Summary
Vi tillhandahåller detaljerade metoder för att generera fyra typer av vävnader från humana mesenkymala stamceller, som används för att rekapitulera brosk, ben, fettkudde och synovium i den mänskliga knäleden. Dessa fyra vävnader är integrerade i en anpassad bioreaktor och anslutna via mikrofluidik, vilket genererar en knäled-på-ett-chip.
Abstract
Den höga förekomsten av försvagande ledsjukdomar som artros (OA) utgör en hög socioekonomisk börda. För närvarande är de tillgängliga läkemedlen som riktar sig mot ledsjukdomar mestadels palliativa. Det ouppfyllda behovet av effektiva sjukdomsmodifierande OA-läkemedel (DMOAD) har främst orsakats av avsaknaden av lämpliga modeller för att studera sjukdomsmekanismerna och testa potentiella DMOAD. Här beskriver vi etableringen av ett miniatyr synovialt ledliknande mikrofysiologiskt system (miniJoint) bestående av fett-, fibrösa och osteokondrala vävnadskomponenter härledda från humana mesenkymala stamceller (MSC). För att erhålla de tredimensionella (3D) mikrovävnaderna inkapslades MSC i fototvärbindningsbart metakrylerat gelatin före eller efter differentiering. De cellbelastade vävnadskonstruktionerna integrerades sedan i en 3D-printad bioreaktor och bildade miniJoint. Separata flöden av osteogena, fibrogena och adipogenic media infördes för att upprätthålla respektive vävnadsfenotyper. En gemensamt delad ström perfuserades genom brosk-, synovial- och fettvävnaderna för att möjliggöra vävnadsöverhörning. Detta flödesmönster möjliggör induktion av störningar i en eller flera av vävnadskomponenterna för mekanistiska studier. Dessutom kan potentiella DMOAD testas via antingen "systemisk administrering" genom alla medieströmmar eller "intraartikulär administrering" genom att lägga till läkemedlen till endast det delade "synovialvätska" -simulerande flödet. Således kan miniJoint fungera som en mångsidig in vitro-plattform för att effektivt studera sjukdomsmekanismer och testa läkemedel i personlig medicin.
Introduction
Gemensamma sjukdomar som artros (OA) är mycket vanliga och försvagande och utgör en ledande orsak till funktionshinder över hela världen1. Det uppskattas att enbart i USA påverkar OA 27 miljoner patienter och förekommer hos 12,1% av vuxna i åldern 60 år och äldre2. Tyvärr är de flesta läkemedel som för närvarande används för att hantera ledsjukdomar palliativa, och inga effektiva sjukdomsmodifierande OA-läkemedel (DMOAD) finns tillgängliga3. Detta ouppfyllda medicinska behov härrör främst från avsaknaden av en effektiv modell för att studera sjukdomsmekanismerna och utveckla potentiella DMOAD. Den konventionella tvådimensionella (2D) cellkulturen återspeglar inte 3D-naturen hos ledvävnader, och kulturen av vävnadsexplantat hindras ofta av signifikant celldöd och misslyckas vanligtvis med att replikera de dynamiska vävnadskopplingarna4. Dessutom minskar genetiska och anatomiska skillnader signifikant den fysiologiska relevansen av djurmodeller4.
Organ-on-chips (OoCs), eller mikrofysiologiska system, är ett lovande forskningsområde i gränssnittet mellan teknik, biologi och medicin. Dessa in vitro-plattformar är minimala funktionella enheter som replikerar definierade friska eller patologiska egenskaper hos sina in vivo-motsvarigheter 5. Dessutom kan dessa miniatyriserade system vara värd för olika celler och matriser och simulera de biofysiska och biokemiska interaktionerna mellan olika vävnader. Därför lovar ett mikrofysiologiskt system som troget kan rekapitulera den ursprungliga synovialleden att erbjuda en effektiv plattform för modellering av ledsjukdomar och utveckla potentiella DMOAD.
Mänskliga mesenkymala stamceller (MSC) kan isoleras från många vävnader i hela kroppen och differentieras till osteogena, kondrogeniska och adipogena linjer6. MSC har framgångsrikt använts för att konstruera olika vävnader, inklusive ben, brosk och fettvävnad6, vilket innebär att de representerar en lovande cellkälla för att konstruera vävnadskomponenterna i knäleden. Vi utvecklade nyligen ett miniatyr gemensamt efterliknande mikrofysiologiskt system, kallat miniJoint, som består av MSC-härledda ben-, brosk-, fibrösa och fettvävnader7. I synnerhet möjliggör den nya designen vävnadsöverhörning genom mikrofluidiskt flöde eller genomträngning (figur 1). Här presenterar vi protokollen för tillverkning av chipkomponenterna, konstruktion av vävnadskomponenterna, odling av de konstruerade vävnaderna i chipet och insamling av vävnader för nedströmsanalyser.
Figur 1: Schematisk bild av miniJoint-chipet som visar arrangemanget av de olika vävnadskomponenterna och medieflödena. OC = osteokondral vävnad. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Följande protokoll följer de etiska riktlinjerna från University of Pittsburgh och den mänskliga forskningsetiska kommittén vid University of Pittsburgh. Information om de material som används i denna studie finns i materialförteckningen.
1. Tillverkning av 3D-tryckta bioreaktorer
- Använd en datorprogramvara för att designa osteokondrala (figur 2A) och minigemensamma bioreaktorer (figur 2B) som inkluderar kammare, insatser och lock. Dimensionsinformationen för varje del visas i figur S1.
- Överför designen till en 3D-skrivare och skriv ut med ett fotopolymerbläck.
- Skölj de 3D-utskrivna delarna (figur 2C-F) med 15 ml 95% etanol tre gånger. Tvärbind sedan de tryckta bitarna helt i 200 s i en ficklampapolymerisationsanordning.
- Lägg till O-ringar på insatser och lock (figur 2C, D) och testa om delarna passar (figur 2G, H).
Figur 2: Tillverkning av de olika komponenterna för att göra miniJoint bioreaktorn. (A,B), 3D-modeller av bioreaktorer för att skapa (A) osteokondrala och (B) miniJoint-chips. (C,D) 3D-tryckta (C) lock och (D) skär med O-ringen installerad. (E,F) 3D-printade kammare för (E) osteokondral och (F) miniledsvävnadsodling. (G,H) Montering av (G) osteokondrala och (H) miniLedchips. Klicka här för att se en större version av denna figur.
2. Konstruktion av vävnadskomponenterna
OBS: Processerna för tillverkning av litiumfenyl-2,4,6-trimetylbensoylfosfinat (LAP) och metakrylerat gelatin (GelMA) beskrivs i tidigare studier 8,9.
- För att skapa GelMA, följ stegen nedan.
- Tillsätt 17 g gelatin typ B till 500 ml destillerat vatten och blanda sedan i en shaker i 30 minuter vid 37 °C.
- Tillsätt sedan 13 ml metakrylanhydrid, lägg tillbaka på 37 ° C-shakern och låt skaka över natten.
- Följande dag, alikvotera GelMA i enskilda dialyspåsar, med ~ 60 ml i varje påse.
- Lägg alla dialyspåsar i destillerat vatten med en omrörningsstång och tillåt 7 dagars dialys. Byt vatten flera gånger per dag och lämna påsarna vid 4 °C över natten.
- På dag 7, frys GelMA vid -80 ° C. När du är helt frusen, fortsätt till lyofilisering.
- Placera GelMA i en skål i vakuumkammaren hos en frystorkare och tillåt frystorkning. Se till att GelMA är helt torkad innan den tas bort från lyofilisatorn.
- Lös upp GelMA i Hanks balanserade saltlösning (HBSS med Ca 2+ och Mg2+) vid 15 % (vikt/volym). För att säkerställa att pH är 7,4, tillsätt NaOH i små mängder tills pH når 7,4. Komplettera lösningen med 1x antibiotika-antimykotisk och 0,15% (massa / volym) LAP baserat på den förvärvade volymen. Förvara 15% GelMA-lösningen vid -20 ° C tills användning och skydda den från ljus.
- Placera 3D-tryckta bioreaktorkammare med dubbla flöden, lock och insatser i autoklavpåsar och autoklav vid 121 °C i 20 minuter med ånga och sedan i 20 minuter med torr värme.
- Inuti det biologiska säkerhetsskåpet, blötlägg bioreaktorkamrarna, locken och insatserna i 15 ml steril fosfatbuffrad saltlösning över natten, varefter de kan torka.
- Isolera humana benmärgshärledda MSC från totalt ledartroplastiskt kirurgiskt avfall med IRB-godkännande (University of Pittsburgh och University of Washington).
- Specifikt, spola ut benmärgen från det trabekulära benet i lårbenet och huvudet och återsuspendera det i Dulbeccos modifierade örnmedium (DMEM).
- Filtrera suspensionen genom en sil på 40 μm och centrifugera genomströmningen vid 300 x g i 5 minuter.
- Ta bort supernatanten, återsuspendera pelletsen med hjälp av tillväxtmedium [DMEM, 10% fetalt bovint serum (FBS) och 1x antibiotika-antimykotisk] och placera sedan i vävnadsodlingskolvar.
- Byt odlingsmedium var 3: e dag till 4 dagar. Se till att en sammanflöde på 70% till 80% uppnås innan du går vidare.
- Lossa cellerna genom att inkubera med trypsin-EDTA i 2-3 minuter och passera i förhållandet 1 miljon celler per T150-kolv.
- Expandera cellerna till P5. Efter trypsinisering, suspendera cellerna, räkna dem och sedan pellet genom centrifugering vid 300x g i 5 minuter.
- Med en 1 000 μL pipett, resuspendera cellerna vid 20 x 106 celler/ml i 15% GelMA-lösning.
OBS: Stäng av lampan på det biologiska säkerhetsskåpet. - Tryck en steril, torr silikonform mot en petriskål med sterila handskar. Lägg sedan en insats i varje hål i silikonformen med pincett, med skärets hålsida nedåt.
- Tillsätt cellsuspensionen med en 200 μL pipett för att fylla skäret (~50 μL per skär).
- Använd en UV-ficklampa (LED-ljus med en våglängd på 395 nm) för att tvärbinda toppen av gelen/insatsen i 1,5 minuter. Tänd sedan den andra sidan i 30 sekunder. Tvärbindning sker när LAP-fotoinitiatorn utsätts för UV-ljus.
OBS: Cellsuspensionen kan förvaras i inkubatorn under denna period eller skyddas från ljus. - Med sterila pincett, överför omedelbart insatserna till 8 ml tillväxtmedium i en icke-vävnadskultur 6-brunnsplatta (DMEM kompletterad med 10% [v / v] FBS och 1x antibiotika-antimykotisk) så att cellerna kan återhämta sig över natten.
- Differentiera cellerna mot fyra linjer.
- För att konstruera fettvävnad (AT), överför insatserna till 8 ml adipogent medium (AM; Alfa-MEM, 10% FBS, 0,2 mM indometacin, 1x insulin-transferrin-selen (ITS), 0,45 mM 3-isobutyl-1-metylxantin, 0,1 μM dexametason och 1x antibiotika-antimykotisk) för att initiera differentiering. Helst placeras fyra insatser i en enda brunn av en icke-vävnadsodlingsbrunnplatta med 8 ml adipogent medium. Odla cellerna i brunnplattorna i 28 dagar, med medelförändringar varannan dag.
- För att konstruera de osteokondrala enheterna (OC), placera insatserna i bioreaktorkammare med dubbla flöden, täck brunnarna och infusera de två strömmarna separat med en flödeshastighet av 5 μl / min med 35 ml osteogent medium (OM; DMEM, 10% FBS, 1x antibiotika-antimykotisk, 0,1 μM dexametason, 0,01 M β-glycerofosfat, 100 ng / ml benmorfogent protein 7 (BMP7), 50 μg / ml askorbinsyra och 10 nM vitamin D3) och 35 ml kondraget medium (CM; DMEM, 1x antibiotika-antimykotisk, 1x ITS, 0,1 μM dexametason, 40 μg/ml prolin, 50 μg/ml askorbinsyra och 10 ng/ml transformerande tillväxtfaktor β3)10. Behåll celldifferentiering i 28 dagar genom att utföra medelstora förändringar varannan vecka.
- För att härleda fibroblasterna, differentiera MSC i 2D-kultur under 21 dagar i en T150 cm2 vävnadsodlingskolv med användning av 20 ml fibrogent medium (FM; avancerad DMEM, 5% FBS, 1x GlutaMAX, 1x antibiotika-antimykotisk och 50 μg / ml askorbinsyra). Byt medium varje vecka. Använd 4 ml trypsin för att lossa cellerna och kapsla in 3D-gelerna i insatserna, enligt protokollet som beskrivs ovan, för att erhålla synovial liknande fibrös vävnad (SFT).
OBS: Sammansättningen av alla differentieringsmedier finns i tabell 1.
3. Upprättande av miniJoint-chipet
- Autoklav 3D miniJoint bioreaktorkammare, silikonrör med en 0,062 tum innerdiameter och en 0,125 tum ytterdiameter och F 1/16 Luer-lock-kontakter. Anslut silikonslangen till miniJoint bioreaktorhulling i ena änden och anslut Luer-låset i den andra änden.
- Förbered AM, OM (ta bort BMP7) och FMCM som nämns i steg 2.11. Förbered dessutom det gemensamma delade mediet (SM; fenolrött DMEM, 1x antibiotika-antimykotiskt, 1x Na-pyruvat, 1x ITS, 40 μg / ml prolin, 50 μg / ml askorbinsyra och 0,5 ng / ml transformerande tillväxtfaktor β3) som ska användas för miniJoint-kulturen. Fyll 35 ml av varje medium i medelbehållarna.
- Använd raka pincett för att överföra osteokondrala enheten från dubbelflödesbioreaktorn till den högra brunnen i miniJoint-bioreaktorn. Överför fettvävnadsinsatsen och fibrös vävnadsinsats till vänster respektive mellersta brunnar. Täck alla brunnar med steriliserade lock.
- Anslut miniJoint-chipets inlopp till mediumbehållarna och utloppen till sprutorna (figur 3A-C).
- Montera sprutorna på en sprutpump (figur 3C) och överför pumpen och flisen till en kuvös. Medelreservoarerna hålls på is utanför inkubatorn.
- Använd pumpen i uttagsläge och dra mediet från mediumbehållaren till miniJoint bioreaktorkammaren. Denna miniGemensamma kulturprocessen varar 28 dagar.
- För att modellera ledinflammation och broskdegeneration, tillsätt interleukin 1β (IL-1β) till den fibrogena medieströmmen vid 10 ng / ml. Byt ut sprutorna på den tredje dagen av IL-1β-behandlingen och ge färsk IL-1β till det fibrogena mediet. Behandlingen varar i 7 dagar.
- Under läkemedelsteststeget, efter 3 dagars IL-1β-behandling, administrera läkemedlet antingen i det delade mediet, simulera en "intraartikulär administrering" (figur 3D) när läkemedlet används lokalt i knäleden eller i alla medietyper, simulera en "systemisk administrering" (figur 3E) när läkemedlet verkar på knäleden genom cirkulationen.
- Samla enskilda vävnader för analys efter 7 dagars IL-1β-behandling, oavsett om proverna genomgick läkemedelsbehandling under de senaste 4 dagarna eller inte.
Figur 3: Montering av miniJoint. (A,B) Vävnadsspecifika medier förs in från inloppen 1–3 (I1–3) och flyttas ut från utloppen 1–3 (O1–3). Det delade mediet perfuseras från I4 till O4. (C) Den fullständiga installationen av mini-Joint-kulturen. Läkemedel (gröna solliknande former) kan antingen införas i (D) det delade mediet endast eller (E) alla medier för att simulera "intraartikulär administrering" respektive "systemisk administrering". Klicka här för att se en större version av denna figur.
4. Individuell vävnadsinsamling
- Använd sterila böjda pincett för att ta bort insatserna.
- Tryck en biopsistans genom mitten av insatsen för att ta bort gelén och placera gelén i PBS.
- Skär osteokondrala geler i hälften när du bedömer genuttrycket.
OBS: Eftersom osteokondralgelén består av två vävnadstyper är det viktigt att separera de osteogena och kondrogena cellerna. - Samla de konditionerade medierna och vävnaderna för olika experiment.
- Samla cirka 1,5 ml från varje mediumkälla.
- Snabbfrys det konditionerade mediet i flytande kväve efter centrifugering vid 14 000 x g i 10 minuter och kassering av sedimentet.
- För histologisk färgning och immunfärgning, fixera först OC- och SFT-proverna i 10% buffrat formalin, dehydrera dem i etanol med stigande koncentrationer, rensa dem i xylen, bädda in dem i paraffin och slutligen dela dem med en tjocklek av 6 μm.
- För AT-mikrovävnaderna, fixera proverna i 10% buffrat formalin och färga dem direkt med Oil Red O-lösning eller BODIPY.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Alla vävnader i miniJoint samlades in för att analysera deras fenotyper efter 28 dagars odling i miniJoint (figur 4A). Detta har beskrivits i vår tidigare publikation7.
Genom användning av RT-qPCR, immunfärgning och histologisk färgning bekräftades att de vävnadsspecifika fenotyperna var väl underhållna för de enskilda mikrovävnaderna (figur 4). Till exempel uttryckte den osseösa komponenten i OC-mikrovävnaderna (OC-O), men inte de andra vävnadskomponenterna, höga nivåer av osteokalcin (OCN). Däremot uttrycktes kollagen typ II (COL2) och aggrecan (ACAN) i broskdelen av osteokondrala vävnader (OC-C) vid signifikant högre nivåer än i de andra vävnaderna (figur 4B). Uttrycksnivåerna av adiponektin (ADIPOQ) och leptin (LEP), två representativa adipogenic gener, var mycket högre i AT än i de andra vävnaderna. Deponeringen av kalciummineraler (figur 4F,G) samt alkaliskt fosfatas (ALP) och OCN-proteiner (figur 4D) sågs främst i OC-O, och OC-C visade väl bibehållen glykosaminoglykan (GAG) (figur 4C) och COL2 (figur 4D). Dessutom visade sig uttrycket av två kondrocythypertrofiassocierade markörer, kollagen typ X (COL10) och indisk igelkott (IHH), som detekterades i OC-C på dag 28, vara signifikant nedreglerade efter 28 dagars kultur i miniJoint (figur 4E).
Resultaten av RT-qPCR, immunfärgning och histologi bekräftade att fenotyperna av AT och SFT framgångsrikt bibehölls efter 4 veckors miniJoint-kultur (figur 4B,H,I). Med hjälp av BODIPY-färgning och Oil Red O-färgning observerade vi riklig lipiddroppavsättning i AT (figur 4H). De immunofluorescensfärgande bilderna i figur 4I visar robust smörjmedel och kadherin 11 (CDH11) uttryck av SFT efter 4 veckors miniJoint kultur.
I kombination indikerar dessa resultat skapandet av en funktionell, multivävnadssynovialledmodell i miniJoint-systemet.
Figur 4: Underhåll av mikrovävnadens individuella vävnadsfenotyper efter 4 veckors samodling i miniJoint-chipet. (A) Tidslinje för generering av ett normalt miniJoint-chip med bibehållna vävnadsspecifika fenotyper. (B) RT-qPCR-resultat som visar nyckelmarkörgener i alla vävnadskomponenter. OCN-data normaliserades till värdena i OC-O, COL2- och ACAN-data till värdena i OC-C, ADIPOQ- och LEP-data till värdena i AT och TNC- och COL1-data till värdena i SFT. Data analyserades med enkelriktad ANOVA (N = 3 biologiska replikat). * p < 0,05; ** p < 0,01; p < 0,001; p < 0,0001. (C) Safranin O färgning av den bifasiska OC-enheten. Skalstång = 1 mm. (D) Histologiska färgnings- och immunfärgningsbilder som bekräftar förekomsten av benspecifika och broskspecifika markörer i motsvarande komponenter i OC-enheten. Skalstapel = 50 μm. (E) Immunfärgning som visar mycket lägre uttryck av två hypertrofimarkörer, COLX och IHH, i OC-C på dag 56 än på dag 28. Skalstapel = 50 μm. (F) Alizarin Röd färgning av OC-enheten som visar närvaron av kalciumavlagringar främst i OC-O. Skalstapel = 500 μm. (G) Förstorade vyer av Alizarin Red-färgningsbilden i (F). Skalstapel = 200 μm. (H) Färgningsbilder från Oil Red O och BODIPY som visar retentionen av lipiddroppar i AT. Skalstapel = 50 μm. (I) Immunfärgningsbilder som visar uttrycket av lubricin och CDH11 av den synovialliknande fibrösa vävnaden (SFT). Skalstapel = 50 μm. Reproducerad med tillstånd från Li et al.7. Klicka här för att se en större version av denna figur.
För att skapa en sjukdomsmodell introducerades interleukin 1β (IL-1β) till FM-strömmen efter 28 dagars samkultur (figur 5A, B). IL-1β-behandling resulterade i cellapoptos och förhöjda MMP-13-nivåer i SFT (figur 5C). Intressant nog observerade vi brosknedbrytning i miniJoint behandlad med IL-1β (figur 5D), vilket tyder på förekomsten av överhörning mellan OC-C och SFT.
Figur 5: Modellering av ledinflammation och degeneration i miniJoint . (A) Schematiskt som visar induktionen av "synovit" genom att utmana SFT med IL-1β. (B) Tidslinje för upprättande och analys av sjukdomsmodellen. c) TUNEL-test och MMP-13-immunfärgning som visar de patologiska förändringarna i SFT. DNA-fragmentering indikeras av de röda pilspetsarna. Skalstapel = 50 μm. (D) Safranin O-färgning och MMP-13 immunfärgningsbilder som visar degenerationen av OC-C. Skalstapel = 50 μm. Reproducerad med tillstånd från Li et al.7. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Slutligen testade vi den terapeutiska effekten av naproxen (NPX) genom "systemisk administrering" (figur 6A), vilket visade sig minska brosknedbrytningen i IL-1β-behandlade miniJoint (figur 6B). Vi undersökte också fyra andra potentiella DMOAD genom "intraartikulär administrering" (figur 6A). Resultaten från realtids-PCR indikerade att dessa fyra föreningar delvis kunde vända broskförlusten (figur 6C).
Figur 6: Testning av läkemedel via "systemiska" och "intraartikulära" vägar i den etablerade sjukdomsmodellen. (A) Schema som visar de två olika administreringsvägarna, inklusive "systemisk administrering" av naproxen (NPX) och "intraartikulär administrering" av fibroblasttillväxtfaktor 18 (FGF18), SM04690, sklerostin (SOST) och IL-1-receptorantagonist (IL-1RN). (B) Färgningsbilder av Safranin O och MMP-13 som visar lindrad OC-C-degeneration efter NPX-behandling. Skalstapel = 50 μm. (C) Genuttryck i OC-C efter "intraartikulär administrering" av fyra olika läkemedel. De statistiska skillnaderna mellan varje läkemedelsbehandlad grupp och kontrollgruppen indikeras med * p < 0,05; ** p < 0,01; p < 0,001; och **** p < 0,0001. Data analyserades med studentens t-test (N = 4 biologiska replikat). Reproducerad med tillstånd från Li et al.7. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I den här artikeln presenterar vi ett protokoll för att skapa ett knäled-på-ett-chip-system, där ben, brosk, fettvävnad och synoviumliknande vävnader bildas från MSC och samodlas i en anpassad bioreaktor. Detta flerkomponents, humana cell-härledda system med plug-and-play-funktioner representerar ett nytt verktyg för att studera patogenesen av ledsjukdomar och utveckla läkemedel.
Med tanke på att olika vävnader gynnar specifika odlingsmedier är det viktigt att tillhandahålla respektive medium för varje vävnad och förhindra fritt mediumutbyte mellan flöden. I synnerhet under genereringen av bifasiska osteokondrala vävnader bestäms ödet för naiva MSC av det medium som de utsätts för. I den nuvarande designen använder vi en gelatinbaserad hydrogel som ställning, vilket ger en mall för celltillväxt och tätar det potentiella gapet mellan vävnaderna och väggarna i insatserna. Därför är det viktigt att in situ fototvärbinda gelén i insatserna. Dessutom kompletteras tillväxtfaktorer såsom BMP7 och TGFβ3 i det osteogena mediet respektive kondrogent mediet. För att behålla sina bioaktiviteter i flera dagar måste det färska mediet hållas utanför inkubatorn innan det introduceras till chipkulturen. Därför måste vi använda sprutor för att dra tillbaka media från behållarna istället för att införa media i inkubatorn.
En annan kritisk punkt vid hantering av bioreaktorn är att undvika onödigt tryck. Vävnaderna är beroende av fysisk bindning till insatsväggen för att hålla sig på plats. Eftersom de utsätts för de övre och nedre medieflödena, om en fas av flödet har ett högre tryck, kan det trycka vävnaderna ut ur insatserna, vilket resulterar i läckage. Därför är ett försiktigt tryck på sprutan avgörande under hanteringsprocesserna, till exempel vid avlägsnande av bubblor. Om hydrogelställningen trycks ut kan den sättas tillbaka, ytterligare ohärdad hydrogel kan appliceras för att fylla gapet och det kan härdas, vilket möjliggör en säker och fast ställningspassning i insatsen.
Med tanke på dess bevisade biokompatibilitet används gelatinbaserade byggnadsställningar för att skapa alla fyra vävnaderna i det nuvarande systemet. Det bör noteras att gelatin kanske inte representerar det bästa materialet för att stödja vävnadsbildning. Därför kan vid behov andra typer av ställningar anpassas för användning. Till exempel kan man använda en porös och styv ställning och kombinera den med gelatin för att ytterligare förbättra MSC-osteogenes11. I det här fallet måste man se till att det inte finns någon fri medelförändring mellan topp- och bottenflödena. Som diskuterats ovan kan man använda biokompatibla hydrogeler för att täta de potentiella läckpunkterna. Dessutom används MSC i det nuvarande vävnadschipet. Med tanke på deras påvisade differentieringspotential i muskuloskeletala vävnader kan inducerade pluripotenta stamceller (iPSC) också användas i framtiden för att ersätta MSC. Som ett första steg mot denna undersökning har vi nyligen använt iPSC för att skapa osteokondrala vävnader12.
Synoviuminflammation, eller synovit, är ett viktigt inslag i OA och många andra ledsjukdomar. Vidare fann Atukorala et al. att synovit är en stark prediktor för efterföljande radiografisk OA13. Därför inducerade vi SFT-inflammation genom IL-1β-behandling för att generera OA-liknande egenskaper i miniJoint. Vi är dock medvetna om att denna sjukdomsinduktionsmetod inte kan fånga alla aspekter av OA. I vår framtida forskning kommer vi därför att undersöka alternativa metoder för att modellera OA i miniJoint genom att till exempel använda hyperfysiologisk belastning för att inducera mekanisk skada på broskkomponenten14. För att tillämpa mekanisk belastning är anpassningen av miniJoint-designen nödvändig. Till exempel kan botten på miniJoint-chipet potentiellt modifieras för att göra broskvävnaden tillgänglig för slagspetsen på en anpassad fjäderbelastad slaganordning som utvecklats i vårt laboratorium15.
Så vitt vi vet är knäled-på-ett-chip som beskrivs här den första in vitro-modellen som inkluderar flera vävnader inom ett system för att simulera en synovialled. Den nya plug-and-play-kapaciteten gör det möjligt att undersöka rollen för en enda vävnad i sjukdomsprogression och dess svar på olika behandlingar. Detta system kan också användas för att modellera andra ledsjukdomar än OA. Till exempel kan bakterier och andra patogener eventuellt införas i SM för att modellera septisk artrit16. Dessutom möjliggör designen realtidsöverhörning mellan vävnaderna, vilket övervinner begränsningen av att använda det konditionerade mediet. Specifikt kan fett-, synovial- och broskvävnader kommunicera genom det delade mediet, och ben och brosk kan interagera genom direkt fysisk bindning. Det finns dock vissa begränsningar för den nuvarande miniJoint. Först används stamcellshärledda vävnader, och huruvida deras fenotyp och funktion liknar deras motsvarigheter i den ursprungliga knäleden behöver undersökas ytterligare. För det andra ingår inte immunceller som makrofager, som spelar en kritisk roll i OA-patogenes. Vår tidigare studie har visat möjligheten att inkludera makrofager i gelatinställningar17. Slutligen ingår inte en fysisk stressaktiverad mekanism för att simulera den mekaniska belastningen på vävnaderna i den ursprungliga knäleden. Nyligen utvecklade Occhetta et al. en brosk-på-ett-chip-modell, där töjningskontrollerad kompression applicerades för att stimulera den konstruerade broskvävnaden14. En liknande metod kan användas för att möjliggöra mekanisk belastning i miniJoint.
Sammanfattningsvis kan miniJoint fungera som en unik plattform för att undersöka patogenesen av OA och relaterade tillstånd in vitro och tillhandahålla en mekanism för att utforska potentiella DMOAD och interventioner för personlig medicin. MiniJoint-systemet kan också integreras med OoCs som efterliknar andra organ för att etablera body-on-a-chip-system som kan användas för att studera interaktionerna mellan olika organhärmare.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inte några konkurrerande intressen.
Acknowledgments
Denna forskning stöddes främst av finansiering från National Institutes of Health (UG3 / UH3TR002136, UG3 / UH3TR003090). Dessutom tackar vi Dr. Paul Manner (University of Washington) för att ha tillhandahållit de mänskliga vävnadsproverna och Dr. Jian Tan för deras hjälp med att isolera MSC: erna och skapa cellpoolen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-isobutyl-1-methylxanthine | Sigma -Aldrich | I17018-1G | |
| 6 well non-tissue culture plate | Corning Falcon® Plates | 351146 | |
| 24 well non-tissue culture plate | Corning Falcon® Plates | 351147 | |
| 30 mL syringes | BD Syringe Luer Lock Cascade Health | 302832 | |
| Alcian blue stain | EK Industries | 1198 | 1% w/v, pH 1.0 |
| Advanced DMEM | Gibco | 12491-015 | |
| αMEM | Gibco | 12571-063 | |
| Antibiotic-antimycotic | Gibco | 15240-062 | |
| Biopsy punch | Integra Miltex | 12-460-407 | |
| BODIPY® fluorophore | Molecular Probes | ||
| Bone morphogenic protein 7 (BMP7) | Peprotech | ||
| Curved forceps | Fisher Brand | 16100110 | |
| DMEM | Gibco | 11995-065 | Dulbecco’s Modified Eagle Medium |
| Dexmethasome | Sigma -Aldrich | 02-05-2002 | |
| E-Shell 450 photopolymer in | EnvisionTec | RES-01-4022 | |
| Fetal Bovine Serum | Gemini-Bio Products | 900-208 | |
| GlutaMAX | Gibco | 3505-061 | |
| gelatin from bovine skin | Hyclone | 1003372809 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution | Sigma -Aldrich | SH30588.02 | |
| indomethacin | Sigma -Aldrich | I7378-56 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine (ITS) | Gibco | 51500-056 | |
| interleukin 1β | Peprotech | 200-01B | |
| Leur-loc connectors | Cole-Parmer Instruments | 45508-50 | |
| L-proline | Sigma -Aldrich | 115388-93-7 | |
| β-glycerophosphate | Sigma -Aldrich | 1003129352 | |
| Medium bags | KiYATEC | FC045 | |
| Methacrylic Anhydride | Sigma -Aldrich | 102378580 | |
| Phosphate buffered Saline | Corning | 21-040-CM | |
| Pointed forceps | Fisher Brand | 12000122 | |
| Silicon mold | McMaster-Carr | RC00114P | |
| Silicon o-rings | McMaster-Carr | ZMCCs1X5 | 1mm x 5mm |
| SolidWorks | Dassault Systèmes SE, Vélizy-Villacoublay, France | ||
| Surgical Blades | Integra Miltex | 4-122 | |
| Syringe pump | Lagato210P, KD Scientific | Z569631 | 10 syringe racks |
| T-182 tissue culture flasks | Fisher Brand | FB012939 | |
| Tissue Culture Dish 150 mm | Fisher Brand | FB012925 | |
| Transforming Growth Factor Beta (TGF-β3) | Peprotech | 100-36E | |
| Trypsin | Gibco | 25200-056 | |
| UV Flashlight | KBS | KB70109 | 395 nm |
| Vida Desktop 3D Printer | EnvisionTec | ||
| Vitamin D3 | Sigma -Aldrich | 32222-06-3 | 1,25-dihydroxyvitamin D3 |
References
- Safiri, S., et al. Global, regional and national burden of osteoarthritis 1990-2017: A systematic analysis of the Global Burden of Disease Study 2017. Annals of the Rheumatic Diseases. 79 (6), 819-828 (2020).
- Lawrence, R. C., et al. Estimates of the prevalence of arthritis and other rheumatic conditions in the United States: Part II. Arthritis and Rheumatism. 58 (1), 26-35 (2008).
- Makarczyk, M. J., et al. Current models for development of disease-modifying osteoarthritis drugs. Tissue Engineering. Part C, Methods. 27 (2), 124-138 (2021).
- He, Y., et al. Pathogenesis of osteoarthritis: risk factors, regulatory pathways in chondrocytes, and experimental models. Biology. 9 (8), 194 (2020).
- Ronaldson-Bouchard, K., Vunjak-Novakovic, G. Organs-on-a-chip: A fast track for engineered human tissues in drug development. Cell Stem Cell. 22 (3), 310-324 (2018).
- Lin, H., Sohn, J., Shen, H., Langhans, M. T., Tuan, R. S. Bone marrow mesenchymal stem cells: aging and tissue engineering applications to enhance bone healing. Biomaterials. 203, 96-110 (2019).
- Li, Z., et al. Human mesenchymal stem cell-derived miniature joint system for disease modeling and drug testing. Advanced Science. 9 (21), 2105909 (2022).
- Lin, H., Cheng, A. W., Alexander, P. G., Beck, A. M., Tuan, R. S. Cartilage tissue engineering application of injectable gelatin hydrogel with in situ visible-light-activated gelation capability in both air and aqueous solution. Tissue Engineering. Part A. 20 (17-18), 2402-2411 (2014).
- Fairbanks, B. D., Schwartz, M. P., Bowman, C. N., Anseth, K. S. Photoinitiated polymerization of PEG-diacrylate with lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate: polymerization rate and cytocompatibility. Biomaterials. 30 (35), 6702-6707 (2009).
- Lin, H., Lozito, T. P., Alexander, P. G., Gottardi, R., Tuan, R. S. Stem cell-based microphysiological osteochondral system to model tissue response to interleukin-1β. Molecular Pharmaceutics. 11 (7), 2203-2212 (2014).
- Yin, B., et al. Hybrid macro-porous titanium ornamented by degradable 3D gel/nHA micro-scaffolds for bone tissue regeneration. International Journal of Molecular Sciences. 17 (4), 575 (2016).
- Lin, Z., et al. Osteochondral tissue chip derived from iPSCs: Modeling OA pathologies and testing drugs. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 411 (2019).
- Atukorala, I., et al. Synovitis in knee osteoarthritis: A precursor of disease. Annals of the Rheumatic Diseases. 75 (2), 390-395 (2016).
- Occhetta, P., et al. Hyperphysiological compression of articular cartilage induces an osteoarthritic phenotype in a cartilage-on-a-chip model. Nature Biomedical Engineering. 3 (7), 545-557 (2019).
- He, C., et al. Modeling early changes associated with cartilage trauma using human-cell-laden hydrogel cartilage models. Stem Cell Research and Therapy. 13 (1), 400 (2022).
- Elsissy, J. G., et al. Bacterial septic arthritis of the adult native knee joint: A review. JBJS Reviews. 8 (1), 0059 (2020).
- Romero-Lopez, M., et al. Macrophage effects on mesenchymal stem cell osteogenesis in a three-dimensional in vitro bone model. Tissue Engineering. Part A. 26 (19-20), 1099-1111 (2020).
