פרוטוקול זה מתאר גישה המאפשרת עריכות מדויקות של דגי זברה באמצעות טכנולוגיית CRISPR-Cas9. צינור פנוטיפ מוצג כדי להדגים את הישימות של טכניקות אלה כדי לדגום וריאנט גן הקשור לתסמונת QT ארוכה.
חזרות פלינדרומיות קצרות (CRISPR) מקובצות באופן קבוע במודלים של בעלי חיים מאפשרות מניפולציה גנטית מדויקת לחקר תופעות פיזיולוגיות. דגי זברה שימשו כמודל גנטי יעיל לחקר שאלות רבות הקשורות למחלות תורשתיות, התפתחות וטוקסיקולוגיה ברמת האיברים והאורגניזמים. הודות לגנום של דגי הזברה המבוארים והממופים היטב, פותחו כלים רבים לעריכת גנים. עם זאת, היעילות של יצירה וקלות של זיהוי עריכות מדויקות באמצעות קריספר היא גורם מגביל. המתוארת כאן היא גישת knock-in מבוססת CRISPR-Cas9 עם זיהוי פשוט של עריכות מדויקות בגן האחראי על רה-פולריזציה של הלב וקשור להפרעה החשמלית, תסמונת Long QT (LQTS). גישת RNA (sgRNA) דו-מנחה זו מכניסה ומחליפה את רצף המטרה ומקשרת בין גן מדווח המקודד גנטית. התועלת של גישה זו מודגמת על ידי תיאור מדידות פנוטיפיות לא פולשניות של תפקוד חשמלי לבבי בזחלים מסוג בר ודגי זברה שעברו עריכה גנטית. גישה זו מאפשרת מחקר יעיל של גרסאות הקשורות למחלות באורגניזם שלם. יתר על כן, אסטרטגיה זו מציעה אפשרויות להחדרת רצפים אקסוגניים של בחירה, כגון גנים מדווחים, אורתולוגים או עורכי גנים.
אסטרטגיות עריכת גנים מבוססות קריספר במודלים של בעלי חיים מאפשרות לחקור מחלות, התפתחות וטוקסיקולוגיה תורשתיות גנטית ברמת האורגניזם השלם 1,2,3. דגי זברה מספקים מודל רב עוצמה הקרוב יותר בהיבטים פיזיולוגיים רבים לבני אדם מאשר מודלים של תאים שמקורם בבני אדם4. מגוון רחב של כלים ואסטרטגיות גנטיות שימשו בדגי זברה הן לבדיקה גנטית קדימה5 והן לבדיקה גנטית הפוכה6. מיפוי גנטי מקיף וביאור בדגי זברה סייעו לגישות לעריכת גנים כטכניקה עיקרית להנדסת נוקאאוטים של גנים ממוקדים (KOs) ודפיקות מדויקות (KIs)7.
למרות זאת, יצירת עריכות KI מדויקות בדגי זברה מוגבלת על ידי יעילות נמוכה והקושי בזיהוי מדויק. למרות שנוקלאזות משפיעות דמויות גורם שעתוק (TALENs) שימשו בהצלחה ואופטימיזציה עבור KIs8, קריספר מספק אסטרטגיית עריכת גנים משופרת עם מיקוד sgRNA פשוט יותר. מחקרים רבים השתמשו בקריספר כדי ליצור KIs מדויקים בדגי זברה 9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20, אם כי עריכות אלה שנוצרו באמצעות תיקון מכוון הומולוגיה בתיווך קריספר (HDR) נוטות להיות לא יעילות עם הצלחה פנימית נמוכה שיעורים הדורשים גנוטיפ כמסך ראשי 9,10,14,21. זה מדגים את הצורך במערכת KI CRISPR יעילה בדגי זברה, כמו גם במערכת אמינה בעלת תפוקה גבוהה לאיתור עריכות מדויקות.
מטרת המחקר הייתה לתאר פלטפורמה ליצירת גן לב מדויק KI בלבבות דגי זברה עם זיהוי פשוט ותפוקה גבוהה של עריכות מוצלחות. מתוארת גישת החלפת אקסון דו-sgRNA מבוססת CRISPR-Cas9, המבוססת על גישת TALEN8. גישה זו כוללת כריתה של רצף המטרה באמצעות מדריכי שני sgRNA והחלפה ברצף תבניות אקסוגני המכיל את ה-KI המעניין וכן גן כתב פנימי מקודד גנטית (איור 1). השילוב של כתב פלואורסצנטי מקודד גנטית בתוך הרצף הפנימי של גן המטרה מאפשר זיהוי יעיל של עריכות חיוביות. לאחר מכן מתוארת פלטפורמה פנוטיפית להערכת התפקוד החשמלי של הלב בזחלים של דגי זברה לצורך אפיון לא פולשני של גרסאות הגנים הקשורות ל-LQTS תורשתי, הפרעה חשמלית לבבית הגורמת לאנשים למוות לבבי פתאומי.
גישות אלה ישפרו את הגישה והשימוש בעריכות גנים של דגי זברה KI כדי ליצור מודלים של מחלות תורשתיות ולתת מענה לשאלות ביולוגיות ופיזיולוגיות, כגון מיפוי דפוסי ביטוי גנים וויסות התפתחותי. מאחר שלבבות דגי זברה מקבילים טוב יותר למאפיינים אלקטרופיזיולוגיים של הלב האנושי מאשר מודלים של מורין, הם עשויים להיות אטרקטיביים במיוחד כמערכת הניתנת למתיחה גנטית עבור מודלים של מחלות לב 7,22,23.
ההנדסה של עריכות גנים מדויקות באמצעות CRISPR-Cas9 מאותגרת על ידי היעילות הנמוכה של מנגנוני HDR והזיהוי היעיל שלהם. כאן מתוארת גישה להחלפת אקסון דו-sgRNA המבוססת על CRISPR-Cas9 שמייצרת עריכות מדויקות בדגי זברה עם זיהוי חזותי פשוט של עריכות חיוביות. היעילות של גישה זו מודגמת על ידי יצירת עריכות מדויקות בג…
The authors have nothing to disclose.
מחקר זה נתמך על ידי מענק פרויקט מחקר של המכונים הקנדיים לבריאות (T.W.C.) ומענקי תגלית של המועצה למחקר מדעי הטבע וההנדסה של קנדה (T.W.C.).
Program | |||
CRISPOR | TEFOR Infrastructure | ||
ENSEMBL | European Bioinformatics Institute | ||
ImageJ | National Institutes of Health (NIH) | ||
Micro-Manager | Open Source (Github) | ||
NEBiocalculator | New England Biolabs (NEB) | ||
EQUIPMENT | |||
24-well Plate | VWR | ||
25 mm Petri Dish | VWR | ||
Blackfly USB3 Camera | Teledyne FLIR | ||
C1000 Thermal Cycler | Bio-Rad | ||
Centrifuge 5415C | Eppendorf | ||
EZNA Gel Extraction Kit | Omega Biotek | ||
MAXIscript T7 Transcription Kit | Invitrogen | ||
MaxQ 5000 Incubator | Barnstead Lab Line | ||
Miniprep Kit | Qiagen | ||
mMessage mMachine T7 Ultra Transcription Kit | Invitrogen | ||
ND1000 Spectrophotometer | Nanodrop | ||
PCR Purification Kit | Qiagen | ||
PLI 100A Picoinjector | Harvard Apparatus | ||
PowerPac Basic Power Supply | Bio-Rad | ||
Stemi 305 Steroscope | Zeiss | ||
Wide Mini Sub Cell GT Electrophoresis System | Bio-Rad | ||
ZebTec Zebrafish Housing System | Tecniplast | ||
SERVICES | |||
Gene Synthesis | Genewiz | ||
Sanger Sequencing | Genewiz | ||
REAGENTS | |||
10β Competent Cells | NEB | ||
10X PCR Buffer | Qiagen | ||
100 mM Nucleotide Mixture | ABM | ||
Ampicillin | Sigma | ||
BamHI Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
BsaI Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
DR274 Plasmid (XL1 Blue bacterial agar stab) | Addgene | ||
EcoRI Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
Glycerol | |||
HEPES | Sigma | ||
HindIII Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
Kanamycin | Sigma | ||
Methylene Blue | Sigma | ||
MLM3613 Plasmid (XL1 Blue bacterial agar stab) | Addgene | ||
MS-222 (Tricaine) | Sigma | ||
pKHR5 Plasmid (DH5α bacterial agar stab) | Addgene | ||
PmeI Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
SalI Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
Sodium Hydroxide | Sigma | ||
T4 Ligase w/ buffer | Sigma | ||
Taq Polymerase | Qiagen | ||
TE Buffer | Sigma | ||
Tris Hydrochloride | Sigma | ||
XhoI Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
RECIPES | |||
Solution | Component | Supplier | |
Annealing Buffer (pH 7.5-8.0) | 10 mM Tris | Sigma | |
50 mM NaCl | Sigma | ||
1 mM EDTA | Sigma | ||
E3 Media (pH 7.2) | 5 mM NaCl | Sigma | |
0.17 mM KCl | Sigma | ||
0.33 mM CaCl2 | Sigma | ||
0.33 mM MgSO4 | Sigma | ||
Injection Buffer (pH 7.5) | 20 mM HEPES | Sigma | |
150 mM KCl | Sigma |