Summary
Detta dokument beskriver ett protokoll för snabb och effektiv spatiotemporal övervakning av normal och avvikande cytosinmetylering inom intakta zebrafiskembryon.
Abstract
Cytosinmetylering är mycket bevarad över ryggradsdjur och spelar, som en viktig drivkraft för epigenetisk programmering och kromatintillstånd, en avgörande roll i tidig embryonal utveckling. Enzymatiska modifieringar driver aktiv metylering och demetylering av cytosin till 5-metylcytosin (5-mC) och efterföljande oxidation av 5-mC till 5-hydroximetylcytosin, 5-formylcytosin och 5-karboxylcytosin. Epigenetisk omprogrammering är en kritisk period under in utero-utveckling , och moderns exponering för kemikalier har potential att omprogrammera epigenomet inom avkomman. Detta kan potentiellt orsaka negativa resultat som omedelbara fenotypiska konsekvenser, långsiktiga effekter på vuxen sjukdomskänslighet och transgenerationella effekter av ärftliga epigenetiska märken. Även om bisulfitbaserad sekvensering gör det möjligt för utredare att förhöra cytosinmetylering vid basparupplösning, är sekvenseringsbaserade tillvägagångssätt kostnadsoöverkomliga och utesluter som sådan förmågan att övervaka cytosinmetylering över utvecklingsstadier, flera koncentrationer per kemikalie och replikera embryon per behandling. På grund av den enkla automatiserade in vivo-avbildningen, genetiska manipulationer, snabb ex utero-utvecklingstid och djurhållning under embryogenesen fortsätter zebrafiskembryon att användas som en fysiologiskt intakt modell för att avslöja xenobiotiska medierade vägar som bidrar till negativa resultat under tidig embryonal utveckling. Därför beskriver vi med hjälp av kommersiellt tillgängliga 5-mC-specifika antikroppar en kostnadseffektiv strategi för snabb och effektiv spatiotemporal övervakning av cytosinmetylering inom enskilda, intakta zebrafiskembryon genom att utnyttja helmonterad immunhistokemi, automatiserad avbildning med högt innehåll och effektiv databehandling med programmeringsspråk före statistisk analys. Enligt nuvarande kunskap är denna metod den första som framgångsrikt detekterar och kvantifierar 5-mC-nivåer in situ inom zebrafiskembryon under tidig utveckling. Metoden möjliggör detektion av DNA-metylering i cellmassan och har också förmågan att detektera cytosinmetylering av äggula-lokaliserade moderns mRNA under den moder-till-zygotiska övergången. Sammantaget kommer denna metod att vara användbar för snabb identifiering av kemikalier som har potential att störa cytosinmetylering in situ under epigenetisk omprogrammering.
Introduction
Enzymatiska modifieringar driver aktiv metylering och demetylering av cytosin till 5-metylcytosin (5-mC) och efterföljande oxidation av 5-mC till 5-hydroximetylcytosin, 5-formylcytosin och 5-karboxylcytosin 1,2. Tris(1,3-diklor-2-propyl)fosfat (TDCIPP) är ett allmänt använt flamskyddsmedel i USA som tidigare har visat sig förändra banan för cytosinmetylering efter tidig embryonal exponering från 0,75 timmar efter befruktning (hpf) genom tidig gastrulation (6 hpf)3,4,5,6,7,8 . Inom ryggradsdjur är 5-mC och dess modifierade derivat avgörande för att reglera tidig embryonal utveckling9. Befruktning av ett embryo utlöser demetylering av föräldra-DNA, följt av moderns mRNA-nedbrytning, zygotisk genomaktivering och metylering av det zygotiska genomet9. Biologiskt relevanta processer som använder cytosinmetylering inkluderar histonmodifiering, rekrytering av transkriptionsmaskiner, RNA-metylering, epigenetisk omprogrammering och bestämning av kromatinstruktur10,11. Cytosinmetylering bevaras också bland ryggradsdjur, vilket understryker vikten av att förstå och undersöka hur avvikande cytosinmetylering kan påverka banan för en organisms utveckling11. Dessutom är utvecklingen i livmodern känslig för exponering av mödrar och har potential att orsaka negativa resultat såsom omedelbara fenotypiska konsekvenser, långsiktiga effekter på vuxnas sjukdomskänslighet och transgenerationella effekter av ärftliga epigenetiska märken12,13,14.
Långa sträckor av cytosin-guaninpar, eller CpG-öar, har varit de primära fokuserna för utredare som syftar till att karakterisera dynamiken i cytosinmetylering över genomet15,16,17. Bisulfitbaserade strategier såsom helgenombisulfitsekvensering, reducerad representation bisulfitsekvensering och bisulfitampliconsekvensering representerar guldstandarden för att förhöra cytosinmetylering vid basparupplösning. Sekvenseringsbaserade metoder är dock kostnadsoöverkomliga och utesluter som sådana förmågan att övervaka cytosinmetylering över utvecklingsstadier, flera koncentrationer per kemikalie och replikera embryon per behandling. Dessutom ger sekvenseringsbaserade metoder inte information om rumslig lokalisering, vilket är avgörande för att förstå potentiellt påverkade celltyper och områden inom ett utvecklande embryo. På liknande sätt är globala DNA-metyleringsanalyser såsom metyleringsberoende restriktionsanalys, 5-mC-enzymbundna immunanalyser (ELISA) och 5-metyl-2'-deoxicytidin (5-mC) vätskekromatografi-masspektrometri (LC-MS) beroende av cell- eller vävnadshomogenater och utesluter som sådan förmågan att övervaka lokaliseringen och storleken på cytosinmetylering över tid och rum inom intakta prover12,18.
På grund av den enkla automatiserade in vivo-avbildningen, genetiska manipulationer, snabb ex utero-utvecklingstid och djurhållning under embryogenesen fortsätter zebrafiskembryon att användas i stor utsträckning som fysiologiskt intakta modeller för att avslöja xenobiotiska medierade vägar som bidrar till negativa resultat under tidig embryonal utveckling. Därför, med hjälp av kommersiellt tillgängliga antikroppar som är specifika för 5-mC, beskriver protokollet nedan en kostnadseffektiv strategi för snabb och effektiv spatiotemporal övervakning av cytosinmetylering inom enskilda, intakta zebrafiskembryon genom att utnyttja helmonterad immunhistokemi (IHC), automatiserad avbildning med högt innehåll och effektiv databehandling med programmeringsspråk före statistisk analys.
Enligt nuvarande kunskap är denna metod den första som övervakar 5-mC inom intakta zebrafiskembryon. Metoden möjliggör detektion av DNA-metylering i cellmassan och har också förmågan att detektera cytosinmetylering av äggula-lokaliserade moderns mRNA under den moder-till-zygotiska övergången. Sammantaget kommer denna metod att vara användbar för snabb identifiering av kemikalier som har potential att störa cytosinmetylering in situ under epigenetisk omprogrammering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Vuxna uppfödare hanterades och behandlades i enlighet med ett IAUC-godkänt protokoll för djurvård och användning (Institutional Animal Care and Use Committee) (#20180063) vid University of California, Riverside.
1. Insamling av zebrafiskembryon och kemisk exponering
- Lägg till avelsfällor i tanken till tankar som innehåller sexuellt mogna och reproduktivt livskraftiga vuxna manliga och kvinnliga zebrafiskar. Lägg till minst tre fällor per 6 L tank minst 12 timmar före insamling klockan ~ 9:00, vilket är den ungefärliga tiden för befruktning och gytning av ägg i tankar.
- Förbered en ny exponeringslösning på morgonen för insamling. Exponeringslösningen framställs med en 5 ml pipett och tillsätter 5,0 ml partikelfritt systemvatten till en 60 mm glasskål.
- Använd sedan en 10 μL glasmikrokapillärpipett för att överföra 10 μL vehikel (dimetylsulfoxid eller DMSO) eller kemisk stamlösning till systemvatten i glasskålen.
- Virvla glasskålen för att säkerställa att stamlösningen försvinner. Tillsätt ytterligare 5,0 ml systemvatten i glasskålen. Virvla glasskålen för att homogenisera exponeringslösningen.
- Upprepa för varje behandlingsgrupp i replikat om fyra för att ge fyra replikat per behandling.
- Efter att exponeringslösningar har beretts, täck glasskålarna med glaslock för att minimera avdunstningen.
- När du tar bort avelsfällorna från varje tank, låt försiktigt vattnet i varje fälla rinna ut i tanken innan du tar bort det från tankarna. Se till att fällorna håller sig rätt uppåt.
- Överför avelsfällorna till labbfatet och skölj dem med en sprutflaska fylld med omvänd osmos (RO) vatten i ett fisknät som tidigare blötläggts i 10% blekmedel och sköljts med vatten. Skölj embryona tills allt skräp har rensats och endast rena embryon kvarstår.
- Överför embryona från fisknätet med en RO-vattenfylld sprutflaska till en petriskål av plast i 100 mm. Sortera slumpmässigt 50 levande embryon vid 0,75 h efterbefruktning (hpf) och ta bort överskott av RO-vatten.
- Använd en mikrospatel och placera sorterade embryon i behandlingslösningen. Alla embryon måste vara i vehikel eller behandlingslösning tidigast 9:45. Virvla glasskålarna för att säkerställa att embryona är jämnt belagda i behandlingslösningen.
- Efter att fyra replikatskålar (N = 50 per replikat) har ställts in för varje behandlingsgrupp, placera glaslocket ovanpå exponeringsskålarna och överför alla diskar till en temperaturkontrollerad inkubator inställd på 28 ° C tills 2 hkf, 4 hpf, 6 hpf, 8 hpf eller 10 hpf.
- Bered färsk 4% paraformaldehyd (PFA) minst 4 timmar innan exponeringen avslutas och förvara vid 4 °C.
- Slå på kokplattan till 115 °C, gör 20 ml 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) (2 ml 10x PBS + 18 ml RO-vatten) i ett 50 ml centrifugrör och vikt ut 800 mg paraformaldehyd.
- Överför 1x PBS-lösning till en 250 ml Erlenmeyerkolv i en kemisk dragskåp, tillsätt 800 mg paraformaldehyd och tillsätt sedan 2 μl 10 N NaOH. Placera en termometer inuti kolven, placera kolven på kokplattan och titta på temperaturen under omrörning.
- När temperaturen når 62-65 °Cremove 4% PFA från kokplattan och låt den svalna till rumstemperatur (RT). Förvara 4 % PFA vid 4 °C.
- När exponeringstiden har upphört, ta bort embryona från inkubatorn och överför alla levande embryon till ett 1,5 ml mikrocentrifugrör. Aspirera kvarvarande exponeringslösning med en 1 ml pipett. Aspirera inte några embryon.
- Tillsätt 500 μl kyld 4% PFA till ett 1,5 ml mikrocentrifugrör och blanda embryona i 4% PFA genom att invertera flera gånger. Låt embryona fixeras i 4% PFA över natten.
OBS: Det rekommenderas inte att embryon stannar i PFA längre än 12 timmar.
2. Dekorionering av embryon
- Följande dag, aspirera bort 4% PFA, återsuspendera embryona i 1x PBS och pipettera försiktigt upp och ner i 30 s. Om det behövs, stoppa protokollet i detta steg och förvara embryona i 1x PBS vid 4 °C i upp till 48 timmar.
- Använd en plastöverföringspipett och överför försiktigt fasta embryon till en RO-vattenfylld glasskål och virvla försiktigt i 30 s. Upprepa detta steg en gång till.
- Använd sprutnålar under 5,0x förstoring med ett vanligt stereomikroskop för att manuellt dekorionera alla embryon. Gör detta genom att använda nålspetsen för att punktera korionen och försiktigt skala bort den från äggulan och cellmassan4.
- När embryona har dekorionerats, använd en mikrokapillärpipett av glas för att överföra upp till 25 intakta embryon till en immunokemikorg (IHC) och placera IHC-korgen i en 96-brunnsplatta. Använd en 1 ml pipett för att aspirera RO-vattnet från varje brunn.
3. Immunohistokemi med användning av 5-mC-specifik antikropp
- Återsuspendera embryona i 500 μL blockerande buffert (1x PBST + 2% fårserum + 2 mg / ml bovint serumalbumin) per brunn och linda in plattan med parafilm och aluminiumfolie för att skydda dem från ljus. Inkubera vid 4 °C i 4 timmar i en orbitalskakapparat (100 rpm).
- Ta bort parafilmfolien och aluminiumet och använd en 1 ml pipett för att aspirera blockeringsbufferten från varje brunn. Byt ut den mot 500 μL av en 1:100 utspädning av monoklonal mus anti-5-mC antikropp i blockeringsbufferten. Inkubera alla embryon med primära antikroppar utom en delmängd av vehikelkontrollembryon som kommer att inkuberas med blockeringsbufferten för att ta hänsyn till bakgrundsbrus. Var försiktig så att du inte stör embryonas integritet eller att aspirera embryon under detta steg.
- Packa om plattan i parafilm och aluminiumfolie och låt plattan inkubera vid 4 °C över natten på en orbital shaker (100 rpm).
- Följande dag, ta bort den primära antikroppslösningen från varje brunn och ersätt den med 1x PBS + 0,1% Tween-20 (1x PBST). Tvätta varje brunn tre gånger med 1x PBST i 15 min per tvätt på en orbital shaker (100 rpm).
- Ersätt 1x PBST med en 1:500 utspädning av get-anti-mus IgG-antikropp i blockerande buffert och inkubera alla embryon med den sekundära antikroppen. Låt plattan inkuberas vid 4 °C över natten i en orbital shaker (100 rpm).
- Följande dag, ta bort den sekundära antikroppen och tvätta restlösningen tre gånger med 1x PBST i 15 min per tvätt på en orbital shaker (100 rpm).
OBS: Protokollet kan stoppas här i upp till 48 timmar om IHC-korgarna förvaras i rena brunnar fyllda med 1x PBS. - Använd en 1 ml pipett för att aspirera 1x PBST från varje brunn och placera IHC-korgen i en petriskål fylld med RO-vatten. Under ett vanligt stereomikroskop sorterar du slumpmässigt intakta embryon i en 96-brunnsplatta, vilket resulterar i ett embryo per brunn.
- Ta bort allt RO-vatten från enskilda brunnar med en pipett på 1 ml och ersätt det med 200 μL 1x PBS. Centrifugera plattan i 3 minuter vid 1 x g.
4. Automatiserad avbildning av embryon i 96-brunnsplattor
- Avbilda embryona med ett 2x mål under överfört ljus och FITC med hjälp av ett höginnehållsscreeningssystem (materialtabell).
OBS: En fluorescerande bild av varje embryo fångades automatiskt med ovan nämnda förstoring och ett FITC-filter19.- Välj Autofokus för att säkerställa att kamerans fokus ligger på undersidan av plattan och kompenseras av den nedre tjockleken.
- Välj en FITC-våglängd med en exponeringstid på 100 ms och ställ in autofokusen på laser med en Z-förskjutning. Observera och bekräfta korrekt bildförvärv i flera brunnar innan du påbörjar plåtförvärv.
OBS: Instrumentet hämtar automatiskt bilder från alla utvalda brunnar som innehåller embryon. En 96-brunnsplatta krävde cirka 30 minuter för bildinsamling och datalagring. Under anskaffningsperioden upprätthölls den interna temperaturen i bildsystemet vid RT.
- Efter bildförvärv utför du dataanalys med hjälp av screeningsystemet med högt innehåll och en anpassad automatiserad bildanalysprocedur. Välj varje embryo på 96-brunnsplattan som ska analyseras för total yta och integrerad intensitet av fluorescens.
OBS: Analysen inkluderade att tillhandahålla bilder som innehöll överlägg av datapunkter från analysen. - Tabulera sedan datapunkterna och exportera dem från screeningsystemet med högt innehåll genom att gå under Mått och välja Öppna datalogg till ett kalkylblad. Plåtanskaffnings- och dataanalysdelarna visas i figur 1.
5. Analys av data
- Ladda upp det exporterade kalkylarket till ett datorprogram där deployerpaketet (dplyr) används för att sortera, summera data för varje brunn och filtrera efter brunnsnummer. Writexl-paketet används sedan för att exportera summerade data till ett kalkylblad. 5mC-programkoden visas i tilläggsfil 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det övergripande syftet med detta protokoll är att avgöra om en behandling påverkar den relativa förekomsten av 5-mC genom att bedöma den totala ytan och den relativa intensiteten av fluorescens inom fasta och märkta zebrafiskembryon. Efter att ha slutfört protokollet kan ett fluorescensstereomikroskop användas för att först avgöra om IHC med helmontering lyckades. När märkta embryon observeras under ett FITC- eller GFP-filter indikeras ett positivt resultat av en positiv FITC-signal i embryot, medan ett negativt resultat indikeras av frånvaron av fluorescens inom kontrollembryon. Med hjälp av ett screeningsystem med högt innehåll kan dessa resultat också bekräftas under bildförvärv med hjälp av ett FITC-filter. Dessutom, under dataanalys, kommer den anpassade modulen att identifiera och kvantifiera den totala ytan och den integrerade intensiteten av fluorescens. Representativa bilder av lyckade resultat visas i figur 1, där förvärvade bilder mättes framgångsrikt av den anpassade modulen, och enskilda datapunkter (visas som blått överlägg) förvärvades för både total yta och integrerad intensitet.
Under extrahering av data är tröskelsträngheten i den anpassade modulen en ytterligare variabel som måste optimeras för att maximera signal-brusförhållandet och öka sannolikheten för att upptäcka en signifikant behandlingsspecifik skillnad i 5 mC-överflöd. Under optimeringen gav denna slutliga tröskel den mest signifikanta separationen mellan medianerna för kontroll- och behandlingsgrupper (t.ex. det största signal-brusförhållandet). Representativa resultat vid varierande anpassade modultrösklar som påverkar signal-brusförhållanden presenteras i figur 2.
Figur 1: Ett flödesschema som ger en grafisk representation av protokollet för exponering och in situ-detektion av 5-metylcytosin för 6 hpf zebrafiskembryon. Flödesdiagrammets riktning är försedd med svarta pilar. Exponeringar förekom i replikat av fyra replikaträtter per behandling och 50 embryon per replikatskål. Förkortningar: cm = cellmassa; ys = äggula sac. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 2: Optimering av den anpassade modulen. Paneler A-D visar optimering av den anpassade modulen genom att bedöma medianen och fördelningen av 5-mC-specifik total yta och integrerad intensitet inom zebrafiskembryon vid 6 hpf. (A,B) Olika testade trösklar listas i förklaringen till höger (skillnad på 100 mellan varje tröskel) och ordnas efter stringens, där 1500 och 2500 representerar de minst respektive strängaste tröskelvärdena som testats. (C,D) Olika testade tröskelvärden listas i förklaringen till höger (skillnaden på 250 mellan varje tröskel) och sorteras efter stringens, där 1500 och 2500 representerar de minst respektive strängaste tröskelvärdena som testats. (*) i C,D betecknar tröskelvärden som skiljer sig avsevärt från vehikelbehandlade embryon (p < 0,05). För A,B var alla testade tröskelvärden signifikanta från fordonskontrollen. X-axeln betecknar exponering för antingen fordon (0,1 % DMSO) eller 0,78 μM TDCIPP (positiv kontroll). Y-axeln betecknar relativ fluorescens. Panel A visar den totala arean på 5 mC som detekterats i embryon som en funktion av behandlingen, medan panel B visar den integrerade intensiteten på 5 mC inom samma område. Ett embryo representeras av en enda datapunkt för totalt N = 96 för varje behandlingsgrupp. Alla exponeringar utfördes i replikat av fyra rätter per behandling med 50 embryon per glasskål. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande fil 1: 5mC programkod. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Under detta protokoll finns det några steg som är kritiska. För det första, när man dekorionerar embryon, är det viktigt att rikta nålen bort från vävnaden i embryot / äggula sac / cellmassan, eftersom dessa delar av det utvecklande embryot är mycket ömtåliga och lätta att punktera. För det andra, när du överför märkta embryon till enskilda brunnar, använd en glaspipett för att överföra embryon eftersom de kommer att fästa vid en plastpipett. För det tredje, när du utför helmonterad IHC, se till att plattan är skyddad mot ljus. Slutligen, efter att ha slutfört IHC-protokollet med hela fästet, låt plattan inkubera i 1x PBS vid 4 ° C över natten före avbildning, eftersom detta minimerar autofluorescens som kan störa avbildning.
Om det finns embryon som har avbrutits under dechorionation eller IHC, uteslut dessa embryon från resten av protokollet. Om ingen fluorescens detekteras kan detta lösas genom att inkubera längre (upp till 16 timmar). Eftersom detta är en 5-mC-specifik antikropp kan både DNA och RNA märkas. En allmän förståelse för rumslig lokalisering är viktig.
Det finns vissa begränsningar i den här metoden. För det första är det en icke-riktad teknik, vilket innebär att den inte kommer att ge den exakta mängden 5 mC, utan snarare det relativa överflödet baserat på den totala ytan och den integrerade intensiteten av fluorescens. Dessutom har detta protokoll endast testats på embryon före segmentering, så om testning av senare utvecklingsstadier kan ytterligare optimering behövas. Eftersom metoden är IHC-baserad kan den dessutom vara mottaglig för icke-specifik bindning. därför är det inte säkert att det bara färgar 5-mC lokaliserat till DNA, utan kan också färga 5-mC lokaliserat till RNA också. Slutligen kan optimering av dataanalyströskeln behövas beroende på kemikalien och strängheten hos de förhållanden som föredras.
Sammantaget ger denna metod snabb och kostnadseffektiv detektion av 5 mC över flera utvecklingsstadier och kemiska koncentrationer3. Det ger därför ett alternativ till kostnadsoöverkomliga bisulfitsekvenseringsbaserade metoder. Genom att erbjuda detta protokoll kan utredare använda denna metod för att snabbt screena kemikalier och bedöma hur överflödet av 5-mC kan påverkas under tidig embryonal utveckling. Dessutom kan denna metod användas som ett förscreeningsverktyg för att identifiera koncentrationsintervallet, utvecklingsperioden och / eller känslighetsfönstret där kemikalien av intresse påverkar 5-mC överflöd. Alternativt kan samma metod användas för en annan biomarkör och antikropp, även om ytterligare optimering behövs. Genom att använda denna metod kan en utredare snabbt, effektivt och kostnadseffektivt screena och identifiera en kemikalie som förändrar det relativa överflödet av 5 mC inom zebrafiskembryon innan man investerar i arbetsintensiva bisulfitsekvenseringsbaserade metoder. Denna metod är dock zebrafiskspecifik, och ytterligare forskning behövs för att avgöra om 5-mC kan detekteras in situ i tidiga embryon från andra modellorganismer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några kända konkurrerande ekonomiska intressen eller personliga relationer som kan ha visat sig påverka det arbete som rapporteras i detta dokument.
Acknowledgments
Forskningsstöd tillhandahölls av ett UCR Graduate Division Fellowship till SAB, ett NRSA T32 Training Program Fellowship (T32ES018827) till SAB och ett National Institutes of Health-bidrag (R01ES027576) och USDA National Institute of Food and Agriculture Hatch Project (1009609) till DCV.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5-mL microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 540225 | |
| 10-µL glass microcapillary pipette | Fisher Scientific | 211762B | |
| 100-mm plastic Petri dish | Fisher Scientific | 08757100D | |
| 10x phosphate-buffered saline | Fisher Scientific | BP399500 | |
| 1-mL pipette | Fisher Scientific | 13690032 | |
| 250-mL Erlenmeyer flask | Fisher Scientific | FB501250 | |
| 5-mL pipette | Fisher Scientific | 13690033 | |
| 60-mm glass petri dishes with lids | Fisher Scientific | 08747A | |
| 96-well plate | Fisher Scientific | 720089 | |
| AlexaFluor 488-conjugated goat anti-mouse IgG antibody | Fisher Scientific | A21121 | |
| Bovine serum albumin | Fisher Scientific | BP67110 | |
| DMSO | Fisher Scientific | BP2311 | |
| Hotplate | Fisher Scientific | 1110016SH | |
| In-tank breeding traps | Aquatic Habitats | N/A | This product is no longer available following acquisition of Aquatic Habitats by Pentair. Investigators can use standard off-system breeding tanks available from multiple vendors. |
| ImageXpress Micro XLS Widefield High-Content Screening System | Molecular Devices | N/A | Any high-content screening system equipped with transmitted light and FITC filter will be suitable. |
| Immunochemistry (IHC) basket | N/A | N/A | Manufactured in-house using microcentrifuge tubes with conical portion removed and bottom fitted with mesh, sized for 24- or 48-well plates. |
| MetaXpress 6.0.3.1658 | Molecular Devices | N/A | Any software capable of quantifying total area and integrated intensity of fluorescence will be suitable. |
| Microspatula | Fisher Scientific | 2140115 | |
| Monoclonal mouse anti-5-mC antibody | Millipore Sigma | MABE146 | |
| NaOH | Fisher Scientific | BP359-500 | |
| Orbital shaker | Fisher Scientific | 50998290 | |
| Parafilm | Fisher Scientific | 1337412 | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | 18612139 | |
| Plastic transfer pipette | Fisher Scientific | 1368050 | |
| Rstudio | RStudio | N/A | RStudio is open-source software and can be downloaded at https://www.rstudio.com. |
| Sheep serum | Millipore Sigma | S3772-5ML | |
| Stereomicroscope | Leica | 10450103 | |
| Temperature-controlled incubator | Fisher Scientific | PR505755L | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | P7949-500ML |
References
- Zhang, H. -Y., Xiong, J., Qi, B. -L., Feng, Y. -Q., Yuan, B. -F. The existence of 5-hydroxymethylcytosine and 5-formylcytosine in both DNA and RNA in mammals. Chemical Communications. 52 (4), 737-740 (2016).
- Huang, W., et al. Formation and determination of the oxidation products of 5-methylcytosine in RNA. Chemical Science. 7 (8), 5495-5502 (2016).
- Avila-Barnard, S., et al. Tris(1,3-dichloro-2-propyl) phosphate disrupts the trajectory of cytosine methylation within developing zebrafish embryos. Environmental Research. 211, 113078 (2022).
- Dasgupta, S., Cheng, V., Volz, D. C. Utilizing zebrafish embryos to reveal disruptions in dorsoventral patterning. Current Protocols. 1 (6), 179 (2021).
- Vliet, S. M. F., et al. Maternal-to-zygotic transition as a potential target for niclosamide during early embryogenesis. Toxicology and Applied Pharmacology. 380, 114699 (2019).
- Kupsco, A., Dasgupta, S., Nguyen, C., Volz, D. C. Dynamic alterations in DNA methylation precede Tris(1,3-dichloro-2-propyl)phosphate-induced delays in zebrafish epiboly. Environmental Science & Technology Letters. 4 (9), 367-373 (2017).
- Dasgupta, S., et al. Complex interplay among nuclear receptor ligands, cytosine methylation, and the metabolome in driving tris(1,3-dichloro-2-propyl)phosphate-induced epiboly defects in zebrafish. Environmental Science & Technology. 53 (17), 10497-10505 (2019).
- McGee, S. P., Cooper, E. M., Stapleton, H. M., Volz, D. C. Early zebrafish embryogenesis is susceptible to developmental TDCPP exposure. Environmental Health Perspectives. 120 (11), 1585-1591 (2012).
- Geiman, T. M., Muegge, K. DNA methylation in early development. Molecular Reproduction and Development. 77 (2), 105-113 (2010).
- Wossidlo, M., et al. 5-Hydroxymethylcytosine in the mammalian zygote is linked with epigenetic reprogramming. Nature Communications. 2 (1), 1-8 (2011).
- Rottach, A., Leonhardt, H., Spada, F. DNA methylation-mediated epigenetic control. Journal of Cellular Biochemistry. 108 (1), 43-51 (2009).
- Egger, G., Liang, G., Aparicio, A., Jones, P. A. Epigenetics in human disease and prospects for epigenetic therapy. Nature. 429 (6990), 457-463 (2004).
- Ooi, S. K. T., O'Donnell, A. H., Bestor, T. H. Mammalian cytosine methylation at a glance. Journal of Cell Science. 122 (16), 2787-2791 (2009).
- Baylin, S. B., Jones, P. A. A decade of exploring the cancer epigenome-biological and translational implications. Nature Reviews Cancer. 11 (10), 726-734 (2011).
- Robertson, K. D. DNA methylation and chromatin-unraveling the tangled web. Oncogene. 21 (35), 5361-5379 (2002).
- Robertson, K. D. DNA methylation and human disease. Nature Reviews Genetics. 6 (8), 597-610 (2005).
- Greenberg, M. V. C., Bourc'his, D. The diverse roles of DNA methylation in mammalian development and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (10), 590-607 (2019).
- Yuan, B. -F., Feng, Y. -Q. Recent advances in the analysis of 5-methylcytosine and its oxidation products. Trends in Analytical Chemistry. 54, 24-35 (2014).
- Lantz-McPeak, S., et al. Developmental toxicity assay using high content screening of zebrafish embryos. Journal of Applied Toxicology. 35 (3), 261-272 (2015).
