يصف هذا البروتوكول نهجا لتسهيل التعديلات الدقيقة في أجنة الزرد باستخدام تقنية CRISPR-Cas9. يتم تقديم خط أنابيب التنميط الظاهري لإثبات قابلية تطبيق هذه التقنيات لنمذجة متغير جيني مرتبط بمتلازمة فترة QT الطويلة.
تتيح التكرارات العنقودية القصيرة المتباعدة بانتظام (CRISPR) في النماذج الحيوانية التلاعب الجيني الدقيق لدراسة الظواهر الفسيولوجية. تم استخدام الزرد كنموذج وراثي فعال لدراسة العديد من الأسئلة المتعلقة بالأمراض الوراثية والتطور وعلم السموم على مستوى الأعضاء والكائنات الحية بأكملها. نظرا لجينوم سمك الزرد المشروح جيدا والمعين ، تم تطوير العديد من الأدوات لتحرير الجينات. ومع ذلك ، فإن فعالية توليد وسهولة اكتشاف التعديلات الدقيقة باستخدام كريسبر هي عامل مقيد. يوصف هنا نهج قائم على CRISPR-Cas9 مع الكشف البسيط عن التعديلات الدقيقة في الجين المسؤول عن إعادة استقطاب القلب والمرتبط بالاضطراب الكهربائي ، متلازمة فترة QT الطويلة (LQTS). هذا النهج ثنائي الدليل RNA (sgRNA) يستأصل ويحل محل التسلسل المستهدف ويربط جين مراسل مشفر وراثيا. يتم توضيح فائدة هذا النهج من خلال وصف قياسات النمط الظاهري غير الغازية للوظيفة الكهربائية للقلب في يرقات الزرد من النوع البري والمحرر جينيا. يتيح هذا النهج الدراسة الفعالة للمتغيرات المرتبطة بالمرض في كائن حي بأكمله. علاوة على ذلك ، توفر هذه الاستراتيجية إمكانيات لإدخال تسلسلات خارجية من الاختيار ، مثل جينات المراسل ، أو تقويم العظام ، أو محرري الجينات.
تتيح استراتيجيات تحرير الجينات القائمة على كريسبر في النماذج الحيوانية دراسة الأمراض الوراثية وراثيا وتطورها وعلم السموم على مستوى الكائن الحي بأكمله1،2،3. يوفر الزرد نموذجا قويا أقرب في العديد من الجوانب الفسيولوجية للبشر من الفئران أو نماذج الخلايا المشتقة من الإنسان4. تم استخدام مجموعة واسعة من الأدوات والاستراتيجيات الجينية في الزرد لكل من الفحص الجيني الأمامي5 والعكسي6. سهلت الخرائط الجينية الشاملة والتعليقات التوضيحية في أسماك الزرد نهج تحرير الجينات كتقنية أولية لهندسة الضربات القاضية الجينية المستهدفة (KOs) والضربات الدقيقة (KIs)7.
على الرغم من ذلك ، فإن إنشاء تعديلات KI دقيقة في الزرد محدود بسبب الكفاءة المنخفضة وصعوبة الكشف الدقيق. على الرغم من أن نوكلياز المستجيب الشبيه بعامل النسخ (TALENs) قد تم استخدامه بنجاح وتحسينه ل KIs8 ، إلا أن CRISPR توفر استراتيجية محسنة لتحرير الجينات مع استهداف sgRNA أبسط. استخدمت العديد من الدراسات كريسبر لتوليد KIs دقيقة في أسماك الزرد9،10،11،12،13،14،15،16،17،18،19،20 ، على الرغم من أن هذه التعديلات التي تم إنشاؤها من خلال الإصلاح الموجه بالتماثل بوساطة كريسبر (HDR) تميل إلى أن تكون غير فعالة مع نجاح جوهري منخفض المعدلات التي تتطلب التنميط الجيني كشاشة أساسية9،10،14،21. يوضح هذا الحاجة إلى نظام KI CRISPR فعال في الزرد ، بالإضافة إلى نظام موثوق عالي الإنتاجية للكشف عن التعديلات الدقيقة.
كان الهدف من هذه الدراسة هو وصف منصة لتوليد جين قلبي دقيق KI في قلوب الزرد مع اكتشاف بسيط وعالي الإنتاجية للتعديلات الناجحة. تم وصف نهج استبدال إكسون ثنائي sgRNA قائم على CRISPR-Cas9 ، والذي يعتمد على نهج TALEN8. يتضمن هذا النهج استئصال التسلسل المستهدف باستخدام دليلين من sgRNA واستبداله بتسلسل قالب خارجي يحتوي على KI محل الاهتمام بالإضافة إلى جين مراسل intronic مشفر وراثيا (الشكل 1). يتيح دمج مراسل الفلورسنت المشفر وراثيا ضمن تسلسل الجين المستهدف الكشف الفعال عن التعديلات الإيجابية. ثم يتم وصف منصة التنميط الظاهري لتقييم الوظيفة الكهربائية للقلب في يرقات الزرد للتوصيف غير الجراحي للمتغيرات الجينية المرتبطة ب LQTS الموروثة ، وهو اضطراب كهربائي في القلب يهيئ الأفراد للموت القلبي المفاجئ.
ستعزز هذه الأساليب الوصول إلى تعديلات جينات KI لسمك الزرد واستخدامها لنمذجة الأمراض الوراثية ومعالجة الأسئلة البيولوجية والفسيولوجية ، مثل رسم خرائط أنماط التعبير الجيني ، والتنظيم التنموي. نظرا لأن قلوب الزرد توازي الخصائص الكهربية للقلب البشري بشكل أفضل من نماذج الفئران ، فقد تكون جذابة بشكل خاص كنظام قابل للتتبع وراثيا لنمذجة أمراض القلب7،22،23.
تواجه هندسة التعديلات الجينية الدقيقة باستخدام CRISPR-Cas9 تحديا بسبب الكفاءة المنخفضة لآليات HDR واكتشافها الفعال. هنا ، يتم وصف نهج استبدال إكسون ثنائي sgRNA قائم على CRISPR-Cas9 ينتج تعديلات دقيقة في الزرد مع اكتشاف مرئي مباشر للتعديلات الإيجابية. يتم إثبات فعالية هذا النهج من خلال توليد تعديلات دق?…
The authors have nothing to disclose.
تم دعم هذا البحث من خلال منحة مشروع المعاهد الكندية للبحوث الصحية (T.W.C.) ومنح مجلس أبحاث العلوم الطبيعية والهندسة في كندا ديسكفري (T.W.C.).
Program | |||
CRISPOR | TEFOR Infrastructure | ||
ENSEMBL | European Bioinformatics Institute | ||
ImageJ | National Institutes of Health (NIH) | ||
Micro-Manager | Open Source (Github) | ||
NEBiocalculator | New England Biolabs (NEB) | ||
EQUIPMENT | |||
24-well Plate | VWR | ||
25 mm Petri Dish | VWR | ||
Blackfly USB3 Camera | Teledyne FLIR | ||
C1000 Thermal Cycler | Bio-Rad | ||
Centrifuge 5415C | Eppendorf | ||
EZNA Gel Extraction Kit | Omega Biotek | ||
MAXIscript T7 Transcription Kit | Invitrogen | ||
MaxQ 5000 Incubator | Barnstead Lab Line | ||
Miniprep Kit | Qiagen | ||
mMessage mMachine T7 Ultra Transcription Kit | Invitrogen | ||
ND1000 Spectrophotometer | Nanodrop | ||
PCR Purification Kit | Qiagen | ||
PLI 100A Picoinjector | Harvard Apparatus | ||
PowerPac Basic Power Supply | Bio-Rad | ||
Stemi 305 Steroscope | Zeiss | ||
Wide Mini Sub Cell GT Electrophoresis System | Bio-Rad | ||
ZebTec Zebrafish Housing System | Tecniplast | ||
SERVICES | |||
Gene Synthesis | Genewiz | ||
Sanger Sequencing | Genewiz | ||
REAGENTS | |||
10β Competent Cells | NEB | ||
10X PCR Buffer | Qiagen | ||
100 mM Nucleotide Mixture | ABM | ||
Ampicillin | Sigma | ||
BamHI Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
BsaI Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
DR274 Plasmid (XL1 Blue bacterial agar stab) | Addgene | ||
EcoRI Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
Glycerol | |||
HEPES | Sigma | ||
HindIII Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
Kanamycin | Sigma | ||
Methylene Blue | Sigma | ||
MLM3613 Plasmid (XL1 Blue bacterial agar stab) | Addgene | ||
MS-222 (Tricaine) | Sigma | ||
pKHR5 Plasmid (DH5α bacterial agar stab) | Addgene | ||
PmeI Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
SalI Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
Sodium Hydroxide | Sigma | ||
T4 Ligase w/ buffer | Sigma | ||
Taq Polymerase | Qiagen | ||
TE Buffer | Sigma | ||
Tris Hydrochloride | Sigma | ||
XhoI Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
RECIPES | |||
Solution | Component | Supplier | |
Annealing Buffer (pH 7.5-8.0) | 10 mM Tris | Sigma | |
50 mM NaCl | Sigma | ||
1 mM EDTA | Sigma | ||
E3 Media (pH 7.2) | 5 mM NaCl | Sigma | |
0.17 mM KCl | Sigma | ||
0.33 mM CaCl2 | Sigma | ||
0.33 mM MgSO4 | Sigma | ||
Injection Buffer (pH 7.5) | 20 mM HEPES | Sigma | |
150 mM KCl | Sigma |