Summary
Mevcut protokol, mavi-LED aydınlatma tekniğini kullanarak TLC plakasındaki bileşiklerin verimini tahmin etmek için bir yöntem geliştirdi. Bu yaklaşımın avantajları, güvenli, etkili, ucuz olması ve araştırmacının aynı anda birden fazla örneği ölçmesine izin vermesidir.
Abstract
İnce tabaka kromatografisi (TLC), bilinmeyen numunelerin verimini ölçmek için organik kimya araştırmalarında yaygın olarak kullanılan erişilebilir bir analitik tekniktir. Bu çalışma, mavi-LED aydınlatıcıyı kullanarak bir TLC plakasındaki numunelerin verimini tahmin etmek için etkili, ucuz ve güvenli bir yöntem geliştirdi. Aspergillus terreus'tan ekstrakte edilen Lovastatin, bu çalışmada kullanılan örnek bileşiktir. Lovastatin verimini değerlendirmek için lovastatin standardına dayanan regresyon modelleri kullanılmıştır. Üç yöntem karşılaştırıldı: biyotahlil, UV algılama ve mavi-LED aydınlatma. Sonuç, mavi-LED aydınlatma yönteminin UV algılama ve biyotahlil yöntemlerinden önemli ölçüde daha fazla zaman etkili olduğunu göstermiştir. Ek olarak, mavi-LED aydınlatma, biyotahlil yöntemindeki biyolojik tehlikeler (örneğin, mikrobiyal enfeksiyon) ve UV algılama yönteminde ultraviyole maruziyeti endişesi nedeniyle nispeten güvenli bir seçenekti. GC, HPLC ve HPTLC gibi bağımsız olarak çalışmadan önce özel cihazlar ve uzun süreli eğitim gerektiren pahalı yöntemlerle karşılaştırıldığında, mavi-LED aydınlatıcıyı kullanmak, bir TLC plakasından numunelerin verimini tahmin etmek için ekonomik bir seçenekti.
Introduction
İnce tabaka kromatografisi (TLC), organik kimya alanında kalitatif ve kantitatif bir teknik olarak yaygın olarak kullanılmaktadır 1,2,3. TLC'nin başlıca avantajları, hızlı algılama, esnek numune gereksinimleri sağlaması ve özel ekipman gerektirmemesidir4. Bugüne kadar, birçok gelişmiş yaklaşım oluşturulmuş olmasına rağmen, TLC hala bir karışımdaki bilinmeyen numuneleri tanımlamak için ana yöntemdir. Bununla birlikte, bu yaklaşımın zorluğu, özellikle sınırlı bütçeli laboratuvarlar geliştirmek için numune verimini ölçmek için güvenli ve ucuz ekipman eksikliğidir. Bu nedenle bu çalışma, numunelerin verimini tahmin etmek için TLC ile birleşen verimli, güvenli ve ucuz bir yöntem geliştirmeyi amaçlamıştır.
Yüksek performanslı TLC (HPTLC), yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) ve gaz kromatografisinin (GC) aksine, katı numune gereksinimleri, zaman alıcı ve numune hazırlama1,5 için çok adımlı katılım, TLC çeşitli avantajlar göstermiştir. İlk olarak, numune hazırlama için, HPLC ve GC ham ekstraktı tespit edemez, çünkü ham ekstrakt HPLC ve GC sütununu tıkayabilir. İkincisi, numuneler UV açısından uygun olmadığında (HPLC analizi için önemli) veya düşük uçuculukta (GC analizi için önemli), bu numunelere TLC uygulanabilir ve görselleştirme reaktifinin kullanılması, izole edilmiş numuneleri ince tabakalar üzerinde görünür kılar 6,7,8. Üçüncüsü, genel kullanıcılar için, HPLC ve GC genellikle TLC'ye kıyasla bağımsız olarak çalışmadan önce nispeten uzun bir ön eğitim gerektirir. Ek olarak, yüksek performanslı TLC (HPTLC) olarak bilinen nicel TLC analizi, son derece hassas bir tarayıcıyla TLC plakasındaki bilgileri dijitalleştirebilir. Bununla birlikte, HPTLC sisteminin maliyeti nispeten pahalıdır. Bu nedenle, TLC plakasındaki numuneleri ölçmek için uygun maliyetli ve hızlı bir yaklaşım geliştirmek önemli bir konudur.
TLC verim ölçümü için benzer yöntemler geliştirilmiştir; Örneğin, Johnson9, bir bilgisayara bağlı düz yataklı bir tarayıcı kullanarak TLC plakasındaki numunelerin miktarının belirlenmesine izin veren bir teknik bildirmiştir. 2001 yılında, El-Gindy ve ark.10, bileşiği optik yoğunlukla tespit etmek için kullanılan TLC-dansitometrik yöntemini geliştirdi ve teknik Elkady ve ark.11 tarafından da uygulandı. 2007 yılında Hess2, UV ışığı ile birleştirilmiş bir dijital kamera kullanarak TLC plakası üzerindeki bir bileşiğin verimini tespit etmek için uygulanan dijital olarak geliştirilmiş TLC (DE-TLC) yöntemini sundu. Hess ayrıca HPTLC ve DE-TLC yöntemi arasındaki maliyet farklarını karşılaştırdı ve DE-TLC yönteminin uygun maliyetli olması nedeniyle lise ve üniversite laboratuvarlarında kullanılabileceği sonucuna vardı2. Bununla birlikte, TLC-densitometrik yöntemin maliyeti hala pahalıydı ve ultraviyole ışığın çalışması, kullanıcıların ultraviyole radyasyona maruz kalabileceği durumlarda yeterli ön eğitim gerektiriyordu. Bu nedenle, TLC ile uyumlu, numune verimini ölçmek için verimli, güvenli ve ucuz bir yöntem geliştirmek arzu edilir.
Bu çalışma, mavi-LED aydınlatıcıyı kullanarak bir TLC plakası üzerindeki numuneyi tespit etmek için bir protokol tanımladı ve bantların boyutlarını ölçmek ve ardından bileşik verimini belirlemek için yüksek güvenilirliğe (yüksek R-kare değeri) sahip bir regresyon modeli geliştirdi. Son olarak, mavi-LED aydınlatma yönteminin nispeten güvenli olduğu bulunmuştur (vs. UV algılama yöntemi), ucuz (vs. GC, HPLC ve HPTLC) ve verim ölçümü için etkili (biyotahlil yöntemine karşı) yaklaşım.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Mevcut protokol örnek olarak lovastatin kullanılarak açıklanmıştır. Lovastatin, bir haftalık Aspergillus terreus'tan çıkarıldı.
1. Bileşik ekstraksiyon
NOT: Bileşik ekstraksiyonu ile ilgili ayrıntılar için lütfen Şekil 1'e bakınız.
- Kültür Aspergillus terreus patates dekstroz agar üzerinde (PDA, bakınız Malzeme Tablosu) 30 °C'de orta.
- Kültürü 24 saat boyunca 40 °C'de kurutun. Kurutulmuş kültürü sterilize cımbız kullanarak 50 mL'lik bir tüpe aktarın ve 15 mL etil asetat ekleyin.
- Karışımı 1 dakika boyunca vorteksleme yaparak kuvvetlice çalkalayın ve 200 rpm'de çalkalayarak 40 ° C'de 1 saat inkübe edin.
- 1 saat boyunca 40 ° C'de 40 kHz ultrasonik banyo ( Malzeme Tablosuna bakınız) kullanarak karışımı sonikleştirin.
- Karışımı oda sıcaklığında 1 dakika boyunca 5.000 x g'de santrifüj yapın ve 11 μm filtre kağıdından süzün.
- Filtrasyonu bir ayırma hunisinde eşit miktarda steril su ile çıkarın.
- Faz ayırmadan sonra, organik tabakayı toplayın ve ardından döner bir evaporatörde buharlaştırın (bkz. Kalıntıyı 2 mL etil asetat içinde çözün.
2. Ham ekstraktın normal faz (NP) adsorpsiyon sütunu ile ayrılması
- Kolonu sabit faz olarak NP silika jel ile paketleyin ve mobil faz olarak n-hekzan: etil asetat: trifloroasetik asit (H: E: T; 80: 20: 0.1, v / v / v) kullanın.
- Ekstraktın 2 mL'sini (adım 1) kolona yükleyin ve ekstraktı ertelemek için mobil faz çözücüyü 1 mL / dak akış hızında ekleyin.
NOT: Akış hızı bir stopcock kullanılarak manuel olarak kontrol edildi. - Lovastatinin varlığını doğrulamak için atık suyu TLC ile doğrulayın ve ardından çözücü çıkarılana kadar 45 ° C'de döner bir evaporatörde buharlaştırın. Bu adım yaklaşık 20-25 dakika sürer.
- Kalıntıyı 1 mL etil asetat içinde çözün ve daha sonra% 1'lik eşit hacimli trifloroasetik asit ile karıştırın.
- Karışımı oda sıcaklığında 1 dakika boyunca 5.000 x g'de santrifüj edin ve organik tabakayı yeni bir cam tüp içinde toplayın.
3. İnce tabakalı kromatogram (TLC) plakaların hazırlanması ve yüklenmesi
- Bir kılcal pipet kullanarak TLC plakasının taban çizgisine 5 μL numune ve lovastatin standartlarını (bkz. Malzeme Tablosu) yerleştirin ve TLC plakasının yanlarında 1 cm'lik bir kenarlık bırakın.
- TLC plakasını oda sıcaklığında 5 dakika boyunca bir davlumbazda kurulayın.
- Plakayı forseps ile nazikçe mobil faz çözücüyü içeren doymuş bir cam hazneye yerleştirin. Odayı bir cam kapakla örtün ve plakanın tamamen gelişmesine izin verin.
- Solvent hattı plakanın üstünden 1 cm'ye ulaştığında plakayı odadan çıkarın.
4. Mavi-LED aydınlatıcı ile analiz
- Çözücü çizgisini bir kalemle işaretleyin. Plakayı davlumbazda oda sıcaklığında 10 dakika kurutun.
- Kuruduktan sonra, plakayı hemen% 10H2SO4 çözücüye batırın ve ardından oda sıcaklığında 10 dakika boyunca davlumbazda kurutun.
- Kahverengi lekeler görünene kadar plakayı ısıtma paneline yerleştirin. Plakanın aşırı ısınmadığından emin olun, çünkü bu lovastatinin görselleştirilmesini zorlaştırabilir.
- Plakayı mavi-LED aydınlatıcıya aktarın ve uyumlu bir ücretsiz yazılım (MiBio Fluo) kullanarak tarayın ( bkz.
5. Regresyon modeli ile verim tahmini
- ImageJ yazılımını kullanarak bantların boyutunu ölçün (bkz.
- 1 mg / mL, 0.75 mg / mL, 0.5 mg / mL ve 0.25 mg / mL dahil olmak üzere lovastatin standartlarının azalan konsantrasyonlarına dayanan veri analizi ve grafik yazılımı kullanarak bir regresyon modeli oluşturun (bkz.
- Örneklerin verimini tahmin etmek için regresyon modelini uygulayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu çalışmada, bileşiklerin verimini tahmin etmek için mavi-LED aydınlatma yöntemi sunulmuş ve bu yöntem biyotahlil ve UV ile saptanan yöntemlerle doğrulanarak karşılaştırılmıştır (Tablo 1). Regresyon modelleri, numunelerin verimini tahmin etmek için sırasıyla üç yöntem için bantların boyutlarına ve standartların konsantrasyonuna dayanarak geliştirilmiştir. İlk olarak, biyotahlil yönteminin sonuçlarında, inhibisyon bölgesinin boyutları ile lovastatin standartları arasındaki R-karesi 0.99 idi ve örnek verimi regresyon modeli tarafından öngörülen 0.56 mg idi (Şekil 2). İkincisi, UV tespit yönteminde, lovastatin standartları ile TLC plakasındaki bantların boyutu arasındaki R-karesi 0.97 idi ve regresyon modeli tarafından öngörülen numunenin verimi 0.53 mg idi (Şekil 3). Özellikle, bandın kenarları bulanıktı ve nispeten düşük sinyal yoğunluğu bantları gözlendi (Şekil 3A). Üçüncüsü, mavi-LED aydınlatma yönteminde, lovastatin standartları ile TLC plakasındaki bantların boyutu arasındaki R-karesi 0.98 idi ve örnek verimi regresyon modeli tarafından öngörülen 0.54 mg idi (Şekil 4). Mavi-LED aydınlatıcı kullanılarak tahmin edilen verim, biyotahlil yöntemine (kontrol olarak ayarlanmış) daha yakındı. Bandın boyutu lovastatin miktarı ile orantılıydı ve berrak bantlar mavi-LED aydınlatma yöntemiyle elde edildi. Ek olarak, biyotahlil, UV algılamalı ve mavi-LED aydınlatma yöntemlerinin çalışma saatleri sırasıyla yaklaşık 24 saat, 2 saat ve 1 saat idi; (Not: çalışma saati, lovastatinin verim incelemesi için harcanan toplam süre anlamına gelir).
Şekil 1: Protokolün çalışma akışı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Biyotahlil yöntemi. (A) Neurospora crassa'ya karşı lovastatin biyotahlili (30 °C'de 24 saat boyunca inkübe edilir). Denemenin sonunda, 90 mm'lik agar plakaları görünür ışık altında fotoğraflandı. (B) Altı lovastatin standardının konsantrasyonları şunlardı: No. 1 (1 mg / mL), No. 2 (0.75 mg / mL), No. 3 (0.5 mg / mL) ve No. 4 (0.25 mg / mL). 5 numaralı örneklem ×0.25'e (1:4) seyreltildi. 6 numaralı örnek, 0.5× (1:2) kadar seyreltildi. İnhibisyon bölgesi boyutu (mm2) görüntüleme yazılımı ile ölçüldü. (C) Standartların inhibisyon bölgesi boyutuna dayalı veri analizi ve grafik yazılımı kullanılarak bir regresyon modeli geliştirilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: UV ışığına maruz kalan ince tabaka kromatogram (TLC) plakası. (A) TLC analizinde mobil faz olarak n-hekzan:etil asetat (2:3 v/v) kullanılmış ve TLC plakası geliştiriciye batırıldıktan sonra UV ışığına (365 nm) maruz bırakılmıştır (%10H2SO4). (B) Altı lovastatin standardının konsantrasyonları şunlardı: No. 1 (1 mg / mL), No. 2 (0.75 mg / mL), No. 3 (0.5 mg / mL) ve No. 4 (0.25 mg / mL). 5 numaralı örneklem ×0.25'e (1:4) seyreltildi. 6 numaralı örnek, 0.5× (1:2) kadar seyreltildi. İnhibisyon bölgesi boyutu (mm2) görüntüleme yazılımı ile ölçüldü. (C) TLC plakası üzerindeki lovastatin standart bantlarının boyutuna dayalı veri analizi ve grafik yazılımı kullanılarak bir regresyon modeli geliştirilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Mavi-LED aydınlatıcı tarafından taranan ince katmanlı kromatogram (TLC) plakası. (A) TLC analizinde mobil faz olarak n-hekzan:etil asetat (2:3 v/v) kullanıldı ve TLC plakası mavi-LED aydınlatıcı tarafından tarandı. (B) Altı lovastatin standardının konsantrasyonları şunlardı: No. 1 (1 mg / mL), No. 2 (0.75 mg / mL), No. 3 (0.5 mg / mL) ve No. 4 (0.25 mg / mL). 5 numaralı örneklem ×0.25'e (1:4) seyreltildi. 6 numaralı örnek, 0.5× (1:2) kadar seyreltildi. İnhibisyon bölgesi boyutu (mm2) görüntüleme yazılımı ile ölçüldü. (C) TLC plakası üzerindeki lovastatin standart bantlarının boyutuna dayalı veri analizi ve grafik yazılımı kullanılarak bir regresyon modeli geliştirilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Biyotahlil | Mavi-LED Aydınlatıcı | UV algılamalı | |
| Sonuç gözlemi | Göz | Mavi-LED aydınlatıcı ve gözler | UV ışığı ve gözler |
| Görüntü çözünürlüğü | Orta | Yüksek | Alçak (bulanık ve soluk görüntü) |
| Yaklaşık zaman maliyeti | 24 saat | 1 saat | 2 saat |
| Gerekli analiz becerisi | Orta | Alçak | Orta |
| Emniyet | Mikrobiyal enfeksiyon | Çok güvenli | UV ışığına maruz kalma |
| Regresyon denklemi | y = 0,0019x + 0,0304 | y = 0,0399x - 0,1271 | y = 0,0657x - 0,6405 |
| R-kare | 0.99 | 0.98 | 0.97 |
| Yamaç | 0.0019 | 0.0399 | 0.0657 |
| Durdur | 0.0304 | -0.1271 | -0.6405 |
| Standart eğim hatası | 8,94E-05 | 3.54E-03 | 6.28E-03 |
| Standart durdurma hatası | 0.03032 | 0.07115 | 0.12375 |
Tablo 1: Bu çalışmada kullanılan üç tespit yönteminin karşılaştırılması.
| TLC-densitometrik yöntem | TLC-görüntü analizi | |||||||
| El-Gindy · ve ark.10 |
Arjantin ve ark.11 |
Müşerref ve ark.12 |
Johnson9 · | Hess2 | Mavi-LED Aydınlatıcı yöntemi (Bu çalışma) |
|||
| Örnek | Asebutolol HCL | Siprofloksasin HCL | Metronidazol | Danazol | Kolesterol | Vanilin | Nikotinamid | Lovastatin |
| Sonuç -ları | UV dedektör |
TLC tarayıcı |
TLC tarayıcı |
Düz yataklı tarayıcı | Dijital fotoğraf makinesi UV lambalı |
Mavi LED aydınlatıcı | ||
| Dalga boyu | 230 nm | 280 mil | 280 mil | 291 nm | NA | 254 deniz mili | NA | |
| Korelasyon katsayısı | 0.996bir | 0.9991a | 0.9994a | 0.996bir | 0.998bir | 0.971b | 0.987b | 0.99a 0.98milyar |
| Regresyon denklemi | NA | y = 5.7853x +19.9383 |
y = 1.1104x + 6.9755 |
y = 7.949x + 2460 | y = 0,96x | NA | NA | y = 0,0399x -0.1271 |
| a: Pearson korelasyon katsayısı | ||||||||
| b: R-kare | ||||||||
Tablo 2: Önceki yöntemler ile mevcut çalışmanın karşılaştırılması.
Ek Şekil 1: Ampisilinli ince tabakalı kromatogram (TLC) plakası mavi-LED aydınlatma yöntemi ile taranmıştır. (A) Etil asetat: metanol (9: 13 v / v), TLC analizinde mobil faz olarak kullanıldı ve TLC plakası mavi-LED aydınlatıcı tarafından tarandı. (B) Dört ampisilin standardının konsantrasyonu şunlardı: No. 1 (100 mg / mL), No. 2 (75 mg / mL), No. 3 (50 mg / mL) ve No. 4 (25 mg / mL). Bantların boyutu görüntüleme yazılımı ile ölçüldü. (C) TLC plakasındaki ampisilin standart bantlarının boyutuna dayanan veri analizi ve grafik yazılımı kullanılarak bir regresyon modeli geliştirilmiştir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Şekil 2: Mavi-LED aydınlatma yöntemi ile taranan aframisin içeren ince tabakalı kromatogram (TLC) plakası. (A) Metanol: Su (6: 5 v / v) TLC analizinde mobil faz olarak kullanılmış ve TLC plakası mavi-LED aydınlatıcı tarafından taranmıştır. (B) Dört aframisin standardının konsantrasyonu şunlardı: No. 1 (50 mg / mL), No. 2 (40 mg / mL), No. 3 (30 mg / mL) ve No. 4 (20 mg / mL). Bantların boyutu görüntüleme yazılımı ile ölçüldü. (C) TLC plakasındaki apramisin standart bantlarının boyutuna dayalı veri analizi ve grafik yazılımı kullanılarak bir regresyon modeli geliştirilmiştir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu çalışmada, HPTLC, HPLC ve GC yöntemi gibi pahalı ve özel ekipman kullanmadan bileşikleri ölçmek için yeni bir yaklaşım olan mavi-LED aydınlatıcı tanımlanmıştır ve yöntem, nicelleştirme performansını değerlendirmek için biyotahlil ve UV tarafından tespit edilen yöntemlerle karşılaştırılmıştır. Sonuç olarak, mavi-LED aydınlatma yönteminin, TLC plakası üzerinde hedeflenen bileşiklerin verimini ölçmek için kullanılan nispeten güvenli ve etkili bir protokol olduğu sonucuna varılmıştır.
Önceki çalışmalar, özel kantitatif ekipman kullanmadan birkaç nicel yöntem bildirmiştir ve tüm çalışmalar, kantitasyonun doğruluğunun, özel ekipman 2,9,10,11,12 kullanımına yakın olduğunu göstermiştir (Tablo 2). Örneğin, El-Gindy ve ark.10, HPLC ve TLC-densitometrik yöntemlere dayanarak tahmini verimin doğruluğunu karşılaştırdı ve sonuçlar iki yöntem arasında anlamlı bir fark olmadığını gösterdi (p değeri < 0.05). Bu çalışmada mavi-LED aydınlatma yöntemi ile karşılaştırıldığında, El-Gindy ve ark.10 tarafından geliştirilen TLC-densitometrik yöntem özel bir dalga boyu dedektörü gerektirirken, mavi-LED aydınlatma yöntemi basit ve ucuz bir mavi-LED tarayıcı gerektirmiştir. Bu arada, mavi-LED tarayıcı, jel elektroforez taraması gibi başka amaçlar için de kullanılabilir, ancak Elkady ve ark.11 tarafından geliştirilen özel TLC tarayıcısı yalnızca TLC-densitometrik yöntem için kullanılmıştır.
TLC-dansitometrik yöntem10,11'e ek olarak, numunelerin verimini tespit etmek için düz yataklı tarayıcı ve dijital kamera yöntemi geliştirilmiştir. Örneğin, Johnson9, düz yataklı tarayıcıyı kullanarak hızlı bir TLC algılama yöntemi oluşturdu ve ardından ticari görüntü yazılımı kullanarak emilimi ölçtü. Ancak mavi-LED aydınlatma yönteminde kullanılan görüntü yazılımı ücretsiz ve kullanımı kolaydı. Hess2, bu çalışmada UV tarafından tespit edilen yönteme benzer şekilde, bir dijital kamera tarafından çekilen TLC plaka görüntülerindeki bantların boyutunu tahmin etmek için "TLC analizörü" yazılımını geliştirdi. Bununla birlikte, her iki yöntem de UV ışığı tehlikeleriyle potansiyel olarak etkileşime girebilir.
Standartların bantlarının boyutuna dayalı regresyon modelleri biyotahlil, mavi-LED aydınlatıcı ve UV tarafından saptanan yöntem için geliştirilmiş ve R-kare değeri sırasıyla 0.99, 0.98 ve 0.97 olarak belirlenmiştir (Tablo 1). Yüksek doğrusallık (R-kare) elde edildiğinden, regresyon modelinin numunelerin verimini ölçebileceği öne sürülmüştür. Regresyon modelindeki X-değeri, standartların bantlarının boyutuyla değiştirildi ve tahmini verim (regresyon modelinde tahmin edilen Y-değeri), sırasıyla biyotahlil, mavi-LED ve UV algılama yöntemleri ile belirlenen yaklaşık 5.6, 5.4 ve 5.3 idi. Sonuçlar, mavi-LED aydınlatıcıyı kullanan R-kare ve tahmini verimin, UV tarafından tespit edilen yöntemden (Tablo 1) biyotahlil yöntemine (kontrol olarak ayarlanmış) daha yakın olduğunu göstermiştir.
Bu yaklaşımın sınırlamalarını anlamak için, yaklaşım ampisilin ve aparamisin dahil olmak üzere diğer iki bileşiği tespit etmek için de uygulanmıştır; sonuçlar Ek Şekil 1 ve Ek Şekil 2'de gösterilmiştir. Bu yaklaşımda iki önemli adıma dikkat edilmelidir: (1) kuruduktan sonra, plaka derhal görselleştirilmelidir; gecikmeli görselleştirme nokta algılamayı etkileyebilir; (2) plakadan taranan görüntü yüksek arka planla birlikte geldiğinden ve lekelerin alanlarını ölçmeyi zorlaştırdığından plakanın aşırı pozlanması önerilmez.
Sonuç olarak, mavi-LED aydınlatma yöntemi, diğer nicel kromatografik yöntemlere kıyasla numunelerin veriminin ölçülmesini hızlandırmak için nispeten güvenli, zaman kazandıran, ucuz ve daha az zahmetli bir yaklaşımdır; bu nedenle, bu yaklaşım sınırlı bütçeli laboratuvarların geliştirilmesinde kullanılmak üzere ideal bir protokoldür. Bu arada, mavi-LED aydınlatma yönteminden alınan TLC plaka görüntüleri, UV algılama yönteminden elde edilenlerden çok daha netti (Şekil 3A vs. Şekil 4A), aynı zamanda TLC plakasındaki bantların boyutunu tam olarak belirlemeye ve ayrıca numunelerin verimini tahmin etmeye yardımcı oldu.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Tüm yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Bu çalışma Tayvan Bilim ve Teknoloji Bakanlığı (MOST 108-2320-B-110-007-MY3) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| American bacteriological Agar | Condalab | 1802.00 | |
| Aspergillus terreus | ATCC 20542 | ||
| Blue-LED illuminator | MICROTEK | Bio-1000F | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | HERAEUS Megafuge 8 | |
| Compact UV lamp | UVP | UVGL-25 | |
| Ethyl Acetate | MACRON | MA-H078-10 | |
| Filter Paper 125mm | ADVANTEC | 60311102 | |
| ImageJ | NIH | Freeware | https://imagej.nih.gov/ij/download.html |
| Lovastatin standard | ACROS | A0404262 | |
| MiBio Fluo | MICROTEK | V1.04 | |
| n-Hexane | C-ECHO | HH3102-000000-72EC | |
| OriginPro | OriginLab | 9.1 | https://www.originlab.com/origin |
| Potato dextrose broth H | STBIO MEDIA | 110533 | |
| Rotary evaporator | EYELA | SB-1000 | |
| Sulfuric acid | Fluka | 30743-2.5L-GL | |
| TLC silica gel 60 F254 | MERCK | 1.05554.0001 | |
| Trifluoroacetic acid | Alfa Aesar | 10229873 | |
| Ultrasonic vibration machine | DELTA | DC600 |
References
- Pyka, A. Detection progress of selected drugs in TLC. BioMed Research International. 2014, 732078 (2014).
- Hess, A. V. I. Digitally enhanced thin-layer chromatography: An inexpensive, new technique for qualitative and quantitative analysis. Journal of Chemical Education. 84 (5), 842-847 (2007).
- Ullah, Q., Mohammad, A. Vitamins determination by TLC/HPTLC-a mini-review. Journal of Planar Chromatography - Modern TLC. 33 (5), 429-437 (2020).
- Chen, Z., Tao, H., Liao, L., Zhang, Z., Wang, Z. Quick identification of xanthine oxidase inhibitor and antioxidant from Erycibe obtusifolia by a drug discovery platform composed of multiple mass spectrometric platforms and thin-layer chromatography bioautography. Journal of Separation Science. 37 (16), 2253-2259 (2014).
- Duncan, J. D. Chiral separations: A comparison of HPLC and TLC. Journal of Liquid Chromatography. 13 (14), 2737-2755 (1990).
- Sherma, J. Thin-layer chromatography in food and agricultural analysis. Journal of Chromatography A. 880 (1-2), 129-147 (2000).
- Bocheńska, P., Pyka, A., Bocheńska, P., Bocheńska, B. Determination of acetylsalicylic acid in pharmaceutical drugs by TLC with densitometric detection in UV. Journal of Liquid Chromatography. 35 (10), 1346-1363 (2012).
- Poole, C. F. Planar chromatography at the turn of the century. Journal of Chromatography A. 856 (1-2), 399-427 (1999).
- Rapid Johnson, M. E. simple quantitation in thin-layer chromatography using a flatbed scanner. Journal of Chemical Education. 77 (3), 368-372 (2000).
- El-Gindy, A., Ashour, A., Abdel-Fattah, L., Shabana, M. M. First derivative spectrophotometric, TLC-densitometric, and HPLC determination of acebutolol HCL in presence of its acid-induced degradation product. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 24 (4), 527-534 (2001).
- Elkady, E. F., Mahrouse, M. A. Reversed-phase ion-pair HPLC and TLC-densitometric methods for the simultaneous determination of ciprofloxacin hydrochloride and metronidazole in tablets. Chromatographia. 73 (3-4), 297-305 (2011).
- Musharraf, S. G., Ul Arfeen,, Shoaib, Q., M, Development and validation of TLC-densitometric method for the quantification of a steroidal drug, danazol in its pharmaceutical formulations. Journal of Planar Chromatography - Modern TLC. 25 (4), 331-337 (2012).
