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Biology

CRISPR-Cas9-मध्यस्थता सटीक नॉक-इन संपादन ज़ेब्राफिश हार्ट्स में

Published: September 13, 2022 doi: 10.3791/64209
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Biomedical Physiology and Kinesiology, Simon Fraser University

Summary

यह प्रोटोकॉल CRISPR-Cas9 तकनीक का उपयोग करके ज़ेब्राफिश भ्रूण में सटीक नॉक-इन संपादन की सुविधा के लिए एक दृष्टिकोण का वर्णन करता है। लॉन्ग क्यूटी सिंड्रोम से जुड़े जीन वेरिएंट को मॉडल करने के लिए इन तकनीकों की प्रयोज्यता को प्रदर्शित करने के लिए एक फेनोटाइपिंग पाइपलाइन प्रस्तुत की गई है।

Abstract

पशु मॉडल में नियमित रूप से इंटरस्पेस्ड शॉर्ट पैलिंड्रोमिक रिपीट (सीआरआईएसपीआर) शारीरिक घटनाओं के अध्ययन के लिए सटीक आनुवंशिक हेरफेर को सक्षम करते हैं। ज़ेबराफिश का उपयोग पूरे अंग और जीव स्तर पर आनुवांशिक बीमारी, विकास और विष विज्ञान से संबंधित कई सवालों का अध्ययन करने के लिए एक प्रभावी आनुवंशिक मॉडल के रूप में किया गया है। अच्छी तरह से एनोटेट और मैप किए गए ज़ेबराफ़िश जीनोम के कारण, जीन संपादन के लिए कई उपकरण विकसित किए गए हैं। हालांकि, सीआरआईएसपीआर का उपयोग करके सटीक नॉक-इन संपादन उत्पन्न करने और पता लगाने में आसानी की प्रभावकारिता एक सीमित कारक है। यहां वर्णित एक सीआरआईएसपीआर-कैस 9-आधारित नॉक-इन दृष्टिकोण है जिसमें कार्डियक रिपोलराइजेशन के लिए जिम्मेदार जीन में सटीक संपादन का सरल पता लगाया गया है और विद्युत विकार, लॉन्ग क्यूटी सिंड्रोम (एलक्यूटीएस) से जुड़ा हुआ है। यह दो-एकल-गाइड आरएनए (एसजीआरएनए) दृष्टिकोण लक्ष्य अनुक्रम को उत्पादित और प्रतिस्थापित करता है और आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड रिपोर्टर जीन को जोड़ता है। इस दृष्टिकोण की उपयोगिता जंगली-प्रकार और जीन-संपादित ज़ेब्राफिश लार्वा में कार्डियक इलेक्ट्रिकल फ़ंक्शन के गैर-इनवेसिव फेनोटाइपिक माप का वर्णन करके प्रदर्शित की जाती है। यह दृष्टिकोण एक पूरे जीव में रोग से जुड़े वेरिएंट के कुशल अध्ययन को सक्षम बनाता है। इसके अलावा, यह रणनीति पसंद के बहिर्जात अनुक्रमों के सम्मिलन के लिए संभावनाएं प्रदान करती है, जैसे कि रिपोर्टर जीन, ऑर्थोलॉग, या जीन संपादक।

Introduction

पशु मॉडल में सीआरआईएसपीआर-आधारित जीन संपादन रणनीतियां पूरे जीव स्तर 1,2,3 पर आनुवंशिक रूप से आनुवांशिक रोग, विकास और विष विज्ञान के अध्ययन को सक्षम करती हैं। ज़ेबराफ़िश एक शक्तिशाली मॉडल प्रदान करती है जो मुराइन या मानव-व्युत्पन्न सेल मॉडल4 की तुलना में मनुष्यों के कई शारीरिक पहलुओं में करीब है। आगे5 और रिवर्स आनुवंशिक स्क्रीनिंग 6 दोनों के लिए जेब्राफिश में आनुवंशिक उपकरणों और रणनीतियों की एक विस्तृत सरणी का उपयोग किया गयाहै। जेब्राफिश में व्यापक आनुवंशिक मानचित्रण और एनोटेशन ने लक्षित जीन नॉकआउट (केओ) और सटीक नॉक-इन (केआई) 7 को इंजीनियर करने के लिए प्राथमिक तकनीक के रूप में जीन-संपादन दृष्टिकोण की सुविधा प्रदान की है।

इसके बावजूद, ज़ेबराफिश में सटीक केआई संपादन उत्पन्न करना कम क्षमता और सटीक पहचान की कठिनाई से सीमित है। यद्यपि प्रतिलेखन कारक जैसे प्रभावक न्यूक्लियस (TALENs) का सफलतापूर्वक उपयोग किया गया है और KIs8 के लिए अनुकूलित किया गया है, CRISPR सरल एसजीआरएनए लक्ष्यीकरण के साथ एक बेहतर जीन-संपादन रणनीति प्रदान करता है। कई अध्ययनों ने जेब्राफिश 9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20 में सटीक केआई उत्पन्न करने के लिए सीआरआईएसपीआर का उपयोग किया है, हालांकि सीआरआईएसपीआर-मध्यस्थता होमोलॉजी-निर्देशित मरम्मत (एचडीआर) के माध्यम से उत्पन्न ये संपादन कम आंतरिक सफलता के साथ अक्षम होते हैं प्राथमिक स्क्रीन के रूप में जीनोटाइपिंग की आवश्यकता वालेदरें 9,10,14,21। यह ज़ेबराफ़िश में एक कुशल केआई सीआरआईएसपीआर प्रणाली की आवश्यकता को दर्शाता है, साथ ही सटीक संपादन का पता लगाने के लिए एक विश्वसनीय उच्च-थ्रूपुट प्रणाली भी है।

इस अध्ययन का लक्ष्य सफल संपादनों के सरल और उच्च-थ्रूपुट डिटेक्शन के साथ ज़ेब्राफिश दिल में एक सटीक कार्डियक जीन केआई उत्पन्न करने के लिए एक मंच का वर्णन करना था। CRISPR-Cas9-आधारित दो-sgRNA एक्सॉन प्रतिस्थापन दृष्टिकोण का वर्णन किया गया है, जो TALEN दृष्टिकोण8 पर आधारित है। इस दृष्टिकोण में दो-एसजीआरएनए गाइड का उपयोग करके लक्ष्य अनुक्रम का छांटना और एक बहिर्जात टेम्पलेट अनुक्रम के साथ प्रतिस्थापन शामिल है जिसमें रुचि के केआई के साथ-साथ आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड इनट्रोनिक रिपोर्टर जीन (चित्रा 1) शामिल है। लक्ष्य जीन इनट्रोनिक अनुक्रम के भीतर आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड फ्लोरोसेंट रिपोर्टर का एकीकरण सकारात्मक संपादन का कुशल पता लगाने में सक्षम बनाता है। विरासत में मिले एलक्यूटीएस से जुड़े जीन वेरिएंट के गैर-इनवेसिव लक्षण वर्णन के लिए ज़ेब्राफिश लार्वा में कार्डियक इलेक्ट्रिकल फ़ंक्शन का आकलन करने के लिए एक फेनोटाइपिंग प्लेटफॉर्म का वर्णन किया गया है, एक कार्डियक इलेक्ट्रिकल डिसऑर्डर जो व्यक्तियों को अचानक कार्डियक मृत्यु के लिए प्रेरित करता है।

ये दृष्टिकोण विरासत में मिली बीमारियों को मॉडल करने और जैविक और शारीरिक प्रश्नों को संबोधित करने के लिए ज़ेब्राफिश केआई जीन संपादन की पहुंच और उपयोग को बढ़ाएंगे, जैसे कि जीन अभिव्यक्ति पैटर्न का मानचित्रण, और विकासात्मक विनियमन। चूंकि ज़ेब्राफिश दिल मुराइन मॉडल की तुलना में बेहतर समानांतर मानव कार्डियक इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल विशेषताओं को बेहतर बनाते हैं, इसलिए वे हृदय रोग मॉडलिंग 7,22,23 के लिए आनुवंशिक रूप से वापस लेने योग्य प्रणाली के रूप में विशेष रूप से आकर्षक हो सकते हैं।

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Protocol

ज़ेबराफिश का उपयोग करने वाले अध्ययन साइमन फ्रेजर विश्वविद्यालय पशु देखभाल समिति और कनाडाई पशु देखभाल परिषद की नीतियों और प्रक्रियाओं के साथ समझौते में आयोजित किए गए थे और प्रोटोकॉल # 1264 के -18 के तहत पूरे किए गए थे।

1. सटीक संपादन के लिए CRISPR घटकों का डिजाइन

  1. केआई लक्ष्य साइट वाले अनुक्रम को आबकारी करने के लिए उपयोग किए जाने वाले दो-एसजीआरएनए गाइडों को डिजाइन करने के लिए, पहले रुचि के जीन के लिए ज़ेबराफिश ऑर्थोलॉग की पहचान करें।
    नोट: चित्रा 2 दो-एसजीआरएनए सीआरआईएसपीआर-सीएएस 9 दृष्टिकोण का उपयोग करके सटीक संपादन को इंजीनियर करने के चरणों का सारांश अवलोकन प्रदान करता है।
  2. इसके बाद, एक डिज़ाइन सॉफ़्टवेयर टूल का उपयोग करें, जैसे कि CRISPOR24, जिसमें एक प्रजाति के रूप में डैनियो रेरियो के लिए चयन और उपयोग किए जाने वाले Cas एंजाइम का चयन शामिल है।
    नोट: इस अध्ययन के लिए रुचि का जीन zkcnh6a था (Ensembl ट्रांसक्रिप्ट आईडी: ENSDART00000090809.6; यूनिप्रोट प्रोटीन आईडी: बी 3 डीजेएक्स 4), और लक्ष्य उत्परिवर्तन एमिनो एसिड, आर 56 क्यू था।
    1. दो-एसजीआरएनए दृष्टिकोण के लिए, एक एसजीआरएनए स्थान चुनें जो लक्ष्य एक्सॉन से पहले है और एक दूसरा एसजीआरएनए जो तत्काल डाउनस्ट्रीम इंट्रॉन के भीतर स्थित है।
    2. सुनिश्चित करें कि चयनित एसजीआरएनए में उच्च विशिष्टता और कम अनुमानित ऑफ-टारगेट बाइंडिंग है। न्यूनतम ऑफ-टारगेट बाइंडिंग वाले गाइड की पहचान करने के लिए CRISPOR रैंकिंग का उपयोग करें। संभावित ऑफ-टारगेट के बीज अनुक्रम में बिना किसी बेमेल वाले गाइड पर विचार न करें।
    3. चरण 6.1.3 में पीसीआर-आधारित सेंगर अनुक्रमण जीनोटाइपिंग के लिए सबसे संभावित संभावित ऑफ-टारगेट साइटों की पहचान करें (CRISPOR स्कोर के आधार पर, शीर्ष तीन एक्सॉन संभावित ऑफ-टारगेट साइटों का चयन करें)।
    4. एक बार दो-एसजीआरएनए का चयन हो जाने के बाद, प्रत्येक के लिए रिवर्स पूरक प्राप्त करें, जैसे कि उपयोग किए जाने वाले चार ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स हैं: दो पूरक ऑलिगोस जो उत्परिवर्तन से पहले होते हैं और दो पूरक ऑलिगोस जो डाउनस्ट्रीम होते हैं।
    5. चार ऑलिगोस में से प्रत्येक पर, पसंद के गाइड प्लास्मिड में शामिल करने के लिए संगत प्रतिबंध साइटों को जोड़ें; डीआर 274 प्लास्मिड में एकीकरण के लिए, ओवरहैंग बनाने के लिए 5 'बीएसएआई प्रतिबंध साइट का उपयोग करें। सुनिश्चित करें कि बीएसए 1 मान्यता साइट को CRISPOR से चयनित गाइड के 5 'अंत में इंजीनियर किया गया है और BSA1 मान्यता साइट को DR274 प्लास्मिड में गाइडों के सही अभिविन्यास को सुनिश्चित करने के लिए पूरक स्ट्रैंड के 5 ' अंत में इंजीनियर किया गया है ( चित्रा 3 देखें)।
  3. ज़ेबराफिश (चित्रा 1) में एचडीआर के लिए उपयोग किए जाने वाले बहिर्जात टेम्पलेट को डिजाइन करने के लिए, दो अनुक्रम टुकड़े चुनें जो पीकेएचआर 5 प्लास्मिड में रखे गए एमवेनस वाईएफपी रिपोर्टर जीन को फ्लैंक करेंगे।
    नोट: इच्छित संशोधन / संपादन को अपस्ट्रीम या डाउनस्ट्रीम टुकड़े में शामिल किया जा सकता है।
    1. एन्सेम्बल का उपयोग करके, रुचि के जीन अनुक्रम के भीतर लक्ष्य साइट का पता लगाएं, जिसमें लगभग 2 केबी फ्लैंकिंग अनुक्रम (होमोलॉजी आर्म) शामिल है, जिसका उपयोग टेम्पलेट बनाने के लिए किया जाएगा।
      नोट: होमोलॉजी हथियार सममित या विषम25,26 और लगभग 1 केबी, लक्ष्य साइट के अपस्ट्रीम और डाउनस्ट्रीम हो सकते हैं।
    2. टेम्पलेट को दो खंडों में विभाजित करें जिन्हें mVenus YFP रिपोर्टर जीन के दोनों ओर डाला जाएगा ( चित्रा 4 देखें)। सुनिश्चित करें कि विभाजित साइट एक इंट्रॉन में है ताकि कोडिंग अनुक्रम बाधित न हो।
      नोट: यदि जीन अच्छी तरह से विशेषता है, तो इंट्रोन में कार्यात्मक भूमिकाओं की जांच करें, जैसे कि स्प्लिसिंग साइट या नियामक क्षेत्र। 5 ' या 3 ' सिरों के करीब के क्षेत्र अक्सर एमआरएनए स्प्लिसिंग में शामिल होते हैं।
    3. टेम्पलेट अनुक्रम में संशोधनों को शामिल करें जिसमें शामिल हैं i) गाइड प्रोटोस्पेसर आसन्न आकृति (पीएएम) या बीज अनुक्रम (वैकल्पिक पीएएम साइटों के बारे में जागरूक रहें जो कैस एंजाइम लक्षित कर सकते हैं) में मौन उत्परिवर्तन कैस एंजाइम को रोकने के लिए; ii) ब्याज का संशोधन; iii) पीकेएचआर 5 प्लास्मिड में क्लोनिंग की सुविधा के लिए प्रतिबंध एंडोन्यूक्लिज़ साइटों का निर्माण, जिसमें एमवेनस वाईएफपी रिपोर्टर जीन होता है ( चित्रा 3 देखें)।
      नोट: इस अध्ययन में, पहले टेम्प्लेट सेगमेंट में आर 56 क्यू म्यूटेशन साइट और एसएएलआई डाउनस्ट्रीम के एक्सएचओआई अपस्ट्रीम और एसएएलआई शामिल थे, जबकि दूसरे टेम्पलेट सेगमेंट में गाइड लक्ष्य अनुक्रम के ईकोआरआई अपस्ट्रीम और बीएएमएचआई डाउनस्ट्रीम थे। यदि चयनित प्रतिबंध साइटों में से कोई भी टेम्पलेट अनुक्रम के भीतर मौजूद है, तो इन्हें चुप करने के लिए उत्परिवर्तन की आवश्यकता होगी, या गिब्सन असेंबली जैसे वैकल्पिक दृष्टिकोणों का उपयोग किया जा सकता है।

2. भ्रूण माइक्रोइंजेक्शन के लिए सीआरआईएसपीआर घटकों की तैयारी

  1. माइक्रोइंजेक्शन से 1 सप्ताह पहले माइक्रोइंजेक्शन के लिए कैस 9 तैयार करें। कैस 9 प्रोटीन का उपयोग करें या इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन के माध्यम से कैस 9 एमआरएनए तैयार करें।
    नोट: इस अध्ययन में, कैस 9 एमआरएनए का उपयोग किया गया था, क्योंकि क्षमता अधिक थी।
    1. एम्पीसिलीन जैसे उपयुक्त एंटीबायोटिक का उपयोग करके व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एक्सएल 1 ब्लू बैक्टीरियल एगर स्टैब (कैस 9 प्लास्मिड युक्त) के जीवाणु संस्कृतियों को बढ़ाएं। -80 डिग्री सेल्सियस पर दीर्घकालिक भंडारण के लिए बैकअप ग्लिसरॉल स्टॉक बनाने के लिए 675 μL तरल संस्कृति (ग्लिसरॉल के 325 μL के साथ) का उपयोग करें।
    2. मिनीप्रेप किट के साथ प्रदान किए गए प्रोटोकॉल के अनुसार, मिनीप्रेप शुद्धिकरण के लिए तरल संस्कृति के शेष का उपयोग करें। प्रदान किए गए क्षालन बफर के 50 μL में अंतिम शुद्ध डीएनए को पुन: निलंबित करें। उपज और शुद्धता की जांच करने के लिए स्पेक्ट्रोफोटोमीटर के माध्यम से उत्पाद की मात्रा निर्धारित करें।
    3. एक उपयुक्त प्रतिबंध एंजाइम का उपयोग करके प्रतिबंध पाचन के माध्यम से शुद्ध डीएनए के 2 डिग्री ग्राम को रैखिक करें और रुचि के एंजाइम के लिए सूचीबद्ध उपयुक्त बफर और इनक्यूबेशन समय का उपयोग करें।
    4. पीसीआर शुद्धिकरण किट का उपयोग करके रैखिक प्लास्मिड को शुद्ध करें, इसे प्रदान किए गए क्षालन बफर के 30 μL में पुन: निलंबित करें।
    5. उत्पाद की मात्रा निर्धारित करने के बाद, ब्याज के प्रमोटर के लिए उपयुक्त प्रतिलेखन किट का उपयोग करके इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन के लिए टेम्पलेट के रूप में इसका उपयोग करें। प्रदान किए गए प्रोटोकॉल का पालन करें और लिथियम क्लोराइड वर्षा27 के माध्यम से शुद्ध करें। शुद्ध आरएनए को न्यूक्लियस-मुक्त एच2ओ के 10 μL में पुन: निलंबित करें और माइक्रोइंजेक्शन मिश्रण में उपयोग के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत करने से पहले इसे निर्धारित करें।
  2. दो एसजीआरएनए गाइड तैयार करें।
    1. व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एक्सएल 1 ब्लू बैक्टीरियल एगर स्टैब (विवरण के लिए सामग्री की तालिका देखें) से बैक्टीरियल संस्कृतियों को बढ़ाकर एसजीआरएनए प्लास्मिड को उसी तरह तैयार करें जैसे ऊपर एमएलएम 3613 (चरण 2.1.1), एम्पीसिलीन के बजाय कनामाइसिन का उपयोग करने के अलावा।
    2. ऊपर डिजाइन किए गए एसजीआरएनए गाइडों के लिए पूरक एकल-फंसे हुए ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स (एसएसओडीएन) के दो जोड़े को पहले 1x एनीलिंग बफर में 100 μM की एकाग्रता में पुन: स्थापित करके।
    3. दो एसजीआरएनए में से प्रत्येक के लिए अलग-अलग प्रतिक्रियाओं में, थर्मल साइक्लर का उपयोग करके पूरक एसएसओडीएन की जोड़ी को नष्ट करें। प्रत्येक पूरक एसएसओडीएन जोड़ी के 2 μg को 50 μL एनीलिंग बफर के साथ मिलाएं और 2 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें, फिर 45 मिनट में 25 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा करें।
    4. व्यावसायिक रूप से उपलब्ध प्लास्मिड को पचाएं जिसमें एक जीआरएनए पाड़ होता है। डीआर 274 प्लास्मिड के 2 μg को 1 μL BSAI, 2 μL उचित बफर, और ddH 2 O से20μL का उपयोग करके 1 घंटे के लिए 37 °C पर पचाएं। जेल वैद्युतकणसंचलन28 का उपयोग करके रैखिककरण (वैकल्पिक: पीसीआर शुद्धिकरण किट का उपयोग करके शुद्ध करें) की पुष्टि करें।
    5. दो अलग-अलग बंधाव प्रतिक्रियाओं (प्रत्येक एसजीआरएनए के लिए एक) में, रैखिक डीआर 274 प्लास्मिड के साथ एनाल्ड एसएसओडीएन को शामिल करें। 3: 1 के मोलर इंसर्ट: वेक्टर अनुपात का उपयोग करें, एक ऑनलाइन लिगेशन कैलकुलेटर के माध्यम से उपयुक्त द्रव्यमान की गणना करें। सम्मिलित और वेक्टर के आवश्यक द्रव्यमान को 1 μL T4 DNA लिगेज, 2 μL लिगेशन बफर, और ddH 2 O से12μL के साथ मिलाएं और 12 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें।
    6. मानक दृष्टिकोण का उपयोग करके लिगेटेड उत्पाद के 2 μL को उपयुक्त सक्षम कोशिकाओं (जैसे 10° कोशिकाओं) में बदलें, और फिर व्यावसायिक रूप से उपलब्ध मिनीप्रेप किट का उपयोग करके उत्पाद को बढ़ाएं और शुद्ध करें। वैकल्पिक: इस उत्पाद का ग्लिसरॉल स्टॉक बनाएं।
    7. 3'डाउनस्ट्रीम प्रतिबंध साइट का उपयोग करके प्रत्येक गाइड के 2 μg को रैखिक करके दो एसजीआरएनए को स्थानांतरित करें जो यथासंभव अंतरिक्ष अनुक्रम के अंत के करीब है। डीआर 274 प्लास्मिड के लिए, हिंद III के साथ रैखिक करें, और फिर पीसीआर शुद्धिकरण किट का उपयोग करके आरएनए टेम्पलेट को शुद्ध करें, क्षालन बफर के 30 μL में पुन: निलंबन करें।
    8. आरएनए ट्रांसक्रिप्शन किट का उपयोग करके दो गाइडों को ट्रांसक्रिप्ट करें। निर्माता के प्रोटोकॉल का पालन करें और लिथियम क्लोराइड वर्षा27 के माध्यम से शुद्ध करें। दो शुद्ध एसजीआरएनए गाइडों को न्यूक्लियस-मुक्त एच2ओ के 10 μL में पुन: निलंबित करें, मात्रा निर्धारित करें, और माइक्रोइंजेक्शन मिश्रण में उपयोग के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
      नोट: आरएनए ट्रांसक्रिप्शन किट में 5 'कैप या पॉली-ए पूंछ शामिल नहीं हो सकती है।
  3. डबल-फंसे हुए, बहिर्जात एचडीआर रिपोर्टर टेम्पलेट तैयार करें।
    नोट: टेम्पलेट को दो भागों में संश्लेषित किया जाता है, एक अपस्ट्रीम और एक एमवेनस वाईएफपी रिपोर्टर जीन का डाउनस्ट्रीम। ये दो खंड एक वाणिज्यिक प्रदाता के माध्यम से ऑर्डर किए गए सिंथेटिक निर्माण हैं और फिर पीकेएचआर 5 (जिसमें एमवेनस वाईएफपी शामिल है) प्लास्मिड में क्रमिक रूप से शामिल होते हैं।
    1. व्यावसायिक रूप से उपलब्ध DH5e बैक्टीरियल स्ट्रेन (विवरण के लिए सामग्री की तालिका देखें) से बैक्टीरियल संस्कृतियों को बढ़ाकर pKHR5 प्लास्मिड को उसी तरह तैयार करें जैसे ऊपर MLM3613 (चरण 2.1.1)।
      नोट: पीकेएचआर 5 प्लास्मिड में एमवेनस वाईएफपी रिपोर्टर जीन अनुक्रम होता है।
    2. टीई बफर में ऊपर डिज़ाइन किए गए दो टेम्प्लेट सेगमेंट को 100 μM तक पुन: निलंबित करें और फिर 10° कोशिकाओं में बदल जाएं।
    3. चरण 1.3.3 में चुने गए प्रतिबंध एंजाइमों का उपयोग करके पहले टेम्पलेट सेगमेंट (एमवेनस वाईएफपी रिपोर्टर जीन के अपस्ट्रीम) और पीकेएचआर 5 प्लास्मिड को पचाएं।
      नोट: एमसीएस में चयनित प्रतिबंध साइटों की निकटता के कारण पीकेएचआर 5 का अनुक्रमिक पाचन आवश्यक है।
    4. अपस्ट्रीम टेम्प्लेट सेगमेंट के लिए पीकेएचआर 5 प्लास्मिड तैयार करने के लिए, 4 μg pKHR5 (चरण 2.2.4 के अनुसार) को एसएएलआई के साथ पचाएं और फिर पीसीआर शुद्धिकरण किट का उपयोग करके शुद्ध करें। ddH2O के 30 μL में पुन: निलंबित करें और XhoI के साथ दूसरी पाचन प्रतिक्रिया के लिए इसे टेम्पलेट के रूप में उपयोग करें। पीसीआर शुद्धिकरण किट का उपयोग करके उत्पाद को शुद्ध करें।
    5. टेम्प्लेट सेगमेंट (चरण 2.3.2), एक्सएचओआई के 1 μL, SALI के 1 μL, उचित बफर के 2 μL, और ddH 2 O से20μL को 37 °C पर 1 घंटे के लिए पचाकर पहला टेम्पलेट सेगमेंट तैयार करें और उत्पाद को जेल-शुद्ध करें।
    6. चरण 2.2.5 में वर्णित प्रतिक्रिया स्थितियों का उपयोग करके तैयार पीकेएचआर 5 में चरण 2.3.5 से अपस्ट्रीम टेम्पलेट सेगमेंट को सूचीबद्ध करें। लिगेटेड उत्पाद को सक्षम 10° कोशिकाओं में बदलें, एक मिनीप्रेप का उपयोग करके बढ़ाएं और शुद्ध करें (वैकल्पिक: इस उत्पाद का ग्लिसरॉल स्टॉक बनाएं)।
    7. चरण 2.3.6 से लिगेटेड उत्पाद का उपयोग करें (जिसमें mVenus YFP रिपोर्टर जीन के ऊपर pKHR5 प्लास्मिड में पहला टेम्पलेट सेगमेंट होता है) और दूसरे (mVenus रिपोर्टर के डाउनस्ट्रीम) टेम्पलेट सेगमेंट के लिए तैयार करने के लिए डाइजेस्ट करें। बीएएमएचआई के साथ लिगेटेड उत्पाद के 4 μg (चरण 2.3.6 से, चरण 2.2.4 में) को पचाएं, और फिर पीसीआर शुद्धिकरण किट का उपयोग करके शुद्ध करें। ddH2O के 30 μL में पुन: निलंबित करें और इसे EcoRI के साथ दूसरी पाचन प्रतिक्रिया के लिए टेम्पलेट के रूप में उपयोग करें। पीसीआर शुद्धिकरण किट का उपयोग करके उत्पाद को शुद्ध करें।
    8. टेम्पलेट सेगमेंट (चरण 2.3.2), बीएएमएचआई के 1 μL, EcoRI के 1 μL, उपयुक्त बफर के 2 μL, और ddH 2 O से20μL को 37 °C पर 1 घंटे के लिए पचाकर दूसरा टेम्पलेट सेगमेंट तैयार करें और उत्पाद को जेल-शुद्ध करें।
    9. चरण 2.2.5 में वर्णित प्रतिक्रिया स्थितियों का उपयोग करके तैयार किए गए पीकेएचआर 5 (चरण 2.3.7 से) में डाउनस्ट्रीम टेम्पलेट सेगमेंट को सूचीबद्ध करें। लिगेटेड उत्पाद को सक्षम कोशिकाओं में बदलें, एक मिनीप्रेप किट का उपयोग करके बढ़ाएं और शुद्ध करें। इस अंतिम उत्पाद का ग्लिसरॉल स्टॉक बनाएं, जिसमें पीकेएचआर 5 के भीतर एमवेनस वाईएफपी रिपोर्टर जीन के दोनों तरफ दोनों टेम्प्लेट सेगमेंट शामिल हैं।
  4. कैस 9 एमआरएनए, दो एसजीआरएनए और बहिर्जात एचडीआर रिपोर्टर टेम्पलेट का उपयोग करके माइक्रोइंजेक्शन मिश्रण तैयार करें।
    1. कैस 9 एमआरएनए के 200 एनजी / μL, प्रत्येक sgRNA के 100 ng / μL, और एक्सोजेनस HDR रिपोर्टर टेम्पलेट के 200 ng / μL को 1x इंजेक्शन बफर में 20 μL की अंतिम मात्रा में मिलाएं।
    2. माइक्रोइंजेक्शन मिश्रण को -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें और तीन फ्रीज-पिघलने चक्रों के बाद अप्रयुक्त मिश्रण को छोड़ दें।
      नोट: प्रत्येक भ्रूण की जर्दी थैली में माइक्रोइंजेक्शन के लिए इस माइक्रोइंजेक्शन मिश्रण के 4 एनएल का उपयोग करें।

3. जेब्राफिश और भ्रूण माइक्रोइंजेक्शन का प्रजनन

नोट: जेब्राफिश प्रजनन और एकल-कोशिका भ्रूण के माइक्रोइंजेक्शन के लिए प्रोटोकॉल पहले 29,30,31 वर्णित किए गए हैं।

  1. प्रजनन के लिए, एबी स्ट्रेन के ज़ेब्राफिश का उपयोग करें और जो 6-12 महीने की उम्र के हैं। निषेचन के बाद लगभग 40 मिनट पर एक-कोशिका चरण में भ्रूण को इंजेक्ट करें ( चित्रा 5 देखें)।
    नोट: इंजेक्शन भ्रूण का जैविक लिंग ज्ञात नहीं था; यौन द्विरूपता32 वर्ष की आयु के लगभग 3 महीने तक स्पष्ट नहीं है।

4. CRISPR-Cas9-संपादित लार्वा ज़ेबराफिश की रिपोर्टर जीन स्क्रीनिंग

  1. सफल एचडीआर संपादनों के लिए स्क्रीन करने के लिए सीआरआईएसपीआर-सीएएस 9 घटकों के माइक्रोइंजेक्शन के बाद जेब्राफिश लार्वा में वाईएफपी एकीकरण की कल्पना करें।
    1. 25 मिमी पेट्री डिश में, निषेचन के बाद 3 दिनों में 24 जेब्राफिश लार्वा को 0.3% ट्राइकेन मीथेन सल्फोनेट (एमएस -222, एचईपीईएस और सोडियम हाइड्रॉक्साइड के साथ पीएच 7.0-7.4 तक बफर) में एनेस्थेटाइज करें, जब तक कि वे अपने आत्म-सही रिफ्लेक्स (आमतौर पर 1-2 मिनट) को खो न दें। एक बार एनेस्थेटाइज्ड होने के बाद, प्रत्येक लार्वा को 24-वेल प्लेट के एक व्यक्तिगत कुएं में स्थानांतरित करें।
    2. जीएफपी / वाईएफपी का पता लगाने में सक्षम माइक्रोस्कोप का उपयोग करके, प्रत्येक व्यक्तिगत लार्वा की आंखों में रिपोर्टर जीन फ्लोरेसेंस के लिए स्क्रीन।
    3. प्रत्येक लार्वा की छवियों को कैप्चर करें और रिपोर्टर जीन अभिव्यक्ति की उपस्थिति या अनुपस्थिति का दस्तावेजीकरण करें।

5. CRISPR-Cas9-संपादित लार्वा ज़ेबराफ़िश की फेनोटाइपिंग

  1. रिपोर्टर जीन स्क्रीनिंग के बाद, प्रत्येक लार्वा पर कार्डियक फेनोटाइपिंग (हृदय गति, पेरिकार्डियल आयाम, ईसीजी) करें। फेनोटाइप रिपोर्टर जीन-पॉजिटिव और -नकारात्मक लार्वा की एक समान संख्या है।
    1. लार्वा को एनेस्थेटाइज्ड करते समय हृदय गति और पेरिकार्डियल आयामों को मापने के लिए सीसीडी कैमरा (जैसे, ब्लैकफ्लाई यूएसबी 3) और वीडियो और इमेज रिकॉर्डिंग सॉफ्टवेयर (जैसे, इमेजजे के लिए माइक्रोमैनेजर) का उपयोग करें।
    2. हृदय गति को मापने के लिए, माइक्रोमैनेजर का उपयोग करके, रुचि का एक क्षेत्र (आरओआई) बनाएं ताकि दिल को पकड़ा जा सके और अन्य संरचनाओं को बाहर किया जा सके।
      1. छवि अनुक्रम के रूप में वीडियो को इमेजजे में आयात करें, और सुनिश्चित करें कि छवियों की संख्या के तहत फ्रेम की सही संख्या दर्ज की गई है।
      2. फ़ाइल खुली होने के बाद, हृदय के भीतर आरओआई खींचने के लिए आयत चयन उपकरण का उपयोग करें, लेकिन अन्य गतिशील तत्वों को छोड़कर, और आरओआई प्रबंधक में आरओआई को सहेजें (विश्लेषण करें | उपकरण | आरओआई प्रबंधक)।
      3. इंस्टॉल | प्लगइन्स पर क्लिक करें, और डिफ़ॉल्ट फ़ोल्डर में कोड स्थापित करने के लिए हृदय गति एल्गोरिदम का चयन करें, फिर प्लगइन्स टैब के निचले भाग में प्लगइन का चयन करें। पॉप-अप विंडो से बीट्स प्रति मिनट (बीपीएम) रिकॉर्ड करें।
        नोट: छवि पहचान एल्गोरिदम वेंट्रिकुलर सिस्टोलिक संकुचन से जुड़े व्यक्तिगत पिक्सेल घनत्व परिवर्तनों को मापकर हृदय गति का पता लगाने के लिए कस्टम-लिखे गए थे। कोड https://github.com/dpoburko/zFish_HR पर पाया जा सकता है।
    3. पेरिकार्डियल थैली और आंखों में से एक के चारों ओर आरओआई को मुक्त करने के लिए इमेजजे जैसे मुफ्त उपकरण का उपयोग करके पेरिकार्डियल आयामों को मापें। इमेजजे में छवि खोलें और पेरिकार्डियल थैली के चारों ओर पहले आरओआई खींचने के लिए बहुभुज चयन उपकरण का उपयोग करें, इसे चरण 5.1.2 में आरओआई प्रबंधक में सहेजें, और आंख के लिए दोहराएं। ROI प्रबंधन r में इन दो ROIsका चयन करें, फिर माप क्लिक करें। प्रत्येक लार्वा में आंख क्षेत्र में सामान्यीकृत पेरिकार्डियल थैली के क्षेत्र की गणना करने के लिए प्रत्येक के लिए क्षेत्र रिकॉर्ड करें।
    4. हृदय गति और पेरिकार्डियल माप के बाद, व्यक्तिगत लार्वा से ईसीजी रिकॉर्ड करें।
      नोट: ज़ेबराफिश ईसीजी को रिकॉर्ड करने के लिए प्रोटोकॉल पहले 33,34,35,36 वर्णित किए गए हैं।

6. CRISPR-Cas9-संपादित लार्वा ज़ेबराफिश की जीनोटाइपिंग

  1. फेनोटाइपिक विश्लेषण के बाद, सटीक और सटीक एचडीआर जीन संपादन की पुष्टि करने के लिए ऑन-और संभावित ऑफ-टारगेट जीनोटाइपिंग का संचालन करें।
    1. हॉटशॉट विधि37 का उपयोग करके जीडीएनए को अलग करने के लिए 0.3% एमएस -222 और टेल क्लिप में प्रत्येक 3 डीपीएफ लार्वा को एनेस्थेटाइज करें। प्रत्येक एक्साइज्ड टेल क्लिप को 20 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर 25 एमएम एनएओएच के 15 μL में इनक्यूबेट करें। फिर, ट्राइस-एचसीएल के 1.5 μL के साथ बेअसर करें और 30 सेकंड के लिए 13,800 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें। सुपरनैटेंट को बनाए रखें, जिसमें निकाले गए जीडीएनए होते हैं।
    2. ई 3 मीडिया में लार्वा को पुनर्प्राप्त करें और यदि आगे के विकास या अध्ययन का इरादा है तो उन्हें आवास प्रणाली में वापस कर दें।
    3. निकाले गए जीडीएनए को टेम्पलेट के रूप में उपयोग करते हुए, ऑन-टारगेट और संभावित ऑफ-टारगेट साइटों का पीसीआर-आधारित सेंगर अनुक्रमण करें।
      नोट: वैकल्पिक: एक नेस्टेड पीसीआर दृष्टिकोण कुछ जीन क्षेत्रों के लिए फायदेमंद हो सकता है।
    4. सुनिश्चित करें कि ऑन-टारगेट प्राइमर डिज़ाइन उत्परिवर्तन साइट और निकटतम एसजीआरएनए बाइंडिंग साइट को कैप्चर करता है। रुचि के जीन में एकीकरण की पुष्टि करने के लिए सम्मिलित होमोलॉजी आर्म और लक्ष्य जीन से संक्रमण का पता लगाने के लिए एक अलग अनुक्रमण प्राइमर डिजाइन करें। चरण 1.2.3 में पहचाने गए शीर्ष तीन संभावित ऑफ-टारगेट साइटों को अनुक्रमित करने के लिए प्राइमर डिज़ाइन करें।
      नोट: गाइड-डिज़ाइन सॉफ़्टवेयर प्रोग्राम अक्सर प्राइमरों का उपयोग करने का सुझाव देते हैं, लेकिन इष्टतम परिणाम प्राप्त करने के लिए अनुकूलन आवश्यक हो सकता है।
    5. प्रत्येक ज़ेब्राफिश के लिए पहचाने जाने योग्य ऑन-और ऑफ-टारगेट जीनोटाइपिंग, हृदय गति, पेरिकार्डियल आयाम, ईसीजी फेनोटाइपिंग और रिपोर्टर जीन डेटा संकलित करें।

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Representative Results

इस दो-एसजीआरएनए एक्सॉन प्रतिस्थापन सीआरआईएसपीआर दृष्टिकोण के सफल उपयोग को जेब्राफिश में जेडकेसीएनएच 6 ए जीन में एलक्यूटीएस से जुड़े संस्करण, आर 56 क्यू को इंजीनियर करने के लिए एक सटीक संपादन की शुरूआत और सरल पहचान द्वारा उजागर किया गया है। चित्रा 6 ऊपर वर्णित सीआरआईएसपीआर घटकों के साथ एक-कोशिका भ्रूण चरण में इंजेक्ट किए गए एक प्रतिनिधि 3 डीपीएफ लार्वा को दर्शाता है। चित्रा 6 ए सफल टेम्पलेट एकीकरण के सकारात्मक रिपोर्टर के रूप में आंख लेंस में वाईएफपी एमवेनस रिपोर्टर जीन अभिव्यक्ति की उपस्थिति को दर्शाता है। चित्रा 6 बी, सी क्रमशः जंगली प्रकार और रिपोर्टर जीन पॉजिटिव मछली के पूंछ क्लिप नमूनों से अलग जीनोमिक डीएनए से प्राप्त सेंगर अनुक्रमण क्रोमैटोग्राम दिखाता है। रिपोर्टर जीन-पॉजिटिव मछलियों में सटीक संपादन, जी टू ए पाया गया, जो आर 56 क्यू संस्करण को जेडकेसीएनएच 6 ए में पेश करता है। जीनोटाइपिंग ने वाईएफपी रिपोर्टर जीन अभिव्यक्ति और सटीक आर 56 क्यू जीन संपादन की उपस्थिति के बीच 100% सहसंबंध दिखाया, इस फ्लोरेसेंस स्क्रीनिंग टूल को मान्य किया।

जीन-संपादित ज़ेब्राफिश लार्वा का फेनोटाइपिंग 3 डीपीएफ पर आयोजित किया गया था। चित्रा 7 जंगली प्रकार और आर 56 क्यू जीन-संपादित लार्वा से प्रतिनिधि परिणाम दिखाता है। ऊपर वर्णित वीडियो कैप्चर द्वारा हृदय गति का पता लगाया गया था। आंख क्षेत्र के अनुपात के रूप में पेरिकार्डियल आयामों के माप का एक उदाहरण दिखाया गया है (चित्रा 7 ए)। चित्रा 7 बी सामान्यीकृत पेरिकार्डियल आयामों के खिलाफ हृदय गति को प्लॉट करता है, जो पेरिकार्डियल एडिमा में वृद्धि के साथ ब्रैडीकार्डिया की प्रवृत्ति को उजागर करता है, जो जेब्राफिश 8,38,39,40 में कार्डियक रिपोलराइजेशन के विकारों से जुड़ा हुआ है। चित्रा 7 सी 3 डीपीएफ लार्वा से ईसीजी रिकॉर्डिंग का एक प्रतिनिधि उदाहरण दिखाता है। मानक अंतराल (क्यूटी, क्यूआरएस) को औसत ईसीजी संकेतों से मापा गया था।

Figure 1
चित्रा 1: जेब्राफिश जीनोम में एचडीआर टेम्पलेट का एकीकरण। गहरे भूरे, होमोलॉजी आर्म्स; कैस 9 रीकटिंग को रोकने के लिए साइलेंट म्यूटेशन के साथ हरे, एसजीआरएनए गाइड लक्ष्य; हल्के भूरे, ब्याज के लक्ष्य एक्सॉन; लाल रेखा, बिंदु उत्परिवर्तन; एक α-क्रिस्टललिन प्रमोटर के तहत पीला, एमवेनस वाईएफपी रिपोर्टर जीन; धराशायी रेखाएं होमोलॉजी का संकेत देती हैं। यहां, लक्षित सटीक संपादन zkcnh6a जीन के एक्सॉन 2 में R56Q था। संक्षेप: एचडीआर = होमोलॉजी-निर्देशित मरम्मत; एसजीआरएनए = एकल-गाइड आरएनए; वाईएफपी = पीला फ्लोरोसेंट प्रोटीन; डीएसबी = डबल-फंसे हुए ब्रेक; डब्ल्यूटी = जंगली प्रकार। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: दो-एसजीआरएनए सीआरआईएसपीआर-कैस 9 दृष्टिकोण का उपयोग करके ज़ेब्राफिश जीन में सटीक संपादन को इंजीनियर करने के चरणों का सारांश (संबंधित प्रोटोकॉल चरण संख्याओं को कोष्ठक में इंगित किया गया है)। संक्षेप: एसजीआरएनए = एकल-गाइड आरएनए; वाईएफपी = पीला फ्लोरोसेंट प्रोटीन; जीडीएनए = जीनोमिक डीएनए; ईसीजी = इलेक्ट्रोकार्डियोग्राम; डीपीएफ = निषेचन के बाद के दिन; एमएस -222 = ट्राइकेन मीथेन सल्फोनेट। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्र 3: एक्सोजेनस टेम्प्लेट टुकड़े और एसजीआरएनए गाइड तैयार करना। (ए) पीकेएचआर 5 में एमवेनस वाईएफपी रिपोर्टर जीन अनुक्रम के अपस्ट्रीम और डाउनस्ट्रीम टेम्पलेट टुकड़ों का अनुक्रमिक पाचन और बंधाव। (बी) पूरक एसजीआरएनए जोड़े का एनीलिंग जिसमें डीआर 274 में बंधाव के लिए प्रतिबंध शामिल है। संक्षेप: एसजीआरएनए = एकल-गाइड आरएनए; वाईएफपी = पीला फ्लोरोसेंट प्रोटीन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: एचडीआर टेम्पलेट का निर्माण। गहरे भूरे, होमोलॉजी आर्म्स; कैस 9 रीकटिंग को रोकने के लिए साइलेंट म्यूटेशन के साथ हरे, एसजीआरएनए गाइड लक्ष्य; हल्के भूरे, ब्याज के लक्ष्य एक्सॉन; लाल रेखा, बिंदु उत्परिवर्तन; एक α-क्रिस्टललिन प्रमोटर के तहत पीला, एमवेनस वाईएफपी रिपोर्टर जीन; गहरे नीले रंग की रेखा, प्रतिबंध साइटों को जोड़ा गया। दो टेम्प्लेट टुकड़े पीकेएचआर 5 प्लास्मिड दाता में एकीकृत हैं। संक्षेप: एचडीआर = होमोलॉजी-निर्देशित मरम्मत; एसजीआरएनए = एकल-गाइड आरएनए। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: सीआरआईएसपीआर-सीएएस 9 घटकों के साथ एकल-कोशिका ज़ेब्राफिश भ्रूण का माइक्रोइंजेक्शन। स्केल बार = 0.5 मिमी। संक्षेप: एचडीआर = होमोलॉजी-निर्देशित मरम्मत; एसजीआरएनए = एकल-गाइड आरएनए। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 6
चित्रा 6: एमवेनस वाईएफपी रिपोर्टर जीन फ्लोरेसेंस का आसान पता लगाना लक्ष्य जीन में सकारात्मक एचडीआर बहिर्जात टेम्पलेट एकीकरण को इंगित करता है। (ए) एक संपादित ज़ेब्राफिश लार्वा में ज़ेबराफ़िश आंख (तीर) में एमवेनस वाईएफपी अभिव्यक्ति का उदाहरण। (बी) सफल संपादन की पुष्टि क्रोमैटोग्राम अनुक्रमण (बाएं, डब्ल्यूटी; दाएं, आर 56 क्यू संपादन) द्वारा की जाती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 7
चित्रा 7: zkcnh6a लक्ष्य जीन में सटीक R56Q संपादन के बाद 3 डीपीएफ ज़ेब्राफिश में कार्डियक परिणामों का फेनोटाइपिक विश्लेषण। पेरिकार्डियल थैली की सीमाओं को उपयोगकर्ता द्वारा पारभासी और रंजकता में परिवर्तन के आधार पर एकल रिकॉर्डिंग फ्रेम से चिह्नित किया गया था। सामान्य पेरिकार्डियल आयाम और पेरिकार्डियल बहाव के उदाहरण दिखाए गए हैं। स्केल बार = 0.5 मिमी (बी) पेरिकार्डियल आयाम (आंख आयाम के सापेक्ष) और हृदय गति के बीच सहसंबंध, आर2 = 0.33। (सी) 3 डीपीएफ जेब्राफिश लार्वा हार्ट (बाएं) और औसत कॉम्प्लेक्स (दाएं) से ईसीजी रिकॉर्डिंग का उदाहरण। हृदय गति, 131 बीपीएम; हृदय गति-सही क्यूटीसी अंतराल, 460 एमएस। संक्षेप: डीपीएफ = निषेचन के बाद के दिन; ईसीजी = इलेक्ट्रोकार्डियोग्राम। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

CRISPR-Cas9 का उपयोग करके सटीक जीन संपादन की इंजीनियरिंग को एचडीआर तंत्र की कम क्षमता और उनकी कुशल पहचान से चुनौती दी जाती है। यहां, एक सीआरआईएसपीआर-कैस 9-आधारित दो-एसजीआरएनए एक्सॉन प्रतिस्थापन दृष्टिकोण का वर्णन किया गया है जो सकारात्मक संपादनों के सीधे दृश्य पहचान के साथ ज़ेबराफिश में सटीक संपादन पैदा करता है। इस दृष्टिकोण की प्रभावकारिता zkcnh6a जीन में सटीक संपादन उत्पन्न करके प्रदर्शित की जाती है। यह पेपर दिखाता है कि जीन-संपादित ज़ेब्राफिश लार्वा में कार्डियक फ़ंक्शन का मूल्यांकन हृदय गति, पेरिकार्डियल आयाम और ईसीजी आकृति विज्ञान के गैर-इनवेसिव फेनोटाइपिक उपायों का उपयोग करके कैसे किया जा सकता है। यह दृष्टिकोण, जीन संपादन शुरू करने से लेकर फेनोटाइपिक मूल्यांकन तक, लगभग 1 सप्ताह के भीतर शुरू से अंत तक पूरा किया जा सकता है।

उपरोक्त संपादन और फेनोटाइपिंग दृष्टिकोण के लाभ सीआरआईएसपीआर संशोधन डिजाइन की आसानी, कई शारीरिक प्रणालियों में व्यापक प्रयोज्यता, बड़े जीन या जीन टुकड़े सम्मिलित करने की क्षमता और विकास और पीढ़ियों के माध्यम से अनुदैर्ध्य रूप से वेरिएंट प्रभावों को ट्रैक करने की क्षमता है। इस दृष्टिकोण में सटीक संपादन की सफलता बड़े टेम्पलेट आकार (रिपोर्टर जीन सम्मिलित और लंबे होमोलॉजी हथियारों के कारण) के संयोजन से संबंधित हो सकती है, जिसे ज़ेबराफ़िश14 में संपादन की दक्षता बढ़ाने के लिए दिखाया गया है, और दो-एसजीआरएनए-गाइड रणनीति, जिसका उपयोग ज़ेब्राफ़िश टैलेन-प्रेरित संपादन8 में प्रभावी ढंग से किया गया है।

वर्णित दृष्टिकोण की एक विशेष ताकत बड़े जीन या जीन टुकड़े डालने की क्षमता है। यह उपयोगी हो सकता है, उदाहरण के लिए, मानव ऑर्थोलॉग41 को सम्मिलित करने के लिए, ऑर्थोलॉग्स के बीच अधिक चिकित्सकीय रूप से ट्रांसलैटेबल लक्षण वर्णन और तुलना की अनुमति देता है। वैकल्पिक रूप से, कैस एंजाइमों को एन्कोडिंग करने वाले जीन भी डाले जा सकते हैं, जिससे विवो सीआरआईएसपीआर संपादन तंत्र के साथ ज़ेब्राफिश की एक पंक्ति की अनुमति मिलती है, जो एक इंड्यूसेबल सिस्टम प्रदान करती है। इसी तरह, वैकल्पिक सीआरआईएसपीआर तंत्र, जैसे कि प्राइम एडिटिंग, को एकीकृत किया जा सकता है और इसके परिणामस्वरूप ज़ेबराफिश की एक पंक्ति हो सकती है जो आसानी से सटीक और कुशलता से संपादित की जाती है।

इस दृष्टिकोण के फायदों के बावजूद, कुछ सीमाएं हैं। सबसे पहले, केवल एक जीन और लोकस को संशोधित किया गया है, और अन्य साइटों या अन्य जीनों में आगे का परीक्षण यह मूल्यांकन करने के लिए आवश्यक है कि यह दृष्टिकोण कितना व्यापक रूप से लागू होता है। आवश्यक लंबे होमोलॉजी हथियारों के कारण, टेम्पलेट डिजाइन लागत अधिक है; हालांकि, यह कुशल स्क्रीनिंग द्वारा ऑफसेट किया जा सकता है। एक और सीमा यह है कि स्क्रीनिंग दृष्टिकोण को प्रतिदीप्ति पहचान क्षमता की आवश्यकता होती है। हालांकि, ऑप्टिकल आवश्यकताएं अपेक्षाकृत कम हैं और इसे कस्टम-निर्मित या व्यावसायिक रूप से काफी कम लागत पर खरीदा जा सकता है। दो-एसजीआरएनए दृष्टिकोण का उपयोग करने से संभावित ऑफ-टारगेट घटनाओं की संख्या बढ़ जाती है; हालांकि, यह कम संभावना से कम हो जाता है कि दो एसजीआरएनए गाइड दोनों इस तरह से नष्ट हो जाएंगे जो रिपोर्टर जीन अभिव्यक्ति प्राप्त करने के लिए टेम्पलेट को शामिल करने की सुविधा प्रदान करता है। अंत में, कैस 9 एमआरएनए का उपयोग करने से मोज़ेकिज्म हो सकता है क्योंकि कैस 9 बाद के विकास चरणों तक सक्रिय नहीं है। यह विशेष ऊतक प्रकारों को अनुक्रमित करके जिम्मेदार ठहराया जा सकता है; हालांकि, ज़ेबराफिश लार्वा के आकार को देखते हुए, यह तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण है।

सारांश में, जेब्राफिश में यह सीआरआईएसपीआर-कैस 9 दो-एसजीआरएनए सटीक संपादन दृष्टिकोण सकारात्मक संपादनों के सरल दृश्य पहचान को सक्षम बनाता है और इसे किसी भी स्थान पर रुचि के बड़े जीन को शामिल करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। फेनोटाइपिक उपायों के साथ संयुक्त, यह नैदानिक रूप से प्रासंगिक कार्डियक वेरिएंट का अध्ययन करने के लिए एक विश्वसनीय और उच्च थ्रूपुट प्लेटफॉर्म की अनुमति देता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

इस शोध को कनाडाई इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ रिसर्च प्रोजेक्ट ग्रांट (टीडब्ल्यूसी) और नेचुरल साइंसेज एंड इंजीनियरिंग रिसर्च काउंसिल ऑफ कनाडा डिस्कवरी ग्रांट्स (टीडब्ल्यूसी) द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Program
CRISPOR TEFOR Infrastructure
ENSEMBL European Bioinformatics Institute
ImageJ National Institutes of Health (NIH)
Micro-Manager Open Source (Github)
NEBiocalculator New England Biolabs (NEB)
EQUIPMENT
24-well Plate VWR
25 mm Petri Dish VWR
Blackfly USB3 Camera Teledyne FLIR
C1000 Thermal Cycler Bio-Rad
Centrifuge 5415C Eppendorf
EZNA Gel Extraction Kit Omega Biotek
MAXIscript T7 Transcription Kit Invitrogen
MaxQ 5000 Incubator Barnstead Lab Line
Miniprep Kit Qiagen
mMessage mMachine T7 Ultra Transcription Kit Invitrogen
ND1000 Spectrophotometer Nanodrop
PCR Purification Kit Qiagen
PLI 100A Picoinjector Harvard Apparatus
PowerPac Basic Power Supply Bio-Rad
Stemi 305 Steroscope Zeiss
Wide Mini Sub Cell GT Electrophoresis System Bio-Rad
ZebTec Zebrafish Housing System Tecniplast
SERVICES
Gene Synthesis Genewiz
Sanger Sequencing Genewiz
REAGENTS
10β Competent Cells NEB
10X PCR Buffer Qiagen
100 mM Nucleotide Mixture ABM
Ampicillin Sigma
BamHI Endonuclease w/ buffer NEB
BsaI Endonuclease w/ buffer NEB
DR274 Plasmid (XL1 Blue bacterial agar stab) Addgene
EcoRI Endonuclease w/ buffer NEB
Glycerol
HEPES Sigma
HindIII Endonuclease w/ buffer NEB
Kanamycin Sigma
Methylene Blue Sigma
MLM3613 Plasmid (XL1 Blue bacterial agar stab) Addgene
MS-222 (Tricaine) Sigma
pKHR5 Plasmid (DH5α bacterial agar stab) Addgene
PmeI Endonuclease w/ buffer NEB
SalI Endonuclease w/ buffer NEB
Sodium Hydroxide Sigma
T4 Ligase w/ buffer Sigma
Taq Polymerase Qiagen
TE Buffer Sigma
Tris Hydrochloride Sigma
XhoI Endonuclease w/ buffer NEB
RECIPES
Solution Component Supplier
Annealing Buffer (pH 7.5-8.0) 10 mM Tris Sigma
50 mM NaCl Sigma
1 mM EDTA Sigma
E3 Media (pH 7.2) 5 mM NaCl Sigma
0.17 mM KCl Sigma
0.33 mM CaCl2 Sigma
0.33 mM MgSO4 Sigma
Injection Buffer (pH 7.5) 20 mM HEPES Sigma
150 mM KCl Sigma

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References

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जीव विज्ञान अंक 187 CRISPR-Cas9 ज़ेब्राफिश होमोलॉजी-निर्देशित मरम्मत एचईआरजी लॉन्ग क्यूटी सिंड्रोम
CRISPR-Cas9-मध्यस्थता सटीक नॉक-इन संपादन ज़ेब्राफिश हार्ट्स में
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Simpson, K. E., Faizi, S.,… More

Simpson, K. E., Faizi, S., Venkateshappa, R., Yip, M., Johal, R., Poburko, D., Cheng, Y. M., Hunter, D., Lin, E., Tibbits, G. F., Claydon, T. W. CRISPR-Cas9-Mediated Precise Knock-In Edits in Zebrafish Hearts. J. Vis. Exp. (187), e64209, doi:10.3791/64209 (2022).

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