Summary
O presente protocolo desenvolveu um método para estimar o rendimento de compostos na placa TLC utilizando a técnica de iluminação azul-LED. As vantagens dessa abordagem são que ela é segura, eficaz, barata e permite que o pesquisador meça várias amostras simultaneamente.
Abstract
A cromatografia em camada fina (TLC) é uma técnica analítica acessível que tem sido amplamente utilizada em pesquisas em química orgânica para quantificar o rendimento de amostras desconhecidas. O presente estudo desenvolveu um método eficaz, barato e seguro para estimar o rendimento de amostras em uma placa TLC utilizando o iluminador azul-LED. A lovastatina extraída de Aspergillus terreus foi o composto de exemplo utilizado no presente estudo. Modelos de regressão baseados no padrão de lovastatina foram utilizados para avaliar o rendimento de lovastatina. Três métodos foram comparados: bioensaio, detecção de UV e iluminação azul-LED. O resultado mostrou que o método de iluminação azul-LED é significativamente mais eficaz no tempo do que os métodos de detecção UV e bioensaio. Além disso, a iluminação LED-azul foi uma opção relativamente segura devido à preocupação com os riscos biológicos no método de bioensaio (por exemplo, infecção microbiana) e a exposição ultravioleta no método de detecção UV. Em comparação com os métodos caros que exigem instrumentos especializados e treinamento de longo prazo antes de trabalhar de forma independente, como GC, HPLC e HPTLC, o uso do iluminador blue-LED foi uma opção econômica para estimar o rendimento de amostras de uma placa TLC.
Introduction
A cromatografia em camada fina (TLC) é amplamente utilizada como técnica qualitativa e quantitativa no campo da química orgânica 1,2,3. As principais vantagens do TLC são que ele fornece detecção rápida, requisitos de amostra flexíveis e não requer equipamentos especializados4. Até o momento, embora muitas abordagens avançadas tenham sido estabelecidas, o TLC ainda é o principal método para identificar amostras desconhecidas em uma mistura. No entanto, o desafio dessa abordagem é a falta de equipamentos seguros e baratos para quantificar o rendimento da amostra, especialmente para o desenvolvimento de laboratórios com orçamentos limitados. O presente estudo, portanto, teve como objetivo desenvolver um método eficiente, seguro e barato de combinação com CPT para estimar o rendimento das amostras.
Ao contrário do TLC de alta eficiência (HPTLC), da cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) e da cromatografia gasosa (GC) com requisitos rigorosos de amostra, demorado e envolvimento de várias etapas para o preparo da amostra1,5, o TLC mostrou várias vantagens. Em primeiro lugar, para a preparação da amostra, a HPLC e a CG não podem detectar o extracto bruto porque o extracto bruto pode ligar a coluna de HPLC e GC. Em segundo lugar, quando as amostras não são adequadas aos raios UV (importante para a análise por HPLC) ou com baixa volatilidade (importante para a análise de CG), o TLC pode ser aplicado a essas amostras, e o uso de reagente de visualização torna as amostras isoladas visíveis em camadas finas 6,7,8. Em terceiro lugar, para usuários em geral, HPLC e GC geralmente exigem um pré-treinamento de tempo relativamente longo antes de trabalhar de forma independente, em comparação com o TLC. Além disso, a análise quantitativa de TLC, conhecida como TLC de alto desempenho (HPTLC), pode digitalizar as informações em uma placa TLC com um scanner altamente sensível. No entanto, o custo do sistema HPTLC é relativamente caro. Como tal, o desenvolvimento de uma abordagem econômica e rápida para quantificar amostras na placa TLC é um tópico importante.
Métodos semelhantes foram desenvolvidos para quantificação do rendimento de TLC; por exemplo, Johnson9 relatou uma técnica que permite a quantificação das amostras em uma placa TLC usando um scanner de mesa conectado a um computador. Em 2001, El-Gindy et al.10 desenvolveram o método densitométrico TLC-, que foi utilizado para detectar o composto com densidade óptica, e a técnica também foi aplicada por Elkady et al.11. Em 2007, Hess2 apresentou o método digitalmente aprimorado-TLC (DE-TLC) aplicado para detectar o rendimento de um composto em uma placa TLC usando uma câmera digital combinada com luz UV. Hess também comparou as diferenças de custo entre o método HPTLC e DE-TLC e concluiu que o método DE-TLC poderia ser usado em laboratórios de ensino médio e universitário devido ao seu custo acessível2. No entanto, o custo do método densitométrico TLC ainda era caro, e a operação da luz ultravioleta requer pré-treinamento adequado no caso de os usuários ficarem expostos à radiação ultravioleta. Portanto, compatível com TLC, é desejável o desenvolvimento de um método eficiente, seguro e barato para quantificar o rendimento da amostra.
O presente estudo descreveu um protocolo para detecção da amostra em uma placa TLC utilizando o iluminador azul-LED, e desenvolveu um modelo de regressão com alta confiabilidade (alto valor R-quadrado) para medir as dimensões das bandas e, em seguida, determinar o rendimento do composto. Finalmente, verificou-se que o método de iluminação azul-LED é relativamente seguro (vs. Método de detecção UV), barato (vs. GC, HPLC e HPTLC) e abordagem eficaz (vs. método de bioensaio) para quantificação do rendimento.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
O presente protocolo é descrito usando lovastatina como exemplo. A lovastatina foi extraída de Aspergillus terreus de uma semana de idade.
1. Extração composta
NOTA: Para obter detalhes sobre a extração de compostos, consulte a Figura 1.
- Cultura de Aspergillus terreus no meio de ágar batata-dextrose (PDA, ver Tabela de Materiais) a 30 °C.
- Secar a cultura a 40 °C durante 24 h. Transfira a cultura seca para um tubo de 50 mL usando pinças esterilizadas e adicione 15 mL de acetato de etila.
- Agitar vigorosamente a mistura por vórtice durante 1 min e incubar durante 1 h a 40 °C com agitação a 200 rpm.
- Sonicate a mistura usando um banho ultra-sônico de 40 kHz (ver Tabela de Materiais) a 40 °C por 1 h.
- Centrifugar a mistura a 5.000 x g durante 1 min à temperatura ambiente e filtrar através de um papel de filtro de 11 μm.
- Extrair o filtrado com um volume igual de água estéril numa ampola separatória.
- Após a separação de fases, recolha a camada orgânica e, em seguida, evapore num evaporador rotativo (ver Tabela de Materiais). Dissolver o resíduo em 2 mL de acetato de etila.
2. Separação do extracto bruto por coluna de adsorção de fase normal (NP)
- Embale a coluna com sílica gel NP como fase estacionária e use n-hexano:acetato de etila:ácido trifluoroacético (H:E:T; 80:20:0.1, v/v/v) como fase móvel.
- Carregar 2 ml do extracto (passo 1) na coluna e adicionar o solvente de fase móvel a um caudal de 1 ml/min para eluír o extracto.
NOTA: A taxa de fluxo foi controlada manualmente usando uma torneira. - Verificar o efluente por TLC para confirmar a presença de lovastatina e, em seguida, evaporar num evaporador rotativo a 45 °C até que o solvente seja removido. Este passo leva aproximadamente 20-25 min.
- Dissolva o resíduo em 1 mL de acetato de etila e, em seguida, misture com um volume igual de ácido trifluoroacético a 1%.
- Centrifugar a mistura a 5.000 x g durante 1 min à temperatura ambiente e recolher a camada orgânica num novo tubo de vidro.
3. Preparação e carregamento de placas de cromatograma de camada fina (TLC)
- Colocar 5 μL de amostras e padrões de lovastatina (ver Tabela de Materiais) na linha de base da placa TLC usando uma pipeta capilar, deixando uma borda de 1 cm nas laterais da placa TLC.
- Seque a placa TLC em um exaustor por 5 minutos à temperatura ambiente.
- Coloque a placa suavemente por pinça em uma câmara de vidro saturada contendo o solvente de fase móvel. Cubra a câmara com uma tampa de vidro e deixe a placa se desenvolver completamente.
- Remova a placa da câmara quando a linha de solvente atingir 1 cm do topo da placa.
4. Análise pelo iluminador azul-LED
- Marque a linha de solvente com um lápis. Seque a placa no exaustor por 10 minutos à temperatura ambiente.
- Após a secagem, mergulhe imediatamente a placa em 10% de solvente H2SO4 e, em seguida, seque no exaustor por 10 minutos à temperatura ambiente.
- Coloque a placa no painel de aquecimento até que as manchas marrons apareçam. Certifique-se de que a placa não esteja superaquecida, pois isso pode dificultar a visualização da lovastatina.
- Transfira a placa para o iluminador de LED azul e digitalize usando um freeware compatível (MiBio Fluo) (consulte a Tabela de Materiais).
5. Estimativa de rendimento pelo modelo de regressão
- Meça a dimensão das bandas usando o software ImageJ (consulte Tabela de materiais).
- Estabeleça um modelo de regressão usando software de análise de dados e gráficos (ver Tabela de Materiais) com base nas concentrações decrescentes dos padrões de lovastatina, incluindo 1 mg/mL, 0,75 mg/mL, 0,5 mg/mL e 0,25 mg/mL.
- Aplicar o modelo de regressão para estimar o rendimento das amostras.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Este estudo apresentou o método de iluminação azul-LED para estimar o rendimento de compostos, e este método foi validado e comparado com os métodos de bioensaio e UV-detectados (Tabela 1). Os modelos de regressão foram desenvolvidos com base nas dimensões das bandas e concentração dos padrões para três métodos, respectivamente, para predizer o rendimento das amostras. Primeiramente, nos resultados do método de bioensaio, o R-quadrado entre as dimensões da zona de inibição e os padrões de lovastatina foi de 0,99, e o rendimento da amostra foi de 0,56 mg previsto pelo modelo de regressão (Figura 2). Em segundo lugar, no método de detecção de UV, o quadrado R entre os padrões de lovastatina e a dimensão das bandas na placa TLC foi de 0,97, e o rendimento da amostra previsto pelo modelo de regressão foi de 0,53 mg (Figura 3). Notavelmente, as bordas da banda estavam borradas, e bandas de intensidade de sinal relativamente baixas foram observadas (Figura 3A). Em terceiro lugar, no método de iluminação azul-LED, o quadrado R entre os padrões de lovastatina e a dimensão das bandas na placa TLC foi de 0,98, e o rendimento da amostra foi de 0,54 mg previsto pelo modelo de regressão (Figura 4). O rendimento previsto usando o iluminador de LED azul foi mais próximo do método de bioensaio (definido como controle). A dimensão da faixa foi proporcional à quantidade de lovastatina, e as faixas claras foram obtidas pelo método de iluminação azul-LED. Além disso, as horas de trabalho dos métodos de bioensaio, UV-detectado e azul-LED foram de aproximadamente 24 h, 2 h e 1 h, respectivamente; (Nota: hora de trabalho significa o tempo total gasto no exame de rendimento da lovastatina).
Figura 1: O fluxo de trabalho do protocolo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Método de bioensaio. (A) Bioensaio de lovastatina contra Neurospora crassa (incubado por 24 h a 30 °C). No final do ensaio, as placas de ágar de 90 mm foram fotografadas sob luz visível. (B) As concentrações de seis padrões de lovastatina foram: nº 1 (1 mg/mL), nº 2 (0,75 mg/mL), nº 3 (0,5 mg/mL) e nº 4 (0,25 mg/mL). A amostra nº 5 foi diluída a 0,25× (1:4). A amostra nº 6 foi diluída a 0,5× (1:2). A dimensão da zona de inibição (mm2) foi medida pelo software de imagem. (C) Um modelo de regressão foi desenvolvido utilizando software de análise de dados e gráficos baseado na dimensão da zona de inibição das normas. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Placa de cromatograma de camada fina (TLC) exposta à luz UV. (A) O acetato de n-hexano:etila (2:3 v/v) foi utilizado como fase móvel na análise de TLC, e a placa de TLC foi exposta à luz UV (365 nm) após imersão no revelador (10% H2SO4). (B) As concentrações de seis padrões de lovastatina foram: nº 1 (1 mg/mL), nº 2 (0,75 mg/mL), nº 3 (0,5 mg/mL) e nº 4 (0,25 mg/mL). A amostra nº 5 foi diluída a 0,25× (1:4). A amostra nº 6 foi diluída a 0,5× (1:2). A dimensão da zona de inibição (mm2) foi medida pelo software de imagem. (C) Um modelo de regressão foi desenvolvido utilizando software de análise de dados e gráficos baseado na dimensão das bandas padrão de lovastatina na placa TLC. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Placa de cromatograma de camada fina (TLC) digitalizada pelo iluminador de LED azul. (A) O acetato de n-hexano:etila (2:3 v/v) foi utilizado como fase móvel na análise de TLC, e a placa de TLC foi digitalizada pelo iluminador de LED azul. (B) As concentrações de seis padrões de lovastatina foram: nº 1 (1 mg/mL), nº 2 (0,75 mg/mL), nº 3 (0,5 mg/mL) e nº 4 (0,25 mg/mL). A amostra nº 5 foi diluída a 0,25× (1:4). A amostra nº 6 foi diluída a 0,5× (1:2). A dimensão da zona de inibição (mm2) foi medida pelo software de imagem. (C) Um modelo de regressão foi desenvolvido utilizando software de análise de dados e gráficos baseado na dimensão das bandas padrão de lovastatina na placa TLC. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Bioassay | Iluminador Azul-LED | Detectado por UV | |
Observação dos resultados | Olho | Iluminador e olhos azuis-LED | Luz UV e olhos |
Resolução da imagem | Média | Alto | Baixo (imagem desfocada e fraca) |
Custo aproximado do tempo | 24 horas | 1 h | 2 h |
Habilidade de análise necessária | Média | Baixo | Média |
Segurança | Infecção microbiana | Muito seguro | Exposição à luz UV |
Equação de regressão | y = 0,0019x + 0,0304 | y = 0,0399x - 0,1271 | y = 0,0657x - 0,6405 |
R-quadrado | 0.99 | 0.98 | 0.97 |
Declive | 0.0019 | 0.0399 | 0.0657 |
Interceptar | 0.0304 | -0.1271 | -0.6405 |
Erro padrão de inclinação | 8,94E-05 | 3,54E-03 | 6,28E-03 |
Erro padrão de interceptação | 0.03032 | 0.07115 | 0.12375 |
Tabela 1: Comparação dos três métodos de detecção utilizados neste estudo.
Método densitométrico TLC | Análise de imagem TLC | |||||||
El-Gindy et al.10 |
Elkady • et al.11 |
Musharraf • et al.12 |
Johnson9 Anúncios | Hess2 | Método do iluminador azul-LED (Este estudo) |
|||
Amostra | Acebutolol HCL | Ciprofloxacina HCL | Metronidazol | Danazol | Colesterol | Vanilina | Nicotinamida | Lovastatina |
Resultados | UV detetor |
TLC scanner |
TLC scanner |
Scanner de mesa | Câmera digital com lâmpada UV |
Iluminador LED azul | ||
Comprimento de onda | 230 nm | 280 nm | 280 nm | 291 nm | NA | 254 nm | NA | |
Coeficiente de correlação | 0,996a | 0,9991a | 0,9994a | 0,996a | 0,998a | 0,971b | 0,987b | 0,99a 0,98b |
Equação de regressão | NA | y = 5,7853x +19.9383 |
y = 1,1104x + 6.9755 |
y = 7,949x + 2460 | y = 0,96x | NA | NA | y = 0,0399x -0.1271 |
a: coeficiente de correlação de Pearson | ||||||||
b: R-quadrado |
Tabela 2: Comparação dos métodos anteriores com o presente estudo.
Figura suplementar 1: A placa de cromatograma de camada fina (TLC) com ampicilina foi digitalizada pelo método de iluminação LED-azul. (A) Acetato de etila:metanol (9:13 v/v) foi utilizado como fase móvel na análise de TLC, e a placa de TLC foi escaneada pelo iluminador de LED azul. (B) A concentração de quatro padrões de ampicilina foi: nº 1 (100 mg/mL), nº 2 (75 mg/mL), nº 3 (50 mg/mL) e nº 4 (25 mg/mL). A dimensão das bandas foi medida pelo software de imagem. (C) Um modelo de regressão foi desenvolvido utilizando software de análise de dados e gráficos baseado na dimensão das bandas padrão de ampicilina na placa TLC. Clique aqui para baixar este arquivo.
Figura 2 suplementar: Placa de cromatograma de camada fina (TLC) com apramicina digitalizada pelo método de iluminação LED azul. (A) Metanol:água (6:5 v/v) foi utilizada como fase móvel na análise de TLC e a placa de TLC foi escaneada pelo iluminador de LED azul. (B) A concentração de quatro padrões de apramicina foi: nº 1 (50 mg/mL), nº 2 (40 mg/mL), nº 3 (30 mg/mL) e nº 4 (20 mg/mL). A dimensão das bandas foi medida pelo software de imagem. (C) Um modelo de regressão foi desenvolvido utilizando software de análise de dados e gráficos baseado na dimensão das bandas padrão de apramicina na placa TLC. Clique aqui para baixar este arquivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
O presente estudo descreveu uma nova abordagem, o iluminador azul-LED, para quantificar compostos sem o uso de equipamentos caros e especializados, como HPTLC, HPLC e GC, e o método foi comparado com os métodos de bioensaio e UV detectados para avaliar o desempenho de quantificação. Como resultado, concluiu-se que o método de iluminação azul-LED é um protocolo relativamente seguro e eficaz usado para quantificar o rendimento de compostos alvo na placa TLC.
Estudos prévios relataram vários métodos quantitativos sem o uso de equipamentos quantitativos especializados, e todos os estudos mostraram que a acurácia da quantificação foi próxima à do uso de equipamentos especializados 2,9,10,11,12 (Tabela 2). Por exemplo, El-Gindy et al.10 compararam a acurácia do rendimento estimado com base nos métodos densitométricos de HPLC e TLC, e os resultados mostraram que não houve diferenças significativas entre os dois métodos (p-valor < 0,05). Comparado com o método de iluminação azul-LED neste estudo, o método TLC-densitométrico desenvolvido por El-Gindy et al.10 exigiu um detector de comprimento de onda especial, enquanto o método de iluminação azul-LED exigiu um scanner blue-LED simples e barato. Enquanto isso, o scanner de LED azul também poderia ser usado para outros fins, como a varredura por eletroforese em gel, mas o scanner TLC especializado desenvolvido por Elkady et al.11 foi usado apenas para o método densitométrico TLC.
Além do método densitométrico TLC10,11, o scanner de mesa e o método de câmera digital foram desenvolvidos para detectar o rendimento das amostras. Por exemplo, a Johnson9 estabeleceu um método de detecção rápida de TLC usando o scanner de mesa e, em seguida, mediu a absorção usando software de imagem comercial. No entanto, o software de imagem usado no método de iluminação azul-LED era gratuito e fácil de usar. Hess2 desenvolveu o software "analisador TLC" para estimar a dimensão das bandas em imagens de placas TLC tiradas por uma câmera digital, que foi semelhante ao método detectado por UV neste estudo. No entanto, ambos os métodos podem interagir potencialmente com os perigos da luz UV.
Os modelos de regressão baseados na dimensão das bandas dos padrões foram desenvolvidos para bioensaio, iluminador LED azul e método detectado por UV, e o valor do quadrado R foi de 0,99, 0,98 e 0,97, respectivamente (Tabela 1). Como a alta linearidade (R-quadrado) foi alcançada, sugere-se que o modelo de regressão pudesse medir o rendimento das amostras. O valor X no modelo de regressão foi substituído pela dimensão das bandas dos padrões, e o rendimento estimado (valor Y previsto no modelo de regressão) foi de aproximadamente 5,6, 5,4 e 5,3, determinado pelos métodos de bioensaio, LED-azul e detecção de UV, respectivamente. Os resultados indicaram que o R-quadrado e o rendimento estimado utilizando o iluminador azul-LED foram mais próximos do método de bioensaio (definido como controle) do que o método detectado por UV (Tabela 1).
Para compreender as limitações dessa abordagem, a abordagem também foi aplicada para detectar dois outros compostos, incluindo ampicilina e apramicina; os resultados são apresentados na Figura 1 Suplementar e na Figura Suplementar 2. Dois passos importantes devem ser observados nesta abordagem: (1) após a secagem, a placa deve ser visualizada imediatamente; a visualização atrasada pode afetar a detecção de pontos; (2) a superexposição da placa não é recomendada, pois a imagem digitalizada da placa vem com fundo alto e dificulta a medição das áreas das manchas.
Para concluir, o método de iluminação azul-LED é uma abordagem relativamente segura, que economiza tempo, barata e menos trabalhosa para acelerar a quantificação do rendimento das amostras em comparação com outros métodos cromatográficos quantitativos; portanto, essa abordagem é um protocolo ideal para uso em laboratórios em desenvolvimento com orçamentos limitados. Enquanto isso, as imagens da placa TLC recuperadas do método de iluminação azul-LED foram muito mais claras do que as do método de detecção UV (Figura 3A vs. Figura 4A), que também ajudou a determinar com precisão a dimensão das bandas na placa TLC, e também a estimar o rendimento das amostras.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Todos os autores declaram que não têm conflitos de interesse.
Acknowledgments
Este estudo foi apoiado pelo Ministério da Ciência e Tecnologia, Taiwan (MOST 108-2320-B-110-007-MY3).
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
American bacteriological Agar | Condalab | 1802.00 | |
Aspergillus terreus | ATCC 20542 | ||
Blue-LED illuminator | MICROTEK | Bio-1000F | |
Centrifuge | Thermo Scientific | HERAEUS Megafuge 8 | |
Compact UV lamp | UVP | UVGL-25 | |
Ethyl Acetate | MACRON | MA-H078-10 | |
Filter Paper 125mm | ADVANTEC | 60311102 | |
ImageJ | NIH | Freeware | https://imagej.nih.gov/ij/download.html |
Lovastatin standard | ACROS | A0404262 | |
MiBio Fluo | MICROTEK | V1.04 | |
n-Hexane | C-ECHO | HH3102-000000-72EC | |
OriginPro | OriginLab | 9.1 | https://www.originlab.com/origin |
Potato dextrose broth H | STBIO MEDIA | 110533 | |
Rotary evaporator | EYELA | SB-1000 | |
Sulfuric acid | Fluka | 30743-2.5L-GL | |
TLC silica gel 60 F254 | MERCK | 1.05554.0001 | |
Trifluoroacetic acid | Alfa Aesar | 10229873 | |
Ultrasonic vibration machine | DELTA | DC600 |
References
- Pyka, A. Detection progress of selected drugs in TLC. BioMed Research International. 2014, 732078 (2014).
- Hess, A. V. I. Digitally enhanced thin-layer chromatography: An inexpensive, new technique for qualitative and quantitative analysis. Journal of Chemical Education. 84 (5), 842-847 (2007).
- Ullah, Q., Mohammad, A. Vitamins determination by TLC/HPTLC-a mini-review. Journal of Planar Chromatography - Modern TLC. 33 (5), 429-437 (2020).
- Chen, Z., Tao, H., Liao, L., Zhang, Z., Wang, Z. Quick identification of xanthine oxidase inhibitor and antioxidant from Erycibe obtusifolia by a drug discovery platform composed of multiple mass spectrometric platforms and thin-layer chromatography bioautography. Journal of Separation Science. 37 (16), 2253-2259 (2014).
- Duncan, J. D. Chiral separations: A comparison of HPLC and TLC. Journal of Liquid Chromatography. 13 (14), 2737-2755 (1990).
- Sherma, J. Thin-layer chromatography in food and agricultural analysis. Journal of Chromatography A. 880 (1-2), 129-147 (2000).
- Bocheńska, P., Pyka, A., Bocheńska, P., Bocheńska, B. Determination of acetylsalicylic acid in pharmaceutical drugs by TLC with densitometric detection in UV. Journal of Liquid Chromatography. 35 (10), 1346-1363 (2012).
- Poole, C. F. Planar chromatography at the turn of the century. Journal of Chromatography A. 856 (1-2), 399-427 (1999).
- Rapid Johnson, M. E. simple quantitation in thin-layer chromatography using a flatbed scanner. Journal of Chemical Education. 77 (3), 368-372 (2000).
- El-Gindy, A., Ashour, A., Abdel-Fattah, L., Shabana, M. M. First derivative spectrophotometric, TLC-densitometric, and HPLC determination of acebutolol HCL in presence of its acid-induced degradation product. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 24 (4), 527-534 (2001).
- Elkady, E. F., Mahrouse, M. A. Reversed-phase ion-pair HPLC and TLC-densitometric methods for the simultaneous determination of ciprofloxacin hydrochloride and metronidazole in tablets. Chromatographia. 73 (3-4), 297-305 (2011).
- Musharraf, S. G., Ul Arfeen,, Shoaib, Q., M, Development and validation of TLC-densitometric method for the quantification of a steroidal drug, danazol in its pharmaceutical formulations. Journal of Planar Chromatography - Modern TLC. 25 (4), 331-337 (2012).