Summary
Dit protocol beschrijft een aanpak om nauwkeurige knock-in bewerkingen in zebravisembryo's te vergemakkelijken met behulp van CRISPR-Cas9-technologie. Een fenotyperingspijplijn wordt gepresenteerd om de toepasbaarheid van deze technieken aan te tonen om een long QT-syndroom-geassocieerde genvariant te modelleren.
Abstract
Geclusterde regelmatig tussen elkaar geplaatste korte palindromische herhalingen (CRISPR) in diermodellen maken nauwkeurige genetische manipulatie mogelijk voor de studie van fysiologische verschijnselen. Zebravissen zijn gebruikt als een effectief genetisch model om tal van vragen met betrekking tot erfelijke ziekten, ontwikkeling en toxicologie op het niveau van het hele orgaan en het organisme te bestuderen. Vanwege het goed geannoteerde en in kaart gebrachte zebravisgenoom zijn er talloze hulpmiddelen voor genbewerking ontwikkeld. De effectiviteit van het genereren en het gemak van het detecteren van nauwkeurige knock-in bewerkingen met CRISPR is echter een beperkende factor. Hier beschreven is een CRISPR-Cas9-gebaseerde knock-in benadering met de eenvoudige detectie van nauwkeurige bewerkingen in een gen dat verantwoordelijk is voor cardiale repolarisatie en geassocieerd met de elektrische aandoening, Long QT Syndrome (LQTS). Deze twee-single-guide RNA (sgRNA) benadering snijdt en vervangt de doelsequentie en koppelt een genetisch gecodeerd reporter-gen. Het nut van deze aanpak wordt aangetoond door het beschrijven van niet-invasieve fenotypische metingen van de cardiale elektrische functie in wildtype en gen-bewerkte zebravislarven. Deze aanpak maakt een efficiënte studie van ziekte-geassocieerde varianten in een heel organisme mogelijk. Bovendien biedt deze strategie mogelijkheden voor het invoegen van exogene sequenties naar keuze, zoals reportergenen, orthologen of geneditors.
Introduction
Crispr-gebaseerde genbewerkingsstrategieën in diermodellen maken de studie van genetisch erfelijke ziekten, ontwikkeling en toxicologie op het niveau van het hele organismemogelijk 1,2,3. Zebravissen bieden een krachtig model dat in tal van fysiologische aspecten dichter bij de mens staat dan muizen- of van de mens afgeleide celmodellen4. Een uitgebreid scala aan genetische hulpmiddelen en strategieën is gebruikt in zebravissen voor zowel voorwaartse5 als omgekeerde genetische screening6. Uitgebreide genetische mapping en annotatie in zebravissen hebben genbewerkingsbenaderingen vergemakkelijkt als een primaire techniek om gerichte gen knock-outs (KO's) en precieze knock-ins (KPI's) te engineeren7.
Desondanks wordt het genereren van nauwkeurige KI-bewerkingen in zebravissen beperkt door lage efficiënties en de moeilijkheidsgraad van nauwkeurige detectie. Hoewel transcriptiefactorachtige effectornucleasen (TALENs) met succes zijn gebruikt en geoptimaliseerd voor KPI's8, biedt CRISPR een verbeterde genbewerkingsstrategie met eenvoudigere sgRNA-targeting. Talrijke studies hebben CRISPR gebruikt om precieze KPI's te genereren in zebravissen 9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20, hoewel deze bewerkingen gegenereerd door CRISPR-gemedieerde homologie-gerichte reparatie (HDR) meestal inefficiënt zijn met een laag intrinsiek succes tarieven die genotypering als primair scherm vereisen 9,10,14,21. Dit toont de behoefte aan een efficiënt KI CRISPR-systeem in zebravissen, evenals een betrouwbaar high-throughput systeem voor het detecteren van nauwkeurige bewerkingen.
Het doel van deze studie was om een platform te beschrijven voor het genereren van een nauwkeurig hartgen KI in zebravisharten met eenvoudige en high-throughput detectie van succesvolle bewerkingen. Er wordt een CRISPR-Cas9-gebaseerde twee-sgRNA exonvervangingsbenadering beschreven, die gebaseerd is op een TALEN-benadering8. Deze benadering omvat excisie van de doelsequentie met behulp van twee-sgRNA-geleiders en vervanging door een exogene sjabloonsequentie die de KI van belang bevat, evenals een genetisch gecodeerd intronisch reportergen (figuur 1). De integratie van een genetisch gecodeerde fluorescerende reporter in de intronische sequentie van het doelgen maakt de efficiënte detectie van positieve bewerkingen mogelijk. Een fenotyperingsplatform wordt vervolgens beschreven voor het beoordelen van de cardiale elektrische functie in zebravislarven voor niet-invasieve karakterisering van de genvarianten geassocieerd met erfelijke LQTS, een cardiale elektrische aandoening die individuen vatbaar maakt voor plotselinge hartdood.
Deze benaderingen zullen de toegang tot en het gebruik van zebravis KI-genbewerkingen verbeteren om erfelijke ziekten te modelleren en biologische en fysiologische vragen aan te pakken, zoals het in kaart brengen van genexpressiepatronen en ontwikkelingsregulatie. Omdat zebravisharten beter parallelle menselijke cardiale elektrofysiologische kenmerken hebben dan muizenmodellen, kunnen ze bijzonder aantrekkelijk zijn als een genetisch hanteerbaar systeem voor hartaandoeningen met 7,22,23.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Studies met zebravissen werden uitgevoerd in overeenstemming met het beleid en de procedures van het Simon Fraser University Animal Care Committee en de Canadian Council of Animal Care en werden voltooid onder protocol # 1264K-18.
1. Ontwerp van CRISPR-componenten voor nauwkeurige bewerkingen
- Om de twee-sgRNA-gidsen te ontwerpen die zullen worden gebruikt om de sequentie met de KI-doellocatie te verwijderen, identificeert u eerst de zebravisorthoplog voor het gen van belang.
OPMERKING: Figuur 2 geeft een overzicht van de stappen voor het ontwerpen van nauwkeurige bewerkingen met behulp van de crispr-cas9-benadering met twee sgRNA's. - Gebruik vervolgens een ontwerpsoftwaretool, zoals CRISPOR24, die selectie voor Danio rerio als soort en van het te gebruiken Cas-enzym omvat.
OPMERKING: Het gen van belang voor deze studie was zkcnh6a (Ensembl Transcript ID: ENSDART00000090809.6; UniProt Protein ID: B3DJX4), en de doelmutatie was aminozuur, R56Q.- Kies voor de twee-sgRNA-benadering één sgRNA-locatie die voorafgaat aan het doelexon en een tweede sgRNA dat zich in het onmiddellijke downstream-intron bevindt.
- Zorg ervoor dat de geselecteerde sgRNA's een hoge specificiteit en een lage voorspelde off-target binding hebben. Gebruik CRISPOR-classificaties om hulplijnen te identificeren met minimale off-target binding. Overweeg geen gidsen zonder mismatches in de zaadvolgorde van potentiële off-targets.
- Identificeer de meest waarschijnlijke potentiële off-target sites (op basis van CRISPOR-scores, selecteer de top drie exon potentiële off-target sites) voor PCR-gebaseerde Sanger sequencing genotypering in stap 6.1.3.
- Zodra de twee-sgRNA's zijn geselecteerd, verkrijgt u het omgekeerde complement voor elk, zodat er vier oligonucleotiden moeten worden gebruikt: twee complementaire oligo's die aan de mutatie voorafgaan en twee complementaire oligo's die downstream zijn.
- Voeg op elk van de vier oligo's compatibele beperkingsplaatsen toe voor opname in een geleidingsplasmide naar keuze; voor integratie in het DR274 plasmide, gebruik een 5 'BsaI-beperkingssite om een overhang te creëren. Zorg ervoor dat de Bsa1-herkenningslocatie is ontworpen aan het 5'-uiteinde van de gids die is geselecteerd uit CRISPOR en dat de Bsa1-herkenningslocatie is ontworpen aan het 5'-uiteinde van de complementaire strengen om de juiste oriëntatie van de geleiders in het DR274-plasmide te garanderen (zie figuur 3).
- Om de exogene sjabloon te ontwerpen die wordt gebruikt voor HDR in zebravissen (figuur 1), kiest u twee sequentiefragmenten die het mVenus YFP-reportergen flankeren dat is ondergebracht in het pKHR5-plasmide.
OPMERKING: De beoogde wijziging/bewerking kan worden opgenomen in het upstream- of downstreamfragment.- Lokaliseer met Ensembl de doellocatie binnen de gensequentie van belang, inclusief ongeveer de flankerende sequentie van 2 kb (homologiearm), die zal worden gebruikt om de sjabloon te maken.
OPMERKING: Homologiearmen kunnen symmetrisch of asymmetrisch zijn25,26 en ongeveer 1 kb elk, stroomopwaarts en stroomafwaarts van de doellocatie. - Verdeel de sjabloon in twee segmenten die aan weerszijden van het mVenus YFP-reportergen worden ingevoegd (zie figuur 4). Zorg ervoor dat de gesplitste site zich in een intron bevindt, zodat de coderingsvolgorde niet wordt onderbroken.
OPMERKING: Als het gen goed gekarakteriseerd is, controleer dan op functionele rollen in het intron, zoals splicingplaatsen of regulerende regio's. Gebieden dicht bij de 5' of 3' uiteinden zijn vaker betrokken bij mRNA-splicing. - Wijzigingen in de sjabloonsequentie opnemen die i) stille mutaties in het guide protospacer adjacent motif (PAM) of zaadsequentie omvatten (wees je bewust van alternatieve PAM-sites waarop het Cas-enzym zich zou kunnen richten) om cas-enzymhersnijding te voorkomen; ii) de wijziging van de rente; iii) het creëren van restrictie-endonucleaseplaatsen om het klonen in het pKHR5-plasmide, dat het mVenus YFP-reportergen bevat, te vergemakkelijken (zie figuur 3).
OPMERKING: In deze studie bevatte het eerste sjabloonsegment XhoI stroomopwaarts van de R56Q-mutatieplaats en SalI downstream, terwijl het tweede sjabloonsegment EcoRI stroomopwaarts van de gidsdoelsequentie en BamHI stroomafwaarts had. Als een van de geselecteerde beperkingssites aanwezig is in de sjabloonvolgorde, zijn mutaties vereist om deze te dempen of kunnen alternatieve benaderingen zoals Gibson Assembly worden gebruikt.
- Lokaliseer met Ensembl de doellocatie binnen de gensequentie van belang, inclusief ongeveer de flankerende sequentie van 2 kb (homologiearm), die zal worden gebruikt om de sjabloon te maken.
2. Voorbereiding van CRISPR-componenten voor micro-injectie van embryo's
- Bereid de Cas9 1 week voor de micro-injecties voor op micro-injecties. Gebruik Cas9-eiwit of bereid Cas9-mRNA via in vitro transcriptie.
OPMERKING: In deze studie werd Cas9-mRNA gebruikt, omdat de efficiëntie meestal hoger was.- Versterk bacterieculturen van in de handel verkrijgbare XL1 Blue bacteriële agar-steek (die Cas9-plasmide bevat) met behulp van een geschikt antibioticum zoals ampicilline. Gebruik 675 μL vloeistofkweek (met 325 μL glycerol) om een back-up glycerolvoorraad te maken voor langdurige opslag bij −80 °C.
- Gebruik de rest van de vloeibare cultuur voor een miniprep-zuivering, volgens het protocol dat bij de miniprep-kit wordt geleverd. Resuspendeer het uiteindelijke gezuiverde DNA in 50 μL van de verstrekte elutiebuffer. Kwantificeer het product via een spectrofotometer om de opbrengst en zuiverheid te onderzoeken.
- Lineariseer 2 μg van het gezuiverde DNA via restrictievergisting met behulp van een geschikt restrictie-enzym en gebruik de juiste buffer en incubatietijd zoals vermeld voor het enzym van belang.
- Zuiver het gelineariseerde plasmide met behulp van een PCR-zuiveringskit en resuspendeer het in 30 μL van de meegeleverde elutiebuffer.
- Nadat u het product hebt gekwantificeerd, gebruikt u dit als een sjabloon voor in vitro transcriptie met behulp van de juiste transcriptiekit voor de promotor van belang. Volg het meegeleverde protocol en zuiver via lithiumchlorideprecipitatie27. Resuspensie het gezuiverde RNA in 10 μL nucleasevrij H2O en kwantificeer het voordat het wordt bewaard bij −20 °C voor gebruik in het micro-injectiemengsel.
- Bereid de twee sgRNA-gidsen voor.
- Bereid het sgRNA-plasmide met een steiger door bacterieculturen van de in de handel verkrijgbare XL1 Blue bacterial agar stab (zie materiaaltabel voor details) op dezelfde manier te versterken als MLM3613 hierboven (stap 2.1.1), behalve kanamycine gebruiken in plaats van ampicilline.
- Annealiseer de twee paren complementaire enkelstrengs oligonucleotiden (ssODN's) voor de hierboven ontworpen sgRNA-geleiders door de ssODN's eerst in 1x gloeibuffer te resuspenderen tot een concentratie van 100 μM.
- In afzonderlijke reacties voor elk van de twee sgRNA's gloei het paar complementaire ssODN's met behulp van een thermische cycler. Meng 2 μg van elk complementair ssODN-paar met 50 μL gloeibuffer en incubeer bij 95 °C gedurende 2 minuten en koel vervolgens af tot 25 °C gedurende 45 minuten.
- Verwerk een in de handel verkrijgbaar plasmide dat een gRNA-steiger bevat. Vergist 2 μg van het DR274-plasmide met 1 μL BsaI, 2 μL geschikte buffer en ddH2O tot 20 μL bij 37 °C gedurende 1 uur. Bevestig linearisatie (optioneel: zuiveren met een PCR-zuiveringskit) met behulp van gel-elektroforese28.
- In twee afzonderlijke ligatiereacties (één voor elk sgRNA) ligateeren de gegloeide ssODN's met het gelineariseerde DR274-plasmide. Gebruik een molaire insert:vectorverhouding van 3:1 en bereken de juiste massa via een online ligatiecalculator. Meng de vereiste massa van de insert en vector met 1 μL T4 DNA-ligase, 2 μL ligatiebuffer en ddH2O tot 12 μL en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 12 uur.
- Transformeer 2 μL van het geligeerde product in geschikte competente cellen (zoals 10β-cellen) met behulp van standaardbenaderingen en versterk en zuiver het product vervolgens met behulp van een in de handel verkrijgbare Miniprep Kit. Optioneel: maak een glycerolvoorraad van dit product aan.
- Transcribeer de twee sgRNA's door 2 μg van elke geleider te lineariseren met behulp van een 3'-stroomafwaartse beperkingsplaats die zo dicht mogelijk bij het einde van de ruimtesequentie ligt. Voor het DR274-plasmide, lineariseren met HindIII en vervolgens het RNA-sjabloon zuiveren met behulp van een PCR-zuiveringskit, resuspendatie in 30 μL van de elutiebuffer.
- Transcribeer de twee gidsen met behulp van een RNA-transcriptiekit. Volg het protocol van de fabrikant en zuiver via lithiumchlorideprecipitatie27. Resuspendeer de twee gezuiverde sgRNA-geleiders in 10 μL nucleasevrij H2O, kwantificeer en bewaar bij −20 °C voor gebruik in het micro-injectiemengsel.
OPMERKING: De RNA-transcriptiekit kan geen 5'-dop of poly-A-staart bevatten.
- Bereid de dubbelstrengs, exogene HDR-reportersjabloon voor.
OPMERKING: De sjabloon is gesynthetiseerd in twee delen, een stroomopwaarts en een stroomafwaarts van het mVenus YFP-reportergen. Deze twee segmenten zijn synthetische constructies die via een commerciële leverancier worden besteld en vervolgens achtereenvolgens in de pKHR5 (die mVenus YFP bevat) plasmide worden geligeerd.- Bereid het pKHR5-plasmide door bacterieculturen van de in de handel verkrijgbare DH5α-bacteriestam te versterken (zie materiaaltabel voor details) op dezelfde manier als MLM3613 hierboven (stap 2.1.1).
OPMERKING: Het pKHR5-plasmide bevat de mVenus YFP reporter-gensequentie. - Resuspensie de twee hierboven ontworpen sjabloonsegmenten tot 100 μM in TE-buffer en transformeer vervolgens in 10β-cellen.
- Verwerk het eerste sjabloonsegment (het segment stroomopwaarts van het mVenus YFP-reportergen) en het pKHR5-plasmide met behulp van de restrictie-enzymen die zijn geselecteerd in stap 1.3.3.
OPMERKING: Sequentiële samenvatting van pKHR5 is noodzakelijk vanwege de nabijheid van de geselecteerde beperkingslocaties in het MCS. - Om het pKHR5-plasmide voor te bereiden op het upstream-sjabloonsegment, vergist u 4 μg pKHR5 (volgens stap 2.2.4) met SalI en zuivert u vervolgens met behulp van een PCR-zuiveringskit. Resuspendeer in 30 μL ddH2O en gebruik dit als sjabloon voor de tweede verteringsreactie met XhoI. Zuiver het product met behulp van de PCR Purification Kit.
- Bereid het eerste sjabloonsegment voor door 2 μg van het sjabloonsegment (stap 2.3.2), 1 μL XhoI, 1 μL SalI, 2 μL geschikte buffer en ddH 2 O tot20μL gedurende 1 uur bij 37 °C te verteren en het product te zuiveren.
- Liteer het upstream template segment van stap 2.3.5 in de voorbereide pKHR5 met behulp van de reactieomstandigheden beschreven in stap 2.2.5. Transformeer het geligeerde product in competente 10β-cellen, versterk en zuiver met behulp van een miniprep (optioneel: maak een glycerolvoorraad van dit product).
- Gebruik het geligeerde product uit stap 2.3.6 (dat het eerste sjabloonsegment bevat dat is geligeerd in pKHR5-plasmide stroomopwaarts van het mVenus YFP-reportergen) en verteer om u voor te bereiden op het tweede (stroomafwaarts van de mVenus-reporter) sjabloonsegment. Vergist 4 μg van het geligeerde product (uit stap 2.3.6, zoals in stap 2.2.4) met BamHI en zuiver vervolgens met behulp van een PCR-zuiveringskit. Resuspendeer in 30 μL ddH2O en gebruik dit als sjabloon voor de tweede digestieve reactie met EcoRI. Zuiver het product met behulp van de PCR Purification Kit.
- Bereid het tweede sjabloonsegment voor door 2 μg van het sjabloonsegment (stap 2.3.2), 1 μL BamHI, 1 μL EcoRI, 2 μL geschikte buffer en ddH 2 O tot20μL gedurende 1 uur bij 37 °C te verteren en het product te zuiveren.
- Liteer het downstream template segment in de voorbereide pKHR5 (vanaf stap 2.3.7) met behulp van de reactieomstandigheden beschreven in stap 2.2.5. Transformeer het geligeerde product in competente cellen, versterk en zuiver met behulp van een miniprep-kit. Maak een glycerolvoorraad van dit eindproduct, die beide sjabloonsegmenten bevat die aan weerszijden van het mVenus YFP-reportergen binnen pKHR5 zijn geligeerd.
- Bereid het pKHR5-plasmide door bacterieculturen van de in de handel verkrijgbare DH5α-bacteriestam te versterken (zie materiaaltabel voor details) op dezelfde manier als MLM3613 hierboven (stap 2.1.1).
- Bereid de micro-injectiemix voor met behulp van cas9-mRNA, twee sgRNA's en de exogene HDR-reportersjabloon.
- Meng 200 ng/μL Cas9 mRNA, 100 ng/μL van elk sgRNA en 200 ng/μL exogene HDR reporter template in 1x injectiebuffer tot een eindvolume van 20 μL.
- Bewaar het micro-injectiemengsel bij −20 °C en gooi het ongebruikte mengsel na drie vries-dooicycli weg.
OPMERKING: Gebruik 4 nL van deze micro-injectiemix voor micro-injectie in de dooierzak van elk embryo.
3. Fokken van zebravissen en embryo-micro-injectie
OPMERKING: Protocollen voor het fokken van zebravissen en de micro-injectie van eencellige embryo's zijn eerder beschreven 29,30,31.
- Gebruik voor het fokken zebravissen van de AB-stam en die 6-12 maanden oud zijn. Injecteer de embryo's in het eencellige stadium ongeveer 40 minuten na de bevruchting (zie figuur 5).
OPMERKING: Het biologische geslacht van de geïnjecteerde embryo's was niet bekend; seksueel dimorfisme is niet duidelijk tot ongeveer 3 maanden oud32 jaar.
4. Reporter gen screening van CRISPR-Cas9-bewerkte larvale zebravis
- Visualiseer YFP-integratie in zebravislarven na de microinjectie van CRISPR-Cas9-componenten om te screenen voor succesvolle HDR-bewerkingen.
- Verdoof in een petrischaaltje van 25 mm 24 zebravislarven 3 dagen na de bevruchting (dpf) in 0,3% tricaïnehaansulfonaat (MS-222, gebufferd tot pH 7,0-7,4 met HEPES en natriumhydroxide) totdat ze hun zelfrichtende reflex verliezen (meestal 1-2 min). Eenmaal verdoofd, breng elke larve over in een individuele put van een 24-well plaat.
- Met behulp van een microscoop die GFP / YFP kan detecteren, screent u op reporter-genfluorescentie in de ogen van elke individuele larve.
- Leg beelden vast van elke larve en documenteer de aan- of afwezigheid van reporter-genexpressie.
5. Fenotypering van CRISPR-Cas9-bewerkte larvale zebravis
- Voer na screening van het reportergen cardiale fenotypering (hartslag, pericardiale dimensies, ECG) uit op elke larve. Fenotype een gelijk aantal reporter gen-positieve en -negatieve larven.
- Gebruik een CCD-camera (bijv. Blackfly USB3) en video- en beeldopnamesoftware (bijv. Micromanager voor ImageJ) om de hartslag en pericardafmetingen te meten terwijl de larven worden verdoofd.
- Om de hartslag te meten, met behulp van Micromanager, creëer je een regio van belang (ROI) om het hart te vangen en andere structuren uit te sluiten.
- Importeer de video in ImageJ als een afbeeldingsreeks en zorg ervoor dat het juiste aantal frames wordt ingevoerd onder aantal afbeeldingen.
- Nadat het bestand is geopend, gebruikt u het gereedschap voor rechthoekige selectie om een ROI in het hart te tekenen, maar andere bewegende elementen uit te sluiten, en slaat u de ROI op in de ROI-manager (analyseer | tools | ROI manager).
- Klik op plug-ins | installeren en selecteer het hartslagalgoritme om de code in de standaardmap te installeren en selecteer vervolgens de plug-in onder aan het tabblad plug-ins . Noteer de beats per minuut (bpm) vanuit het pop-upvenster.
OPMERKING: Beelddetectiealgoritmen zijn op maat geschreven om de hartslag te detecteren door individuele pixeldichtheidsveranderingen te meten die verband houden met ventriculaire systolische contractie. De code is te vinden op https://github.com/dpoburko/zFish_HR.
- Meet pericardiale afmetingen met behulp van een gratis tool zoals ImageJ om ROI's vrij te tekenen rond de pericardiale zak en een van de ogen. Open de afbeelding in ImageJ en gebruik het gereedschap voor het selecteren van polygonen om eerst een ROI rond de pericardiale zak te tekenen, deze op te slaan in de ROI-manager zoals in stap 5.1.2 en herhaal deze voor het oog. Selecteer deze twee ROI's in de R ROI beherenr en klik vervolgens op meten. Noteer het gebied voor elk om later het gebied van de pericardiale zak te berekenen dat is genormaliseerd naar het ooggebied in elke larve.
- Na hartslag- en pericardiale metingen, registreer ECG van individuele larven.
OPMERKING: Protocollen voor het registreren van zebravis-ECG zijn eerder beschreven 33,34,35,36.
6. Genotypering van CRISPR-Cas9-bewerkte larvale zebravis
- Voer na fenotypische analyses on- en potentiële off-target genotypering uit om nauwkeurige en nauwkeurige HDR-genbewerking te bevestigen.
- Verdoof elke 3 dpf-larve in 0,3% MS-222 en staartclip om gDNA te isoleren met behulp van de HOTShot-methode37. Incubeer elke weggesneden staartclip in 15 μL van 25 mM NaOH bij 95 °C gedurende 20 min. Neutraliseer vervolgens met 1,5 μL Tris-HCl en centrifugeer bij 13.800 x g gedurende 30 s. Behoud het supernatant, dat geëxtraheerd gDNA bevat.
- Herstel de larven in E3-media en breng ze terug naar het huisvestingssysteem als verdere ontwikkeling of studie is bedoeld.
- Gebruik de geëxtraheerde gDNA als sjabloon en voer pcr-gebaseerde Sanger-sequencing uit van on-target en potentiële off-target sites.
OPMERKING: Optioneel: een geneste PCR-benadering kan gunstig zijn voor sommige genregio's. - Zorg ervoor dat het on-target primerontwerp de mutatieplaats en de dichtstbijzijnde sgRNA-bindingsplaats vastlegt. Ontwerp een afzonderlijke sequencingprimer om de overgang van de ingebrachte homologiearm en het doelgen te detecteren om de integratie in het gen van belang te bevestigen. Ontwerp primers om de top drie potentiële off-target locaties te rangschikken die in stap 1.2.3 zijn geïdentificeerd.
OPMERKING: Softwareprogramma's voor het ontwerpen van richtlijnen suggereren vaak primers om te gebruiken, maar aanpassing kan nodig zijn om optimale resultaten te bereiken. - Verzamel on- en off-target genotypering, hartslag, pericardiale dimensies, ECG-fenotypering en reporter-gengegevens die identificeerbaar zijn voor elke zebravis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het succesvolle gebruik van deze twee-sgRNA exon vervangende CRISPR-aanpak wordt benadrukt door de introductie en eenvoudige detectie van een nauwkeurige bewerking om de LQTS-geassocieerde variant, R56Q, in het zkcnh6a-gen in zebravissen te engineeren. Figuur 6 toont een representatieve 3 dpf-larven die in het eencellige embryostadium zijn geïnjecteerd met CRISPR-componenten zoals hierboven beschreven. Figuur 6A toont de aanwezigheid van de YFP mVenus reporter genexpressie in de ooglens als een positieve verslaggever van succesvolle template integratie. Figuur 6B,C toont Sanger sequencing chromatogrammen verkregen uit genomisch DNA geïsoleerd uit staartclipmonsters van respectievelijk wild-type en reporter gen-positieve vissen. Reporter gen-positieve vissen bleken de precieze bewerking te hebben, G naar A, die de R56Q-variant in zkcnh6a introduceert. Genotypering toonde een 100% correlatie tussen YFP reporter genexpressie en de aanwezigheid van de precieze R56Q genbewerking, die deze fluorescentie screening tool valideert.
Fenotypering van gen-bewerkte zebravislarven werd uitgevoerd bij 3 dpf. Figuur 7 toont representatieve resultaten van wildtype en R56Q gen-bewerkte larven. Hartslag werd gedetecteerd door video-opname zoals hierboven beschreven. Een voorbeeld van de meting van pericardiale dimensies als verhouding van het oogoppervlak wordt getoond (figuur 7A). Figuur 7B zet de hartslag af tegen genormaliseerde pericardiale dimensies, wat een trend van bradycardie met toenemend pericardiaal oedeem benadrukt, wat geassocieerd is met aandoeningen van cardiale repolarisatie bij zebravissen 8,38,39,40. Figuur 7C toont een representatief voorbeeld van ECG-opnames van 3 dpf-larven. Standaardintervallen (QT, QRS) werden gemeten aan de hand van gemiddelde ECG-signalen.
Figuur 1: Integratie van HDR-sjabloon in het zebravisgenoom. Donkergrijs, homologiearmen; groene, sgRNA-geleidingsdoelen met stille mutatie om cas9-recutting te voorkomen; lichtgrijs, doel exon van belang; rode lijn, puntmutatie; geel, mVenus YFP reporter gen onder een α-crystalline promotor; stippellijnen geven homologie aan. Hier was de beoogde precieze bewerking R56Q in exon 2 van het zkcnh6a-gen . Afkortingen: HDR = homologie-gerichte reparatie; sgRNA = single-guide RNA; YFP = geel fluorescerend eiwit; DSB = dubbelstrengs breuk; WT = wild type. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Samenvatting van de stappen om nauwkeurige bewerkingen in zebravisgenen te ontwikkelen met behulp van de twee-sgRNA CRISPR-Cas9-benadering (gerelateerde protocolstapnummers worden tussen haakjes aangegeven). Afkortingen: sgRNA = single-guide RNA; YFP = geel fluorescerend eiwit; gDNA = genomisch DNA; ECG = elektrocardiogram; dpf = dagen na de bevruchting; MS-222 = tricaïne methaansulfonaat. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Voorbereiding van exogene templatefragmenten en sgRNA guides. (A) Sequentiële vertering en ligatie van template fragmenten stroomopwaarts en stroomafwaarts van de mVenus YFP reporter gensequentie in pKHR5. (B) Gloeien van complementaire sgRNA-paren met restrictie-overhang voor ligatie in DR274. Afkortingen: sgRNA = single-guide RNA; YFP = geel fluorescerend eiwit. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Constructie van HDR-sjabloon. Donkergrijs, homologiearmen; groene, sgRNA-geleidingsdoelen met stille mutatie om cas9-recutting te voorkomen; lichtgrijs, doel exon van belang; rode lijn, puntmutatie; geel, mVenus YFP reporter gen onder een α-crystalline promotor; donkerblauwe lijn, beperkingssites toegevoegd. De twee sjabloonfragmenten zijn geïntegreerd in de pKHR5 plasmidedonor. Afkortingen: HDR = homologie-gerichte reparatie; sgRNA = single-guide RNA. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Micro-injectie van eencellige zebravisembryo's met CRISPR-Cas9-componenten. Schaalbalk = 0,5 mm. Afkortingen: HDR = homologie-gerichte reparatie; sgRNA = single-guide RNA. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Eenvoudige detectie van mVenus YFP reporter genfluorescentie duidt op positieve HDR exogene template integratie in het doelgen. (A) Voorbeeld van mVenus YFP-expressie in een zebravisoog (pijl) in een bewerkte zebravislarve. (B) Succesvolle bewerkingen worden bevestigd door sequencing chromatogrammen (links, WT; rechts, R56Q bewerken). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7: Fenotypische analyse van cardiale gevolgen in 3 dpf zebravissen na de precieze R56Q-bewerking in het zkcnh6a-doelgen . (A) Beelddetectie van pericardiale afmetingen ten opzichte van ooggrootte met behulp van de polygoontool in ImageJ. De grenzen van de pericardiale zak werden door de gebruiker gemarkeerd vanuit een enkel opnameframe op basis van veranderingen in doorschijnendheid en pigmentatie. Voorbeelden van normale pericardiale afmetingen en pericardiale effusie worden getoond. Schaalbalk = 0,5 mm. (B) Correlatie tussen pericardiale afmetingen (ten opzichte van oogafmeting) en hartslag, R2 = 0,33. (C) Voorbeeld van ECG-registratie van een 3 dpf zebravislarve hart (links) en gemiddelde complexen (rechts). Hartslag, 131 bpm; hartslaggecorrigeerd QTc-interval, 460 ms. Afkortingen: dpf = dagen na de bevruchting; ECG = elektrocardiogram. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De engineering van nauwkeurige genbewerkingen met CRISPR-Cas9 wordt uitgedaagd door de lage efficiëntie van HDR-mechanismen en hun efficiënte detectie. Hier wordt een CRISPR-Cas9-gebaseerde twee-sgRNA exon vervangingsbenadering beschreven die nauwkeurige bewerkingen in zebravissen produceert met eenvoudige visuele detectie van positieve bewerkingen. De werkzaamheid van deze aanpak wordt aangetoond door het genereren van nauwkeurige bewerkingen in het zkcnh6a-gen . Dit artikel laat zien hoe de hartfunctie in gen-bewerkte zebravislarven kan worden beoordeeld met behulp van niet-invasieve fenotypische metingen van hartslag, pericardiale dimensies en ECG-morfologie. Deze aanpak, van het introduceren van een genbewerking tot fenotypische evaluatie, kan van begin tot eind binnen ongeveer 1 week worden voltooid.
De voordelen van de bovenstaande bewerkings- en fenotyperingsbenadering zijn het gemak van CRISPR-modificatieontwerp, de brede toepasbaarheid in meerdere fysiologische systemen, het vermogen om grote genen of genfragmenten in te voegen en de mogelijkheid om varianteffecten longitudinaal te volgen door ontwikkeling en generaties. Het succes van nauwkeurige bewerkingen in deze aanpak kan te maken hebben met de combinatie van de grote sjabloongrootte (vanwege de reporter-geninvoeging en lange homologiearmen), waarvan is aangetoond dat ze de efficiëntie van bewerkingen in zebravis14 verhogen, en de twee-sgRNA-gidsenstrategie, die effectief is gebruikt in door ZEBRAVIS TALEN geïnduceerde bewerkingen8.
Een bijzondere kracht van de beschreven aanpak is het vermogen om grote genen of genfragmenten in te brengen. Dit kan bijvoorbeeld nuttig zijn om menselijke orthologen41 in te voegen, waardoor een meer klinisch vertaalbare karakterisering en vergelijking tussen orthologen mogelijk wordt. Als alternatief kunnen ook genen worden ingebracht die coderen voor Cas-enzymen, waardoor een lijn zebravissen met in vivo CRISPR-bewerkingsmechanismen mogelijk wordt, waardoor een induceerbaar systeem ontstaat. Op dezelfde manier kunnen alternatieve CRISPR-mechanismen, zoals prime editing, worden geïntegreerd en resulteren in een lijn zebravissen die gemakkelijk nauwkeurig en efficiënt kunnen worden bewerkt.
Ondanks de voordelen van deze aanpak zijn er enkele beperkingen. Ten eerste zijn slechts één gen en locus gemodificeerd en is verder testen op andere locaties of in andere genen nodig om te evalueren hoe breed toepasbaar deze aanpak is. Vanwege de lange homologiearmen die nodig zijn, zijn de ontwerpkosten van de sjabloon hoger; dit kan echter worden gecompenseerd door een efficiënte screening. Een andere beperking is dat de screeningsaanpak fluorescentiedetectievermogen vereist. De optische vereisten zijn echter relatief laag en kunnen op maat worden gebouwd of commercieel worden gekocht tegen redelijk lage kosten. Het gebruik van een twee-sgRNA-benadering verhoogt het aantal potentiële off-target gebeurtenissen; dit wordt echter waarschijnlijk verzacht door de lagere waarschijnlijkheid dat de twee sgRNA-gidsen beide zullen gloeien op een manier die de integratie van de sjabloon om reporter-genexpressie te verkrijgen vergemakkelijkt. Ten slotte kan het gebruik van Cas9-mRNA leiden tot mozaïcisme, omdat de Cas9 pas in latere ontwikkelingsstadia actief is. Dit kan worden verklaard door bepaalde weefseltypen te sequencen; gezien de grootte van de zebravislarven is dit echter technisch een uitdaging.
Samenvattend, deze CRISPR-Cas9 twee-sgRNA nauwkeurige bewerkingsbenadering in zebravissen maakt de eenvoudige visuele detectie van positieve bewerkingen mogelijk en kan worden aangepast om grote genen van belang op elke locus op te nemen. In combinatie met fenotypische metingen zorgt dit voor een betrouwbaar en high throughput platform voor het bestuderen van klinisch relevante cardiale varianten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd ondersteund door een Canadian Institutes of Health Research Project grant (T.W.C.) en Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada Discovery grants (T.W.C.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Program | |||
| CRISPOR | TEFOR Infrastructure | ||
| ENSEMBL | European Bioinformatics Institute | ||
| ImageJ | National Institutes of Health (NIH) | ||
| Micro-Manager | Open Source (Github) | ||
| NEBiocalculator | New England Biolabs (NEB) | ||
| EQUIPMENT | |||
| 24-well Plate | VWR | ||
| 25 mm Petri Dish | VWR | ||
| Blackfly USB3 Camera | Teledyne FLIR | ||
| C1000 Thermal Cycler | Bio-Rad | ||
| Centrifuge 5415C | Eppendorf | ||
| EZNA Gel Extraction Kit | Omega Biotek | ||
| MAXIscript T7 Transcription Kit | Invitrogen | ||
| MaxQ 5000 Incubator | Barnstead Lab Line | ||
| Miniprep Kit | Qiagen | ||
| mMessage mMachine T7 Ultra Transcription Kit | Invitrogen | ||
| ND1000 Spectrophotometer | Nanodrop | ||
| PCR Purification Kit | Qiagen | ||
| PLI 100A Picoinjector | Harvard Apparatus | ||
| PowerPac Basic Power Supply | Bio-Rad | ||
| Stemi 305 Steroscope | Zeiss | ||
| Wide Mini Sub Cell GT Electrophoresis System | Bio-Rad | ||
| ZebTec Zebrafish Housing System | Tecniplast | ||
| SERVICES | |||
| Gene Synthesis | Genewiz | ||
| Sanger Sequencing | Genewiz | ||
| REAGENTS | |||
| 10β Competent Cells | NEB | ||
| 10X PCR Buffer | Qiagen | ||
| 100 mM Nucleotide Mixture | ABM | ||
| Ampicillin | Sigma | ||
| BamHI Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
| BsaI Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
| DR274 Plasmid (XL1 Blue bacterial agar stab) | Addgene | ||
| EcoRI Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
| Glycerol | |||
| HEPES | Sigma | ||
| HindIII Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
| Kanamycin | Sigma | ||
| Methylene Blue | Sigma | ||
| MLM3613 Plasmid (XL1 Blue bacterial agar stab) | Addgene | ||
| MS-222 (Tricaine) | Sigma | ||
| pKHR5 Plasmid (DH5α bacterial agar stab) | Addgene | ||
| PmeI Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
| SalI Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
| Sodium Hydroxide | Sigma | ||
| T4 Ligase w/ buffer | Sigma | ||
| Taq Polymerase | Qiagen | ||
| TE Buffer | Sigma | ||
| Tris Hydrochloride | Sigma | ||
| XhoI Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
| RECIPES | |||
| Solution | Component | Supplier | |
| Annealing Buffer (pH 7.5-8.0) | 10 mM Tris | Sigma | |
| 50 mM NaCl | Sigma | ||
| 1 mM EDTA | Sigma | ||
| E3 Media (pH 7.2) | 5 mM NaCl | Sigma | |
| 0.17 mM KCl | Sigma | ||
| 0.33 mM CaCl2 | Sigma | ||
| 0.33 mM MgSO4 | Sigma | ||
| Injection Buffer (pH 7.5) | 20 mM HEPES | Sigma | |
| 150 mM KCl | Sigma |
References
- Zarei, A., Razban, V., Hosseini, S. E., Tabei, S. M. B. Creating cell and animal models of human disease by genome editing using CRISPR/Cas9. The Journal of Gene Medicine. 21 (4), 3082 (2019).
- Lee, H., Yoon, D. E., Kim, K. Genome editing methods in animal models. Animal Cells and Systems. 24 (1), 8-16 (2020).
- Li, Q., et al. Applications of genome editing technology in animal disease modeling and gene therapy. Computational and Structural Biotechnology Journal. 17, 689-698 (2019).
- Gut, P., Reischauer, S., Stainier, D. Y. R., Arnaout, R. Little fish, big data: Zebrafish as a model for cardiovascular and metabolic disease. Physiological Reviews. 97 (3), 889-938 (2017).
- Kegel, L., et al. Forward genetic screen using zebrafish to identify new genes involved in myelination. Oligodendrocytes: Methods and Protocols. 1936, 185-209 (2019).
- Shah, A. N., Davey, C. F., Whitebirch, A. C., Miller, A. C., Moens, C. B. Rapid reverse genetic screening using CRISPR in zebrafish. Nature Methods. 12 (6), 535-540 (2015).
- González-Rosa, J. M. Zebrafish models of cardiac disease: From fortuitous mutants to precision medicine. Circulation Research. 130 (12), 1803-1826 (2022).
- Hoshijima, K., Jurynec, M. J., Grunwald, D. J. Precise editing of the Zebrafish genome made simple and efficient. Developmental Cell. 36 (6), 654-667 (2016).
- Albadri, S., Del Bene, F., Revenu, C. Genome editing using CRISPR/Cas9-based knock-in approaches in zebrafish. Methods. 121-122, 77-85 (2017).
- Armstrong, G. A. B., et al. Homology directed knockin of point mutations in the zebrafish tardbp and fus genes in ALS using the CRISPR/Cas9 system. PLoS One. 11 (3), 0150188 (2016).
- Bai, H., et al. CRISPR/Cas9-mediated precise genome modification by a long ssDNA template in zebrafish. BMC Genomics. 21 (1), 67 (2020).
- de Vrieze, E., et al. Efficient generation of knock-in zebrafish models for inherited disorders using CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein complexes. International Journal of Molecular Sciences. 22 (17), 9429 (2021).
- Eschstruth, A., Schneider-Maunoury, S., Giudicelli, F. Creation of zebrafish knock-in reporter lines in the nefma gene by Cas9-mediated homologous recombination. Genesis. 58 (1), 23340 (2020).
- Irion, U., Krauss, J., Nüsslein-Volhard, C. Precise and efficient genome editing in zebrafish using the CRISPR/Cas9 system. Development. 141 (24), 4827-4830 (2014).
- Kimura, Y., Hisano, Y., Kawahara, A., Higashijima, S. Efficient generation of knock-in transgenic zebrafish carrying reporter/driver genes by CRISPR/Cas9-mediated genome engineering. Scientific Reports. 4 (1), 6545 (2014).
- Levic, D. S., Yamaguchi, N., Wang, S., Knaut, H., Bagnat, M. Knock-in tagging in zebrafish facilitated by insertion into non-coding regions. Development. 148 (19), (2021).
- Prykhozhij, S. V., et al. Optimized knock-in of point mutations in zebrafish using CRISPR/Cas9. Nucleic Acids Research. 46 (17), 102 (2018).
- Wierson, W. A., et al. Efficient targeted integration directed by short homology in zebrafish and mammalian cells. eLife. 9, 53968 (2020).
- Boel, A., et al. CRISPR/Cas9-mediated homology-directed repair by ssODNs in zebrafish induces complex mutational patterns resulting from genomic integration of repair-template fragments. Disease Models & Mechanisms. 11 (10), (2018).
- Tessadori, F., et al. Effective CRISPR/Cas9-based nucleotide editing in zebrafish to model human genetic cardiovascular disorders. Disease Models & Mechanisms. 11 (10), (2018).
- Zhang, Y., Zhang, Z., Ge, W. An efficient platform for generating somatic point mutations with germline transmission in the zebrafish by CRISPR/Cas9-mediated gene editing. The Journal of Biological Chemistry. 293 (17), 6611-6622 (2018).
- Vornanen, M., Hassinen, M. Zebrafish heart as a model for human cardiac electrophysiology. Channels. 10 (2), 101-110 (2016).
- Nemtsas, P., Wettwer, E., Christ, T., Weidinger, G., Ravens, U. Adult zebrafish heart as a model for human heart? An electrophysiological study. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 48 (1), 161-171 (2010).
- Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biology. 17 (1), 148 (2016).
- Liang, X., Potter, J., Kumar, S., Ravinder, N., Chesnut, J. D. Enhanced CRISPR/Cas9-mediated precise genome editing by improved design and delivery of gRNA, Cas9 nuclease, and donor DNA. Journal of Biotechnology. 241, 136-146 (2017).
- Richardson, C. D., Ray, G. J., DeWitt, M. A., Curie, G. L., Corn, J. E. Enhancing homology-directed genome editing by catalytically active and inactive CRISPR-Cas9 using asymmetric donor DNA. Nature Biotechnology. 34 (3), 339-344 (2016).
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Precipitation of Large RNAs with Lithium Chloride. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Book 3. E.15. , Cold Spring Harbor Laboratory. Long Island, NY. (1989).
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Agarose Gel Electrophoresis. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Book 1. , Cold Spring Harbor Laboratory. Long Island, NY. 3-20 (1989).
- Sorlien, E. L., Witucki, M. A., Ogas, J. Efficient production and identification of CRISPR/Cas9-generated gene knockouts in the model system Danio rerio. Journal of Visualized Experiments. (138), e56969 (2018).
- Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: An introduction. Journal of Visualized Experiments. (69), e4196 (2012).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. Journal of Visualized Experiments. (25), e1115 (2009).
- Kossack, M. E., Draper, B. W. Genetic regulation of sex determination and maintenance in zebrafish (Danio rerio). Current Topics in Developmental Biology. 134, 119-149 (2019).
- Tanaka, Y., et al. Functional analysis of KCNH2 gene mutations of type 2 long QT syndrome in larval zebrafish using microscopy and electrocardiography. Heart and Vessels. 34 (1), 159-166 (2019).
- Dhillon, S. S., et al. Optimisation of embryonic and larval ECG measurement in zebrafish for quantifying the effect of QT prolonging drugs. PLoS One. 8 (4), 60552 (2013).
- Yu, F., et al. Evolving cardiac conduction phenotypes in developing zebrafish larvae: Implications to drug sensitivity. Zebrafish. 7 (4), 325-331 (2010).
- Hurst, R. M. Development and optimization of tools for embryonic electrocardiograph recording for heart dysfunction in zebrafish. , University of Birmingham. PhD thesis (2018).
- Meeker, N. D., Hutchinson, S. A., Ho, L., Trede, N. S. Method for isolation of PCR-ready genomic DNA from zebrafish tissues. BioTechniques. 43 (5), 610-614 (2007).
- Arnaout, R., et al. Zebrafish model for human long QT syndrome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (27), 11316-11321 (2007).
- Milan, D. J., Peterson, T. A., Ruskin, J. N., Peterson, R. T., MacRae, C. A. Drugs that induce repolarization abnormalities cause bradycardia in zebrafish. Circulation. 107 (10), 1355-1358 (2003).
- Langheinrich, U., Vacun, G., Wagner, T. Zebrafish embryos express an orthologue of HERG and are sensitive toward a range of QT-prolonging drugs inducing severe arrhythmia. Toxicology and Applied Pharmacology. 193 (3), 370-382 (2003).
- MacRae, C. A. Cardiac arrhythmia: In vivo screening in the zebrafish to overcome complexity in drug discovery. Expert Opinion on Drug Discovery. 5 (7), 619-632 (2010).
