Summary
Das vorliegende Protokoll entwickelte eine Methode zur Abschätzung der Ausbeute von Verbindungen auf der TLC-Platte unter Verwendung der Blau-LED-Beleuchtungstechnik. Die Vorteile dieses Ansatzes sind, dass er sicher, effektiv und kostengünstig ist und es dem Forscher ermöglicht, mehrere Proben gleichzeitig zu messen.
Abstract
Die Dünnschichtchromatographie (TLC) ist eine zugängliche Analysetechnik, die in der organischen Chemie umfassend eingesetzt wurde, um die Ausbeute unbekannter Proben zu quantifizieren. Die vorliegende Studie entwickelte eine effektive, kostengünstige und sichere Methode, um die Ausbeute von Proben auf einer TLC-Platte mit dem blauen LED-Illuminator abzuschätzen. Lovastatin, extrahiert aus Aspergillus terreus , war die Beispielverbindung, die in der vorliegenden Studie verwendet wurde. Zur Bewertung der Ausbeute von Lovastatin wurden Regressionsmodelle verwendet, die auf dem Lovastatin-Standard basieren. Drei Methoden wurden verglichen: Bioassay, UV-Detektion und Blue-LED-Beleuchtung. Das Ergebnis zeigte, dass die Blue-LED-Beleuchtungsmethode deutlich zeiteffektiver ist als UV-Detektions- und Bioassay-Methoden. Darüber hinaus war die Blau-LED-Beleuchtung eine relativ sichere Option, da biologische Gefahren bei der Bioassay-Methode (z. B. mikrobielle Infektion) und UV-Exposition bei der UV-Detektionsmethode besorgt waren. Im Vergleich zu den teuren Methoden, die spezielle Instrumente und langes Training erfordern, bevor sie unabhängig arbeiten können, wie GC, HPLC und HPTLC, war die Verwendung des Blue-LED-Illuminators eine wirtschaftliche Option, um die Ausbeute von Proben von einer TLC-Platte abzuschätzen.
Introduction
Die Dünnschichtchromatographie (TLC) ist als qualitative und quantitative Technik auf dem Gebiet der organischen Chemie weit verbreitet 1,2,3. Die Hauptvorteile von TLC sind, dass es eine schnelle Erkennung und flexible Probenanforderungen bietet und keine spezielle Ausrüstung erfordert4. Obwohl viele fortschrittliche Ansätze etabliert wurden, ist TLC bis heute die Hauptmethode zur Identifizierung unbekannter Proben in einem Gemisch. Die Herausforderung dieses Ansatzes ist jedoch der Mangel an sicheren und kostengünstigen Geräten zur Quantifizierung der Probenausbeute, insbesondere für Entwicklungslaboratorien mit begrenzten Budgets. Die vorliegende Studie zielte daher darauf ab, eine effiziente, sichere und kostengünstige Methode in Kombination mit TLC zu entwickeln, um die Ausbeute der Proben abzuschätzen.
Im Gegensatz zu Hochleistungs-TLC (HPTLC), Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) und Gaschromatographie (GC) mit strengen Probenanforderungen, zeitaufwändig und Mehrschritt-Beteiligung für die Probenvorbereitung 1,5 zeigte TLC mehrere Vorteile. Erstens können HPLC und GC für die Probenvorbereitung den Rohextrakt nicht nachweisen, da der Rohextrakt die Säule von HPLC und GC verstopfen kann. Zweitens, wenn die Proben nicht UV-geeignet sind (wichtig für die HPLC-Analyse) oder mit geringer Flüchtigkeit (wichtig für die GC-Analyse), kann TLC auf diese Proben angewendet werden, und die Verwendung von Visualisierungsreagenz macht die isolierten Proben auf dünnen Schichtensichtbar 6,7,8. Drittens erfordern HPLC und GC für allgemeine Anwender im Vergleich zu TLC im Allgemeinen ein relativ langes Vortraining, bevor sie unabhängig arbeiten können. Darüber hinaus kann die quantitative TLC-Analyse, bekannt als Hochleistungs-TLC (HPTLC), die Informationen auf einer TLC-Platte mit einem hochempfindlichen Scanner digitalisieren. Die Kosten für das HPTLC-System sind jedoch relativ teuer. Daher ist die Entwicklung eines kostengünstigen und schnellen Ansatzes zur Quantifizierung von Proben auf der TLC-Platte ein wichtiges Thema.
Ähnliche Methoden wurden für die TLC-Ertragsquantifizierung entwickelt; Zum Beispiel berichtete Johnson9 über eine Technik, die die Quantifizierung der Proben auf einer TLC-Platte ermöglicht, indem ein Flachbettscanner verwendet wird, der an einen Computer angeschlossen ist. Im Jahr 2001 entwickelten El-Gindy et al.10 die TLC-densitometrische Methode, mit der die Verbindung mit optischer Dichte nachgewiesen wurde, und die Technik wurde auch von Elkady et al.11 angewendet. Im Jahr 2007 präsentierte Hess2 die digital enhanced-TLC (DE-TLC) Methode, die angewendet wird, um die Ausbeute einer Verbindung auf einer TLC-Platte mit einer Digitalkamera in Kombination mit UV-Licht zu detektieren. Hess verglich auch die Kostenunterschiede zwischen HPTLC- und DE-TLC-Methode und kam zu dem Schluss, dass die DE-TLC-Methode aufgrund ihrer erschwinglichen Kosten in High-School- und College-Labors verwendet werden könnte2. Die Kosten für die TLC-densitometrische Methode waren jedoch immer noch teuer, und der Betrieb von ultraviolettem Licht erfordert eine angemessene Vorschulung, falls die Benutzer ultravioletter Strahlung ausgesetzt werden könnten. Daher ist es wünschenswert, in Übereinstimmung mit TLC eine effiziente, sichere und kostengünstige Methode zur Quantifizierung der Probenausbeute zu entwickeln.
Die vorliegende Studie beschrieb ein Protokoll zur Detektion der Probe auf einer TLC-Platte unter Verwendung des blauen LED-Illuminators und entwickelte ein Regressionsmodell mit hoher Zuverlässigkeit (hoher R-Quadrat-Wert), um die Abmessungen der Bänder zu messen und dann die Wirkstoffausbeute zu bestimmen. Schließlich wurde festgestellt, dass die Blau-LED-Beleuchtungsmethode eine relativ sichere (vs. UV-Detektionsmethode), billig (vs. GC, HPLC und HPTLC) und effektiver (vs. Bioassay-Methode) Ansatz zur Ertragsquantifizierung.
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Protocol
Das vorliegende Protokoll wird am Beispiel von Lovastatin beschrieben. Lovastatin wurde aus dem eine Woche alten Aspergillus terreus extrahiert.
1. Extraktion von Verbindungen
HINWEIS: Einzelheiten zur Extraktion von Verbindungen finden Sie in Abbildung 1.
- Kultur Aspergillus terreus auf dem Medium Kartoffeldextrose (PDA, siehe Materialtabelle) bei 30 °C.
- Die Kultur wird 24 h bei 40 °C getrocknet. Die getrocknete Kultur wird mit einer sterilisierten Pinzette in ein 50-ml-Röhrchen überführt und 15 mL Ethylacetat hinzugefügt.
- Die Mischung 1 min lang kräftig durch Wirbeln schütteln und 1 h bei 40 °C mit Schütteln bei 200 U/min inkubieren.
- Das Gemisch mit einem 40 kHz Ultraschallbad (siehe Materialtabelle) bei 40 °C für 1 h beschallen.
- Zentrifugieren Sie die Mischung bei 5.000 x g für 1 min bei Raumtemperatur und filtrieren Sie durch ein 11 μm Filterpapier.
- Extrahieren Sie das Filtrat mit einer gleichen Menge sterilen Wassers in einem Scheidetrichter.
- Nach der Phasentrennung die organische Schicht sammeln und dann in einem Rotationsverdampfer verdampfen (siehe Materialtabelle). Der Rückstand wird in 2 mL Ethylacetat gelöst.
2. Trennung des Rohextrakts durch Normalphasenadsorptionssäule (NP)
- Packen Sie die Säule mit NP-Kieselgel als stationäre Phase und verwenden Sie n-Hexan:Ethylacetat:Trifluoressigsäure (H:E:T; 80:20:0,1, v/v/v) als mobile Phase.
- Laden Sie 2 mL des Extrakts (Schritt 1) auf die Säule und fügen Sie das Lösungsmittel der mobilen Phase mit einer Flussrate von 1 ml / min hinzu, um den Extrakt zu eluieren.
HINWEIS: Der Durchfluss wurde manuell mit einem Absperrhahn gesteuert. - Überprüfen Sie das Abwasser durch TLC, um das Vorhandensein von Lovastatin zu bestätigen, und verdampfen Sie dann in einem Rotationsverdampfer bei 45 °C, bis das Lösungsmittel entfernt ist. Dieser Schritt dauert ca. 20-25 min.
- Der Rückstand wird in 1 ml Ethylacetat gelöst und dann mit einem gleichen Volumen von 1% Trifluoressigsäure gemischt.
- Zentrifugieren Sie die Mischung bei 5.000 x g für 1 min bei Raumtemperatur und sammeln Sie die organische Schicht in einem neuen Glasröhrchen.
3. Herstellung und Beladung von Dünnschichtchromatogrammplatten (TLC)
- 5 μL Proben und Lovastatin-Standards (siehe Materialtabelle) mit einer Kapillarpipette auf die Grundlinie der TLC-Platte setzen, wobei an den Seiten der TLC-Platte ein Rand von 1 cm verbleibt.
- Trocknen Sie die TLC-Platte in einem Abzug für 5 min bei Raumtemperatur.
- Legen Sie die Platte vorsichtig mit einer Pinzette in eine gesättigte Glaskammer, die das Lösungsmittel der mobilen Phase enthält. Decken Sie die Kammer mit einem Glasdeckel ab und lassen Sie die Platte vollständig entfalten.
- Entfernen Sie die Platte aus der Kammer, wenn die Lösungsmittellinie 1 cm von der Oberseite der Platte entfernt ist.
4. Analyse durch die blaue LED-Beleuchtung
- Markieren Sie die Lösungsmittellinie mit einem Bleistift. Trocknen Sie die Platte im Abzug für 10 min bei Raumtemperatur.
- Nach dem Trocknen die Platte sofort in 10%H2SO4 Lösungsmittel einweichen und anschließend 10 min bei Raumtemperatur im Abzug trocknen.
- Legen Sie die Platte auf die Heizplatte, bis die braunen Flecken erscheinen. Stellen Sie sicher, dass die Platte nicht überhitzt ist, da dies die Visualisierung von Lovastatin erschweren könnte.
- Übertragen Sie die Platte auf die blaue LED-Beleuchtung und scannen Sie mit einer kompatiblen Freeware (MiBio Fluo) (siehe Materialtabelle).
5. Ertragsschätzung durch das Regressionsmodell
- Messen Sie die Abmessungen von Bändern mit der ImageJ-Software (siehe Materialtabelle).
- Erstellen Sie ein Regressionsmodell mit Datenanalyse- und Grafiksoftware (siehe Materialtabelle), das auf den absteigenden Konzentrationen der Lovastatin-Standards basiert, einschließlich 1 mg / ml, 0,75 mg / ml, 0,5 mg / ml und 0,25 mg / ml.
- Wenden Sie das Regressionsmodell an, um die Ausbeute der Stichproben zu schätzen.
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Representative Results
In dieser Studie wurde die Blue-LED-Beleuchtungsmethode zur Abschätzung der Ausbeute von Verbindungen vorgestellt, und diese Methode wurde validiert und mit Bioassay- und UV-detektierten Methoden verglichen (Tabelle 1). Die Regressionsmodelle wurden basierend auf den Dimensionen der Banden und der Konzentration von Standards für jeweils drei Methoden entwickelt, um die Ausbeute von Proben vorherzusagen. Erstens betrug in den Ergebnissen der Bioassay-Methode das R-Quadrat zwischen den Dimensionen der Hemmzone und den Lovastatin-Standards 0,99, und die Probenausbeute betrug 0,56 mg, die vom Regressionsmodell vorhergesagt wurde (Abbildung 2). Zweitens betrug bei der UV-Detektionsmethode das R-Quadrat zwischen den Lovastatin-Standards und der Dimension der Banden auf der TLC-Platte 0,97, und die Ausbeute der vom Regressionsmodell vorhergesagten Probe betrug 0,53 mg (Abbildung 3). Bemerkenswerterweise waren die Ränder des Bandes verschwommen und relativ niedrige Signalintensitätsbänder wurden beobachtet (Abbildung 3A). Drittens betrug bei der Blau-LED-Beleuchtungsmethode das R-Quadrat zwischen Lovastatin-Standards und der Dimension der Bänder auf der TLC-Platte 0,98, und die Probenausbeute betrug 0,54 mg, die vom Regressionsmodell vorhergesagt wurde (Abbildung 4). Die vorhergesagte Ausbeute mit dem Blue-LED-Illuminator lag näher an der Bioassay-Methode (als Kontrolle eingestellt). Die Dimension des Bandes war proportional zur Menge an Lovastatin, und die klaren Bänder wurden durch die Blau-LED-Beleuchtungsmethode erhalten. Darüber hinaus betrug die Arbeitszeit der Bioassay-, UV-detektierten und Blue-LED-Beleuchtungsmethoden ca. 24 h, 2 h bzw. 1 h; (Anmerkung: Arbeitsstunde bedeutet die Gesamtzeit, die für die Ertragsuntersuchung von Lovastatin aufgewendet wird).
Abbildung 1: Der Arbeitsablauf des Protokolls. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Bioassay-Methode. (A) Bioassay von Lovastatin gegen Neurospora crassa (inkubiert für 24 h bei 30 °C). Am Ende des Versuchs wurden die 90-mm-Agarplatten unter sichtbarem Licht fotografiert. (B) Die Konzentrationen von sechs Lovastatin-Standards waren: Nr. 1 (1 mg / ml), Nr. 2 (0,75 mg / ml), Nr. 3 (0,5 mg / ml) und Nr. 4 (0,25 mg / ml). Probe Nr. 5 wurde auf 0,25× (1:4) verdünnt. Probe Nr. 6 wurde auf 0,5× (1:2) verdünnt. Die Inhibitionszonendimension (mm2) wurde mit der Bildgebungssoftware gemessen. (C) Es wurde ein Regressionsmodell unter Verwendung von Datenanalyse- und Grafiksoftware entwickelt, die auf der Hemmzonendimension von Standards basiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Dünnschichtchromatogramm (TLC)-Platte unter UV-Licht. (A) Das n-Hexan:Ethylacetat (2:3 v/v) wurde als mobile Phase in der TLC-Analyse verwendet, und die TLC-Platte wurde nach Einweichen in den Entwickler UV-Licht (365 nm) ausgesetzt (10%H2SO4). (B) Die Konzentrationen von sechs Lovastatin-Standards waren: Nr. 1 (1 mg / ml), Nr. 2 (0,75 mg / ml), Nr. 3 (0,5 mg / ml) und Nr. 4 (0,25 mg / ml). Probe Nr. 5 wurde auf 0,25× (1:4) verdünnt. Probe Nr. 6 wurde auf 0,5× (1:2) verdünnt. Die Inhibitionszonendimension (mm2) wurde mit der Bildgebungssoftware gemessen. (C) Es wurde ein Regressionsmodell unter Verwendung von Datenanalyse- und Grafiksoftware entwickelt, das auf der Dimension der Lovastatin-Standardbänder auf der TLC-Platte basiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Dünnschichtchromatogramm (TLC), gescannt mit der blauen LED-Beleuchtung. (A) Das n-Hexan:Ethylacetat (2:3 v/v) wurde als mobile Phase in der TLC-Analyse verwendet, und die TLC-Platte wurde von der blauen LED-Beleuchtung gescannt. (B) Die Konzentrationen von sechs Lovastatin-Standards waren: Nr. 1 (1 mg / ml), Nr. 2 (0,75 mg / ml), Nr. 3 (0,5 mg / ml) und Nr. 4 (0,25 mg / ml). Probe Nr. 5 wurde auf 0,25× (1:4) verdünnt. Probe Nr. 6 wurde auf 0,5× (1:2) verdünnt. Die Inhibitionszonendimension (mm2) wurde mit der Bildgebungssoftware gemessen. (C) Es wurde ein Regressionsmodell unter Verwendung von Datenanalyse- und Grafiksoftware entwickelt, das auf der Dimension der Lovastatin-Standardbänder auf der TLC-Platte basiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
| Bioassay | Blau-LED-Beleuchtung | UV-detektiert | |
| Ergebnisbeobachtung | Augen | Blau-LED-Beleuchtung und Augen | UV-Licht und Augen |
| Bildauflösung | Mittel | Hoch | Niedrig (unscharfes und schwaches Bild) |
| Ungefähre Zeitkosten | 24 Std. | 1 Std. | 2 Std. |
| Analysekenntnisse erforderlich | Mittel | Niedrig | Mittel |
| Sicherheit | Mikrobielle Infektion | Sehr sicher | UV-Lichtbestrahlung |
| Regressionsgleichung | y = 0,0019x + 0,0304 | y = 0,0399x - 0,1271 | y = 0,0657x - 0,6405 |
| R-Quadrat | 0.99 | 0.98 | 0.97 |
| Steigung | 0.0019 | 0.0399 | 0.0657 |
| Abfangen | 0.0304 | -0.1271 | -0.6405 |
| Standardfehler der Steigung | 8.94E-05 | 3.54E-03 | 6.28E-03 |
| Standardfehler des Abfangens | 0.03032 | 0.07115 | 0.12375 |
Tabelle 1: Vergleich der drei in dieser Studie verwendeten Nachweismethoden.
| TLC-densitometrisches Verfahren | TLC-Bildanalyse | |||||||
| El-Gindy et al.10 |
Elkady et al.11 |
Musharraf et al.12 |
Johnson9 | Hess2 | Blue-LED Illuminator Methode (Diese Studie) |
|||
| Probe | Acebutolol HCL | Ciprofloxacin HCL | Metronidazol | Danazol | Cholesterin | Vanillin | Nicotinamid | Lovastatin |
| Befund | UV Detektor |
TLC Scanner |
TLC Scanner |
Flachbettscanner | Digitalkamera mit UV-Lampe |
Blau-LED-Beleuchtung | ||
| Wellenlänge | 230 nm | 280 nm | 280 nm | 291 nm | NA | 254 nm | NA | |
| Korrelationskoeffizient | 0,996a | 0,9991a | 0,9994a | 0,996a | 0,998a | 0,971b | 0,987b | 0,99a 0,98b |
| Regressionsgleichung | NA | y = 5,7853x +19.9383 |
y = 1,1104x + 6.9755 |
y = 7,949x + 2460 | y = 0,96x | NA | NA | y = 0,0399x -0.1271 |
| a: Pearson-Korrelationskoeffizient | ||||||||
| b: R-Quadrat | ||||||||
Tabelle 2: Vergleich früherer Methoden und der aktuellen Studie.
Ergänzende Abbildung 1: Die Dünnschichtchromatogrammplatte (TLC) mit Ampicillin wurde mit dem Blue-LED-Beleuchtungsverfahren abgetastet. (A) Ethylacetat:Methanol (9:13 v/v) wurde als mobile Phase in der TLC-Analyse verwendet, und die TLC-Platte wurde von der blauen LED-Beleuchtung gescannt. (B) Die Konzentration von vier Ampicillin-Standards war: Nr. 1 (100 mg/ml), Nr. 2 (75 mg/ml), Nr. 3 (50 mg/ml) und Nr. 4 (25 mg/ml). Die Abmessungen der Bänder wurden von der Bildgebungssoftware gemessen. (C) Es wurde ein Regressionsmodell unter Verwendung von Datenanalyse- und Grafiksoftware entwickelt, das auf der Dimension der Ampicillin-Standardbänder auf der TLC-Platte basiert. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung 2: Dünnschichtchromatogramm (TLC)-Platte mit Apramycin, abgetastet durch das Blue-LED-Beleuchtungsverfahren. (A) Methanol:Wasser (6:5 v/v) wurde als mobile Phase in der TLC-Analyse verwendet und die TLC-Platte wurde von der blauen LED-Beleuchtung gescannt. (B) Die Konzentration von vier Apramycin-Standards war: Nr. 1 (50 mg/ml), Nr. 2 (40 mg/ml), Nr. 3 (30 mg/ml) und Nr. 4 (20 mg/ml). Die Abmessungen der Bänder wurden von der Bildgebungssoftware gemessen. (C) Es wurde ein Regressionsmodell unter Verwendung von Datenanalyse- und Grafiksoftware entwickelt, das auf der Dimension der Apramycin-Standardbänder auf der TLC-Platte basiert. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
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Discussion
Die vorliegende Studie beschrieb einen neuen Ansatz, den Blue-LED-Illuminator, zur Quantifizierung von Verbindungen ohne Verwendung teurer und spezialisierter Geräte wie HPTLC-, HPLC- und GC-Methode, und die Methode wurde mit den Bioassay- und UV-detektierten Methoden verglichen, um die Quantifizierungsleistung zu bewerten. Als Ergebnis wurde der Schluss gezogen, dass die Blue-LED-Beleuchtungsmethode ein relativ sicheres und effektives Protokoll ist, das verwendet wird, um die Ausbeute von Zielverbindungen auf der TLC-Platte zu quantifizieren.
Frühere Studien berichteten über mehrere quantitative Methoden ohne Verwendung spezieller quantitativer Geräte, und alle Studien zeigten, dass die Genauigkeit der Quantifizierung nahe an der der Verwendung von Spezialgerätenlag 2,9,10,11,12 (Tabelle 2). Zum Beispiel verglichen El-Gindy et al.10 die Genauigkeit der geschätzten Ausbeute basierend auf den HPLC- und TLC-densitometrischen Methoden, und die Ergebnisse zeigten, dass es keine signifikanten Unterschiede zwischen den beiden Methoden gab (p-Wert < 0,05). Im Vergleich zur Blau-LED-Beleuchtungsmethode in dieser Studie erforderte die von El-Gindy et al.10 entwickelte TLC-densitometrische Methode einen speziellen Wellenlängendetektor, während die Blau-LED-Beleuchtungsmethode einen einfachen und kostengünstigen Blau-LED-Scanner erforderte. Inzwischen könnte der Blue-LED-Scanner auch für andere Zwecke verwendet werden, wie z.B. Gelelektrophorese-Scanning, aber der von Elkady et al.11 entwickelte spezialisierte TLC-Scanner wurde nur für die TLC-densitometrische Methode verwendet.
Neben dem TLC-densitometrischen Verfahren10,11 wurden der Flachbettscanner und das Digitalkameraverfahren zur Erfassung der Ausbeute von Proben entwickelt. Zum Beispiel etablierte Johnson9 eine schnelle TLC-Detektionsmethode mit dem Flachbettscanner und maß dann die Absorption mit kommerzieller Bildsoftware. Die Bildsoftware, die bei der Blau-LED-Beleuchtungsmethode verwendet wurde, war jedoch kostenlos und einfach zu bedienen. Hess2 entwickelte die Software "TLC analyzer", um die Dimension von Banden auf TLC-Plattenbildern abzuschätzen, die von einer Digitalkamera aufgenommen wurden, was der UV-detektierten Methode in dieser Studie ähnelte. Beide Methoden können jedoch potenziell mit UV-Lichtgefahren interagieren.
Die Regressionsmodelle, die auf der Dimension der Standardbänder basieren, wurden für Bioassay, Blue-LED-Illuminator und UV-detektierte Methode entwickelt, und der R-Quadrat-Wert betrug 0,99, 0,98 bzw. 0,97 (Tabelle 1). Da eine hohe Linearität (R-Quadrat) erreicht wurde, wird vorgeschlagen, dass das Regressionsmodell die Ausbeute von Stichproben messen könnte. Der X-Wert im Regressionsmodell wurde durch die Dimension der Standardbänder ersetzt, und die geschätzte Ausbeute (vorhergesagter Y-Wert im Regressionsmodell) betrug ungefähr 5,6, 5,4 und 5,3, bestimmt durch Bioassay-, Blue-LED- und UV-Detektionsmethoden. Die Ergebnisse zeigten, dass das R-Quadrat und die geschätzte Ausbeute unter Verwendung der blauen LED-Beleuchtung näher an der Bioassay-Methode (als Kontrolle festgelegt) als die UV-detektierte Methode lag (Tabelle 1).
Um die Grenzen dieses Ansatzes zu verstehen, wurde der Ansatz auch angewendet, um zwei weitere Verbindungen nachzuweisen, darunter Ampicillin und Apramycin; Die Ergebnisse sind in der ergänzenden Abbildung 1 und der ergänzenden Abbildung 2 dargestellt. Dabei sind zwei wichtige Schritte zu beachten: (1) Nach dem Trocknen muss die Platte sofort visualisiert werden; Eine verzögerte Visualisierung kann die Fleckenerkennung beeinträchtigen. (2) Eine Überbelichtung der Platte wird nicht empfohlen, da das gescannte Bild von der Platte einen hohen Hintergrund aufweist und die Messung der Bereiche der Flecken erschwert.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Blue-LED-Beleuchtungsmethode ein relativ sicherer, zeitsparender, kostengünstiger und weniger mühsamer Ansatz ist, um die Quantifizierung der Ausbeute von Proben im Vergleich zu anderen quantitativen chromatographischen Methoden zu beschleunigen. Daher ist dieser Ansatz ein ideales Protokoll für die Entwicklung von Laboren mit begrenzten Budgets. In der Zwischenzeit waren die TLC-Plattenbilder, die von der Blau-LED-Beleuchtungsmethode abgerufen wurden, viel klarer als die der UV-Detektionsmethode (Abbildung 3A vs. Abbildung 4A), die auch dazu beitrug, die Dimension der Banden auf der TLC-Platte genau zu bestimmen und auch die Ausbeute der Proben abzuschätzen.
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Disclosures
Alle Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte haben.
Acknowledgments
Diese Studie wurde vom Ministerium für Wissenschaft und Technologie, Taiwan unterstützt (MOST 108-2320-B-110-007-MY3).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| American bacteriological Agar | Condalab | 1802.00 | |
| Aspergillus terreus | ATCC 20542 | ||
| Blue-LED illuminator | MICROTEK | Bio-1000F | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | HERAEUS Megafuge 8 | |
| Compact UV lamp | UVP | UVGL-25 | |
| Ethyl Acetate | MACRON | MA-H078-10 | |
| Filter Paper 125mm | ADVANTEC | 60311102 | |
| ImageJ | NIH | Freeware | https://imagej.nih.gov/ij/download.html |
| Lovastatin standard | ACROS | A0404262 | |
| MiBio Fluo | MICROTEK | V1.04 | |
| n-Hexane | C-ECHO | HH3102-000000-72EC | |
| OriginPro | OriginLab | 9.1 | https://www.originlab.com/origin |
| Potato dextrose broth H | STBIO MEDIA | 110533 | |
| Rotary evaporator | EYELA | SB-1000 | |
| Sulfuric acid | Fluka | 30743-2.5L-GL | |
| TLC silica gel 60 F254 | MERCK | 1.05554.0001 | |
| Trifluoroacetic acid | Alfa Aesar | 10229873 | |
| Ultrasonic vibration machine | DELTA | DC600 |
References
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