पर फाइब्रोजेनिक मध्यम धारा में इंटरल्यूकिन 1 (आईएल -1 ) जोड़ें। आईएल -1 उपचार के तीसरे दिन सिरिंज को बदलें, और फाइब्रोजेनिक माध्यम को ताजा आईएल -1 प्रदान करें। उपचार 7 दिनों तक रहता है।
- दवा परीक्षण चरण के दौरान, आईएल -1 के उपचार के 3 दिनों के बाद, दवा को या तो साझा माध्यम में प्रशासित किया जाता है, एक "इंट्राआर्टिकुलर प्रशासन" (चित्रा 3 डी) का अनुकरण करते हुए, जब दवा का उपयोग घुटने के जोड़ में स्थानीय रूप से किया जाता है, या सभी मध्यम प्रकारों में, "प्रणालीगत प्रशासन" (चित्रा 3 ई) का अनुकरण करते हुए, जब दवा परिसंचरण के माध्यम से घुटने के जोड़ पर कार्य करती है।
- आईएल -1 उपचार के 7 दिनों के बाद विश्लेषण के लिए व्यक्तिगत ऊतकों को इकट्ठा करें कि नमूने पिछले 4 दिनों के लिए दवा उपचार से गुजरे हैं या नहीं।
चित्र 3: मिनीजॉइंट की असेंबली। (ए, बी) ऊतक-विशिष्ट मीडिया को इनलेट 1-3 (आई 1-3) से पेश किया जाता है और आउटलेट 1-3 (ओ 1-3) से बाहर ले जाया जाता है। साझा माध्यम को I4 से O4 तक प्रतिरोपित किया जाता है। (सी) मिनीजॉइंट संस्कृति का पूरा सेटअप। ड्रग्स (हरे सूरज जैसी आकृतियां) को या तो केवल (डी) साझा माध्यम में पेश किया जा सकता है या (ई) सभी माध्यमों को क्रमशः "इंट्राआर्टिकुलर प्रशासन" या "प्रणालीगत प्रशासन" अनुकरण करने के लिए पेश किया जा सकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
4. व्यक्तिगत ऊतक संग्रह
- आवेषण को हटाने के लिए बाँझ घुमावदार बल का उपयोग करें।
- जेल को हटाने के लिए डालने के केंद्र के माध्यम से बायोप्सी पंच दबाएं, और जेल को पीबीएस में रखें।
- जीन अभिव्यक्ति का आकलन करते समय ओस्टियोकॉन्ड्रल जैल को आधे में काट लें।
नोट: चूंकि ओस्टियोकॉन्ड्रल जेल में दो ऊतक प्रकार होते हैं, इसलिए ओस्टोजेनिक और चोंड्रोजेनिक कोशिकाओं को अलग करना महत्वपूर्ण है। - विभिन्न प्रयोगों के लिए वातानुकूलित मीडिया और ऊतकों को इकट्ठा करें।
- प्रत्येक मध्यम स्रोत से लगभग 1.5 एमएल एकत्र करें।
- 10 मिनट के लिए 14,000 x g पर सेंट्रीफ्यूजिंग के बाद तरल नाइट्रोजन में वातानुकूलित मीडिया को फ्लैश-फ्रीज करें और तलछट को छोड़ दें।
- हिस्टोलॉजिकल स्टेनिंग और इम्यूनोस्टेनिंग के लिए, पहले ओसी और एसएफटी नमूनों को 10% बफर फॉर्मेलिन में ठीक करें, उन्हें आरोही सांद्रता के इथेनॉल में निर्जलित करें, उन्हें जाइलीन में साफ करें, उन्हें पैराफिन में एम्बेड करें, और अंत में उन्हें 6 μm की मोटाई पर विभाजित करें।
- एटी माइक्रोटिशूज के लिए, नमूनों को 10% बफर फॉर्मेलिन में ठीक करें, और सीधे उन्हें ऑयल रेड ओ समाधान या बीओडीआईपीवाई के साथ दाग दें।
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Representative Results
मिनीजॉइंट के सभी ऊतकों को मिनीजॉइंट (चित्रा 4 ए) में 28 दिनों की संस्कृति के बाद उनके फेनोटाइप का विश्लेषण करने के लिए एकत्र किया गया था। यह हमारे पिछले प्रकाशन7 में विस्तृत किया गया है।
आरटी-क्यूपीसीआर, इम्यूनोस्टेनिंग और हिस्टोलॉजिकल स्टेनिंग के उपयोग के माध्यम से, यह पुष्टि की गई थी कि ऊतक-विशिष्ट फेनोटाइप व्यक्तिगत सूक्ष्म ऊतकों के लिए अच्छी तरह से बनाए रखा गया था (चित्रा 4)। उदाहरण के लिए, ओसी माइक्रोटिश्यूज (ओसी-ओ) के ओसेस घटक, लेकिन अन्य ऊतक घटकों ने ओस्टियोकैल्सिन (ओसीएन) के उच्च स्तर को व्यक्त नहीं किया। इसके विपरीत, ओस्टियोकॉन्ड्रल ऊतकों (ओसी-सी) के उपास्थि भाग में, कोलेजन प्रकार II (COL2) और एग्ग्रेकन (ACAN) अन्य ऊतकों की तुलना में काफी उच्च स्तर पर व्यक्त किए गए थे (चित्रा 4B)। एडिपोनेक्टिन (एडीआईपीओक्यू) और लेप्टिन (एलईपी), दो प्रतिनिधि एडिपोजेनिक जीन के अभिव्यक्ति स्तर, अन्य ऊतकों की तुलना में एटी में बहुत अधिक थे। कैल्शियम खनिजों (चित्रा 4 एफ, जी) के साथ-साथ क्षारीय फॉस्फेट (एएलपी) और ओसीएन प्रोटीन (चित्रा 4 डी) का जमाव मुख्य रूप से ओसी-ओ में देखा गया था, और ओसी-सी ने अच्छी तरह से बरकरार ग्लाइकोसामिनोग्लाइकन (जीएजी) (चित्रा 4 सी) और सीओएल 2 (चित्रा 4 डी) दिखाया। इसके अलावा, दो चोंड्रोसाइट्स हाइपरट्रॉफी से जुड़े मार्करों, कोलेजन टाइप एक्स (सीओएल 10) और इंडियन हेजहोग (आईएचएच) की अभिव्यक्ति, जो 28 वें दिन ओसी-सी में पाई गई थी, को मिनीजॉइंट (चित्रा 4 ई) में 28 दिनों की संस्कृति के बाद काफी कम पाया गया था।
आरटी-क्यूपीसीआर, इम्यूनोस्टेनिंग और हिस्टोलॉजी के परिणामों ने पुष्टि की कि एटी और एसएफटी के फेनोटाइप को मिनीजॉइंट कल्चर (चित्रा 4 बी, एच, आई) के 4 सप्ताह के बाद सफलतापूर्वक बनाए रखा गया था। बीओडीआईपीवाई स्टेनिंग और ऑयल रेड ओ स्टेनिंग का उपयोग करते हुए, हमने एटी (चित्रा 4 एच) में प्रचुर मात्रा में लिपिड बूंद जमाव देखा। चित्रा 4 आई में इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला छवियां मिनीजॉइंट कल्चर के 4 सप्ताह के बाद एसएफटी द्वारा मजबूत लुब्रिकिन और कैडरिन 11 (सीडीएच 11) अभिव्यक्ति दिखाती हैं।
संयोजन में, ये परिणाम मिनीजॉइंट सिस्टम में एक कार्यात्मक, बहु-ऊतक श्लेष संयुक्त मॉडल के निर्माण का संकेत देते हैं।
चित्रा 4: मिनीजॉइंट चिप में सह-संस्कृति के 4 सप्ताह के बाद सूक्ष्म ऊतकों के व्यक्तिगत ऊतक फेनोटाइप का रखरखाव। (ए) ऊतक-विशिष्ट फेनोटाइप ्स के साथ एक सामान्य मिनीजॉइंट चिप बनाने की समयरेखा। (बी) आरटी-क्यूपीसीआर परिणाम सभी ऊतक घटकों में प्रमुख मार्कर जीन दिखाते हैं। OCN डेटा को OC-O में मानों के लिए, COL2 और ACAN डेटा को OC-C में मानों के लिए, ADIPOQ और LEP डेटा को AT, और TNC और COL1 डेटा को SFT में मानों के लिए सामान्यीकृत किया गया था। डेटा का विश्लेषण एक-तरफा एनोवा (एन = 3 जैविक प्रतिकृति) द्वारा किया गया था। * पी < 0.05; ** पी < 0.01; पी < 0.001; पी < 0.0001. (सी) बाइफैसिक ओसी इकाई का सैफ्रानिन ओ धुंधला होना। स्केल बार = 1 मिमी (डी) हिस्टोलॉजिकल धुंधलापन और इम्यूनोस्टेनिंग छवियां ओसी इकाई के संबंधित घटकों में हड्डी-विशिष्ट और उपास्थि-विशिष्ट मार्करों की उपस्थिति की पुष्टि करती हैं। स्केल बार = 50 μm. (E) इम्यूनोस्टेनिंग 28 वें दिन की तुलना में 56 वें दिन OC-C में दो हाइपरट्रॉफी मार्करों, COLX और IHH की बहुत कम अभिव्यक्ति दिखाता है। स्केल बार = 50 μm. (F) OC-O में मुख्य रूप से कैल्शियम जमा की उपस्थिति को दर्शाने वाली OC इकाई का Alizarin लाल धुंधलापन। स्केल बार = 500 μm. (G) (F) में Alizarin Red धुंधला छवि के आवर्धित दृश्य। स्केल बार = 200 μm. (H) ऑयल रेड O और BODIPY धुंधला चित्र जो एटी में लिपिड बूंदों के प्रतिधारण को दर्शाते हैं। स्केल बार = 50 μm. (I) इम्यूनोस्टेनिंग छवियां श्लेष जैसे रेशेदार ऊतक (एसएफटी) द्वारा लुब्रिकिन और सीडीएच 11 की अभिव्यक्ति दिखाती हैं। स्केल बार = 50 μm। ली एट अल.7 से अनुमति के साथ पुन: प्रस्तुत किया गया। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
एक रोग मॉडल बनाने के लिए, इंटरल्यूकिन 1 (आईएल -1 ) को 28 दिनों के सह-संस्कृति (चित्रा 5 ए, बी) के बाद एफएम स्ट्रीम में पेश किया गया था। आईएल -1 के उपचार के परिणामस्वरूप एसएफटी (चित्रा 5 सी) में सेल एपोप्टोसिस और ऊंचा एमएमपी -13 स्तर हुआ। दिलचस्प बात यह है कि हमने आईएल -1 (चित्रा 5 डी) द्वारा इलाज किए गए मिनीजॉइंट में उपास्थि क्षरण देखा, जो ओसी-सी और एसएफटी के बीच क्रॉसस्टॉक की घटना का सुझाव देता है।
चित्रा 5: मिनीजॉइंट में संयुक्त सूजन और अध: पतन का मॉडलिंग। (ए) आईएल -1 के साथ एसएफटी को चुनौती देकर "सिनोवाइटिस" के प्रेरण को दर्शाने वाला योजनाबद्ध। (बी) रोग मॉडल स्थापित करने और विश्लेषण करने की समयरेखा। (सी) ट्यूनल परख और एमएमपी -13 इम्यूनोस्टेनिंग एसएफटी में पैथोलॉजिकल परिवर्तनों को दर्शाता है। डीएनए विखंडन लाल तीर के निशान द्वारा इंगित किया जाता है। स्केल बार = 50 μm. (D) सैफरानिन ओ स्टेनिंग और एमएमपी -13 इम्यूनोस्टेनिंग छवियां ओसी-सी के अध: पतन को दर्शाती हैं। स्केल बार = 50 μm। ली एट अल.7 से अनुमति के साथ पुन: प्रस्तुत किया गया। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
अंत में, हमने "प्रणालीगत प्रशासन" (चित्रा 6 ए) के माध्यम से नेप्रोक्सन (एनपीएक्स) की चिकित्सीय प्रभावकारिता का परीक्षण किया, जिसे आईएल -1-उपचारित मिनीजॉइंट (चित्रा 6 बी) में उपास्थि क्षरण को कम करने के लिए दिखाया गया था। हमने "इंट्राआर्टिकुलर प्रशासन" (चित्रा 6 ए) के माध्यम से चार अन्य संभावित डीएमओएडी की भी जांच की। वास्तविक समय पीसीआर के परिणामों ने संकेत दिया कि ये चार यौगिक उपास्थि हानि को आंशिक रूप से उलटने में सक्षम थे (चित्रा 6 सी)।
चित्रा 6: स्थापित रोग मॉडल में "प्रणालीगत" और "इंट्राआर्टिकुलर" मार्गों के माध्यम से दवाओं का परीक्षण । (ए) दो अलग-अलग दवा प्रशासन मार्गों को दर्शाने वाला योजनाबद्ध, जिसमें नेप्रोक्सन (एनपीएक्स) का "प्रणालीगत प्रशासन" और फाइब्रोब्लास्ट विकास कारक 18 (एफजीएफ 18), एसएम 04690, स्क्लेरोस्टिन (एसओएसटी), और आईएल -1 रिसेप्टर विरोधी (आईएल -1आरएन) का "इंट्राआर्टिकुलर प्रशासन" शामिल है। (बी) सफ्रानिन ओ और एमएमपी -13 धुंधला चित्र एनपीएक्स उपचार के बाद ओसी-सी अध: पतन को कम करते हैं। स्केल बार = 50 μm. (C) चार अलग-अलग दवाओं के "इंट्राआर्टिकुलर प्रशासन" के बाद OC-C में जीन अभिव्यक्ति। प्रत्येक दवा-उपचारित समूह और नियंत्रण समूह के बीच सांख्यिकीय अंतर * पी < 0.05 द्वारा इंगित किया जाता है; ** पी < 0.01; पी < 0.001; और **** पी < 0.0001। डेटा का विश्लेषण छात्र के टी-टेस्ट (एन = 4 जैविक प्रतिकृति) द्वारा किया गया था। ली एट अल.7 से अनुमति के साथ पुन: प्रस्तुत किया गया। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
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Discussion
इस लेख में, हम घुटने के संयुक्त-ऑन-चिप सिस्टम बनाने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं, जिसमें हड्डी, उपास्थि, वसा ऊतक और सिनोवियम जैसे ऊतक एमएससी से बनते हैं और एक अनुकूलित बायोरिएक्टर के भीतर सह-सुसंस्कृत होते हैं। प्लग-एंड-प्ले सुविधाओं के साथ यह बहु-घटक, मानव सेल-व्युत्पन्न प्रणाली संयुक्त रोगों के रोगजनन का अध्ययन करने और दवाओं के विकास के लिए एक नया उपकरण का प्रतिनिधित्व करती है।
यह देखते हुए कि विभिन्न ऊतक विशिष्ट संस्कृति मीडिया का पक्ष लेते हैं, प्रत्येक ऊतक के लिए संबंधित माध्यम प्रदान करना और प्रवाह के बीच मुक्त माध्यम विनिमय को रोकना महत्वपूर्ण है। विशेष रूप से, बाइफेसिक ओस्टियोकॉन्ड्रल ऊतकों की पीढ़ी के दौरान, भोले एमएससी का भाग्य उस माध्यम से निर्धारित होता है जिसके लिए वे उजागर होते हैं। वर्तमान डिजाइन में, हम पाड़ के रूप में जिलेटिन-आधारित हाइड्रोगेल का उपयोग करते हैं, जो सेल विकास के लिए एक टेम्पलेट प्रदान करता है और ऊतकों और आवेषण की दीवारों के बीच संभावित अंतर को सील करता है। इसलिए, इंसर्ट के भीतर जेल को सीटू फोटोक्रॉसलिंक करना महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, बीएमपी 7 और टीजीएफ 3 जैसे विकास कारक क्रमशः ओस्टोजेनिक माध्यम और चोंड्रोजेनिक माध्यम में पूरक हैं। कई दिनों तक अपनी जैव गतिविधियों को बनाए रखने के लिए, चिप संस्कृति में पेश किए जाने से पहले ताजा मीडिया को इनक्यूबेटर के बाहर रखा जाना चाहिए। इसलिए, हमें इनक्यूबेटर में मीडिया को शामिल करने के बजाय जलाशयों से मीडिया को वापस लेने के लिए सिरिंज का उपयोग करने की आवश्यकता है।
बायोरिएक्टर को संभालने के दौरान एक और महत्वपूर्ण बिंदु अनावश्यक दबाव से बचना है। ऊतक स्थिति में रहने के लिए सम्मिलित दीवार के लिए भौतिक बंधन पर निर्भर करते हैं। चूंकि वे शीर्ष और निचले मध्यम प्रवाह के संपर्क में आते हैं, यदि प्रवाह के एक चरण में उच्च दबाव होता है, तो यह ऊतकों को आवेषण से बाहर धकेल सकता है, जिसके परिणामस्वरूप रिसाव होता है। इसलिए, हैंडलिंग प्रक्रियाओं के दौरान, जैसे बुलबुले हटाते समय, सिरिंज का एक कोमल धक्का महत्वपूर्ण है। यदि हाइड्रोगेल मचान को बाहर धकेल दिया जाता है, तो इसे वापस रखा जा सकता है, अंतर को भरने के लिए अतिरिक्त अनियंत्रित हाइड्रोगेल लगाया जा सकता है, और इसे ठीक किया जा सकता है, जिससे डालने के भीतर एक सुरक्षित और दृढ़ मचान फिट हो सकता है।
इसकी सिद्ध जैव-रासायनिकता को देखते हुए, जिलेटिन-आधारित मचानों का उपयोग वर्तमान प्रणाली में सभी चार ऊतकों को बनाने के लिए किया जाता है। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि जिलेटिन ऊतक गठन का समर्थन करने के लिए सबसे अच्छी सामग्री का प्रतिनिधित्व नहीं कर सकता है। इसलिए, यदि आवश्यक हो, तो अन्य प्रकार के मचानों को उपयोग के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, कोई एक छिद्रपूर्ण और कठोर मचान का उपयोग कर सकता है और एमएससी ओस्टियोजेनेसिस11 को और बढ़ाने के लिए जिलेटिन के साथ जोड़ सकता है। इस मामले में, किसी को यह सुनिश्चित करने की आवश्यकता है कि शीर्ष और नीचे प्रवाह के बीच कोई मुक्त माध्यम परिवर्तन न हो। जैसा कि ऊपर चर्चा की गई है, संभावित रिसाव बिंदुओं को सील करने के लिए बायोकंपैटिबल हाइड्रोगेल का उपयोग किया जा सकता है। इसके अलावा, एमएससी का उपयोग वर्तमान ऊतक चिप में किया जाता है। मस्कुलोस्केलेटल ऊतकों में उनकी प्रदर्शित भेदभाव क्षमता को देखते हुए, एमएससी को बदलने के लिए भविष्य में प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (आईपीएससी) का भी उपयोग किया जा सकता है। इस जांच की दिशा में पहले कदम के रूप में, हमने हाल ही में ओस्टियोकॉन्ड्रल ऊतक12 बनाने के लिए आईपीएससी का उपयोग किया है।
सिनोवियम सूजन, या सिनोवाइटिस, ओए और कई अन्य संयुक्त रोगों की एक प्रमुख विशेषता है। इसके अलावा, एटुकोराला एट अल ने पाया कि सिनोवाइटिस बाद के रेडियोग्राफिक ओए13 का एक मजबूत भविष्यवक्ता है। इसलिए, हमने मिनीजॉइंट में ओए जैसी विशेषताओं को उत्पन्न करने के लिए आईएल -1 उपचार द्वारा एसएफटी सूजन को प्रेरित किया। हालांकि, हम जानते हैं कि यह रोग प्रेरण विधि ओए के सभी पहलुओं को पकड़ नहीं सकती है। इस प्रकार, हमारे भविष्य के शोध में, हम मिनीजॉइंट में ओए मॉडलिंग के लिए वैकल्पिक दृष्टिकोण का पता लगाएंगे, उदाहरण के लिए, उपास्थि घटक14 की यांत्रिक चोट को प्रेरित करने के लिए हाइपरफिजियोलॉजिकल लोडिंग का उपयोग करके। यांत्रिक लोडिंग लागू करने के लिए, मिनीजॉइंट डिज़ाइन का अनुकूलन आवश्यक होगा। उदाहरण के लिए, मिनीजॉइंट चिप के निचले हिस्से को संभावित रूप से संशोधित किया जा सकता है ताकि उपास्थि ऊतक को हमारी प्रयोगशाला15 में विकसित एक अनुकूलित स्प्रिंग-लोडेड प्रभाव डिवाइस के प्रभावक सिरे तक पहुंच योग्य बनाया जा सके।
हमारे ज्ञान के अनुसार, यहां वर्णित घुटने का संयुक्त-ऑन-चिप पहला इन विट्रो मॉडल है जिसमें श्लेष जोड़ का अनुकरण करने के लिए एक प्रणाली के भीतर कई ऊतक शामिल हैं। उपन्यास प्लग-एंड-प्ले क्षमता रोग की प्रगति में एकल ऊतक की भूमिका और विभिन्न उपचारों के प्रति इसकी प्रतिक्रिया की जांच करने की अनुमति देती है। इस प्रणाली को ओए के अलावा अन्य संयुक्त रोगों को मॉडल करने के लिए भी नियोजित किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, बैक्टीरिया और अन्य रोगजनकों को संभवतः सेप्टिक गठिया16 मॉडल करने के लिए एसएम में पेश किया जा सकता है। इसके अलावा, डिजाइन ऊतकों के बीच वास्तविक समय क्रॉसटॉक को सक्षम बनाता है, इस प्रकार वातानुकूलित माध्यम का उपयोग करने की सीमा पर काबू पाता है। विशेष रूप से, वसा, श्लेष और उपास्थि ऊतक साझा माध्यम के माध्यम से संवाद कर सकते हैं, और हड्डी और उपास्थि प्रत्यक्ष शारीरिक बंधन के माध्यम से बातचीत कर सकते हैं। हालांकि, वर्तमान मिनीजॉइंट की कुछ सीमाएं हैं। सबसे पहले, स्टेम सेल-व्युत्पन्न ऊतकों का उपयोग किया जाता है, और क्या उनके फेनोटाइप और कार्य देशी घुटने के जोड़ में उनके समकक्षों से मिलते जुलते हैं, आगे की जांच की आवश्यकता है। दूसरा, मैक्रोफेज जैसी प्रतिरक्षा कोशिकाएं, जो ओए रोगजनन में महत्वपूर्ण भूमिका निभाती हैं, शामिल नहीं हैं। हमारे पिछले अध्ययन ने जिलेटिन स्काफोल्ड्स17 में मैक्रोफेज को शामिल करने की व्यवहार्यता का प्रदर्शन किया है। अंत में, मूल घुटने के जोड़ में ऊतकों पर यांत्रिक लोडिंग का अनुकरण करने के लिए एक शारीरिक तनाव-सक्षम तंत्र शामिल नहीं है। हाल ही में, ऑक्चेटा एट अल ने एक कार्टिलेज-ऑन-ए-चिप मॉडल विकसित किया, जिसमें इंजीनियर उपास्थि ऊतक14 को उत्तेजित करने के लिए तनाव-नियंत्रित संपीड़न लागू किया गया था। मिनीजॉइंट में मैकेनिकल लोडिंग को सक्षम करने के लिए एक समान विधि अपनाई जा सकती है।
सारांश में, मिनीजॉइंट इन विट्रो में ओए और संबंधित स्थितियों के रोगजनन की जांच करने के लिए एक अद्वितीय मंच के रूप में काम कर सकता है और व्यक्तिगत चिकित्सा के लिए संभावित डीएमओएडी और हस्तक्षेप की खोज के लिए एक तंत्र प्रदान कर सकता है। मिनीज्वाइंट सिस्टम को बॉडी-ऑन-ए-चिप सिस्टम स्थापित करने के लिए अन्य अंगों की नकल करने वाले ओओसी के साथ भी एकीकृत किया जा सकता है जिसका उपयोग विभिन्न अंग मिमिक्स के बीच बातचीत का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है।
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Disclosures
लेखक ों ने कोई प्रतिस्पर्धी हितों की घोषणा नहीं की है।
Acknowledgments
यह शोध मुख्य रूप से राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (UG3/ UH3TR002136, UG3 / UH3TR003090) से वित्त पोषण द्वारा समर्थित था। पॉल मैनर (वाशिंगटन विश्वविद्यालय) को मानव ऊतक के नमूने प्रदान करने के लिए और डॉ जियान टैन को एमएससी को अलग करने और सेल पूल बनाने में उनकी मदद के लिए धन्यवाद देते हैं।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-isobutyl-1-methylxanthine | Sigma -Aldrich | I17018-1G | |
| 6 well non-tissue culture plate | Corning Falcon® Plates | 351146 | |
| 24 well non-tissue culture plate | Corning Falcon® Plates | 351147 | |
| 30 mL syringes | BD Syringe Luer Lock Cascade Health | 302832 | |
| Alcian blue stain | EK Industries | 1198 | 1% w/v, pH 1.0 |
| Advanced DMEM | Gibco | 12491-015 | |
| αMEM | Gibco | 12571-063 | |
| Antibiotic-antimycotic | Gibco | 15240-062 | |
| Biopsy punch | Integra Miltex | 12-460-407 | |
| BODIPY® fluorophore | Molecular Probes | ||
| Bone morphogenic protein 7 (BMP7) | Peprotech | ||
| Curved forceps | Fisher Brand | 16100110 | |
| DMEM | Gibco | 11995-065 | Dulbecco’s Modified Eagle Medium |
| Dexmethasome | Sigma -Aldrich | 02-05-2002 | |
| E-Shell 450 photopolymer in | EnvisionTec | RES-01-4022 | |
| Fetal Bovine Serum | Gemini-Bio Products | 900-208 | |
| GlutaMAX | Gibco | 3505-061 | |
| gelatin from bovine skin | Hyclone | 1003372809 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution | Sigma -Aldrich | SH30588.02 | |
| indomethacin | Sigma -Aldrich | I7378-56 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine (ITS) | Gibco | 51500-056 | |
| interleukin 1β | Peprotech | 200-01B | |
| Leur-loc connectors | Cole-Parmer Instruments | 45508-50 | |
| L-proline | Sigma -Aldrich | 115388-93-7 | |
| β-glycerophosphate | Sigma -Aldrich | 1003129352 | |
| Medium bags | KiYATEC | FC045 | |
| Methacrylic Anhydride | Sigma -Aldrich | 102378580 | |
| Phosphate buffered Saline | Corning | 21-040-CM | |
| Pointed forceps | Fisher Brand | 12000122 | |
| Silicon mold | McMaster-Carr | RC00114P | |
| Silicon o-rings | McMaster-Carr | ZMCCs1X5 | 1mm x 5mm |
| SolidWorks | Dassault Systèmes SE, Vélizy-Villacoublay, France | ||
| Surgical Blades | Integra Miltex | 4-122 | |
| Syringe pump | Lagato210P, KD Scientific | Z569631 | 10 syringe racks |
| T-182 tissue culture flasks | Fisher Brand | FB012939 | |
| Tissue Culture Dish 150 mm | Fisher Brand | FB012925 | |
| Transforming Growth Factor Beta (TGF-β3) | Peprotech | 100-36E | |
| Trypsin | Gibco | 25200-056 | |
| UV Flashlight | KBS | KB70109 | 395 nm |
| Vida Desktop 3D Printer | EnvisionTec | ||
| Vitamin D3 | Sigma -Aldrich | 32222-06-3 | 1,25-dihydroxyvitamin D3 |
References
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