यह प्रोटोकॉल CRISPR-Cas9 तकनीक का उपयोग करके ज़ेब्राफिश भ्रूण में सटीक नॉक-इन संपादन की सुविधा के लिए एक दृष्टिकोण का वर्णन करता है। लॉन्ग क्यूटी सिंड्रोम से जुड़े जीन वेरिएंट को मॉडल करने के लिए इन तकनीकों की प्रयोज्यता को प्रदर्शित करने के लिए एक फेनोटाइपिंग पाइपलाइन प्रस्तुत की गई है।
पशु मॉडल में नियमित रूप से इंटरस्पेस्ड शॉर्ट पैलिंड्रोमिक रिपीट (सीआरआईएसपीआर) शारीरिक घटनाओं के अध्ययन के लिए सटीक आनुवंशिक हेरफेर को सक्षम करते हैं। ज़ेबराफिश का उपयोग पूरे अंग और जीव स्तर पर आनुवांशिक बीमारी, विकास और विष विज्ञान से संबंधित कई सवालों का अध्ययन करने के लिए एक प्रभावी आनुवंशिक मॉडल के रूप में किया गया है। अच्छी तरह से एनोटेट और मैप किए गए ज़ेबराफ़िश जीनोम के कारण, जीन संपादन के लिए कई उपकरण विकसित किए गए हैं। हालांकि, सीआरआईएसपीआर का उपयोग करके सटीक नॉक-इन संपादन उत्पन्न करने और पता लगाने में आसानी की प्रभावकारिता एक सीमित कारक है। यहां वर्णित एक सीआरआईएसपीआर-कैस 9-आधारित नॉक-इन दृष्टिकोण है जिसमें कार्डियक रिपोलराइजेशन के लिए जिम्मेदार जीन में सटीक संपादन का सरल पता लगाया गया है और विद्युत विकार, लॉन्ग क्यूटी सिंड्रोम (एलक्यूटीएस) से जुड़ा हुआ है। यह दो-एकल-गाइड आरएनए (एसजीआरएनए) दृष्टिकोण लक्ष्य अनुक्रम को उत्पादित और प्रतिस्थापित करता है और आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड रिपोर्टर जीन को जोड़ता है। इस दृष्टिकोण की उपयोगिता जंगली-प्रकार और जीन-संपादित ज़ेब्राफिश लार्वा में कार्डियक इलेक्ट्रिकल फ़ंक्शन के गैर-इनवेसिव फेनोटाइपिक माप का वर्णन करके प्रदर्शित की जाती है। यह दृष्टिकोण एक पूरे जीव में रोग से जुड़े वेरिएंट के कुशल अध्ययन को सक्षम बनाता है। इसके अलावा, यह रणनीति पसंद के बहिर्जात अनुक्रमों के सम्मिलन के लिए संभावनाएं प्रदान करती है, जैसे कि रिपोर्टर जीन, ऑर्थोलॉग, या जीन संपादक।
पशु मॉडल में सीआरआईएसपीआर-आधारित जीन संपादन रणनीतियां पूरे जीव स्तर 1,2,3 पर आनुवंशिक रूप से आनुवांशिक रोग, विकास और विष विज्ञान के अध्ययन को सक्षम करती हैं। ज़ेबराफ़िश एक शक्तिशाली मॉडल प्रदान करती है जो मुराइन या मानव-व्युत्पन्न सेल मॉडल4 की तुलना में मनुष्यों के कई शारीरिक पहलुओं में करीब है। आगे5 और रिवर्स आनुवंशिक स्क्रीनिंग 6 दोनों के लिए जेब्राफिश में आनुवंशिक उपकरणों और रणनीतियों की एक विस्तृत सरणी का उपयोग किया गयाहै। जेब्राफिश में व्यापक आनुवंशिक मानचित्रण और एनोटेशन ने लक्षित जीन नॉकआउट (केओ) और सटीक नॉक-इन (केआई) 7 को इंजीनियर करने के लिए प्राथमिक तकनीक के रूप में जीन-संपादन दृष्टिकोण की सुविधा प्रदान की है।
इसके बावजूद, ज़ेबराफिश में सटीक केआई संपादन उत्पन्न करना कम क्षमता और सटीक पहचान की कठिनाई से सीमित है। यद्यपि प्रतिलेखन कारक जैसे प्रभावक न्यूक्लियस (TALENs) का सफलतापूर्वक उपयोग किया गया है और KIs8 के लिए अनुकूलित किया गया है, CRISPR सरल एसजीआरएनए लक्ष्यीकरण के साथ एक बेहतर जीन-संपादन रणनीति प्रदान करता है। कई अध्ययनों ने जेब्राफिश 9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20 में सटीक केआई उत्पन्न करने के लिए सीआरआईएसपीआर का उपयोग किया है, हालांकि सीआरआईएसपीआर-मध्यस्थता होमोलॉजी-निर्देशित मरम्मत (एचडीआर) के माध्यम से उत्पन्न ये संपादन कम आंतरिक सफलता के साथ अक्षम होते हैं प्राथमिक स्क्रीन के रूप में जीनोटाइपिंग की आवश्यकता वालेदरें 9,10,14,21। यह ज़ेबराफ़िश में एक कुशल केआई सीआरआईएसपीआर प्रणाली की आवश्यकता को दर्शाता है, साथ ही सटीक संपादन का पता लगाने के लिए एक विश्वसनीय उच्च-थ्रूपुट प्रणाली भी है।
इस अध्ययन का लक्ष्य सफल संपादनों के सरल और उच्च-थ्रूपुट डिटेक्शन के साथ ज़ेब्राफिश दिल में एक सटीक कार्डियक जीन केआई उत्पन्न करने के लिए एक मंच का वर्णन करना था। CRISPR-Cas9-आधारित दो-sgRNA एक्सॉन प्रतिस्थापन दृष्टिकोण का वर्णन किया गया है, जो TALEN दृष्टिकोण8 पर आधारित है। इस दृष्टिकोण में दो-एसजीआरएनए गाइड का उपयोग करके लक्ष्य अनुक्रम का छांटना और एक बहिर्जात टेम्पलेट अनुक्रम के साथ प्रतिस्थापन शामिल है जिसमें रुचि के केआई के साथ-साथ आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड इनट्रोनिक रिपोर्टर जीन (चित्रा 1) शामिल है। लक्ष्य जीन इनट्रोनिक अनुक्रम के भीतर आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड फ्लोरोसेंट रिपोर्टर का एकीकरण सकारात्मक संपादन का कुशल पता लगाने में सक्षम बनाता है। विरासत में मिले एलक्यूटीएस से जुड़े जीन वेरिएंट के गैर-इनवेसिव लक्षण वर्णन के लिए ज़ेब्राफिश लार्वा में कार्डियक इलेक्ट्रिकल फ़ंक्शन का आकलन करने के लिए एक फेनोटाइपिंग प्लेटफॉर्म का वर्णन किया गया है, एक कार्डियक इलेक्ट्रिकल डिसऑर्डर जो व्यक्तियों को अचानक कार्डियक मृत्यु के लिए प्रेरित करता है।
ये दृष्टिकोण विरासत में मिली बीमारियों को मॉडल करने और जैविक और शारीरिक प्रश्नों को संबोधित करने के लिए ज़ेब्राफिश केआई जीन संपादन की पहुंच और उपयोग को बढ़ाएंगे, जैसे कि जीन अभिव्यक्ति पैटर्न का मानचित्रण, और विकासात्मक विनियमन। चूंकि ज़ेब्राफिश दिल मुराइन मॉडल की तुलना में बेहतर समानांतर मानव कार्डियक इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल विशेषताओं को बेहतर बनाते हैं, इसलिए वे हृदय रोग मॉडलिंग 7,22,23 के लिए आनुवंशिक रूप से वापस लेने योग्य प्रणाली के रूप में विशेष रूप से आकर्षक हो सकते हैं।
CRISPR-Cas9 का उपयोग करके सटीक जीन संपादन की इंजीनियरिंग को एचडीआर तंत्र की कम क्षमता और उनकी कुशल पहचान से चुनौती दी जाती है। यहां, एक सीआरआईएसपीआर-कैस 9-आधारित दो-एसजीआरएनए एक्सॉन प्रतिस्थापन दृष्टिकोण का व…
The authors have nothing to disclose.
इस शोध को कनाडाई इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ रिसर्च प्रोजेक्ट ग्रांट (टीडब्ल्यूसी) और नेचुरल साइंसेज एंड इंजीनियरिंग रिसर्च काउंसिल ऑफ कनाडा डिस्कवरी ग्रांट्स (टीडब्ल्यूसी) द्वारा समर्थित किया गया था।
Program | |||
CRISPOR | TEFOR Infrastructure | ||
ENSEMBL | European Bioinformatics Institute | ||
ImageJ | National Institutes of Health (NIH) | ||
Micro-Manager | Open Source (Github) | ||
NEBiocalculator | New England Biolabs (NEB) | ||
EQUIPMENT | |||
24-well Plate | VWR | ||
25 mm Petri Dish | VWR | ||
Blackfly USB3 Camera | Teledyne FLIR | ||
C1000 Thermal Cycler | Bio-Rad | ||
Centrifuge 5415C | Eppendorf | ||
EZNA Gel Extraction Kit | Omega Biotek | ||
MAXIscript T7 Transcription Kit | Invitrogen | ||
MaxQ 5000 Incubator | Barnstead Lab Line | ||
Miniprep Kit | Qiagen | ||
mMessage mMachine T7 Ultra Transcription Kit | Invitrogen | ||
ND1000 Spectrophotometer | Nanodrop | ||
PCR Purification Kit | Qiagen | ||
PLI 100A Picoinjector | Harvard Apparatus | ||
PowerPac Basic Power Supply | Bio-Rad | ||
Stemi 305 Steroscope | Zeiss | ||
Wide Mini Sub Cell GT Electrophoresis System | Bio-Rad | ||
ZebTec Zebrafish Housing System | Tecniplast | ||
SERVICES | |||
Gene Synthesis | Genewiz | ||
Sanger Sequencing | Genewiz | ||
REAGENTS | |||
10β Competent Cells | NEB | ||
10X PCR Buffer | Qiagen | ||
100 mM Nucleotide Mixture | ABM | ||
Ampicillin | Sigma | ||
BamHI Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
BsaI Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
DR274 Plasmid (XL1 Blue bacterial agar stab) | Addgene | ||
EcoRI Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
Glycerol | |||
HEPES | Sigma | ||
HindIII Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
Kanamycin | Sigma | ||
Methylene Blue | Sigma | ||
MLM3613 Plasmid (XL1 Blue bacterial agar stab) | Addgene | ||
MS-222 (Tricaine) | Sigma | ||
pKHR5 Plasmid (DH5α bacterial agar stab) | Addgene | ||
PmeI Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
SalI Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
Sodium Hydroxide | Sigma | ||
T4 Ligase w/ buffer | Sigma | ||
Taq Polymerase | Qiagen | ||
TE Buffer | Sigma | ||
Tris Hydrochloride | Sigma | ||
XhoI Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
RECIPES | |||
Solution | Component | Supplier | |
Annealing Buffer (pH 7.5-8.0) | 10 mM Tris | Sigma | |
50 mM NaCl | Sigma | ||
1 mM EDTA | Sigma | ||
E3 Media (pH 7.2) | 5 mM NaCl | Sigma | |
0.17 mM KCl | Sigma | ||
0.33 mM CaCl2 | Sigma | ||
0.33 mM MgSO4 | Sigma | ||
Injection Buffer (pH 7.5) | 20 mM HEPES | Sigma | |
150 mM KCl | Sigma |