Summary
Denne artikkelen beskriver en protokoll for rask og effektiv spatiotemporal overvåking av normal og avvikende cytosinmetylering i intakte sebrafiskembryoer.
Abstract
Cytosinmetylering er svært konservert på tvers av virveldyrarter, og som en nøkkeldriver for epigenetisk programmering og kromatintilstand spiller en kritisk rolle i tidlig embryonal utvikling. Enzymatiske modifikasjoner driver aktiv metylering og demetylering av cytosin til 5-metylcytosin (5 mC) og påfølgende oksidasjon av 5 mC til 5-hydroksymetylcytosin, 5-formylcytosin og 5-karboksylcytosin. Epigenetisk omprogrammering er en kritisk periode under in utero utvikling, og mors eksponering for kjemikalier har potensial til å omprogrammere epigenomet i avkom. Dette kan potensielt forårsake uønskede utfall som umiddelbare fenotypiske konsekvenser, langsiktige effekter på følsomhet for voksen sykdom og transgenerasjonelle effekter av arvelige epigenetiske merker. Selv om bisulfittbasert sekvensering gjør det mulig for etterforskere å forhøre cytosinmetylering ved baseparoppløsning, er sekvenseringsbaserte tilnærminger kostnadsoverkommelige og utelukker som sådan evnen til å overvåke cytosinmetylering på tvers av utviklingsstadier, flere konsentrasjoner per kjemikalie og replikere embryoer per behandling. På grunn av den enkle automatiserte in vivo-avbildningen, genetiske manipulasjoner, rask ex utero-utviklingstid og husdyrhold under embryogenese, fortsetter sebrafiskembryoer å bli brukt som en fysiologisk intakt modell for å avdekke xenobiotisk medierte veier som bidrar til uønskede utfall under tidlig embryonal utvikling. Ved hjelp av kommersielt tilgjengelige 5-mC-spesifikke antistoffer beskriver vi derfor en kostnadseffektiv strategi for rask og effektiv spatiotemporal overvåking av cytosinmetylering i individuelle, intakte sebrafiskembryoer ved å utnytte helmontert immunhistokjemi, automatisert bildebehandling med høyt innhold og effektiv databehandling ved hjelp av programmeringsspråk før statistisk analyse. Med dagens kunnskap er denne metoden den første som lykkes med å oppdage og kvantifisere 5 mC-nivåer in situ i sebrafiskembryoer under tidlig utvikling. Metoden muliggjør påvisning av DNA-metylering i cellemassen og har også evnen til å oppdage cytosinmetylering av eggeplomme-lokaliserte maternelle mRNA under den maternelle-til-zygotiske overgangen. Samlet sett vil denne metoden være nyttig for rask identifisering av kjemikalier som har potensial til å forstyrre cytosinmetylering in situ under epigenetisk omprogrammering.
Introduction
Enzymatiske modifikasjoner driver aktiv metylering og demetylering av cytosin til 5-metylcytosin (5 mC) og påfølgende oksidasjon av 5 mC til 5-hydroksymetylcytosin, 5-formylcytosin og 5-karboksylcytosin 1,2. Tris (1,3-diklor-2-propyl) fosfat (TDCIPP) er et mye brukt flammehemmende middel i USA som tidligere har vist seg å endre banen til cytosinmetylering etter tidlig embryonal eksponering fra 0,75 timer etter befruktning (hpf) gjennom tidlig gastrulering (6 hkf) 3,4,5,6,7,8 . Innenfor virveldyr er 5 mC og dets modifiserte derivater avgjørende for å regulere tidlig embryonal utvikling9. Befruktning av et embryo utløser demetylering av foreldrenes DNA, etterfulgt av mors mRNA-nedbrytning, zygotisk genomaktivering og remetylering av det zygotiske genomet9. Biologisk relevante prosesser som benytter cytosinmetylering inkluderer histonmodifisering, rekruttering av transkripsjonsmaskiner, RNA-metylering, epigenetisk omprogrammering og bestemmelse av kromatinstruktur10,11. Cytosinmetylering er også bevart blant virveldyrarter, noe som understreker viktigheten av å forstå og undersøke hvordan avvikende cytosinmetylering kan påvirke banen til en organismes utvikling11. Videre er in utero utvikling følsom for mors eksponering og har potensial til å forårsake uønskede utfall som umiddelbare fenotypiske konsekvenser, langsiktige effekter på følsomhet for voksen sykdom og transgenerasjonelle effekter av arvelige epigenetiske merker12,13,14.
Lange strekninger av cytosin-guaninpar, eller CpG-øyer, har vært de primære fokusene til etterforskere som tar sikte på å karakterisere dynamikken i cytosinmetylering over genomet15,16,17. Bisulfittbaserte strategier som helgenombisulfittsekvensering, redusert representasjonsbisulfittsekvensering og bisulfittamplikonsekvensering representerer gullstandarden for å forhøre cytosinmetylering ved baseparoppløsning. Sekvenseringsbaserte tilnærminger er imidlertid kostnadsoverkommelige og utelukker som sådan evnen til å overvåke cytosinmetylering på tvers av utviklingsstadier, flere konsentrasjoner per kjemikalie og replikere embryoer per behandling. I tillegg gir sekvenseringsbaserte tilnærminger ikke informasjon om romlig lokalisering, noe som er kritisk for å forstå potensielt berørte celletyper og områder i et utviklende embryo. På samme måte er globale DNA-metyleringsanalyser som metyleringsavhengig restriksjonsanalyse, 5-mC enzymbundne immunoassays (ELISAs) og 5-metyl-2'-deoksycytidin (5-mC) væskekromatografi-massespektrometri (LC-MS) avhengige av celle- eller vevshomogenater og utelukker som sådan evnen til å overvåke lokaliseringen og størrelsen på cytosinmetylering over rom og tid innenfor intakte prøver12,18.
På grunn av den enkle automatiserte in vivo-avbildningen, genetiske manipulasjoner, rask ex utero-utviklingstid og husdyrhold under embryogenese, fortsetter sebrafiskembryoer å bli mye brukt som fysiologisk intakte modeller for å avdekke xenobiotisk medierte veier som bidrar til uønskede utfall under tidlig embryonal utvikling. Ved bruk av kommersielt tilgjengelige antistoffer som er spesifikke for 5-mC, beskriver derfor protokollen nedenfor en kostnadseffektiv strategi for rask og effektiv spatiotemporal overvåking av cytosinmetylering i individuelle, intakte sebrafiskembryoer ved å utnytte helmontert immunhistokjemi (IHC), automatisert bildebehandling med høyt innhold og effektiv databehandling ved hjelp av programmeringsspråk før statistisk analyse.
Til dagens kunnskap er denne metoden den første som overvåker 5 mC i intakte sebrafiskembryoer. Metoden muliggjør påvisning av DNA-metylering i cellemassen og har også evnen til å oppdage cytosinmetylering av eggeplomme-lokaliserte maternelle mRNA under den maternelle-til-zygotiske overgangen. Samlet sett vil denne metoden være nyttig for rask identifisering av kjemikalier som har potensial til å forstyrre cytosinmetylering in situ under epigenetisk omprogrammering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Voksne oppdrettere ble håndtert og behandlet i samsvar med en Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) -godkjent dyrebruksprotokoll (#20180063) ved University of California, Riverside.
1. Sebrafisk embryo samling og kjemisk eksponering
- Legg til oppdrettsfeller i tanken til tanker som inneholder seksuelt modne og reproduktivt levedyktige voksne mannlige og kvinnelige sebrafisk. Legg til minst tre feller per 6 L tank minst 12 timer før innsamling kl. ~ 9:00, som er omtrentlig tid for befruktning og gyting av egg i tanker.
- Forbered en frisk eksponeringsløsning om morgenen for innsamling. Eksponeringsløsningen fremstilles ved hjelp av en 5 ml pipette og tilsetter 5,0 ml partikkelfritt systemvann til en petriskål i 60 mm.
- Bruk deretter en 10 μL glass mikrokapillær pipette for å overføre 10 μL kjøretøy (dimetylsulfoksid eller DMSO) eller kjemisk stamløsning for å systemvanne i glassfatet.
- Virvle glasset petriskålen for å sikre at stamløsningen forsvinner. Tilsett ytterligere 5,0 ml systemvann i glassfatet. Virvle glasset petriskålen for å homogenisere eksponeringsløsningen.
- Gjenta for hver behandlingsgruppe i replikasjoner på fire for å gi fire replikasjoner per behandling.
- Etter at eksponeringsløsninger er tilberedt, dekk glassskålene med glasslokk for å minimere fordampning.
- Mens du fjerner avlsfellene fra hver tank, må du forsiktig la vannet i hver felle renne ut i tanken før du fjerner det fra tankene. Pass på at fellene holder seg med høyre side opp.
- Overfør avlsfellene til laboratorievasken og skyll dem med en spruteflaske fylt med omvendt osmose (RO) vann i et fiskenett som tidligere var gjennomvåt i 10% blekemiddel og skyllet med vann. Skyll embryoene til alt rusk er ryddet og bare rene embryoer forblir.
- Overfør embryoene fra fiskenettet ved hjelp av en RO vannfylt spruteflaske til en 100 mm plast petriskål. Sorter tilfeldig 50 levende embryoer ved 0,75 timer etter befruktning (hpf) og fjern overflødig RO-vann.
- Bruk en mikrospatel til å plassere sorterte embryoer i behandlingsløsningen. Alle embryoer må være i kjøretøy eller behandlingsløsning ikke tidligere enn kl. 09:45. Virvle glassfatene for å sikre at embryoene er jevnt belagt i behandlingsløsningen.
- Etter at fire replikasjonsretter (N = 50 per replikasjon) er satt opp for hver behandlingsgruppe, plasser glasslokket på toppen av eksponeringsrettene og overfør alle rettene til en temperaturkontrollert inkubator satt til 28 ° C til 2 hpf, 4 hpf, 6hpf, 8 hpf eller 10 hpf.
- Tilbered fersk 4 % paraformaldehyd (PFA) minst 4 timer før eksponeringen avsluttes og oppbevares ved 4 °C.
- Slå på kokeplaten til 115 ° C, lag 20 ml 1x fosfatbufret saltvann (PBS) (2 ml 10x PBS + 18 ml RO-vann) i et 50 ml sentrifugerør, og vekt ut 800 mg paraformaldehyd.
- Innenfor en kjemisk avtrekksvifte, overfør 1x PBS-løsning til en 250 ml Erlenmeyer-kolbe, tilsett 800 mg paraformaldehyd, og tilsett deretter 2 μL 10 N NaOH. Plasser et termometer inne i kolben, legg kolben på kokeplaten, og se på temperaturen mens du rører.
- Når temperaturen når 62-65 °Cfjern 4% PFA fra kokeplaten og la den avkjøles til romtemperatur (RT). Oppbevar 4 % PFA ved 4 °C.
- Når eksponeringsvarigheten er avsluttet, fjern embryoene fra inkubatoren og overfør alle levende embryoer til et 1,5 ml mikrosentrifugerør. Aspirat resteksponeringsløsning ved bruk av en pipette på 1 ml. Ikke aspirer noen embryoer.
- Tilsett 500 μL kjølt 4% PFA til et 1,5 ml mikrosentrifugerør og bland embryoene i 4% PFA ved å invertere flere ganger. La embryoene fikse i 4% PFA over natten.
MERK: Det anbefales ikke å la embryoer forbli i PFA i mer enn 12 timer.
2. Dekorionering av embryoer
- Neste dag, aspirer av 4% PFA, resuspender embryoene i 1x PBS, og pipetter forsiktig opp og ned i 30 s. Stopp om nødvendig protokollen på dette trinnet og oppbevar embryoene i 1x PBS ved 4 °C i opptil 48 timer.
- Bruk en plastoverføringspipette til å overføre faste embryoer forsiktig til en RO vannfylt glassfat og virvle forsiktig i 30 s. Gjenta dette trinnet én gang til.
- Bruk sprøytespisser under 5,0x forstørrelse ved hjelp av et standard stereomikroskop for å manuelt dekorionere alle embryoer. Gjør dette ved å bruke nålespissen til å punktere korionen og skrell den forsiktig bort fra eggeplommen og cellemassen4.
- Når embryoene har blitt dekorionert, bruk en glassmikrokapillær pipette for å overføre opptil 25 intakte embryoer til en immunkjemi (IHC) kurv og plasser IHC-kurven i en 96-brønnsplate. Bruk en pipette på 1 ml til å aspirere RO-vannet fra hver brønn.
3. Immunhistokjemi ved bruk av 5-mC-spesifikt antistoff
- Resuspender embryoene i 500 μL blokkeringsbuffer (1x PBST + 2% saueserum + 2 mg / ml bovint serumalbumin) per brønn, og pakk platen med parafilm og aluminiumsfolie for å beskytte dem mot lys. Inkuber ved 4 °C i 4 timer på en orbital shaker (100 rpm).
- Fjern parafilmfolien og aluminiumet og bruk en 1 ml pipette for å aspirere blokkeringsbufferen fra hver brønn. Bytt den ut med 500 μL av en 1:100 fortynning av monoklonalt mus anti-5-mC antistoff i blokkeringsbufferen. Inkuber alle embryoer med primære antistoffer, bortsett fra en undergruppe av kjøretøykontrollembryoer som vil bli inkubert med blokkeringsbufferen for å ta hensyn til bakgrunnsstøy. Vær forsiktig så du ikke forstyrrer integriteten til embryoer, og heller ikke aspirerer embryoer i løpet av dette trinnet.
- Pakk platen om i parafilm og aluminiumsfolie og la platen ruge ved 4 °C over natten på en orbital shaker (100 o / min).
- Dagen etter fjerner du den primære antistoffløsningen fra hver brønn og erstatter den med 1x PBS + 0,1% Tween-20 (1x PBST). Vask hver brønn tre ganger med 1x PBST i 15 minutter per vask på en orbital shaker (100 rpm).
- Erstatt 1x PBST med en 1:500 fortynning av geit anti-mus IgG antistoff i blokkering buffer og inkubere alle embryoer med det sekundære antistoffet. La platen ruge ved 4 °C over natten på en orbital shaker (100 rpm).
- Neste dag, fjern det sekundære antistoffet og vask restløsningen tre ganger med 1x PBST i 15 minutter per vask på en orbital shaker (100 rpm).
MERK: Protokollen kan stoppes her i opptil 48 timer hvis IHC-kurvene lagres i rene brønner fylt med 1x PBS. - Bruk en 1 ml pipette til å aspirere 1x PBST fra hver brønn og legg IHC-kurven i en glass-petriskål fylt med RO-vann. Under et standard stereomikroskop, tilfeldig sortere intakte embryoer i en 96-brønns plate, noe som resulterer i ett embryo per brønn.
- Bruk en 1 ml pipette, fjern alt RO-vann fra individuelle brønner og erstatt det med 200 μL 1x PBS. Sentrifuge platen i 3 min ved 1 x g.
4. Automatisert avbildning av embryoer innenfor 96-brønnsplater
- Avbilde embryoene med et 2x mål under overført lys og FITC ved hjelp av et høyt innhold screening system (Table of Materials).
MERK: Et fluorescerende bilde av hvert embryo ble tatt automatisk ved hjelp av ovennevnte forstørrelse og et FITC-filter19.- Velg Autofokus for å sikre at kameraets fokus er på undersiden av platen og forskjøvet av bunntykkelsen.
- Velg en FITC-bølgelengde med en eksponeringsvarighet på 100 ms, og sett autofokus til laser med Z-offset. Observere og bekrefte riktig bildeinnsamling i flere brønner før plateinnsamling påbegynnes.
MERK: Instrumentet tar automatisk bilder fra alle utvalgte brønner som inneholder embryoer. En plate med 96 brønner krevde ca. 30 minutter for bildeinnsamling og datalagring. I løpet av anskaffelsesperioden ble den interne temperaturen i bildesystemet opprettholdt ved RT.
- Etter bildeinnsamling, utfør dataanalyse ved hjelp av screeningsystemet med høyt innhold og en tilpasset automatisert bildeanalyseprosedyre. Velg hvert embryo på 96-brønnsplaten som skal analyseres for totalt areal og integrert intensitet av fluorescens.
MERK: Analysen inkluderte å gi bilder som inneholdt overlegg av datapunkter fra analysen. - Deretter tabulerer du datapunktene og eksporterer dem fra screeningsystemet med høyt innhold ved å gå under Mål og velge Åpne datalogg til et regneark. Delene plateinnhenting og dataanalyse er avbildet i figur 1.
5. Analyse av data
- Last opp det eksporterte regnearket til et dataprogram der deployer-pakken (dplyr) brukes til å sortere, summere data for hver brønn og filtrere etter brønnnummer. Writexl-pakken brukes deretter til å eksportere de summerte dataene til et regneark. 5mC-programkoden vises i tilleggsfil 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det overordnede målet med denne protokollen er å avgjøre om en behandling påvirker den relative overfloden av 5 mC ved å vurdere det totale arealet og den relative intensiteten av fluorescens innenfor faste og merkede sebrafiskembryoer. Etter å ha fullført protokollen, kan et fluorescensstereomikroskop brukes til først å avgjøre om hele IHC var vellykket. Når merkede embryoer observeres under et FITC- eller GFP-filter, indikeres et positivt resultat av et positivt FITC-signal i embryoet, mens et negativt resultat indikeres ved fravær av fluorescens i kontrollembryoer. Ved hjelp av et screeningsystem med høyt innhold kan disse resultatene også bekreftes under bildeopptak ved hjelp av et FITC-filter. I tillegg, under dataanalyse, vil den tilpassede modulen identifisere og kvantifisere det totale arealet og den integrerte intensiteten av fluorescens. Representative bilder av vellykkede resultater er vist i figur 1, der innhentede bilder ble målt vellykket av den tilpassede modulen, og individuelle datapunkter (vist som blått overlegg) ble anskaffet for både totalt areal og integrert intensitet.
Under datautvinning er terskelstrengen i den tilpassede modulen en tilleggsvariabel som må optimaliseres for å maksimere signal-til-støy-forholdet og øke sannsynligheten for å oppdage en signifikant behandlingsspesifikk forskjell i 5 mC overflod. Under optimalisering ga denne endelige terskelen det mest signifikante skillet mellom median av kontroll- og behandlingsgrupper (f.eks. Det største signal-til-støy-forholdet). Representative resultater ved varierende tilpassede modulterskler som påvirker signal-støy-forhold er presentert i figur 2.
Figur 1: Et flytskjema som gir en grafisk fremstilling av protokollen for eksponering og in situ påvisning av 5-metylcytosin for 6 hpf sebrafiskembryoer. Retningen til flytskjemaet er utstyrt med svarte piler. Eksponeringer forekom i replikasjoner av fire replikasjonsretter per behandling og 50 embryoer per replikasjonsfat. Forkortelser: cm = cellemasse; ys = eggeplomme sac. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Optimalisering av den tilpassede modulen. Paneler A-D viser optimalisering av den tilpassede modulen ved å vurdere median og fordeling av 5 mC-spesifikt totalt areal og integrert intensitet i sebrafiskembryoer ved 6 hkf. (A,B) Ulike terskler som testes, er oppført i forklaringen til høyre (forskjell på 100 mellom hver terskel) og er ordnet etter stringens, der 1500 og 2500 representerer henholdsvis de minste og strengeste tersklene som testes. (C,D) Ulike terskler som testes, er oppført i forklaringen til høyre (forskjell på 250 mellom hver terskel) og sortert etter stringens, der 1500 og 2500 representerer henholdsvis de minste og strengeste tersklene som testes. (*) i C,D angir terskler som er vesentlig forskjellige fra kjøretøybehandlede embryoer (p < 0,05). For A,B var alle terskler som ble testet signifikante fra kjøretøykontrollen. X-aksen angir eksponering for enten kjøretøy (0,1 % DMSO) eller 0,78 μM TDCIPP (positiv kontroll). Y-aksen betegner relativ fluorescens. Panel A viser det totale arealet på 5 mC oppdaget i embryoer som en funksjon av behandling, mens panel B viser den integrerte intensiteten på 5 mC innenfor det samme området. Ett embryo representeres av ett enkelt datapunkt for totalt N=96 for hver behandlingsgruppe. Alle eksponeringer ble utført i replikasjoner av fire retter per behandling med 50 embryoer per glassfat. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Tilleggsfil 1: 5mC programkode. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I løpet av denne protokollen er det noen få trinn som er kritiske. For det første, når du dekorionerer embryoer, er det viktig å peke nålen bort fra vevet til embryoet / eggeplommesekken / cellemassen, da disse delene av det utviklende embryoet er svært skjøre og enkle å punktere. For det andre, når du overfører merkede embryoer til individuelle brønner, bruk en glasspipette for å overføre embryoer, da de vil feste seg til en plastpipette. For det tredje, når du utfører helmontert IHC, må du sørge for at platen er beskyttet mot lys. Til slutt, etter å ha fullført hele IHC-protokollen, la platen inkubere i 1x PBS ved 4 ° C over natten før avbildning, da dette vil minimere autofluorescens som kan forstyrre avbildning.
Hvis det er embryoer som har blitt kuttet under dekorionering eller IHC, ekskluder disse embryoene fra resten av protokollen. Hvis det ikke oppdages fluorescens, kan dette løses ved å inkubere lenger (opptil 16 timer). Siden dette er et 5-mC-spesifikt antistoff, kan både DNA og RNA merkes. En generell forståelse av romlig lokalisering er viktig.
Det er noen begrensninger i denne metoden. For det første er det en ikke-målrettet teknikk, noe som betyr at den ikke vil gi den nøyaktige mengden 5 mC, men heller den relative overfloden basert på det totale arealet og integrert intensitet av fluorescens. I tillegg har denne protokollen bare blitt testet på embryoer før segmentering, så hvis du tester senere utviklingsstadier, kan det være nødvendig med ytterligere optimalisering. Videre, siden metoden er IHC-basert, kan den være utsatt for ikke-spesifikk binding; derfor er det ikke sikkert å bare være farging 5-mC lokalisert til DNA, men kan også være farging 5-mC lokalisert til RNA også. Til slutt kan optimalisering av dataanalyseterskelen være nødvendig, avhengig av kjemikaliet og strengheten til forholdene som foretrekkes.
Samlet sett gir denne metoden rask og kostnadseffektiv deteksjon av 5 mC på tvers av flere utviklingsstadier og kjemiske konsentrasjoner3. Det gir derfor et alternativ til kostnadsoverkommelige bisulfittsekvenseringsbaserte tilnærminger. Ved å tilby denne protokollen kan etterforskere bruke denne metoden til raskt å skjerme kjemikalier og vurdere hvordan overflod av 5 mC kan påvirkes under tidlig embryonal utvikling. I tillegg kan denne metoden benyttes som et prescreeningsverktøy for å identifisere konsentrasjonsområdet, utviklingsperioden og / eller følsomhetsvinduet der kjemikaliet av interesse påvirker 5 mC overflod. Alternativt kan den samme metoden benyttes for en annen biomarkør og antistoff, selv om ytterligere optimalisering er nødvendig. Ved å bruke denne metoden kan en etterforsker raskt, effektivt og kostnadseffektivt skjerme og identifisere et kjemikalie som endrer den relative overflod av 5 mC i sebrafiskembryoer før man investerer i arbeidsintensive bisulfittsekvenseringsbaserte tilnærminger. Denne metoden er imidlertid sebrafiskspesifikk, og videre forskning er nødvendig for å avgjøre om 5 mC kan påvises in situ i tidlige embryoer av andre modellorganismer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de ikke har noen kjente konkurrerende økonomiske interesser eller personlige forhold som kunne ha syntes å påvirke arbeidet som er rapportert i denne artikkelen.
Acknowledgments
Forskningsstøtte ble gitt av et UCR Graduate Division Fellowship til SAB, et NRSA T32 Training Program Fellowship (T32ES018827) til SAB, og et National Institutes of Health-tilskudd (R01ES027576) og USDA National Institute of Food and Agriculture Hatch Project (1009609) til DCV.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5-mL microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 540225 | |
| 10-µL glass microcapillary pipette | Fisher Scientific | 211762B | |
| 100-mm plastic Petri dish | Fisher Scientific | 08757100D | |
| 10x phosphate-buffered saline | Fisher Scientific | BP399500 | |
| 1-mL pipette | Fisher Scientific | 13690032 | |
| 250-mL Erlenmeyer flask | Fisher Scientific | FB501250 | |
| 5-mL pipette | Fisher Scientific | 13690033 | |
| 60-mm glass petri dishes with lids | Fisher Scientific | 08747A | |
| 96-well plate | Fisher Scientific | 720089 | |
| AlexaFluor 488-conjugated goat anti-mouse IgG antibody | Fisher Scientific | A21121 | |
| Bovine serum albumin | Fisher Scientific | BP67110 | |
| DMSO | Fisher Scientific | BP2311 | |
| Hotplate | Fisher Scientific | 1110016SH | |
| In-tank breeding traps | Aquatic Habitats | N/A | This product is no longer available following acquisition of Aquatic Habitats by Pentair. Investigators can use standard off-system breeding tanks available from multiple vendors. |
| ImageXpress Micro XLS Widefield High-Content Screening System | Molecular Devices | N/A | Any high-content screening system equipped with transmitted light and FITC filter will be suitable. |
| Immunochemistry (IHC) basket | N/A | N/A | Manufactured in-house using microcentrifuge tubes with conical portion removed and bottom fitted with mesh, sized for 24- or 48-well plates. |
| MetaXpress 6.0.3.1658 | Molecular Devices | N/A | Any software capable of quantifying total area and integrated intensity of fluorescence will be suitable. |
| Microspatula | Fisher Scientific | 2140115 | |
| Monoclonal mouse anti-5-mC antibody | Millipore Sigma | MABE146 | |
| NaOH | Fisher Scientific | BP359-500 | |
| Orbital shaker | Fisher Scientific | 50998290 | |
| Parafilm | Fisher Scientific | 1337412 | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | 18612139 | |
| Plastic transfer pipette | Fisher Scientific | 1368050 | |
| Rstudio | RStudio | N/A | RStudio is open-source software and can be downloaded at https://www.rstudio.com. |
| Sheep serum | Millipore Sigma | S3772-5ML | |
| Stereomicroscope | Leica | 10450103 | |
| Temperature-controlled incubator | Fisher Scientific | PR505755L | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | P7949-500ML |
References
- Zhang, H. -Y., Xiong, J., Qi, B. -L., Feng, Y. -Q., Yuan, B. -F. The existence of 5-hydroxymethylcytosine and 5-formylcytosine in both DNA and RNA in mammals. Chemical Communications. 52 (4), 737-740 (2016).
- Huang, W., et al. Formation and determination of the oxidation products of 5-methylcytosine in RNA. Chemical Science. 7 (8), 5495-5502 (2016).
- Avila-Barnard, S., et al. Tris(1,3-dichloro-2-propyl) phosphate disrupts the trajectory of cytosine methylation within developing zebrafish embryos. Environmental Research. 211, 113078 (2022).
- Dasgupta, S., Cheng, V., Volz, D. C. Utilizing zebrafish embryos to reveal disruptions in dorsoventral patterning. Current Protocols. 1 (6), 179 (2021).
- Vliet, S. M. F., et al. Maternal-to-zygotic transition as a potential target for niclosamide during early embryogenesis. Toxicology and Applied Pharmacology. 380, 114699 (2019).
- Kupsco, A., Dasgupta, S., Nguyen, C., Volz, D. C. Dynamic alterations in DNA methylation precede Tris(1,3-dichloro-2-propyl)phosphate-induced delays in zebrafish epiboly. Environmental Science & Technology Letters. 4 (9), 367-373 (2017).
- Dasgupta, S., et al. Complex interplay among nuclear receptor ligands, cytosine methylation, and the metabolome in driving tris(1,3-dichloro-2-propyl)phosphate-induced epiboly defects in zebrafish. Environmental Science & Technology. 53 (17), 10497-10505 (2019).
- McGee, S. P., Cooper, E. M., Stapleton, H. M., Volz, D. C. Early zebrafish embryogenesis is susceptible to developmental TDCPP exposure. Environmental Health Perspectives. 120 (11), 1585-1591 (2012).
- Geiman, T. M., Muegge, K. DNA methylation in early development. Molecular Reproduction and Development. 77 (2), 105-113 (2010).
- Wossidlo, M., et al. 5-Hydroxymethylcytosine in the mammalian zygote is linked with epigenetic reprogramming. Nature Communications. 2 (1), 1-8 (2011).
- Rottach, A., Leonhardt, H., Spada, F. DNA methylation-mediated epigenetic control. Journal of Cellular Biochemistry. 108 (1), 43-51 (2009).
- Egger, G., Liang, G., Aparicio, A., Jones, P. A. Epigenetics in human disease and prospects for epigenetic therapy. Nature. 429 (6990), 457-463 (2004).
- Ooi, S. K. T., O'Donnell, A. H., Bestor, T. H. Mammalian cytosine methylation at a glance. Journal of Cell Science. 122 (16), 2787-2791 (2009).
- Baylin, S. B., Jones, P. A. A decade of exploring the cancer epigenome-biological and translational implications. Nature Reviews Cancer. 11 (10), 726-734 (2011).
- Robertson, K. D. DNA methylation and chromatin-unraveling the tangled web. Oncogene. 21 (35), 5361-5379 (2002).
- Robertson, K. D. DNA methylation and human disease. Nature Reviews Genetics. 6 (8), 597-610 (2005).
- Greenberg, M. V. C., Bourc'his, D. The diverse roles of DNA methylation in mammalian development and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (10), 590-607 (2019).
- Yuan, B. -F., Feng, Y. -Q. Recent advances in the analysis of 5-methylcytosine and its oxidation products. Trends in Analytical Chemistry. 54, 24-35 (2014).
- Lantz-McPeak, S., et al. Developmental toxicity assay using high content screening of zebrafish embryos. Journal of Applied Toxicology. 35 (3), 261-272 (2015).
