يصف هذا البروتوكول نهجا لتسهيل التعديلات الدقيقة في أجنة الزرد باستخدام تقنية CRISPR-Cas9. يتم تقديم خط أنابيب التنميط الظاهري لإثبات قابلية تطبيق هذه التقنيات لنمذجة متغير جيني مرتبط بمتلازمة فترة QT الطويلة.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
تعديلات دقيقة بوساطة CRISPR-Cas9 في قلوب الزرد
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
تتيح التكرارات العنقودية القصيرة المتباعدة بانتظام (CRISPR) في النماذج الحيوانية التلاعب الجيني الدقيق لدراسة الظواهر الفسيولوجية. تم استخدام الزرد كنموذج وراثي فعال لدراسة العديد من الأسئلة المتعلقة بالأمراض الوراثية والتطور وعلم السموم على مستوى الأعضاء والكائنات الحية بأكملها. نظرا لجينوم سمك الزرد المشروح جيدا والمعين ، تم تطوير العديد من الأدوات لتحرير الجينات. ومع ذلك ، فإن فعالية توليد وسهولة اكتشاف التعديلات الدقيقة باستخدام كريسبر هي عامل مقيد. يوصف هنا نهج قائم على CRISPR-Cas9 مع الكشف البسيط عن التعديلات الدقيقة في الجين المسؤول عن إعادة استقطاب القلب والمرتبط بالاضطراب الكهربائي ، متلازمة فترة QT الطويلة (LQTS). هذا النهج ثنائي الدليل RNA (sgRNA) يستأصل ويحل محل التسلسل المستهدف ويربط جين مراسل مشفر وراثيا. يتم توضيح فائدة هذا النهج من خلال وصف قياسات النمط الظاهري غير الغازية للوظيفة الكهربائية للقلب في يرقات الزرد من النوع البري والمحرر جينيا. يتيح هذا النهج الدراسة الفعالة للمتغيرات المرتبطة بالمرض في كائن حي بأكمله. علاوة على ذلك ، توفر هذه الاستراتيجية إمكانيات لإدخال تسلسلات خارجية من الاختيار ، مثل جينات المراسل ، أو تقويم العظام ، أو محرري الجينات.
المقدمة
تتيح استراتيجيات تحرير الجينات القائمة على كريسبر في النماذج الحيوانية دراسة الأمراض الوراثية وراثيا وتطورها وعلم السموم على مستوى الكائن الحي بأكمله1،2،3. يوفر الزرد نموذجا قويا أقرب في العديد من الجوانب الفسيولوجية للبشر من الفئران أو نماذج الخلايا المشتقة من الإنسان4. تم استخدام مجموعة واسعة من الأدوات والاستراتيجيات الجينية في الزرد لكل من الفحص الجيني الأمامي5 والعكسي6. سهلت الخرائط الجينية الشاملة والتعليقات التوضيحية في أسماك الزرد نهج تحرير الجينات كتقنية أولية لهندسة الضربات....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
أجريت الدراسات باستخدام الزرد بالاتفاق مع سياسات وإجراءات لجنة رعاية الحيوان بجامعة سيمون فريزر والمجلس الكندي لرعاية الحيوان وتم الانتهاء منها بموجب البروتوكول # 1264K-18.
1. تصميم مكونات كريسبر لإجراء تعديلات دقيقة
- لتصميم أدلة sgRNA ثنائية التي سيتم استخدامها لاستئصال التسلسل الذي يحتوي على موقع هدف KI ، حدد أولا أورثولوج الزرد للجين محل الاهتمام.
ملاحظة: يقدم الشكل 2 نظرة عامة موجزة عن خطوات هندسة عمليات التحرير الدقيقة باستخدام نهج sgRNA CRISPR-Cas9. - بعد ذلك ، استخدم أداة برمجية للتصميم ، مثل CRISPOR24 ، والتي تتضمن اختيار Danio rerio ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
يتم تسليط الضوء على الاستخدام الناجح لنهج كريسون البديل ثنائي الحمض النووي الريبي من خلال الإدخال والكشف البسيط عن تحرير دقيق لهندسة المتغير المرتبط ب LQTS ، R56Q ، في جين zkcnh6a في الزرد. يوضح الشكل 6 3 يرقات تمثيلية من ألياف الحافظة المحقونة في مرحلة الجنين أحادي الخلية بمكونات كريسبر كما هو موضح أعلاه. يوضح الشكل 6A وجود التعبير الجيني لمراسل YFP mVenus في عدسة العين كمراسل إيجابي لتكامل القالب الناجح. يوضح الشكل 6B ، <.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
تواجه هندسة التعديلات الجينية الدقيقة باستخدام CRISPR-Cas9 تحديا بسبب الكفاءة المنخفضة لآليات HDR واكتشافها الفعال. هنا ، يتم وصف نهج استبدال إكسون ثنائي sgRNA قائم على CRISPR-Cas9 ينتج تعديلات دقيقة في الزرد مع اكتشاف مرئي مباشر للتعديلات الإيجابية. يتم إثبات فعالية هذا النهج من خلال توليد تعديلات دقيقة في جين zkcnh6a . توضح هذه الورقة كيف يمكن تقييم وظيفة القلب في يرقات الزرد المعدلة جينيا باستخدام مقاييس النمط الظاهري غير الغازية لمعدل ضربات القلب وأبعاد التامور ومورفولوجيا تخطيط القلب. يمكن إكمال هذا النهج ،.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.
شكر وتقدير
تم دعم هذا البحث من خلال منحة مشروع المعاهد الكندية للبحوث الصحية (T.W.C.) ومنح مجلس أبحاث العلوم الطبيعية والهندسة في كندا ديسكفري (T.W.C.).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| <قوي>البرنامج | |||
| CRISPOR | TEFOR Infrastructure | ||
| ENSEMBL | المعهد | ||
| ImageJ | المعاهد الوطنية للصحة (NIH) | ||
| Micro-Manager | مفتوح المصدر (Github) | ||
| NEBiocalculator | نيو إنجلاند Biolabs (NEB) | ||
| < قوي > المعدات < / قوي > | |||
| 24 بئر لوحة | VWR | ||
| 25 مم طبق بتري | VWR | ||
| Blackfly USB3 كاميرا | Teledyne FLIR | ||
| C1000 Thermal Cycler | Bio-Rad | ||
| الطرد المركزي 5415C | Eppendorf | ||
| طقم استخراج جل EZNA | أوميغا Biotek | ||
| MAXIscript T7 طقم النسخ | Invitrogen | ||
| MaxQ 5000 حاضنة | Barnstead Lab Line | ||
| Miniprep | Kit Qiagen | ||
| mMessage mMachine T7 Ultra Transcription Kit | Invitrogen | ||
| ND1000 Spectrophotometer | |||
| PCR | Qiagen | ||
| PLI 100A Picoinjector | جهاز هارفارد | ||
| PowerPac امدادات الطاقة الأساسية | Bio-Rad | ||
| Stemi 305 Steroscope | Zeiss | ||
| Wide Sub Cell GT نظام الرحلان الكهربائي | Bio-Rad | ||
| ZebTec Zebrafish الإسكان نظام | Tecniplast | ||
| SERVICES | |||
| Gene Synthesis | Genewiz | ||
| Sanger Sequencing | Genewiz | ||
| REAGENTS | |||
| 10β الخلايا المختصة | NEB | ||
| 10X PCR Buffer | Qiagen | ||
| 100 mM خليط النيوكليوتيدات | ABM | ||
| Ampicillin | Sigma | ||
| BamHI Endonuclease w / buffer | NEB | ||
| BsaI Endonuclease w / buffer | NEB | ||
| DR274 Plasmid (XL1 طعنة أجار البكتيرية الزرقاء) | Addgene | ||
| EcoRI Endonuclease مع المخزن المؤقت | NEB | ||
| Glycerol | |||
| HEPES | Sigma | ||
| HindIII Endonuclease w / buffer | NEB | ||
| Kanamycin | Sigma | ||
| Methylene Blue | Sigma | ||
| MLM3613 Plasmid (XL1 Blue طعنة أجار البكتيرية) | Addgene | ||
| MS-222 (Tricaine) | Sigma | ||
| pKHR5 Plasmid (DH5 & alpha ، طعنة أجار بكتيرية) | Addgene | ||
| PmeI Endonuclease w / buffer | NEB | ||
| Sali Endonuclease w / buffer | NEB | ||
| هيدروكسيد الصوديوم | Sigma | ||
| T4 Ligase ث / العازلة | Sigma | ||
| Taq Polymerase | Qiagen | ||
| TE Buffer | Sigma | ||
| Tris Hydrochloride | Sigma | ||
| XhoI Endonuclease w / buffer | NEB | ||
| RECIPES< / strong> | |||
| Solution | Component Supplier | ||
| المخزن المؤقت للتلدين (الرقم الهيدروجيني 7.5-8.0) | 10 ملي مولار تريس | سيجما | |
| 50 ملي كلوريد الصوديوم | سيجما | ||
| 1 ملي مولار EDTA | سيجما | ||
| E3 الوسائط (درجة الحموضة 7.2) | 5 ملي كلوريد الصوديوم | سيجما | |
| 0.17 ملي مولار KCl | سيجما | ||
| 0.33 ملي مولار كالوريد < الفرعي >2< / فرعي > | سيجما | ||
| 0.33 ملي مولار MgSO4< / sub> | Sigma | ||
| Injection Buffer (درجة الحموضة 7.5) | 20 ملي مولار HEPES | Sigma | |
| 150 ملي مولار KCl | Sigma |
المراجع
- Zarei, A., Razban, V., Hosseini, S. E., Tabei, S. M. B. Creating cell and animal models of human disease by genome editing using CRISPR/Cas9. The Journal of Gene Medicine. 21 (4), 3082(2019).
- Lee, H., Yoon, D. E., Kim, K. Genome editing methods in animal models.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
