Synthèse de protéines acellulaires à partir d’extraits cellulaires déficients en exonucléase utilisant des modèles d’ADN linéaires
Summary
Un protocole pour la préparation et l’étalonnage tampon d’extraits cellulaires de souches knockout d’exonucléase V d’Escherichia coli BL21 Rosetta2 (ΔrecBCD et ΔrecB) est présenté ici. Il s’agit d’une approche rapide, facile et directe pour l’expression dans les systèmes de synthèse de protéines acellulaires utilisant des modèles d’ADN linéaires.
Abstract
La synthèse protéique acellulaire (CFPS) est récemment devenue très populaire dans le domaine de la biologie synthétique en raison de ses nombreux avantages. L’utilisation de modèles d’ADN linéaires pour CFPS permettra à la technologie d’atteindre son plein potentiel, réduisant ainsi le temps expérimental en éliminant les étapes de clonage, de transformation et d’extraction plasmidique. L’ADN linéaire peut être amplifié rapidement et facilement par PCR pour obtenir des concentrations élevées du modèle, évitant ainsi une toxicité potentielle d’expression in vivo . Cependant, les matrices d’ADN linéaires sont rapidement dégradées par les exonucléases naturellement présentes dans les extraits cellulaires. Plusieurs stratégies ont été proposées pour s’attaquer à ce problème, telles que l’ajout d’inhibiteurs de nucléases ou la modification chimique des extrémités linéaires de l’ADN pour la protection. Toutes ces stratégies coûtent du temps et des ressources supplémentaires et n’ont pas encore atteint des niveaux d’expression protéique proches du plasmide. Un protocole détaillé pour une stratégie alternative est présenté ici pour l’utilisation de modèles d’ADN linéaire pour CFPS. En utilisant des extraits cellulaires de cellules knock-out déficientes en exonucléase, les modèles d’ADN linéaires restent intacts sans nécessiter de modifications finales. Nous présentons les étapes de préparation du lysat cellulaire à partir de la souche Escherichia coli BL21 Rosetta2 ΔrecBCD par lyse de sonication et étalonnage tampon pour Mg-glutamate (Mg-glu) et K-glutamate (K-glu) spécifiquement pour l’ADN linéaire. Cette méthode est capable d’atteindre des niveaux d’expression protéique comparables à ceux de l’ADN plasmidique dans E. coli CFPS.
Introduction
Les systèmes de synthèse de protéines acellulaires (CFPS) sont de plus en plus utilisés comme méthode rapide, simple et efficace pour l’ingénierie des biocapteurs, la fabrication décentralisée et le prototypage de circuits génétiques1. En raison de leur grand potentiel, les systèmes CFPS sont régulièrement utilisés dans le domaine de la biologie synthétique. Cependant, jusqu’à présent, les systèmes CFPS reposent sur des plasmides circulaires qui peuvent empêcher la technologie d’atteindre son plein potentiel. La préparation de l’ADN plasmidique dépend de nombreuses étapes chronophages lors du clonage et de grandes quantités d’isolement de l’ADN. D’autre part, l’amplification PCR à partir d’un plasmide, ou d’un modèle d’ADN synthétisé, peut être utilisée pour préparer simplement des modèles CFPS en quelques heures 2,3. Par conséquent, l’application de l’ADN linéaire offre une solution prometteuse pour CFPS. Cependant, l’ADN linéaire est rapidement dégradé par les exonucléases naturellement présentes dans les extraits cellulaires4. Il existe des solutions qui répondent à ce problème, telles que l’utilisation de la protéine λ-phage GamS5 ou de l’ADN contenant des sites Chi6 comme agents protecteurs, ou la protection directe de l’ADN linéaire par modification chimique de ses extrémités 2,7,8,9. Toutes ces méthodes nécessitent des suppléments à l’extrait cellulaire, qui sont coûteux et prennent beaucoup de temps. On sait depuis longtemps que le complexe exonucléase V (RecBCD) dégrade l’ADN linéaire dans les lysats cellulaires4. Récemment, nous avons montré que l’ADN linéaire peut être beaucoup mieux protégé dans les lysats contre les cellules assommées pour les gènes exonucléases (recBCD)10.
Dans ce protocole, les étapes de préparation des lysats acellulaires à partir de la souche E. coli BL21 Rosetta2 ΔrecBCD par lyse par sonication sont décrites en détail. La lyse par sonication est une technique courante et abordable employée par plusieurs laboratoires11,12. Les extraits produits à partir de cette souche n’ont pas besoin de l’ajout d’un composant supplémentaire ou d’une modification du modèle d’ADN pour soutenir l’expression à partir de modèles d’ADN linéaires. La méthode repose sur l’étape essentielle de l’optimisation de la mémoire tampon pour les extraits cellulaires spécifiquement pour l’expression linéaire de l’ADN à partir de promoteurs natifs d’E. coli. Il a été démontré que cette optimisation tampon spécifique pour l’expression linéaire de l’ADN est la clé pour que les promoteurs natifs σ70 produisent des protéines élevées sans protéine GamS ou supplémentation en ADN Chi, évitant même la purification des produits de PCR10. La concentration optimale de Mg-glu pour l’expression linéaire de l’ADN s’est avérée similaire à celle de l’ADN plasmidique. Cependant, la concentration optimale de K-glu a montré une différence substantielle entre l’ADN linéaire et plasmidique, probablement due à un mécanisme lié à la transcription10. La fonctionnalité des protéines exprimées à l’aide de cette méthode a été démontrée pour plusieurs applications, telles que le criblage rapide des commutateurs de maintien et l’évaluation de l’activité des variantes enzymatiques10.
Ce protocole fournit une solution simple, efficace et rentable pour l’utilisation de modèles d’ADN linéaire dans les systèmes sans cellules E. coli en utilisant simplement des extraits de cellules ΔrecBCD mutantes et un étalonnage spécifique pour l’ADN linéaire comme modèle.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ici, nous montrons que le lysat cellulaire préparé à partir d’E. coli BL21 Rosetta2 avec un knockout génomique pour l’opéron recB ou recBCD soutient une expression protéique élevée à partir de modèles d’ADN linéaires. Ce protocole élabore une procédure d’étalonnage du lysat étape par étape spécifique pour les modèles d’ADN linéaire (Figure 2), qui est une étape critique qui conduit à l’expression élevée des promoteurs σ70 dans l?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ACB et JLF reconnaissent le soutien financier de la subvention ANR SINAPUV (ANR-17-CE07-0046). JLF et JB saluent le soutien financier de la subvention ANR SynBioDiag (ANR-18-CE33-0015). MSA et JLF reconnaissent le soutien financier de la subvention ANR iCFree (ANR-20-BiopNSE). JB remercie le CER du soutien apporté au lancement de « COMPUCELL » (numéro de subvention 657579). Le Centre de Biochimie Structurale salue le soutien de l’Infrastructure Français de Biologie Structurale Intégrée (FRISBI) (ANR-10-INSB-05-01). MK remercie le soutien financier du département MICA de l’INRAe, de l’Université Paris-Saclay, du DIM-RFSI de la région Ile-de-France (IdF) et de l’ANR DREAMY (ANR-21-CE48-003). Ces travaux ont été financés par le biais du Consolidator Award (865973 au CLB) du Conseil européen de la recherche.
Materials
| 2-YT Broth | Invitrogen | 22712020 | |
| 1.5 mL Safe-Lock tubes | Eppendorf | 30120086 | 1.5 mL microtube |
| 384-well square-bottom microplate | Thermo Scientific Nunc | 142761 | |
| 3PGA (D-(-)-3-Phosphoglyceric acid disodium) | Sigma-Aldrich | P8877 | |
| adhesive plate seal | Thermo Scientific Nunc | 232701 | |
| Agar | Invitrogen | 30391023 | |
| ATP (Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate) | Sigma-Aldrich | A8937 | |
| BL21 Rosetta2 | Merck Millipore | 71402 | |
| BL21 Rosetta2 ΔrecB | Addgene | 176582 | |
| BL21 Rosetta2 ΔrecBCD | Addgene | 176583 | |
| cAMP (Adenosine 3' 5'-cyclic monophosphate) | Sigma-Aldrich | A9501 | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | |
| CoA (Coenzyme A hydrate) | Sigma-Aldrich | C4282 | |
| Corning 15 mL PP Centrifuge Tubes, Rack Packed with CentriStar Cap, Sterile | Corning | 430790 | 15 mL tube |
| Corning 50 mL PP Centrifuge Tubes, Conical Bottom with CentriStar Cap, Sterile | Corning | 430828 | 50 mL tube |
| CTP (Cytidine 5'-triphosphate, disodium salt hydrate) | Alfa Aesar | J62238 | |
| DpnI | NEB | R0176S | |
| DTT (DL-Dithiothreitol) | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| Folinic acid (solid folinic acid calcium salt) | Sigma-Aldrich | F7878 | |
| GTP (Guanosine 5ʹ-Triphosphate, Disodium Salt) | Sigma-Aldrich | 371701 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| K phosphate dibasic (K2HPO4) | Carl Roth | 231-834-5 | |
| K phosphate monobasic (H2KO4P) | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| K-glutamate | Alfa Aesar | A17232 | |
| Mg-glutamate | Sigma-Aldrich | 49605 | |
| Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm, polyethersulfone | Merck Millipore | SLGP033RB | membrane filter 0.22 µm |
| Monarch PCR & DNA Cleanup Kit | NEB | T1030S | PCR & DNA cleanup Kit |
| Monarch Plasmid Miniprep Kit | NEB | T1010S | Plasmid Miniprep Kit |
| NAD (B-nicotinamide adenine dinucleotide hydrate) | Sigma-Aldrich | N6522 | |
| NIST-traceable FITC standard | Invitrogen | F36915 | NIST-FITC |
| NucleoBond Xtra Maxi kit | Macherey-Nagel | 740414.1 | Plasmid Maxiprep Kit |
| PEG 8000 | Sigma-Aldrich | 89510 | |
| plate reader | Biotek | Synergy HTX | |
| Purified Recombinant EGFP Protein | Chromotek | egfp-250 | recombinant eGFP |
| Q5 High-Fidelity 2X Master Mix | NEB | M0492S | DNA polymerase |
| Q5 High-Fidelity 2X Master Mix | New England Biolabs | M0492L | DNA polymerase |
| Qubit dsDNA BR Assay Kit | Thermo | Q32850 | fluorometric assay with DNA-binding dye |
| RTS Amino Acid Sampler | biotechrabbit | BR1401801 | |
| Spermidine | Sigma-Aldrich | 85558 | |
| Sterile water | Purified water from the Millipore RiOs 8 system, sterilized by autoclaving. | ||
| Tris base | Life Science products Cytiva | 17-1321-01 | |
| tRNA | Roche | 10109550001 | |
| Ultrasonic processor Vibra cell VC-505 | SONICS | VC505 | sonicator |
| UTP Na3 (Uridine 5'- triphosphate, trisodium salt hydrate) | Acros Organics | 226310010 | |
| Water, nuclease-free | Thermo | R0581 | nuclease-free water |
References
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