Summary
本协议开发了一种使用蓝光LED照明技术估计TLC板上化合物产量的方法。这种方法的优点是安全、有效、便宜，并允许研究人员同时测量多个样品。
Abstract
薄层色谱（TLC）是一种可访问的分析技术，已广泛用于有机化学研究，以量化未知样品的产量。本研究开发了一种有效、廉价且安全的方法来使用蓝光LED照明器估计TLC板上样品的产量。从 土曲霉 中提取的洛伐他汀是本研究中使用的示例化合物。基于洛伐他汀标准的回归模型用于评估洛伐他汀的产量。比较了三种方法：生物测定，紫外线检测和蓝光LED照明。结果表明，蓝光LED照明方法比紫外检测和生物测定方法具有显著的时效性。此外，由于生物测定方法中的生物危害（例如微生物感染）和紫外线检测方法中的紫外线暴露，蓝光LED照明是一种相对安全的选择。与在独立工作之前需要专业仪器和长期培训的昂贵方法（如GC、HPLC和HPTLC）相比，使用蓝光LED照明器是估算TLC板样品产量的经济选择。
Introduction
薄层色谱（TLC）被广泛用作有机化学领域的定性和定量技术1，2，3。TLC的主要优点是检测速度快，样品要求灵活，不需要专用设备4.迄今为止，尽管已经建立了许多先进的方法，但TLC仍然是识别混合物中未知样品的主要方法。然而，这种方法的挑战是缺乏安全且廉价的设备来量化样品产量，特别是对于开发预算有限的实验室。因此，本研究旨在开发一种高效、安全且廉价的方法，结合TLC来估计样品的产量。
与高效TLC（HPTLC）、高效液相色谱（HPLC）和气相色谱（GC）不同，TLC具有严格的样品要求，耗时长，并且涉及样品制备的多步骤1，5，TLC表现出几个优点。首先，对于样品制备，HPLC和GC无法检测到粗提取物，因为粗提取物可能会堵塞HPLC和GC的色谱柱。其次，当样品不适合紫外线（对HPLC分析很重要）或挥发性低（对GC分析很重要）时，可以将TLC应用于这些样品，并且使用可视化试剂使分离的样品在薄层6，7，8上可见。第三，对于一般用户来说，与TLC相比，HPLC和GC在独立工作之前通常需要相对较长的预训练时间。此外，定量TLC分析，称为高性能TLC（HPTLC），可以使用高灵敏度扫描仪将TLC板上的信息数字化。然而，HPTLC系统的成本相对昂贵。因此，开发一种经济高效且快速的方法来定量TLC板上的样品是一个重要的主题。
已经开发了类似的TLC产量定量方法;例如，Johnson9 报告了一种技术，该技术允许使用连接到计算机的平板扫描仪对TLC板上的样品进行定量。2001年，El-Gindy等人10 开发了TLC-密度测定法，该方法用于检测具有光密度的化合物，该技术也被Elkady等人11应用。2007年，Hess2 提出了数字增强TLC（DE-TLC）方法，该方法用于使用结合紫外光的数码相机检测TLC板上化合物的产量。Hess还比较了HPTLC和DE-TLC方法之间的成本差异，并得出结论，DE-TLC方法由于其可承受的成本2而可用于高中和大学实验室。然而，TLC密度法的成本仍然昂贵，并且紫外线的操作需要足够的预培训，以防用户可能暴露于紫外线辐射。因此，与TLC兼容，开发一种高效，安全且廉价的方法来定量样品产量是可取的。
本研究描述了一种使用蓝光LED照明器检测TLC板上样品的协议，并开发了一种具有高可靠性（高R平方值）的回归模型来测量条带的尺寸，然后确定化合物产量。最后，发现蓝光LED照明方法相对安全（与紫外线检测方法），便宜（与GC、HPLC 和 HPTLC）以及用于产量定量的有效（与生物测定方法相比）。
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Protocol
使用洛伐他汀作为示例描述本协议。洛伐他汀是从一周大的 土曲霉中提取的。
1. 化合物萃取
注：有关化合物提取的详细信息，请参见 图1。
- 在30°C的马铃薯葡萄糖琼脂（PDA，见材料表）培养基上培养土曲霉。
- 将培养物在40°C干燥24小时。使用灭菌的镊子将干燥的培养物转移到50 mL管中，并加入15 mL乙酸乙酯。
- 通过涡旋1分钟剧烈摇动混合物，并在40°C下以200rpm振荡孵育1小时。
- 使用40kHz超声波浴（见 材料表）在40°C下超声处理混合物1小时。
- 在室温下以5，000× g 离心混合物1分钟，并通过11μm滤纸过滤。
- 在分离漏斗中用等体积的无菌水提取滤液。
- 相分离后，收集有机层，然后在旋转蒸发器中蒸发（见 材料表）。将残留物溶解在 2 mL 乙酸乙酯中。
2. 通过正相（NP）吸附柱分离粗提物
- 以NP硅胶为固定相填料柱，以正己烷：乙酸乙酯：三氟乙酸（H：E：T;80：20：0.1，v/v/v）为流动相。
- 将2 mL提取物（步骤1）上样到色谱柱上，并以1 mL/min的流速加入流动相溶剂以洗脱提取物。
注意：流量是使用旋塞阀手动控制的。 - 通过TLC验证流出物以确认洛伐他汀的存在，然后在45°C的旋转蒸发器中蒸发，直到溶剂被除去。此步骤大约需要 20-25 分钟。
- 将残留物溶解在1mL乙酸乙酯中，然后与等体积的1%三氟乙酸混合。
- 在室温下以5，000× g 离心混合物1分钟，并将有机层收集在新玻璃管中。
3. 薄层色谱（TLC）板的制备和上样
- 使用毛细管移液管将5μL样品和洛伐他汀标准品（参见 材料表）点到TLC板的基线上，在TLC板的侧面留下1cm的边界。
- 在室温下将TLC板在通风橱中干燥5分钟。
- 用镊子将板轻轻放入含有流动相溶剂的饱和玻璃室中。用玻璃盖盖住腔室，让板充分展开。
- 当溶剂管线距离板顶部 1 厘米时，将板从腔室中取出。
4. 蓝光LED照明器分析
- 用铅笔标记溶剂线。在室温下将板在通风橱中干燥10分钟。
- 干燥后，立即将板浸泡在10%H2SO4 溶剂中，然后在室温下在通风橱中干燥10分钟。
- 将板放在加热板上，直到出现棕色斑点。确保板没有过热，因为这可能会使洛伐他汀的可视化变得困难。
- 将印版转移到蓝色LED照明器，并使用兼容的免费软件（MiBio Fluo）进行扫描（参见 材料表）。
5. 通过回归模型估算产量
- 使用 ImageJ 软件测量条带的尺寸（参见 材料表）。
- 使用数据分析和绘图软件（参见 材料表）建立回归模型，基于洛伐他汀标准品的降序浓度，包括1 mg/mL、0.75 mg/mL、0.5 mg/mL和0.25 mg/mL。
- 应用回归模型来估计样本的产量。
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Representative Results
本研究介绍了用于估计化合物产量的蓝光LED照明方法，该方法得到了验证，并与生物测定和紫外线检测方法进行了比较（表1）。基于3种方法的条带维数和标准品浓度分别建立了回归模型，以预测样品的产量。首先，在生物测定方法的结果中，抑制区尺寸与洛伐他汀标准品尺寸之间的R平方为0.99，回归模型预测的样品产率为0.56mg（图2）。其次，在UV检测方法中，洛伐他汀标准品与TLC板上条带尺寸之间的R平方为0.97，回归模型预测的样品产率为0.53 mg（图3）。值得注意的是，波段的边缘模糊，观察到相对较低的信号强度波段（图3A）。第三，在蓝光LED照明方法中，洛伐他汀标准品与TLC板上条带尺寸之间的R平方为0.98，回归模型预测的样品产率为0.54 mg（图4）。使用蓝色LED照明器的预测产量更接近生物测定方法（设置为对照）。条带的尺寸与洛伐他汀的量成正比，采用blue-LED照明法获得清晰的条带。此外，生物测定、紫外检测和蓝光LED照明方法的工作时间分别约为24 h、2 h和1 h;（注：工作时间是指洛伐他汀产量检查所花费的总时间）。
图 1：协议的工作流程。 请单击此处查看此图的大图。
图2：生物测定方法。 （A）洛伐他汀对 神经孢子虫 的生物测定（在30°C下孵育24小时）。在试验结束时，在可见光下拍摄90毫米琼脂平板。（B）六种洛伐他汀标准品的浓度为：1号（1毫克/毫升）、2号（0.75毫克/毫升）、3号（0.5毫克/毫升）和4号（0.25毫克/毫升）。将5号样品稀释至0.25×（1：4）。将6号样品稀释至0.5×（1：2）。抑制区尺寸（mm2）由成像软件测量。（C）使用基于标准抑制区维度的数据分析和绘图软件开发了回归模型。 请点击此处查看此图的大图。
图 3：暴露于紫外光下的薄层色谱图 （TLC） 板。 （A）在TLC分析中以正己烷：乙酸乙酯（2：3 v/v）为流动相，在显影剂中浸泡后将TLC板暴露在紫外光（365 nm）（10% H2SO4）下。（B）六种洛伐他汀标准品的浓度为：1号（1毫克/毫升）、2号（0.75毫克/毫升）、3号（0.5毫克/毫升）和4号（0.25毫克/毫升）。将5号样品稀释至0.25×（1：4）。将6号样品稀释至0.5×（1：2）。抑制区尺寸（mm2）由成像软件测量。（C）使用基于TLC板上洛伐他汀标准条带尺寸的数据分析和绘图软件开发了回归模型。请点击此处查看此图的大图。
图 4：蓝色 LED 照明器扫描的薄层色谱图 （TLC） 板。 （A）在TLC分析中以正己烷：乙酸乙酯（2：3 v/v）作为流动相，用蓝光LED照明器扫描TLC板。（B）六种洛伐他汀标准品的浓度为：1号（1毫克/毫升）、2号（0.75毫克/毫升）、3号（0.5毫克/毫升）和4号（0.25毫克/毫升）。将5号样品稀释至0.25×（1：4）。将6号样品稀释至0.5×（1：2）。抑制区尺寸（mm2）由成像软件测量。（C）使用基于TLC板上洛伐他汀标准条带尺寸的数据分析和绘图软件开发了回归模型。请点击此处查看此图的大图。
| 生物 | 蓝色发光二极管照明器 | 紫外线检测 | |
| 结果观察 | 眼睛 | 蓝色 LED 照明器和眼睛 | 紫外线和眼睛 |
| 图像分辨率 | 中等 | 高 | 低 （模糊和模糊的图像） |
| 大致时间成本 | 24小时 | 1 小时 | 2小时 |
| 所需的分析技能 | 中等 | 低 | 中等 |
| 安全 | 微生物感染 | 非常安全 | 紫外线照射 |
| 回归方程 | y = 0.0019x + 0.0304 | y = 0.0399x - 0.1271 | y = 0.0657x - 0.6405 |
| R-平方 | 0.99 | 0.98 | 0.97 |
| 坡 | 0.0019 | 0.0399 | 0.0657 |
| 拦截 | 0.0304 | -0.1271 | -0.6405 |
| 斜率标准误差 | 8.94E-05 | 3.54E-03 | 6.28E-03 |
| 截距标准误差 | 0.03032 | 0.07115 | 0.12375 |
表1：本研究中使用的三种检测方法的比较。
| 薄层色谱密度法 | 薄层色谱图像分析 | |||||||
| 埃尔-金迪 等人10 |
埃尔卡迪 等人11 |
穆沙拉夫 等人12 |
约翰逊9 | 赫斯2 | 蓝光照明器方法 （本研究） |
|||
| 样本 | 盐酸醋丁洛尔 | 盐酸环丙沙星 | 甲 硝 唑 | 达那唑 | 胆固醇 | 香草醛 | 烟 酰 胺 | 洛伐他汀 |
| 结果 | 紫外线 探测器 |
薄 扫描器 |
薄 扫描器 |
平板扫描仪 | 数码相机 带紫外灯 |
蓝光照明器 | ||
| 波长 | 230 纳米 | 280 纳米 | 280 纳米 | 291 纳米 | 那 | 254 纳米 | 那 | |
| 相关系数 | 0.996安培 | 0.9991安培 | 0.9994安培 | 0.996安培 | 0.998安培 | 0.971字节 | 0.987字节 | 0.99安培 0.98字节 |
| 回归方程 | 那 | y = 5.7853x +19.9383 |
y = 1.1104x + 6.9755 |
y = 7.949x + 2460 | y = 0.96x | 那 | 那 | y = 0.0399x -0.1271 |
| a：皮尔逊相关系数 | ||||||||
| b：R平方 | ||||||||
表2：以前方法和当前研究的比较。
补充图1：采用蓝光LED照明法扫描含有氨苄青霉素的薄层色谱（TLC）板。 （A）乙酸乙酯：甲醇（9：13 v/v）作为TLC分析中的流动相，用蓝光LED照明器扫描TLC板。（B）四种氨苄西林标准的浓度为：1号（100毫克/毫升）、2号（75毫克/毫升）、3号（50毫克/毫升）和4号（25毫克/毫升）。条带的尺寸由成像软件测量。（C）使用数据分析和绘图软件基于TLC板上氨苄青霉素标准条带的尺寸开发了回归模型。 请点击此处下载此文件。
补充图2：薄层色谱图（TLC）板，通过蓝光LED照明方法扫描阿布拉霉素。 （A）甲醇：在TLC分析中使用水（6：5 v/v）作为流动相，用蓝光LED照明器扫描TLC板。（B）四种阿布拉霉素标准品的浓度为：1号（50 mg/mL）、2号（40 mg/mL）、3号（30 mg/mL）和4号（20 mg/mL）。条带的尺寸由成像软件测量。（C）使用数据分析和绘图软件基于TLC板上阿布拉霉素标准条带的尺寸开发了回归模型。 请点击此处下载此文件。
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Discussion
本研究描述了一种新的方法，即蓝光LED照明器，无需使用昂贵和专门的设备（如HPTLC，HPLC和GC方法）即可定量化合物，并将该方法与生物测定和紫外检测方法进行比较以评估定量性能。因此，得出的结论是，蓝光LED照明方法是一种相对安全有效的方案，用于量化TLC板上目标化合物的产率。
以前的研究已经报道了几种不使用专用定量设备的定量方法，并且所有研究表明定量的准确性接近使用专用设备的准确度2，9，10，11，12（表2）。例如，El-Gindy等人10比较了基于HPLC和TLC密度测定方法的估计产量的准确性，结果表明两种方法之间没有显着差异（p值<0.05）。与本研究中的蓝光LED照明方法相比，El-Gindy等人10开发的TLC密度法需要特殊的波长检测器，而蓝光LED照明方法需要简单且廉价的蓝光LED扫描仪。同时，蓝光LED扫描仪也可用于其他目的，例如凝胶电泳扫描，但Elkady等人开发的专用TLC扫描仪11仅用于TLC密度法。
除了TLC密度法10，11外，还开发了平板扫描仪和数码相机法来检测样品的产量。例如，Johnson9 使用平板扫描仪建立了快速TLC检测方法，然后使用商业图像软件测量吸收。然而，蓝光LED照明方法中使用的图像软件是免费的，易于使用。Hess2 开发了“TLC分析仪”软件来估计数码相机拍摄的TLC板图像上的条带尺寸，这与本研究中的UV检测方法相似。然而，这两种方法都可能与紫外线危害发生潜在的相互作用。
基于标准条带维数的生物测定法、蓝光LED照明器和紫外检测法建立了回归模型，R平方值分别为0.99、0.98和0.97（表1）。由于实现了高线性（R平方），建议回归模型可以测量样本的产量。回归模型中的 X 值被标准条带的维度替换，估计产量（回归模型中的预测 Y 值）分别通过生物测定、蓝光 LED 和紫外线检测方法确定，约为 5.6、5.4 和 5.3。结果表明，与紫外检测法相比，使用蓝光LED照明器的R平方和估计产量更接近生物测定方法（设置为对照）（表1）。
为了了解该方法的局限性，该方法还用于检测另外两种化合物，包括氨苄西林和阿布拉霉素;结果如补充 图1 和 补充图2所示。在这种方法中必须注意两个重要步骤：（1）干燥后，必须立即可视化板;延迟可视化可能会影响斑点检测;（2） 不建议对印版进行过度曝光，因为从印版扫描的图像具有高背景，并且难以测量斑点的区域。
总而言之，与其他定量色谱方法相比，blue-LED照明方法是一种相对安全，省时，便宜且省力的方法，可以加快样品产量的定量;因此，这种方法是用于开发预算有限的实验室的理想方案。同时，从蓝光LED照明方法检索到的TLC板图像比从UV检测方法中检索到的TLC板图像更清晰（图3A与图3A）。图4A），这也有助于精确确定TLC板上条带的尺寸，并估计样品的产量。
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Disclosures
所有作者都声明他们没有利益冲突。
Acknowledgments
这项研究得到了台湾科技部的支持（MOST 108-2320-B-110-007-MY3）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| American bacteriological Agar | Condalab | 1802.00 | |
| Aspergillus terreus | ATCC 20542 | ||
| Blue-LED illuminator | MICROTEK | Bio-1000F | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | HERAEUS Megafuge 8 | |
| Compact UV lamp | UVP | UVGL-25 | |
| Ethyl Acetate | MACRON | MA-H078-10 | |
| Filter Paper 125mm | ADVANTEC | 60311102 | |
| ImageJ | NIH | Freeware | https://imagej.nih.gov/ij/download.html |
| Lovastatin standard | ACROS | A0404262 | |
| MiBio Fluo | MICROTEK | V1.04 | |
| n-Hexane | C-ECHO | HH3102-000000-72EC | |
| OriginPro | OriginLab | 9.1 | https://www.originlab.com/origin |
| Potato dextrose broth H | STBIO MEDIA | 110533 | |
| Rotary evaporator | EYELA | SB-1000 | |
| Sulfuric acid | Fluka | 30743-2.5L-GL | |
| TLC silica gel 60 F254 | MERCK | 1.05554.0001 | |
| Trifluoroacetic acid | Alfa Aesar | 10229873 | |
| Ultrasonic vibration machine | DELTA | DC600 |
References
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