Summary
Den nuværende protokol udviklede en metode til at estimere udbyttet af forbindelser på TLC-pladen ved hjælp af blå-LED-belysningsteknikken. Fordelene ved denne tilgang er, at den er sikker, effektiv, billig og giver forskeren mulighed for at måle flere prøver samtidigt.
Abstract
Tyndlagskromatografi (TLC) er en tilgængelig analytisk teknik, der i vid udstrækning er blevet brugt i organisk kemiforskning til at kvantificere udbyttet af ukendte prøver. Denne undersøgelse udviklede en effektiv, billig og sikker metode til at estimere udbyttet af prøver på en TLC-plade ved hjælp af den blå LED-belysning. Lovastatin ekstraheret fra Aspergillus terreus var det eksempel forbindelse, der blev anvendt i denne undersøgelse. Regressionsmodeller baseret på lovastatinstandarden blev brugt til at evaluere udbyttet af lovastatin. Tre metoder blev sammenlignet: bioassay, UV-detektion og blå LED-belysning. Resultatet viste, at blå-LED-belysningsmetoden er betydeligt mere tidseffektiv end UV-detektions- og bioassaymetoder. Derudover var den blå LED-belysning en relativt sikker mulighed på grund af bekymringen for biologiske farer i bioassaymetoden (f.eks. Mikrobiel infektion) og ultraviolet eksponering i UV-detektionsmetoden. Sammenlignet med de dyre metoder, der kræver specialiserede instrumenter og langsigtet træning, før de arbejder uafhængigt, såsom GC, HPLC og HPTLC, var brug af den blå LED-belysning en økonomisk mulighed for at estimere udbyttet af prøver fra en TLC-plade.
Introduction
Tyndlagskromatografi (TLC) anvendes i vid udstrækning som en kvalitativ og kvantitativ teknik inden for organisk kemi 1,2,3. De vigtigste fordele ved TLC er, at det giver hurtig detektion, fleksible prøvekrav og ikke kræver specialudstyr4. Til dato, selvom mange avancerede tilgange er blevet etableret, er TLC stadig den vigtigste metode til at identificere ukendte prøver i en blanding. Udfordringen ved denne tilgang er imidlertid manglen på sikkert og billigt udstyr til kvantificering af prøveudbyttet, især til udvikling af laboratorier med begrænsede budgetter. Denne undersøgelse havde derfor til formål at udvikle en effektiv, sikker og billig metode kombineret med TLC til at estimere udbyttet af prøverne.
I modsætning til højtydende TLC (HPTLC), højtydende væskekromatografi (HPLC) og gaskromatografi (GC) med strenge prøvekrav, tidskrævende og involvering af multistep til prøveforberedelse1,5, viste TLC flere fordele. For det første kan HPLC og GC til prøveforberedelse ikke detektere råekstraktet, fordi råekstraktet kan tilslutte kolonnen af HPLC og GC. For det andet, når prøverne ikke er UV-egnede (vigtige for HPLC-analyse) eller med lav volatilitet (vigtigt for GC-analyse), kan TLC anvendes på disse prøver, og brugen af visualiseringsreagens gør de isolerede prøver synlige på tynde lag 6,7,8. For det tredje kræver HPLC og GC generelt en relativt lang tid før træning, før de arbejder uafhængigt af hinanden sammenlignet med TLC. Derudover kan kvantitativ TLC-analyse, kendt som højtydende TLC (HPTLC), digitalisere oplysningerne på en TLC-plade med en meget følsom scanner. Omkostningerne ved HPTLC-systemet er dog relativt dyre. Som sådan er udvikling af en omkostningseffektiv og hurtig tilgang til kvantificering af prøver på TLC-pladen et vigtigt emne.
Lignende metoder er blevet udviklet til kvantificering af TLC-udbytte; for eksempel rapporterede Johnson9 en teknik, der tillader kvantificering af prøverne på en TLC-plade ved hjælp af en flatbedscanner fastgjort til en computer. I 2001 udviklede El-Gindy et al.10 den TLC-densitometriske metode, som blev brugt til at detektere forbindelsen med optisk tæthed, og teknikken blev også anvendt af Elkady et al.11. I 2007 præsenterede Hess2 den digitalt forbedrede TLC (DE-TLC) metode, der anvendes til at detektere udbyttet af en forbindelse på en TLC-plade ved hjælp af et digitalt kamera kombineret med UV-lys. Hess sammenlignede også omkostningsforskellene mellem HPTLC- og DE-TLC-metoden og konkluderede, at DE-TLC-metoden kunne bruges i gymnasie- og college-laboratorier på grund af dens overkommelige omkostninger2. Omkostningerne ved den TLC-densitometriske metode var dog stadig dyre, og driften af ultraviolet lys kræver tilstrækkelig fortræning, hvis brugerne kan blive udsat for ultraviolet stråling. Derfor er det ønskeligt at udvikle en effektiv, sikker og billig metode til kvantificering af prøveudbyttet.
Denne undersøgelse beskrev en protokol til påvisning af prøven på en TLC-plade ved hjælp af den blå LED-belysning og udviklede en regressionsmodel med høj pålidelighed (høj R-kvadratværdi) til at måle båndenes dimensioner og derefter bestemme det sammensatte udbytte. Endelig blev det konstateret, at den blå LED-belysningsmetode er en relativt sikker (vs. UV-detektionsmetode), billig (vs. GC, HPLC og HPTLC) og effektiv (vs. bioassay-metode) tilgang til kvantificering af udbytte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Den nuværende protokol er beskrevet ved hjælp af lovastatin som et eksempel. Lovastatin blev ekstraheret fra en uge gammel Aspergillus terreus.
1. Sammensat ekstraktion
BEMÆRK: For detaljer om sammensat ekstraktion, se figur 1.
- Kultur Aspergillus terreus på kartoffel dextrose agar (PDA, se materialetabel) medium ved 30 °C.
- Tør kulturen ved 40 °C i 24 timer. Overfør den tørrede kultur til et 50 ml rør ved hjælp af steriliseret pincet og tilsæt 15 ml ethylacetat.
- Blandingen rystes kraftigt ved hvirveldannelse i 1 minut og inkuberes i 1 time ved 40 °C med omrystning ved 200 omdr./min.
- Soniker blandingen ved hjælp af et 40 kHz ultralydsbad (se Materialetabel) ved 40 °C i 1 time.
- Blandingen centrifugeres ved 5.000 x g i 1 minut ved stuetemperatur, og der filtreres gennem et 11 μm filterpapir.
- Filtratet ekstraheres med et tilsvarende volumen sterilt vand i en separationstragt.
- Efter faseadskillelse opsamles det organiske lag og fordampes derefter i en roterende fordamper (se Materialetabel). Remanensen opløses i 2 ml ethylacetat.
2. Adskillelse af råekstraktet ved normalfaseadsorptionskolonne (NP)
- Kolonnen pakkes med NP-silicagel som den stationære fase, og brug n-hexan: ethylacetat: trifluoreddikesyre (H: E: T; 80: 20: 0.1, v / v / v) som mobilfase.
- Ekstraktet (trin 1) hældes på kolonnen, og opløsningsmidlet i mobilfasen tilsættes med en strømningshastighed på 1 ml/min for at fortynde ekstraktet.
BEMÆRK: Strømningshastigheden blev manuelt styret ved hjælp af en stophane. - Spildevandet kontrolleres af TLC for at bekræfte tilstedeværelsen af lovastatin, og fordamp derefter i en roterende fordamper ved 45 °C, indtil opløsningsmidlet fjernes. Dette trin tager cirka 20-25 minutter.
- Remanensen opløses i 1 ml ethylacetat, og blandes derefter med et tilsvarende volumen på 1% trifluoreddikesyre.
- Blandingen centrifugeres ved 5.000 x g i 1 minut ved stuetemperatur, og det organiske lag opsamles i et nyt glasrør.
3. Fremstilling og ilægning af tyndtlagskromatogramplader (TLC)
- Spot 5 μL prøver og lovastatinstandarder (se Materialetabel) på TLC-pladens basislinje ved hjælp af en kapillærpipette, hvilket efterlader en kant på 1 cm på siderne af TLC-pladen.
- Tør TLC-pladen i en stinkskab i 5 minutter ved stuetemperatur.
- Anbring pladen forsigtigt med tang i et mættet glaskammer indeholdende det mobile faseopløsningsmiddel. Dæk kammeret med et glaslåg og lad pladen udvikle sig fuldt ud.
- Fjern pladen fra kammeret, når opløsningsmiddellinjen når 1 cm fra toppen af pladen.
4. Analyse af den blå LED-belysning
- Marker opløsningsmiddellinjen med en blyant. Tør pladen i stinkskabet i 10 minutter ved stuetemperatur.
- Efter tørring lægges pladen straks i blød i 10% H2SO4 opløsningsmiddel, og tør derefter i røghætten i 10 minutter ved stuetemperatur.
- Placer pladen på varmepanelet, indtil de brune pletter vises. Sørg for, at pladen ikke overophedes, da dette kan gøre visualisering af lovastatin vanskelig.
- Overfør pladen til den blå LED-belysning, og scan ved hjælp af et kompatibelt freeware (MiBio Fluo) (se Materialetabel).
5. Afkastestimering ved regressionsmodellen
- Mål dimensionen af bånd ved hjælp af ImageJ-softwaren (se Materialetabel).
- Etablere en regressionsmodel ved hjælp af dataanalyse og grafsoftware (se Materialetabel) baseret på de faldende koncentrationer af lovastatinstandarder, herunder 1 mg / ml, 0,75 mg / ml, 0,5 mg / ml og 0,25 mg / ml.
- Anvend regressionsmodellen for at estimere udbyttet af prøverne.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne undersøgelse præsenterede blå-LED-belysningsmetoden til at estimere udbyttet af forbindelser, og denne metode blev valideret og sammenlignet med bioassay- og UV-detekterede metoder (tabel 1). Regressionsmodellerne blev udviklet baseret på dimensionerne af bånd og koncentration af standarder for henholdsvis tre metoder til at forudsige udbyttet af prøver. For det første var R-kvadratet mellem dimensionerne af inhiberingszonen og lovastatinstandarderne i resultaterne af bioassaymetoden 0, 99, og prøveudbyttet var 0, 56 mg forudsagt af regressionsmodellen (figur 2). For det andet var R-kvadratet mellem lovastatinstandarderne og dimensionen af bånd på TLC-pladen i UV-detektionsmetoden 0,97, og udbyttet af prøven forudsagt af regressionsmodellen var 0,53 mg (figur 3). Især var båndets kanter slørede, og der blev observeret relativt lave signalintensitetsbånd (figur 3A). For det tredje var R-kvadratet mellem lovastatinstandarder og båndenes dimension på TLC-pladen i blå-LED-belysningsmetoden 0,98, og prøveudbyttet var 0,54 mg forudsagt af regressionsmodellen (figur 4). Det forventede udbytte ved hjælp af den blå LED-belysning var tættere på bioassaymetoden (indstillet som kontrol). Bandets dimension var proportional med mængden af lovastatin, og de klare bånd blev opnået ved hjælp af blå-LED-belysningsmetoden. Derudover var arbejdstiden for bioassay-, UV-detektions- og blå-LED-belysningsmetoderne henholdsvis ca. 24 timer, 2 timer og 1 time; (Bemærk: arbejdstid betyder den samlede tid brugt på udbytteundersøgelsen af lovastatin).
Figur 1: Protokollens arbejdsgang. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Bioassay-metode. (A) Bioassay af lovastatin mod Neurospora crassa (inkuberet i 24 timer ved 30 °C). I slutningen af forsøget blev 90 mm agarpladerne fotograferet under synligt lys. (B) Koncentrationerne af seks lovastatinstandarder var: nr. 1 (1 mg/ml), nr. 2 (0,75 mg/ml), nr. 3 (0,5 mg/ml) og nr. 4 (0,25 mg/ml). Prøve nr. 5 blev fortyndet til 0,25× (1:4). Prøve nr. 6 blev fortyndet til 0,5× (1:2). Hæmningszonedimensionen (mm2) blev målt af billeddannelsessoftwaren. (C) Der blev udviklet en regressionsmodel ved hjælp af dataanalyse og grafsoftware baseret på standardernes hæmningszonedimension. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Tyndtlagskromatogram (TLC) plade udsat for UV-lys. (A) N-hexan: ethylacetat (2: 3 v / v) blev brugt som den mobile fase i TLC-analysen, og TLC-pladen blev udsat for UV-lys (365 nm) efter blødning i udvikleren (10% H2SO4). (B) Koncentrationerne af seks lovastatinstandarder var: nr. 1 (1 mg/ml), nr. 2 (0,75 mg/ml), nr. 3 (0,5 mg/ml) og nr. 4 (0,25 mg/ml). Prøve nr. 5 blev fortyndet til 0,25× (1:4). Prøve nr. 6 blev fortyndet til 0,5× (1:2). Hæmningszonedimensionen (mm2) blev målt af billeddannelsessoftwaren. (C) En regressionsmodel blev udviklet ved hjælp af dataanalyse og grafsoftware baseret på dimensionen af lovastatinstandardbåndene på TLC-pladen. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Tyndlagskromatogram (TLC) plade scannet af blå-LED-belysningen. (A) N-hexan: ethylacetat (2: 3 v / v) blev brugt som den mobile fase i TLC-analysen, og TLC-pladen blev scannet af den blå LED-belysning. (B) Koncentrationerne af seks lovastatinstandarder var: nr. 1 (1 mg/ml), nr. 2 (0,75 mg/ml), nr. 3 (0,5 mg/ml) og nr. 4 (0,25 mg/ml). Prøve nr. 5 blev fortyndet til 0,25× (1:4). Prøve nr. 6 blev fortyndet til 0,5× (1:2). Hæmningszonedimensionen (mm2) blev målt af billeddannelsessoftwaren. (C) En regressionsmodel blev udviklet ved hjælp af dataanalyse og grafsoftware baseret på dimensionen af lovastatinstandardbåndene på TLC-pladen. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Bioassay | Blå LED-belysning | UV-detekteret | |
| Observation af resultater | Øjne | Blå LED-belysning og øjne | UV-lys og øjne |
| Billedopløsning | Medium | Høj | Lav (sløret og svagt billede) |
| Omtrentlige tidsomkostninger | 24 timer | 1 time | 2 timer |
| Analysefærdigheder kræves | Medium | Lav | Medium |
| Sikkerhed | Mikrobiel infektion | Meget sikkert | UV-lys eksponering |
| Regressionsligning | y = 0,0019x + 0,0304 | y = 0,0399x - 0,1271 | y = 0,0657x - 0,6405 |
| R-firkant | 0.99 | 0.98 | 0.97 |
| Skråning | 0.0019 | 0.0399 | 0.0657 |
| Opfange | 0.0304 | -0.1271 | -0.6405 |
| Standard fejl i hældning | 8.94E-05 | 3.54E-03 | 6.28E-03 |
| Standard fejl ved aflytning | 0.03032 | 0.07115 | 0.12375 |
Tabel 1: Sammenligning af de tre detektionsmetoder, der er anvendt i denne undersøgelse.
| TLC-densitometrisk metode | TLC-billedanalyse | |||||||
| El-Gindy et al.10 |
Elkady et al.11 |
Musharraf et al.12 |
Sehele annoncen 9. okt 1.000 | Hess2 | Blue-LED Illuminator metode (Denne undersøgelse) |
|||
| Prøve | Acebutolol HCL | Ciprofloxacin HCL | Metronidazol | Danazol | Kolesterol | Vanillin | Nicotinamid | Lovastatin |
| Resultater | UV detektor |
TLC scanner |
TLC scanner |
Flatbed scanner | Digitalkamera med UV-lampe |
Blå LED-belysning | ||
| Bølgelængde | 230 nm | 280 nm | 280 nm | 291 Nm | NA | 254 sømil | NA | |
| Korrelationskoefficienten | 0,996a | 0,9991a | 0,9994a | 0,996a | 0,998a | 0,971b | 0,987b | 0,99a 0,98b |
| Regressionsligning | NA | y = 5,7853x +19.9383 |
y = 1,1104x + 6.9755 |
y = 7.949x + 2460 | y = 0,96x | NA | NA | y = 0,0399x -0.1271 |
| a: Pearson korrelationskoefficient | ||||||||
| b: R-firkant | ||||||||
Tabel 2: Sammenligning af tidligere metoder og den aktuelle undersøgelse.
Supplerende figur 1: Tyndlagskromatogrampladen (TLC) med ampicillin blev scannet ved hjælp af blå-LED-belysningsmetoden. (A) Ethylacetat: methanol (9:13 v / v) blev brugt som den mobile fase i TLC-analysen, og TLC-pladen blev scannet af den blå LED-belysning. (B) Koncentrationen af fire ampicillinnormer var: nr. 1 (100 mg/ml), nr. 2 (75 mg/ml), nr. 3 (50 mg/ml) og nr. 4 (25 mg/ml). Båndenes dimension blev målt af billedbehandlingssoftwaren. (C) En regressionsmodel blev udviklet ved hjælp af dataanalyse og grafsoftware baseret på dimensionen af ampicillinstandardbåndene på TLC-pladen. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur 2: Tyndlagskromatogram (TLC) plade med apramycin scannet ved hjælp af blå-LED-belysningsmetoden. (A) Methanol: vand (6: 5 v / v) blev brugt som den mobile fase i TLC-analysen, og TLC-pladen blev scannet af den blå LED-belysning. (B) Koncentrationen af fire apramycinstandarder var: nr. 1 (50 mg/ml), nr. 2 (40 mg/ml), nr. 3 (30 mg/ml) og nr. 4 (20 mg/ml). Båndenes dimension blev målt af billedbehandlingssoftwaren. (C) En regressionsmodel blev udviklet ved hjælp af dataanalyse og grafsoftware baseret på dimensionen af apramycinstandardbåndene på TLC-pladen. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne undersøgelse beskrev en ny tilgang, den blå LED-belysning, til at kvantificere forbindelser uden at bruge dyrt og specialiseret udstyr, såsom HPTLC, HPLC og GC-metoden, og metoden blev sammenlignet med bioassay- og UV-detekterede metoder til evaluering af kvantificeringsydelse. Som et resultat blev det konkluderet, at blå-LED-belysningsmetoden er en relativt sikker og effektiv protokol, der anvendes til at kvantificere udbyttet af målrettede forbindelser på TLC-pladen.
Tidligere undersøgelser har rapporteret flere kvantitative metoder uden brug af specialiseret kvantitativt udstyr, og alle undersøgelser viste, at nøjagtigheden af kvantificeringen var tæt på nøjagtigheden af brugen af specialudstyr 2,9,10,11,12 (tabel 2). For eksempel sammenlignede El-Gindy et al.10 nøjagtigheden af det estimerede udbytte baseret på HPLC- og TLC-densitometriske metoder, og resultaterne viste, at der ikke var nogen signifikante forskelle mellem de to metoder (p-værdi < 0,05). Sammenlignet med den blå LED-belysningsmetode i denne undersøgelse krævede TLC-densitometrisk metode udviklet af El-Gindy et al.10 en speciel bølgelængdedetektor, mens den blå LED-belysningsmetode krævede en enkel og billig blå-LED-scanner. I mellemtiden kunne den blå LED-scanner også bruges til andre formål, såsom gelelektroforesescanning, men den specialiserede TLC-scanner udviklet af Elkady et al.11 blev kun brugt til den TLC-densitometriske metode.
Ud over den TLC-densitometriske metode10,11 blev flatbedscanneren og digitalkamerametoden udviklet til at detektere udbyttet af prøver. For eksempel etablerede Johnson9 en hurtig TLC-detektionsmetode ved hjælp af flatbedscanneren og målte derefter absorptionen ved hjælp af kommerciel billedsoftware. Imidlertid var billedsoftwaren, der blev brugt i den blå LED-belysningsmetode, gratis og nem at bruge. Hess2 udviklede softwaren "TLC analyzer" til at estimere dimensionen af bånd på TLC-pladebilleder taget af et digitalt kamera, hvilket lignede den UV-detekterede metode i denne undersøgelse. Begge metoder kan dog potentielt interagere med UV-lysfarer.
Regressionsmodellerne baseret på dimensionen af standardbånd blev udviklet til bioassay, blå-LED-belysning og UV-detekteret metode, og R-kvadratværdien var henholdsvis 0,99, 0,98 og 0,97 (tabel 1). Da der blev opnået høj linearitet (R-kvadrat), foreslås det, at regressionsmodellen kunne måle udbyttet af prøver. X-værdien i regressionsmodellen blev erstattet af dimensionen af standardernes bånd, og det estimerede udbytte (forudsagt Y-værdi i regressionsmodellen) var ca. 5,6, 5,4 og 5,3, bestemt ved henholdsvis bioassay-, blå-LED- og UV-detektionsmetoder. Resultaterne viste, at R-kvadratet og det estimerede udbytte ved hjælp af den blå LED-belysning var tættere på bioassaymetoden (indstillet som kontrol) end den UV-detekterede metode (tabel 1).
For at forstå begrænsningerne ved denne tilgang blev tilgangen også anvendt til at detektere to andre forbindelser, herunder ampicillin og apramycin; resultaterne fremgår af supplerende figur 1 og supplerende figur 2. To vigtige trin skal bemærkes i denne tilgang: (1) efter tørring skal pladen straks visualiseres; forsinket visualisering kan påvirke spotdetektionen; (2) Overeksponering af pladen anbefales ikke, da det scannede billede fra pladen har høj baggrund og gør det vanskeligt at måle pletternes områder.
Afslutningsvis er blå-LED-belysningsmetoden en relativt sikker, tidsbesparende, billig og mindre besværlig tilgang til at fremskynde kvantificeringen af udbyttet af prøver sammenlignet med andre kvantitative kromatografiske metoder; Derfor er denne tilgang en ideel protokol til brug i udvikling af laboratorier med begrænsede budgetter. I mellemtiden var TLC-pladebillederne hentet fra den blå LED-belysningsmetode meget klarere end dem fra UV-detektionsmetoden (figur 3A vs. Figur 4A), som også bidrog til præcist at bestemme dimensionen af båndene på TLC-pladen og også til at estimere udbyttet af prøverne.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alle forfatterne erklærer, at de ikke har nogen interessekonflikter.
Acknowledgments
Denne undersøgelse blev støttet af Ministeriet for Videnskab og Teknologi, Taiwan (MOST 108-2320-B-110-007-MY3).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| American bacteriological Agar | Condalab | 1802.00 | |
| Aspergillus terreus | ATCC 20542 | ||
| Blue-LED illuminator | MICROTEK | Bio-1000F | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | HERAEUS Megafuge 8 | |
| Compact UV lamp | UVP | UVGL-25 | |
| Ethyl Acetate | MACRON | MA-H078-10 | |
| Filter Paper 125mm | ADVANTEC | 60311102 | |
| ImageJ | NIH | Freeware | https://imagej.nih.gov/ij/download.html |
| Lovastatin standard | ACROS | A0404262 | |
| MiBio Fluo | MICROTEK | V1.04 | |
| n-Hexane | C-ECHO | HH3102-000000-72EC | |
| OriginPro | OriginLab | 9.1 | https://www.originlab.com/origin |
| Potato dextrose broth H | STBIO MEDIA | 110533 | |
| Rotary evaporator | EYELA | SB-1000 | |
| Sulfuric acid | Fluka | 30743-2.5L-GL | |
| TLC silica gel 60 F254 | MERCK | 1.05554.0001 | |
| Trifluoroacetic acid | Alfa Aesar | 10229873 | |
| Ultrasonic vibration machine | DELTA | DC600 |
References
- Pyka, A. Detection progress of selected drugs in TLC. BioMed Research International. 2014, 732078 (2014).
- Hess, A. V. I. Digitally enhanced thin-layer chromatography: An inexpensive, new technique for qualitative and quantitative analysis. Journal of Chemical Education. 84 (5), 842-847 (2007).
- Ullah, Q., Mohammad, A. Vitamins determination by TLC/HPTLC-a mini-review. Journal of Planar Chromatography - Modern TLC. 33 (5), 429-437 (2020).
- Chen, Z., Tao, H., Liao, L., Zhang, Z., Wang, Z. Quick identification of xanthine oxidase inhibitor and antioxidant from Erycibe obtusifolia by a drug discovery platform composed of multiple mass spectrometric platforms and thin-layer chromatography bioautography. Journal of Separation Science. 37 (16), 2253-2259 (2014).
- Duncan, J. D. Chiral separations: A comparison of HPLC and TLC. Journal of Liquid Chromatography. 13 (14), 2737-2755 (1990).
- Sherma, J. Thin-layer chromatography in food and agricultural analysis. Journal of Chromatography A. 880 (1-2), 129-147 (2000).
- Bocheńska, P., Pyka, A., Bocheńska, P., Bocheńska, B. Determination of acetylsalicylic acid in pharmaceutical drugs by TLC with densitometric detection in UV. Journal of Liquid Chromatography. 35 (10), 1346-1363 (2012).
- Poole, C. F. Planar chromatography at the turn of the century. Journal of Chromatography A. 856 (1-2), 399-427 (1999).
- Rapid Johnson, M. E. simple quantitation in thin-layer chromatography using a flatbed scanner. Journal of Chemical Education. 77 (3), 368-372 (2000).
- El-Gindy, A., Ashour, A., Abdel-Fattah, L., Shabana, M. M. First derivative spectrophotometric, TLC-densitometric, and HPLC determination of acebutolol HCL in presence of its acid-induced degradation product. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 24 (4), 527-534 (2001).
- Elkady, E. F., Mahrouse, M. A. Reversed-phase ion-pair HPLC and TLC-densitometric methods for the simultaneous determination of ciprofloxacin hydrochloride and metronidazole in tablets. Chromatographia. 73 (3-4), 297-305 (2011).
- Musharraf, S. G., Ul Arfeen,, Shoaib, Q., M, Development and validation of TLC-densitometric method for the quantification of a steroidal drug, danazol in its pharmaceutical formulations. Journal of Planar Chromatography - Modern TLC. 25 (4), 331-337 (2012).
