Summary
В настоящем протоколе разработан метод оценки выхода соединений на пластине TLC с использованием метода сине-светодиодного освещения. Преимущества такого подхода заключаются в том, что он безопасен, эффективен, недорог и позволяет исследователю измерять несколько образцов одновременно.
Abstract
Тонкослойная хроматография (TLC) является доступным аналитическим методом, который широко используется в исследованиях органической химии для количественной оценки выхода неизвестных образцов. В настоящем исследовании был разработан эффективный, дешевый и безопасный метод оценки выхода образцов на пластине TLC с использованием синего светодиодного осветителя. Ловастатин, извлеченный из Aspergillus terreus , был примером соединения, используемого в настоящем исследовании. Регрессионные модели, основанные на стандарте ловастатина, были использованы для оценки выхода ловастатина. Сравнивались три метода: биоанализ, УФ-детектирование и сине-светодиодное освещение. Результат показал, что метод сине-светодиодного освещения значительно более эффективен по времени, чем методы обнаружения ультрафиолета и биоанализа. Кроме того, синее светодиодное освещение было относительно безопасным вариантом из-за обеспокоенности биологическими опасностями в методе биоанализа (например, микробная инфекция) и ультрафиолетовым воздействием в методе обнаружения ультрафиолета. По сравнению с дорогостоящими методами, требующими специализированных приборов и длительного обучения перед самостоятельной работой, такими как GC, HPLC и HPTLC, использование синего светодиодного осветителя было экономичным вариантом для оценки выхода образцов из пластины TLC.
Introduction
Тонкослойная хроматография (ТЛК) широко используется как качественная и количественная методика в области органической химии 1,2,3. Основными преимуществами TLC являются то, что он обеспечивает быстрое обнаружение, гибкие требования к образцам и не требует специализированного оборудования4. На сегодняшний день, несмотря на то, что было установлено много передовых подходов, TLC по-прежнему является основным методом идентификации неизвестных образцов в смеси. Однако проблема этого подхода заключается в отсутствии безопасного и недорогого оборудования для количественной оценки выхода проб, особенно для развивающихся лабораторий с ограниченными бюджетами. Таким образом, настоящее исследование было направлено на разработку эффективного, безопасного и недорогого метода в сочетании с TLC для оценки выхода образцов.
В отличие от высокоэффективного TLC (HPTLC), высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC) и газовой хроматографии (GC) со строгими требованиями к образцам, трудоемкими и участием многоступенчатой для пробоподготовки 1,5, TLC показал ряд преимуществ. Во-первых, для пробоподготовки ВЭЖХ и ГК не могут обнаружить сырой экстракт, поскольку сырой экстракт может заткнуть колонну ВЭЖХ и ГХ. Во-вторых, когда образцы не подходят для УФ-излучения (важно для анализа ВЭЖХ) или с низкой летучестью (важно для анализа ГК), К этим образцам может быть применен TLC, а использование реагента визуализации делает изолированные образцы видимыми на тонких слоях 6,7,8. В-третьих, для обычных пользователей ВЭЖХ и ГК, как правило, требуют относительно длительного времени предварительной подготовки перед самостоятельной работой по сравнению с TLC. Кроме того, количественный анализ TLC, известный как высокопроизводительный TLC (HPTLC), может оцифровать информацию на пластине TLC с помощью высокочувствительного сканера. Однако стоимость системы ВЭЖХ относительно дорогая. Таким образом, разработка экономически эффективного и быстрого подхода к количественной оценке образцов на пластине TLC является важной темой.
Аналогичные методы были разработаны для количественной оценки урожайности TLC; Например, Джонсон9 сообщил о методе, который позволяет количественно оценить образцы на пластине TLC с помощью планшетного сканера, подключенного к компьютеру. В 2001 году El-Gindy et al.10 разработали TLC-денситометрический метод, который использовался для обнаружения соединения с оптической плотностью, и этот метод также был применен Elkady et al.11. В 2007 году Hess2 представил метод цифрового усовершенствования TLC (DE-TLC), применяемый для обнаружения выхода соединения на пластине TLC с использованием цифровой камеры в сочетании с ультрафиолетовым светом. Гесс также сравнил разницу в стоимости между методом HPTLC и DE-TLC и пришел к выводу, что метод DE-TLC может использоваться в лабораториях средней школы и колледжа из-за его доступной стоимости2. Тем не менее, стоимость TLC-денситометрического метода все еще была дорогой, и работа ультрафиолетового света требует адекватной предварительной подготовки на случай, если пользователи могут подвергнуться воздействию ультрафиолетового излучения. Поэтому, совместимый с TLC, желательно разработать эффективный, безопасный и недорогой метод количественной оценки выхода образца.
В настоящем исследовании описан протокол обнаружения образца на пластине TLC с использованием синего светодиодного осветителя и разработана регрессионная модель с высокой надежностью (высоким значением R-квадрата) для измерения размеров полос, а затем определения выхода соединения. Наконец, было установлено, что метод сине-светодиодного освещения является относительно безопасным (vs. Метод УФ-детектирования), дешевый (vs. GC, ВЭЖХ и ВЭЖХ) и эффективный (по сравнению с методом биоанализа) подход к количественной оценке урожайности.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Настоящий протокол описан на примере ловастатина. Ловастатин был извлечен из недельного Aspergillus terreus.
1. Экстракция соединений
ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения подробной информации об извлечении соединений см. Рисунок 1.
- Культура Aspergillus terreus на картофельный агар декстрозы (КПК, см. Таблицу материалов) в среде при 30 °C.
- Высушите культуру при 40 °C в течение 24 ч. Переложите высушенную культуру в 50 мл пробирку с помощью стерилизованного пинцета и добавьте 15 мл этилацетата.
- Смесь энергично встряхнуть вихрем в течение 1 мин и инкубировать в течение 1 ч при 40 °С с встряхиванием при 200 об/мин.
- Обжайте смесь ультразвуком с помощью ультразвуковой ванны 40 кГц (см. Таблицу материалов) при 40 °C в течение 1 ч.
- Центрифугируйте смесь при 5000 х г в течение 1 мин при комнатной температуре и фильтруйте через фильтровальную бумагу 11 мкм.
- Экстрагировать фильтрат равным объемом стерильной воды в сепараторную воронку.
- После разделения фаз собирают органический слой, а затем испаряют во вращающемся испарителе (см. Таблицу материалов). Растворить остаток в 2 мл этилацетата.
2. Разделение сырого экстракта по адсорбционной колонне нормальной фазы (NP)
- Упакуйте колонку силикагелем NP в качестве стационарной фазы и используйте n-гексан:этилацетат:трифторуксусную кислоту (H:E:T; 80:20:0.1, v/v/v) в качестве подвижной фазы.
- Загрузите 2 мл экстракта (стадия 1) на колонну и добавьте растворитель подвижной фазы со скоростью потока 1 мл/мин для элюляции экстракта.
ПРИМЕЧАНИЕ: Скорость потока управлялась вручную с помощью запорного крана. - Проверьте сточные воды с помощью TLC, чтобы подтвердить наличие ловастатина, а затем испарите во вращающемся испарителе при 45 °C до тех пор, пока растворитель не будет удален. Этот шаг занимает примерно 20-25 минут.
- Растворяют остаток в 1 мл этилацетата, а затем смешивают с равным объемом 1% трифторуксусной кислоты.
- Центрифугируйте смесь при 5000 х г в течение 1 мин при комнатной температуре и соберите органический слой в новую стеклянную трубку.
3. Подготовка и загрузка пластин тонкослойной хроматограммы (TLC)
- Нанесите 5 мкл образцов и эталонов ловастатина (см. Таблицу материалов) на базовую линию пластины TLC с помощью капиллярной пипетки, оставив границу 1 см по бокам пластины TLC.
- Высушите пластину TLC в вытяжном шкафу в течение 5 мин при комнатной температуре.
- Аккуратно поместите пластину щипцами в насыщенную стеклянную камеру, содержащую растворитель подвижной фазы. Накройте камеру стеклянной крышкой и дайте пластине полностью развиться.
- Снимите пластину из камеры, когда линия растворителя достигнет 1 см от верхней части пластины.
4. Анализ с помощью сине-светодиодного осветителя
- Пометьте линию растворителя карандашом. Высушите пластину в вытяжке в течение 10 мин при комнатной температуре.
- После высыхания сразу же замочите пластину в 10% растворителеH2SO4 , а затем высушите в вытяжке в течение 10 мин при комнатной температуре.
- Поместите пластину на нагревательную панель до появления коричневых пятен. Убедитесь, что пластина не перегревается, так как это может затруднить визуализацию ловастатина.
- Перенесите пластину на сине-светодиодный осветитель и отсканируйте с помощью совместимого бесплатного программного обеспечения (MiBio Fluo) (см. Таблицу материалов).
5. Оценка доходности по регрессионной модели
- Измерьте размеры полос с помощью программного обеспечения ImageJ (см. Таблицу материалов).
- Создание регрессионной модели с использованием программного обеспечения для анализа данных и построения графиков (см. Таблицу материалов) на основе нисходящих концентраций стандартов ловастатина, включая 1 мг/мл, 0,75 мг/мл, 0,5 мг/мл и 0,25 мг/мл.
- Примените регрессионную модель для оценки выхода образцов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В этом исследовании был представлен метод сине-светодиодного освещения для оценки выхода соединений, и этот метод был валидирован и сопоставлен с методами биоанализа и УФ-детектирования (таблица 1). Регрессионные модели были разработаны на основе размеров полос и концентрации эталонов для трех методов, соответственно, для прогнозирования выхода образцов. Во-первых, в результатах метода биоанализа R-квадрат между размерами зоны ингибирования и эталонами ловастатина составил 0,99, а выход образца составил 0,56 мг, предсказанный регрессионной моделью (рисунок 2). Во-вторых, в методе УФ-детектирования R-квадрат между стандартами ловастатина и размерностью полос на пластине TLC составлял 0,97, а выход образца, предсказанного регрессионной моделью, составлял 0,53 мг (рисунок 3). Примечательно, что края полосы были размытыми, и наблюдались относительно низкие полосы интенсивности сигнала (рисунок 3A). В-третьих, в методе сине-светодиодного освещения R-квадрат между стандартами ловастатина и размером полос на пластине TLC составлял 0,98, а выход образца составлял 0,54 мг, предсказанный регрессионной моделью (рисунок 4). Прогнозируемый выход с использованием синего светодиодного осветителя был ближе к методу биоанализа (установленному в качестве контрольного). Размер полосы был пропорционален количеству ловастатина, а прозрачные полосы были получены методом сине-светодиодной подсветки. Кроме того, рабочее время методов биоанализа, УФ-детектирования и синего светодиодного освещения составляло примерно 24 ч, 2 ч и 1 ч соответственно; (Примечание: рабочий час означает общее время, затраченное на экспертизу выхода ловастатина).
Рисунок 1: Рабочий поток протокола. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Метод биоанализа. (А) Биоанализ ловастатина против Neurospora crassa (инкубируется в течение 24 ч при 30 °C). В конце испытания 90-миллиметровые агаровые пластины были сфотографированы при видимом свете. (B) Концентрации шести стандартов ловастатина составляли: No 1 (1 мг/мл), No 2 (0,75 мг/мл), No 3 (0,5 мг/мл) и No 4 (0,25 мг/мл). Образец No5 разбавляли до 0,25× (1:4). Образец No6 разбавляли до 0,5× (1:2). Размер зоны ингибирования (мм2) измеряли с помощью программного обеспечения для визуализации. С) была разработана регрессионная модель с использованием программного обеспечения для анализа данных и построения графиков на основе измерения зоны ингибирования стандартов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Пластина тонкослойной хроматограммы (TLC), подвергающаяся воздействию ультрафиолетового света. (A) Н-гексан:этилацетат (2:3 в/об) использовалась в качестве подвижной фазы в анализе TLC, а пластина TLC подвергалась воздействию ультрафиолетового света (365 нм) после замачивания в разработчике (10%H2SO4). (B) Концентрации шести стандартов ловастатина составляли: No 1 (1 мг/мл), No 2 (0,75 мг/мл), No 3 (0,5 мг/мл) и No 4 (0,25 мг/мл). Образец No5 разбавляли до 0,25× (1:4). Образец No6 разбавляли до 0,5× (1:2). Размер зоны ингибирования (мм2) измеряли с помощью программного обеспечения для визуализации. (C) Была разработана регрессионная модель с использованием программного обеспечения для анализа данных и построения графиков на основе размеров стандартных полос ловастатина на пластине TLC. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Пластина тонкослойной хроматограммы (TLC), отсканированная синим светодиодным осветителем. (A) Н-гексан:этилацетат (2:3 в/об) использовался в качестве подвижной фазы в анализе TLC, а пластина TLC сканировалась синим светодиодным осветителем. (B) Концентрации шести стандартов ловастатина составляли: No 1 (1 мг/мл), No 2 (0,75 мг/мл), No 3 (0,5 мг/мл) и No 4 (0,25 мг/мл). Образец No5 разбавляли до 0,25× (1:4). Образец No6 разбавляли до 0,5× (1:2). Размер зоны ингибирования (мм2) измеряли с помощью программного обеспечения для визуализации. (C) Была разработана регрессионная модель с использованием программного обеспечения для анализа данных и построения графиков на основе размеров стандартных полос ловастатина на пластине TLC. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Биоанализ | Сине-светодиодный осветитель | УФ-детектирование | |
| Наблюдение за результатами | Взор | Сине-светодиодный осветитель и глаза | Ультрафиолетовый свет и глаза |
| Разрешение изображения | Терпимая | Высокий | Низкий (размытое и слабое изображение) |
| Приблизительная стоимость времени | 24 ч | 1 ч | 2 ч |
| Требуется навык анализа | Терпимая | Низкий | Терпимая |
| Безопасность | Микробная инфекция | Очень безопасно | Воздействие ультрафиолетового света |
| Уравнение регрессии | y = 0,0019x + 0,0304 | y = 0,0399x - 0,1271 | y = 0,0657x - 0,6405 |
| R-квадрат | 0.99 | 0.98 | 0.97 |
| Наклон | 0.0019 | 0.0399 | 0.0657 |
| Перехватывать | 0.0304 | -0.1271 | -0.6405 |
| Стандартная погрешность наклона | 8.94Е-05 | 3.54Е-03 | 6.28Е-03 |
| Стандартная ошибка перехвата | 0.03032 | 0.07115 | 0.12375 |
Таблица 1: Сравнение трех методов обнаружения, использованных в данном исследовании.
| TLC-денситометрический метод | Анализ TLC-изображений | |||||||
| Эль-Гинди и др.10 |
Элкады и др.11 |
Мушарраф и др.12 |
Джонсон9 | Гесс2 | Метод сине-светодиодного осветителя (Это исследование) |
|||
| Образец | Ацебутолол HCL | Ципрофлоксацин HCL | Метронидазол | Даназол | Холестерин | Ванилин | Никотинамид | Ловастатин |
| Результаты | УЛЬТРАФИОЛЕТОВЫЙ детектор |
ТЛЦ сканер |
ТЛЦ сканер |
Планшетный сканер | Цифровой фотоаппарат с УФ-лампой |
Сине-светодиодный осветитель | ||
| Длина волны | 230 морских миль | 280 морских миль | 280 морских миль | 291 морских миль | Н.А. | 254 морских миль | Н.А. | |
| Коэффициент корреляции | 0.996а | 0.9991а | 0.9994а | 0.996а | 0.998а | 0.971млрд | 0.987млрд | 0.99а 0.98б |
| Уравнение регрессии | Н.А. | y = 5,7853x +19.9383 |
y = 1,1104x + 6.9755 |
y = 7,949x + 2460 | y = 0,96x | Н.А. | Н.А. | y = 0,0399x -0.1271 |
| a: Коэффициент корреляции Пирсона | ||||||||
| b: R-квадрат | ||||||||
Таблица 2: Сравнение предыдущих методов и текущего исследования.
Дополнительный рисунок 1: Пластина тонкослойной хроматограммы (TLC) с ампициллином сканировалась методом сине-светодиодной подсветки. (A) Этилацетат:метанол (9:13 v/v) использовался в качестве подвижной фазы в анализе TLC, а пластина TLC сканировалась синим светодиодным осветителем. (B) Концентрация четырех эталонов ампициллина составляла: No 1 (100 мг/мл), No 2 (75 мг/мл), No 3 (50 мг/мл) и No 4 (25 мг/мл). Размер полос измерялся с помощью программного обеспечения для визуализации. С) Была разработана регрессионная модель с использованием программного обеспечения для анализа данных и построения графиков на основе размеров стандартных полос ампициллина на пластине TLC. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный рисунок 2: Пластина тонкослойной хроматограммы (TLC) с апрамицином, отсканированная методом сине-светодиодной подсветки. (A) Метанол:вода (6:5 v/v) использовался в качестве подвижной фазы в анализе TLC, а пластина TLC сканировалась синим светодиодным осветителем. (B) Концентрация четырех стандартов апрамицина составляла: No 1 (50 мг/мл), No 2 (40 мг/мл), No 3 (30 мг/мл) и No 4 (20 мг/мл). Размер полос измерялся с помощью программного обеспечения для визуализации. С) Была разработана регрессионная модель с использованием программного обеспечения для анализа данных и построения графиков на основе размеров стандартных полос апрамицина на пластине TLC. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В настоящем исследовании описан новый подход, синий светодиодный осветитель, для количественной оценки соединений без использования дорогостоящего и специализированного оборудования, такого как метод ВЭЖХ, ВЭЖХ и ГК, и этот метод сравнивали с методами биоанализа и УФ-детектирования для оценки эффективности количественной оценки. В результате был сделан вывод о том, что метод сине-светодиодного освещения является относительно безопасным и эффективным протоколом, используемым для количественной оценки выхода целевых соединений на пластине TLC.
В предыдущих исследованиях сообщалось о нескольких количественных методах без использования специализированного количественного оборудования, и все исследования показали, что точность количественного определения была близка к точности использования специализированного оборудования 2,9,10,11,12 (таблица 2). Например, El-Gindy et al.10 сравнили точность расчетного выхода на основе методов ВЭЖХ и TLC-денситометрии, и результаты показали, что между этими двумя методами не было существенных различий (p-значение < 0,05). По сравнению с методом сине-светодиодного освещения в этом исследовании, TLC-денситометрический метод, разработанный El-Gindy et al.10, требовал специального детектора длин волн, в то время как метод сине-светодиодной подсветки требовал простого и недорогого синего светодиодного сканера. Между тем, сине-светодиодный сканер также может быть использован для других целей, таких как сканирование гель-электрофореза, но специализированный сканер TLC, разработанный Elkady et al.11, использовался только для TLC-денситометрического метода.
В дополнение к TLC-денситометрическому методу 10,11 были разработаны планшетный сканер и метод цифровой камеры для определения выхода образцов. Например, Johnson9 установил метод быстрого обнаружения TLC с помощью планшетного сканера, а затем измерил поглощение с помощью коммерческого программного обеспечения для изображений. Тем не менее, программное обеспечение для изображений, используемое в методе сине-светодиодного освещения, было бесплатным и простым в использовании. Hess2 разработал программное обеспечение «TLC analyzer» для оценки размера полос на изображениях пластин TLC, сделанных цифровой камерой, что было похоже на метод обнаружения УФ-излучения в этом исследовании. Однако оба способа могут потенциально взаимодействовать с опасностями ультрафиолетового излучения.
Регрессионные модели, основанные на размерности диапазонов стандартов, были разработаны для биоанализа, синего светодиодного осветителя и метода УФ-детектирования, а значение R-квадрата составило 0,99, 0,98 и 0,97 соответственно (таблица 1). Поскольку была достигнута высокая линейность (R-квадрат), предполагается, что регрессионная модель может измерять выход образцов. Значение X в регрессионной модели было заменено размерностью полос стандартов, а расчетный выход (прогнозируемое значение Y в регрессионной модели) составлял примерно 5,6, 5,4 и 5,3, определяемый методами биоанализа, синего светодиода и УФ-детектирования соответственно. Результаты показали, что R-квадрат и расчетный выход с использованием синего светодиодного осветителя были ближе к методу биоанализа (установленному в качестве контрольного), чем методу, обнаруженному УФ-излучением (таблица 1).
Чтобы понять ограничения этого подхода, подход был также применен для обнаружения двух других соединений, включая ампициллин и апрамицин; результаты показаны на дополнительном рисунке 1 и дополнительном рисунке 2. При таком подходе необходимо отметить два важных шага: 1) после высыхания пластина должна быть немедленно визуализирована; отсроченная визуализация может повлиять на обнаружение пятен; (2) Передержка пластины не рекомендуется, так как отсканированное изображение с пластины поставляется с высоким фоном и затрудняет измерение областей пятен.
В заключение, метод синего светодиодного освещения является относительно безопасным, экономящим время, недорогим и менее трудоемким подходом к ускорению количественной оценки выхода образцов по сравнению с другими количественными хроматографическими методами; таким образом, этот подход является идеальным протоколом для использования в лабораториях разработки с ограниченными бюджетами. Между тем, изображения пластин TLC, полученные с помощью метода синего светодиодного освещения, были намного четче, чем изображения из метода обнаружения УФ-излучения (рисунок 3A vs. Рисунок 4А), который также помог точно определить размеры полос на пластине TLC, а также оценить выход образцов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Все авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано Министерством науки и технологий Тайваня (MOST 108-2320-B-110-007-MY3).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| American bacteriological Agar | Condalab | 1802.00 | |
| Aspergillus terreus | ATCC 20542 | ||
| Blue-LED illuminator | MICROTEK | Bio-1000F | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | HERAEUS Megafuge 8 | |
| Compact UV lamp | UVP | UVGL-25 | |
| Ethyl Acetate | MACRON | MA-H078-10 | |
| Filter Paper 125mm | ADVANTEC | 60311102 | |
| ImageJ | NIH | Freeware | https://imagej.nih.gov/ij/download.html |
| Lovastatin standard | ACROS | A0404262 | |
| MiBio Fluo | MICROTEK | V1.04 | |
| n-Hexane | C-ECHO | HH3102-000000-72EC | |
| OriginPro | OriginLab | 9.1 | https://www.originlab.com/origin |
| Potato dextrose broth H | STBIO MEDIA | 110533 | |
| Rotary evaporator | EYELA | SB-1000 | |
| Sulfuric acid | Fluka | 30743-2.5L-GL | |
| TLC silica gel 60 F254 | MERCK | 1.05554.0001 | |
| Trifluoroacetic acid | Alfa Aesar | 10229873 | |
| Ultrasonic vibration machine | DELTA | DC600 |
References
- Pyka, A. Detection progress of selected drugs in TLC. BioMed Research International. 2014, 732078 (2014).
- Hess, A. V. I. Digitally enhanced thin-layer chromatography: An inexpensive, new technique for qualitative and quantitative analysis. Journal of Chemical Education. 84 (5), 842-847 (2007).
- Ullah, Q., Mohammad, A. Vitamins determination by TLC/HPTLC-a mini-review. Journal of Planar Chromatography - Modern TLC. 33 (5), 429-437 (2020).
- Chen, Z., Tao, H., Liao, L., Zhang, Z., Wang, Z. Quick identification of xanthine oxidase inhibitor and antioxidant from Erycibe obtusifolia by a drug discovery platform composed of multiple mass spectrometric platforms and thin-layer chromatography bioautography. Journal of Separation Science. 37 (16), 2253-2259 (2014).
- Duncan, J. D. Chiral separations: A comparison of HPLC and TLC. Journal of Liquid Chromatography. 13 (14), 2737-2755 (1990).
- Sherma, J. Thin-layer chromatography in food and agricultural analysis. Journal of Chromatography A. 880 (1-2), 129-147 (2000).
- Bocheńska, P., Pyka, A., Bocheńska, P., Bocheńska, B. Determination of acetylsalicylic acid in pharmaceutical drugs by TLC with densitometric detection in UV. Journal of Liquid Chromatography. 35 (10), 1346-1363 (2012).
- Poole, C. F. Planar chromatography at the turn of the century. Journal of Chromatography A. 856 (1-2), 399-427 (1999).
- Rapid Johnson, M. E. simple quantitation in thin-layer chromatography using a flatbed scanner. Journal of Chemical Education. 77 (3), 368-372 (2000).
- El-Gindy, A., Ashour, A., Abdel-Fattah, L., Shabana, M. M. First derivative spectrophotometric, TLC-densitometric, and HPLC determination of acebutolol HCL in presence of its acid-induced degradation product. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 24 (4), 527-534 (2001).
- Elkady, E. F., Mahrouse, M. A. Reversed-phase ion-pair HPLC and TLC-densitometric methods for the simultaneous determination of ciprofloxacin hydrochloride and metronidazole in tablets. Chromatographia. 73 (3-4), 297-305 (2011).
- Musharraf, S. G., Ul Arfeen,, Shoaib, Q., M, Development and validation of TLC-densitometric method for the quantification of a steroidal drug, danazol in its pharmaceutical formulations. Journal of Planar Chromatography - Modern TLC. 25 (4), 331-337 (2012).
