Summary
ここに提示するのは、エシェリヒア・コリBL21 Rosetta2のエキソヌクレアーゼVノックアウト株からの細胞抽出物(ΔrecBCDおよびΔrecB)の調製およびバッファー較正のためのプロトコルである。これは、線形DNAテンプレートを使用した無細胞タンパク質合成システムで発現するための迅速、簡単、かつ直接的なアプローチです。
Abstract
無細胞タンパク質合成(CFPS)は、その多くの利点のために、合成生物学の分野で最近非常に人気が高まっています。CFPSにリニアDNAテンプレートを使用すると、クローニング、形質転換、プラスミド抽出のステップを排除することで実験時間を短縮し、技術の可能性を最大限に引き出すことができます。直鎖状DNAはPCRによって迅速かつ容易に増幅して高濃度の鋳型を得ることができ、 潜在的なin vivo 発現毒性を回避します。しかしながら、線状DNAテンプレートは、細胞抽出物中に天然に存在するエキソヌクレアーゼによって急速に分解される。この問題に取り組むために、ヌクレアーゼ阻害剤の追加や、保護のための直鎖状DNA末端の化学修飾など、いくつかの戦略が提案されています。これらの戦略はすべて、余分な時間とリソースを要し、プラスミドに近いレベルのタンパク質発現をまだ取得していません。CFPSに線状DNAテンプレートを使用するための代替戦略の詳細なプロトコルをここに示します。エキソヌクレアーゼ欠損ノックアウト細胞からの細胞抽出物を使用することにより、線状DNAテンプレートは末端修飾を必要とせずにそのまま残ります。我々は、特に直鎖DNAのためのMg-グルタミン酸(Mg-glu)およびK-グルタミン酸(K-glu)のための超音波処理溶解および緩衝液較正による大腸 菌BL21 Rosetta2 ΔrecBCD 株からの細胞ライセートの調製ステップを提示する。この方法は、 大腸菌 CFPSのプラスミドDNAから得られるタンパク質発現レベルに匹敵するタンパク質発現レベルを達成することができる。
Introduction
無細胞タンパク質合成(CFPS)システムは、バイオセンサーエンジニアリング、分散型製造、および遺伝子回路のプロトタイピングのための高速、簡単、効率的な方法としてますます使用されています1。その大きな可能性から、CFPSシステムは合成生物学の分野で定期的に使用されています。しかし、これまでのところ、CFPSシステムは環状プラスミドに依存しているため、技術がその潜在能力を最大限に発揮できない可能性があります。プラスミドDNAの調製は、クローニング中の多くの時間のかかるステップと大量のDNA単離に依存します。一方、プラスミドまたは合成されたDNAテンプレートからのPCR増幅は、数時間以内にCFPSテンプレートを調製するために使用できます2,3。したがって、線状DNAの適用は、CFPSの有望なソリューションを提供します。しかし、直鎖状DNAは、細胞抽出物4に天然に存在するエキソヌクレアーゼによって急速に分解される。λファージGamSタンパク質5またはカイサイト6を含むDNAを保護剤として使用したり、その末端2,7,8,9の化学修飾によって直鎖状DNAを直接保護したりするなど、この問題に対処する解決策があります。これらの方法はすべて、細胞抽出物への補給を必要とし、それは費用と時間がかかります。エキソヌクレアーゼV複合体(RecBCD)が細胞ライセート中の直鎖状DNAを分解することは長い間知られていました4。最近、私たちは、直鎖状DNAが、エキソヌクレアーゼ遺伝子(recBCD)のためにノックアウトされた細胞からのライセートではるかによく保護できることを示しました10。
このプロトコルでは、超音波処理溶解による大腸菌BL21 Rosetta2 ΔrecBCD株からの無細胞溶解物を調製するためのステップが詳細に説明される。超音波処理溶解は、いくつかのラボ11,12で採用されている一般的で手頃な技術です。この株から製造された抽出物は、線状DNAテンプレートからの発現をサポートするために、余分な成分やDNAテンプレートの修飾を追加する必要はありません。この方法は、天然大腸菌プロモーターからの線形DNA発現に特化した細胞抽出物のバッファー最適化という必須ステップに依存しています。直鎖状DNA発現のためのこの特定のバッファー最適化は、ネイティブσ70プロモーターがPCR産物の精製を回避しても、GamSタンパク質またはChi DNA補給なしで高タンパク質生産をもたらすための鍵であることが示されています10。直鎖状DNA発現のためのMg-gluの最適濃度は、プラスミドDNAのそれと同様であることがわかった。しかしながら、K−gluの最適濃度は、おそらく転写関連のメカニズムに起因する直鎖状DNAとプラスミドDNAの間に実質的な差を示した10。この方法を用いて発現されるタンパク質の機能性は、トーホールドスイッチの迅速なスクリーニングや酵素変異体の活性評価など、いくつかの用途で実証されています10。
このプロトコルは、変異型ΔrecBCD細胞抽出物と直鎖DNAの特異的キャリブレーションをテンプレートとして使用するだけで、大腸菌細胞フリーシステムで線状DNAテンプレートを使用するためのシンプルで効率的かつ費用対効果の高いソリューションを提供します。
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Protocol
1. 培地およびバッファーの調製
- 2xYT+P培地(固体および液体)の調製
- 表1に記載のように液体および固体培地を調製し、次いでオートクレーブ滅菌により滅菌する。
注:このプロトコルには、クロラムフェニコール(10 μg / mL)を含む2xYT+P寒天プレートが1枚必要です。液体媒体の体積は、必要なライセートの量に比例します。ここでは、開始容量5 Lの液体2xYT+P培地を使用します。ただし、1 Lの細胞培養により2〜3 mLの最終細胞ライセートが得られることを知って、必要に応じて容量を調整できます。
- 表1に記載のように液体および固体培地を調製し、次いでオートクレーブ滅菌により滅菌する。
- クロラムフェニコール(34 mg/mL)の調製
- クロラムフェニコール0.34 gを量り、エタノールを10 mLに加え、混合して溶解します。各1 mLを数本のチューブに分注し、後で使用するために-20°Cで保存します。
- S30Aバッファーの調製
- 表2に従ってS30A緩衝液を調製し、この緩衝液2Lを目指す。
注:繰り返しになりますが、このバッファーの容量は、必要なライセートの量に比例します。 - オートクレーブする前に、氷酢酸を使用してバッファーのpHを7.7に調整します。
- バッファーをオートクレーブします。
- オートクレーブ処理後は、このバッファーを4°Cに保ちます。
- 使用前に、DTT(0.22 μmメンブレンフィルターでろ過)をS30Aバッファーに加えて、最終濃度2 mM(ストック1 M DTT2 mLからS30Aバッファー1 L)に到達します。
注:繰り返しになりますが、このバッファーの容量は、必要なライセートの量に比例します。
- 表2に従ってS30A緩衝液を調製し、この緩衝液2Lを目指す。
- エネルギー溶液の調製
注:このエネルギー溶液は、Sunらの論文13(14倍のストック濃度)に基づいています。表3は、エネルギー溶液ストックの調製に必要な成分を、このプロトコルで使用されるすべての化学物質のカタログ番号とともに要約したものです。- 表3に従って原液を調製し、氷上に保管します。
- 表3に示すように、トリスバッファー2 M(250 mL容量の滅菌水中に60.57 gのトリス塩基)またはKOH 15%(100 mL容量の滅菌水中に15 gのKOH)のいずれかを使用して、示された成分の要求に応じてpHを校正します。
- 15 mLチューブに、 表3に示す順序で各成分の容量を追加します。
- エネルギー溶液をチューブあたり150μLずつ分注します。
- アリコートをドライアイス上でフラッシュ凍結し、-80°Cで保存します。
- アミノ酸(AA)溶液の調製
注意: アミノ酸溶液は、RTSアミノ酸サンプラーキットによって調製されます。このキットでは、20個のアミノ酸のそれぞれが、140 mMのロイシンを除いて、168 mMで1.5 mLの容量として提供されます。ここで、調製された原液は、必要な作業溶液ではなく、4倍濃縮される。アミノ酸溶液の最終濃度は、5mMであるロイシンを除く全てのアミノ酸について6mMである。- 20個のアミノ酸チューブをボルテックスで解凍し、完全に溶解するまで37°Cでインキュベートします。
注意: Cysは完全に溶解しない場合があります。 - 50 mLチューブに、滅菌水12 mLとアミノ酸各1.5 mLを 表4に示す順序で加えます。
- 溶液がかなり透明になるまでボルテックスし、必要に応じて37°Cでインキュベートする。
注意: Cysは完全に溶解しない場合があります。 - 氷上でチューブあたり500 μLのアミノ酸溶液を分注します。
- アリコートをドライアイスで瞬間凍結し、-80°Cで保存します。
- 20個のアミノ酸チューブをボルテックスで解凍し、完全に溶解するまで37°Cでインキュベートします。
- バッファーキャリブレーション用の溶液の調製
- 表5に示すように、Mg-glu(100 mM)およびK-glu(3 M)のストック溶液を調製します。校正手順の補足ファイル1に示されているように、これらのストックからMg-glu(0〜20 mM)およびK-glu(20〜300 mM)の段階希釈(1 mL容量)を行います。
注意: これらのストック濃度はキャリブレーションステップ用であり、最終実験を設定するときに変更が必要になる場合があります。このプロトコルでテストされたストックの最高濃度は、Mg-gluとK-gluでそれぞれ1 Mと4.5 Mです。
- 表5に示すように、Mg-glu(100 mM)およびK-glu(3 M)のストック溶液を調製します。校正手順の補足ファイル1に示されているように、これらのストックからMg-glu(0〜20 mM)およびK-glu(20〜300 mM)の段階希釈(1 mL容量)を行います。
- PEG8000溶液ストックの調製
- 50 mLの40%PEG8000溶液を調製します(50 mL容量の滅菌水に20 gのPEG8000)。
2.細胞培養とライセート調製(4日間の実験)
- 1日目
- ストリーク株BL21 Rosetta2 ΔrecBCD (表6)を-80°Cのグリセロールストックから10 μg/mLのクロラムフェニコールを含む2xYT+P寒天プレートに導入します。あるいは、BL21ロゼッタ 2ΔrecB (表6)10も使用され得る。
- 37°Cで一晩インキュベートします。
- 2日目
- 上記の寒天プレートの単一コロニーを、10 μg/mLクロラムフェニコールを添加した10 mLの2xYT+Pに接種します。
- 200rpmで振とうしながら37°Cで一晩インキュベートします。
- 3日目
- 一晩培養液を10 μg/mLクロラムフェニコールを含む4 Lの新鮮な2xYT+P培地に100倍に希釈して継代培養を行います。
注:たとえば、40 mLの一晩培養を3960 mLの新鮮な培地に加えます。希釈後、4Lの培地を、各フラスコが1Lを含むように4つのフラスコ(5L容量)に分ける。 - 37°C、200 rpmで約3〜4時間の成長でインキュベートし、OD600 が1.5〜2.0になるようにします。OD600 > 0.8を測定する場合は、培養液を4倍に希釈します。
注:正確なインキュベーション時間は、菌株、最初の接種材料、実験器具、および使用する機器によって異なる場合があります。ΔrecB/ΔrecBCDノックアウト株は、BL21ロゼッタ2親株に匹敵する成長率を有する(補足図1)。 - 文化を氷の上に置きます。
- 細胞を5,000 x g で4°Cで12分間スピンダウンし、デカントして上清を廃棄します。
- 細胞ペレットを800 mLのチルドS30A + DTTに再懸濁します。
注:S30A + DTTの体積は、元の細胞培養量の5倍です。例えば、細胞培養の開始容量が1 Lの場合、細胞ペレットを200 mLのS30A+DTTに再懸濁します。また、このステップは4°Cの冷蔵室で実行し、すべての材料を氷上に保つことをお勧めします。 - 細胞を5,000 x g で4°Cで12分間スピンダウンし、デカントして上清を廃棄します。
- 手順 2.3.5 と 2.3.6 を繰り返します。
- 細胞ペレットを160 mLのチルドS30A+DTTに再懸濁します。
注:今回のS30A + DTTの体積は、元の細胞培養量の25倍です。例えば、細胞培養の開始容量が1 Lの場合、細胞ペレットを40 mLのS30A+DTTに再懸濁します。繰り返しになりますが、材料を氷上に保つために、4°Cの冷蔵室でこのステップを実行することをお勧めします。 - 細胞を冷やして事前に計量した50 mLチューブに移します。
- 細胞を2,000 x g で4°Cで8分間スピンダウンし、デカントして上清を廃棄します。
- 細胞を2,000 x g で4°Cで4分間スピンダウンし、ピペットを使用して残りの上清を注意深く除去します。
- チューブの重量を再測定して、セルペレットの重量を計算します。
- セルペレットを-80°Cに保ちます。
- 一晩培養液を10 μg/mLクロラムフェニコールを含む4 Lの新鮮な2xYT+P培地に100倍に希釈して継代培養を行います。
- 4日目
- セルペレットを-80°Cから取り出し、氷上で1〜2時間解凍します。
- ペレット重量1グラムあたり0.9mLのS30A+DTTバッファーに細胞ペレットを再懸濁します。ピペットでゆっくりと細胞を再懸濁し、上部の泡がある場合はできるだけ避けます。
- 再懸濁した細胞1 mLアリコートを1.5 mLマイクロチューブに入れ、氷上または4°Cで予め冷却したコールドブロック(金属ブロックを使用することが好ましい)に保ちます。
注:最後のアリコートが1mLよりはるかに少ない場合は、最適でない量を超音波処理するよりも廃棄する方が良いです。超音波処理のための最適容量(1mL)は、このセットアップ(チューブ、超音波処理器、およびプローブ)のために決定され、異なるもののために異なる場合があります。 - 超音波処理器(3 mmプローブ、周波数20 kHz)で各チューブを超音波処理し、3サイクル(30秒超音波処理、1分間の一時停止)で20%振幅を設定します。
注:3サイクルで供給される総エネルギーは~266ジュール(サイクルあたり~80-110ジュール)でした。このステップでは、氷に囲まれたコールドブロックにチューブを置きます。プローブの過熱を避けるために、2つのコールドブロックを交互に切り替えます(スタンバイコールドブロックも氷上で冷たく保たれます)。両方のコールドブロックは、超音波処理の前日に冷蔵庫で事前に冷やされました。 - ライセートを12,000 x g で4°Cで10分間スピンダウンします。
- 上清(細胞ライセート)をピペットで回収し、50 mLチューブに移します。
- 細胞ライセートを37°C、200rpm攪拌で80分間インキュベートします。
- ライセートを12,000 x g で4°Cで10分間スピンダウンします。
- 上清を収集し、すべてのチューブを氷上に保ちながら、事前に冷やした1.5 mLマイクロチューブにそれぞれ30 μLを分注します。
- ライセートアリコートをドライアイス上で瞬間凍結し、-80°Cで保存します。
3. 線状DNAの無細胞バッファーキャリブレーション
注:無細胞緩衝液は、Sunら13に記載されているように、最適なMg-gluおよびK-glu濃度になるように較正されました。 補足ファイル1 は、キャリブレーション手順に必要です。反応物をそれぞれ10.5 μLの最終容量に設定しました。抽出物は、1 nMの直鎖状(以下のセクション4を参照)またはプラスミドDNAを使用して較正しました。実験は、バッファーが調製された同じ日に実行することも、調製したバッファーを-80°Cで凍結して別の日に実験を実行することもできます。すべてのキャリブレーションステップで、各成分を氷上で解凍してから、混合して384ウェルプレートにピペッティングしました。
- Excelファイル 補足ファイル1の「バッファー調製」タブに従って、(a)細胞抽出物(総反応量の33%)、(b)レポーターDNA(直鎖状および/またはプラスミドDNAとして)を最終濃度1 nM、(c)無細胞バッファー(PEG8000、AA溶液、およびエネルギー溶液)、および(d)K-gluを最終濃度80 mMまで含むマスターミックスを調製します。
- 反応容量が10.5 μLの場合、異なる濃度のMg-glu 10x濃縮ストック(最終濃度範囲:0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、および20 mM)の1.05 μL(10%全反応)を取り、9.45 μL(90%全反応)のマスターミックスを加えます。穏やかに混ぜる。
注:PCR8ストリップチューブを使用して希釈液を調製し、マルチチャンネルピペットで混合します。必要に応じて、異なる範囲のMg-glu濃度を用いてもよい。 - 上記の反応物10 μLを384ウェル角底マイクロプレートにピペットし、接着プレートシールで覆い、蛍光出力として遺伝子発現を測定します。プレートリーダーで蛍光データを記録(例:485 nm;Em:528 nm)を一定の間隔(例えば、5分間)で30°Cで8時間インキュベートし、307cpmで連続的に軌道振とうします。
注:必要に応じて、データ収集を開始する前に、384ウェルマイクロプレート(<2,500 x g、1分、室温)をスピンダウンします。エンドポイント測定を用いて、異なる緩衝液組成物におけるGFP発現を比較した。蛍光値は、プロット用に標準化された単位に変換できます(以下を参照)。 - エンドポイントで最も高い蛍光値をもたらすMg-glu濃度を特定します。
注意: 得られた最適なMg-glu濃度がわからない場合は、より多様な濃度範囲で手順3.2を繰り返します。 - 最適化されたMg-glu濃度で、手順3.2で示したのと同じ容量を使用して、濃度の範囲(20、40、60、80、100、120、140、160、180、200、220、および240 mM)のK-gluキャリブレーションに進みます。実験を実行し、テストしたK-glu濃度の中から最も高い蛍光値を特定します。これは、このライセートに対するMg-gluおよびK-gluの最適なバッファー組成を示しています。
注意: 得られた最適なK-glu濃度がわからない場合は、より多様な濃度範囲で手順を繰り返します。 - Mg-gluおよびK-gluの値が確立されたら、得られたバッチ量に従って最適化された緩衝液組成のストックチューブを調製する。 補足ファイル1の「バッファー調製」タブを使用して、必要なバッファーチューブの数を計算し、チューブあたり38 μLを分注し、-80°Cで保存します。
4. 直鎖状DNA調製
注:ライセートキャリブレーションには、プラスミドP70a-deGFPが使用されます。このプラスミドは、プラスミドミニプレップキットを使用したミニプレップ、またはプラスミドマキシプレップキットを使用したマキシプレップのために 、大腸菌 KL740 cl857+(表6)で維持されました。無細胞反応における発現鋳型として用いた直鎖状DNA断片を、表 7 および 表8に列挙したプライマーおよび鋳型を用いてPCR増幅した。
- PCRは、 表7に列挙したオリゴプライマーを有するDNAポリメラーゼを用いてプラスミドP70a-deGFPから増幅する。サーモサイクラープログラムを使用して、製造元のプロトコルに従って、PCR反応を50 μLの容量でセットアップします:[98°Cで2分間;40サイクルx(98°Cで30秒間→66°Cで30秒間→72°Cで60秒間); 72°Cで10分間;4°Cで∞]。
- 50 μL PCR反応あたり1 μLのDpnI制限酵素を添加してPCR反応で鋳型DNAを消化し、37°Cで1時間インキュベートします。次に、PCR & DNAクリーンアップキットを使用してPCR反応を精製し、ヌクレアーゼフリーの水で溶出します。
- 使用前に、1%アガロースゲル(1x TAE)でPCR産物を確認してください。
- 精製されたPCR産物(またはプラスミド調製物)をナノドロップ(ND-1,000)を使用して定量します。
注:下流の無細胞反応に直接適合するDNAポリメラーゼ/バッファーを使用する場合は、精製ステップ(ステップ2)を完全にスキップし、代わりにDNA結合色素を使用した蛍光アッセイによって未精製DNAの濃度を測定することができます(Batista et al.10を参照)。
5. 実験実行
注: 補足ファイル1を使用して調製された各ライセートバッチのバッファーストックを校正することに加えて(上記)、ファイルの[反応準備]タブを使用して、後続の無細胞反応を設定することをお勧めします。以前と同様に、反応容量は反応あたり10.5 μLに設定され、そのうち10 μLのみが最終的にデータ取得のために384ウェルプレートにピペットで移されます。ここでは、各テンプレートの5nMが無細胞発現に使用される。反応物をピペッティングするときは、同じピペットとチップの種類を使用することが重要です。ウェル内の気泡やウェルの壁に付着した液体を避けるために慎重にディスペンスしてください。必要に応じて、プレートをスピンダウンします(<2,500 x g、1分、室温)。
- サンプルごとに必要なサンプルの説明と反復を 補足ファイル1の「反応準備」タブに入力して、ピペットする容量を計算します。
注:10.5μL以外の反応量が必要な場合は、 補足ファイル1にも入力できます。このファイルは、以前に最適化されたバッファーストックのチューブ数と、氷上で解凍する細胞抽出チューブを計算します。 - 最適なマスターミックス調製用に1.5 mLマイクロチューブにラベルを付け(直鎖DNAとプラスミドDNA用に別々に)、適切な量のバッファーとライセートを加えて、穏やかに混合します。
注:バッファー中の最適なK-glu濃度には違いがあるため、「反応準備」タブのコピーは、直鎖DNAとプラスミドDNAで別々に使用する必要があります。 - 最初にDNAサンプルをピペットで、次にヌクレアーゼフリーの水をピペットで、最後にステップ5.2の最適マスターミックス(MM)をピペットで行います。プレートリーダーに加える直前に、無細胞反応をピペットで穏やかに混合し、気泡を避けます。
注:PCR8ストリップチューブを使用して、追加の反復のために反応量を混合します。例えば、技術的なトリプリケートを意図している場合は、サンプルをプレートに追加する際のピペッティングエラーを減らすために、4つの反応用のミックスを準備し、チューブ内にデッドボリュームを残します。 - プレートリーダーで反応を設定します(Ex 485 nm;Em 528 nm)。キネティックランでは、30°Cで8時間のインキュベーションを行い、307cpmで連続的に軌道を振とうしながら、一定の間隔(5分など)で蛍光データを記録しました。
注:エンドポイントの測定は、8時間の時点として報告されました。収集された蛍光値は任意の単位(a.u.)ですが、プロット用に標準化された単位に変換できます(以下を参照)。
6. FITCおよびGFPの相対定量
注:GFP発現は、プレートリーダーによって任意の蛍光単位(a.u.)でエクスポートされます。ただし、異なる設定(バッチ、機器、ユーザー、およびラボ)間で蛍光値を比較するために、標準化された測定単位を使用することをお勧めします。ここでは、NIST-FITCおよび組換えeGFPの標準曲線を使用して、蛍光値(a.u.)をFITC等価値およびeGFP(μM)値に変換する詳細な手順を示します。NIST-FITCストック溶液を4°Cで保存し、組換えeGFPを-20°Cで保存します。 原液と連続希釈液が光から保護されていることを確認してください。送達時には、組換えeGFPをより小さな容量に分注して、複数の凍結融解サイクルを回避することをお勧めします。
- 100 mMホウ酸ナトリウム、pH 9.5の溶液を調製し、室温または4°Cで保存します。
- ホウ酸ナトリウム溶液を使用して、50 μMストックから1ステップあたり2倍(50、25、12.5、6.25、3.125、1.562、0.781、0.390、0.195、0.097、0.048、および0 μM)の標準曲線用に12個の希釈液(各70 μL)を調製します。希釈系列を3連で調製します。
- ステップ6.2と同様に、ホウ酸ナトリウム溶液(1.2、0.3、0.075、0.0188、0.0047、0.0012、0.、0003、0.、00007、および0μM)を使用して、組換えeGFPから段階希釈液(各70μL)を調製します。モル濃度の計算には、タンパク質のフルサイズ(28 kDa)と精製されたeGFPの濃度(1 g / L)を考慮してください。希釈系列を3連で調製します。
- 各希釈液20 μL(各9ウェル = 3希釈シリーズ x 3テクニカルレプリケート)を接着プレートシールで覆われた384ウェルの四角底マイクロプレートに加え、プレートリーダーでインキュベートして測定します。
注:ここで使用された設定は、励起:485/20、放出:528/20、ゲイン50でした。ただし、追加の波長/ゲインの組み合わせを使用して、他の蛍光分子のキャリブレーションやゲイン設定を行うこともできます。変換係数を計算するには、無細胞実験からGFP蛍光データと検量線データを取得するために、同じ波長とゲイン設定が必要です。 - 線形信号範囲(ここでは、たとえば、[FITC] ≤ 0.781 μM)を使用して、各条件の傾き[y = axおよびR2]を適合させます。
注意: 範囲は、使用するマシンや標準ソリューションによって異なる場合があります。 - 表9の例に従って、FITCおよびeGFPキャリブレーションのデータを保存し、ラボの相対測定値を計算します。蛍光任意単位(a.u.)で得られた値を曲線勾配「a」値(y = ax)で割って、FITCまたはeGFPの観点からGFP産生を推定します。
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Representative Results
代表的な結果は、直鎖DNAとプラスミドDNAについて別々に最適なMg-グルタミン酸レベルとK-グルタミン酸レベルについてライセートを校正した後のここに示されています(図1)。Mg-グルタミン酸の最適濃度は、8 mMのΔrecB およびΔrecBCD 抽出物全体で類似しています(図1B)。ただし、プラスミドDNAの最適なK-グルタミン酸濃度は140 mMですが、同じ抽出物の直鎖状DNAの最適なK-グルタミン酸濃度は20 mMです(図1C)。WTおよびΔrecBCD 細胞からの抽出物におけるGFP発現の比較分析では、エキソヌクレアーゼV欠失抽出物に使用される直鎖DNAおよびプラスミドDNAからの最適な発現のために、抽出物のバッファー組成を特異的に較正する必要があることがわかりました。
較正ステップの後、WTおよびΔrecBCD抽出物中の直鎖状およびプラスミドDNA(5nM)からのGFP発現のレベルを比較した(図1D)。直鎖状DNAからのGFP発現は、ΔrecBおよびΔrecBCD株からの抽出物におけるプラスミドDNAからの発現のそれぞれ102%および138%に達した。まとめると、これらの結果は、天然大腸菌σ70プロモーターを用いた直鎖DNAからの発現が、そのような変異体から細胞ライセートを調製し、無細胞バッファーを直鎖DNA用に特異的に較正した場合、プラスミド発現からの発現と同じレベルに達する可能性があることを示しています。
図1:ΔrecB/ΔrecBCD抽出物中の直鎖状およびプラスミドDNAの差動バッファー最適化。 (A)プラスミドp70a-deGFPから1361 bpの直鎖状DNAアンプリコンを増幅し、バッファーキャリブレーション用の遺伝子発現の鋳型として使用しました。(B)0〜20 mMの異なる濃度を使用した各DNAタイプの1 nMによるMg-グルタミン酸バッファーのキャリブレーション(K-グルタミン酸を80 mMに固定)。四角いボックスは、選択された濃度ポイントを示します。P =プラスミドDNA、L =直鎖DNA。(C)各溶解液に最適なMg-グルタミン酸濃度を選択した後、K-グルタミン酸を20〜240 mM滴定した。四角いボックスは、選択された濃度ポイントを示します。P =プラスミドDNA、L =直鎖DNA。ヒートマップ(B)および(C)に示されているデータは、単一の実験からのものです。(D)バッファーキャリブレーション後、各DNAタイプの5 nMで無細胞反応を行った。抽出物BL21 Rosetta2は線状DNA発現をサポートしていませんが、ΔrecBおよびΔrecBCD株からの差動最適化抽出物はプラスミドDNA(青)レベルと同様の線状DNA(緑)発現を示します。示されているエンドポイントデータは、同じ日に行われ±インキュベーションの8時間後に収集された3回の反復の平均SDです。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:プロトコルの視覚的表現。 CFPS合成のテンプレートとしての線状DNAの細胞ライセート調製およびライセート最適化のワークフロー。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
表1:液体および固体の2xYT+P培地を調製するための成分のリスト。各コンポーネントの数量 (グラム単位) は、1 L のメディアに対して指定されます。必要に応じて比例してスケールアップします。メディアは使用前にオートクレーブ滅菌する必要があります。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
表2:緩衝液S30A+DTTを調製するための成分のリスト。 各成分の量(グラム単位)は、1LのバッファS30Aに対して指定される。必要に応じて比例してスケールアップします。S30Aバッファーは、使用前にオートクレーブ滅菌してから冷却(4°C)する必要があります。DTTバッファーは、示されているように個別に調製およびろ過し(15 mLチューブ内)、-20°Cで保存する必要があります。 バッファーS30Aを使用する直前に、2 mLのDTT(1 Mストックから)を1 LのS30Aバッファーに追加します。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
表3:エネルギー溶液調製用の成分のリスト。 各成分の量(グラム単位)または容量は、指定された濃度(列F)のストック溶液の指定された量(列H)を調製するために(列Gで)指定されます。各成分のpHは、示されているように(列IおよびJに)、必要に応じて調整する必要があります。14xエネルギー溶液ストックは、各成分の列挙された体積(列K)を列挙された順序で混合することによって調製される。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
表4:アミノ酸原液を調製するための成分のリスト。 4xアミノ酸ストック溶液を調製するには、すべてのアミノ酸をリストされた順序で混合する必要があります。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
表 5.ライセート校正溶液を調製するための成分のリスト。 Mg-グルタミン酸およびK-グルタミン酸ストック溶液の量(グラム単位)を指定して、各バッファーの指示濃度の50 mLを調製します。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
表6:このプロトコルで使用される細菌株のリスト。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
表7:このプロトコルで使用されるプライマーのリスト。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
表8:このプロトコルでライセートキャリブレーション用およびPCRによる線形DNA増幅用のテンプレートとして使用したプラスミド。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
表9:FITCおよびeGFP変換。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
ここでは、recBまたはrecBCDオペロンのいずれかのゲノムノックアウトを有する大腸菌BL21 Rosetta2から調製された細胞ライセートが、線状DNAテンプレートからの高タンパク質発現をサポートすることを示します。このプロトコルは、線状DNAテンプレートに特異的な段階的なライセートキャリブレーション手順を詳しく説明しており(図2)、これは直鎖DNA中のσ70プロモーターからの高発現をもたらし、等モルDNA濃度のプラスミドレベルに近いレベルに達する重要なステップです。このプロトコルは、最終アプリケーションで使用するDNA(直鎖状またはプラスミド)の種類に応じたバッファーキャリブレーションの重要性を強調しています。
このプロトコルは、プラスミドクローニングを回避するのに役立ち、時間とコストを大幅に向上させます。線状DNA断片は、市販のプロバイダーによって合成され、および/または実験室でのPCRによって増幅され得る。プラスミドDNAを使用した同じプロセスは、クローニング、配列検証、およびDNA調製ステップ10を考慮すると、少なくとも1週間長くかかります。実験間のバッチ間のばらつきを最小限に抑えるために、大量の細胞抽出物と線形DNAテンプレートを準備することをお勧めします14,15。
この方法は堅牢であることが示されており、ラボ全体で使用されています10。これらの抽出物の結果は、生物学的複製物、異なる抽出物バッチ、および異なる株バックグラウンドにわたって一貫しています10。プロトコルの堅牢性は、細胞溶解方法、温度、DNAテンプレート、さまざまなDNA濃度など、さまざまな実験パラメーターでもテストされています。この方法は、トーホールドスイッチライブラリの特性評価と酵素活性スクリーニングという2つの関連アプリケーションのための遺伝子構築物の迅速なスクリーニングと特性評価にすでに使用されています10。
この研究では、生産性の高い親株である大腸菌BL21 Rosetta2からのΔrecB / ΔrecBCD抽出物の線状DNAから高い発現レベルが得られましたが、この方法論では、関心のある新しい株のゲノムエンジニアリングが必要になります。対照的に、GamS5やChi DNA6などの直鎖DNAの保護剤の補給は、新しい株に適用するのは簡単ですが、コストと時間がかかります。
ここで提供されるプロトコルは、無細胞システムでの線形DNAテンプレートの使用を容易にし、合成生物学コミュニティの設計-構築-テストサイクルを加速します。 ΔrecB/ΔrecBCD 抽出物中の線状DNAテンプレートからのより簡単な無細胞発現は、目的の低分子、バイオシミラー、およびその他のオンデマンドポイントオブケアアプリケーションの生産に展開できます。
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Disclosures
何一つ
Acknowledgments
ACBとJLFは、ANR SINAPUV助成金(ANR-17-CE07-0046)による資金援助を認めています。JLFとJBは、ANR SynBioDiag助成金(ANR-18-CE33-0015)による資金援助を認めています。MSAとJLFは、ANR iCFree助成金(ANR-20-BiopNSE)による資金援助を認めています。JBは、ERCが「COMPUCELL」(付与番号657579)を開始するサポートを認めています。Centre de Biochimie Structuraleは、フランス統合構造生物学インフラストラクチャ(FRISBI)(ANR-10-INSB-05-01)からの支援を認めています。MKは、INRAeのMICA部門、パリサクレー大学、イルドフランス(IdF)地域のDIM-RFSI、およびANRドリーミー(ANR-21-CE48-003)からの資金援助を認めています。この作業は、欧州研究会議コンソリデーター賞(CLBへの865973)による資金提供によってサポートされました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-YT Broth | Invitrogen | 22712020 | |
| 1.5 mL Safe-Lock tubes | Eppendorf | 30120086 | 1.5 mL microtube |
| 384-well square-bottom microplate | Thermo Scientific Nunc | 142761 | |
| 3PGA (D-(-)-3-Phosphoglyceric acid disodium) | Sigma-Aldrich | P8877 | |
| adhesive plate seal | Thermo Scientific Nunc | 232701 | |
| Agar | Invitrogen | 30391023 | |
| ATP (Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate) | Sigma-Aldrich | A8937 | |
| BL21 Rosetta2 | Merck Millipore | 71402 | |
| BL21 Rosetta2 ΔrecB | Addgene | 176582 | |
| BL21 Rosetta2 ΔrecBCD | Addgene | 176583 | |
| cAMP (Adenosine 3' 5'-cyclic monophosphate) | Sigma-Aldrich | A9501 | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | |
| CoA (Coenzyme A hydrate) | Sigma-Aldrich | C4282 | |
| Corning 15 mL PP Centrifuge Tubes, Rack Packed with CentriStar Cap, Sterile | Corning | 430790 | 15 mL tube |
| Corning 50 mL PP Centrifuge Tubes, Conical Bottom with CentriStar Cap, Sterile | Corning | 430828 | 50 mL tube |
| CTP (Cytidine 5'-triphosphate, disodium salt hydrate) | Alfa Aesar | J62238 | |
| DpnI | NEB | R0176S | |
| DTT (DL-Dithiothreitol) | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| Folinic acid (solid folinic acid calcium salt) | Sigma-Aldrich | F7878 | |
| GTP (Guanosine 5?-Triphosphate, Disodium Salt) | Sigma-Aldrich | 371701 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| K phosphate dibasic (K2HPO4) | Carl Roth | 231-834-5 | |
| K phosphate monobasic (H2KO4P) | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| K-glutamate | Alfa Aesar | A17232 | |
| Mg-glutamate | Sigma-Aldrich | 49605 | |
| Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm, polyethersulfone | Merck Millipore | SLGP033RB | membrane filter 0.22 µm |
| Monarch PCR & DNA Cleanup Kit | NEB | T1030S | PCR & DNA cleanup Kit |
| Monarch Plasmid Miniprep Kit | NEB | T1010S | Plasmid Miniprep Kit |
| NAD (B-nicotinamide adenine dinucleotide hydrate) | Sigma-Aldrich | N6522 | |
| NIST-traceable FITC standard | Invitrogen | F36915 | NIST-FITC |
| NucleoBond Xtra Maxi kit | Macherey-Nagel | 740414.1 | Plasmid Maxiprep Kit |
| PEG 8000 | Sigma-Aldrich | 89510 | |
| plate reader | Biotek | Synergy HTX | |
| Purified Recombinant EGFP Protein | Chromotek | egfp-250 | recombinant eGFP |
| Q5 High-Fidelity 2X Master Mix | NEB | M0492S | DNA polymerase |
| Q5 High-Fidelity 2X Master Mix | New England Biolabs | M0492L | DNA polymerase |
| Qubit dsDNA BR Assay Kit | Thermo | Q32850 | fluorometric assay with DNA-binding dye |
| RTS Amino Acid Sampler | biotechrabbit | BR1401801 | |
| Spermidine | Sigma-Aldrich | 85558 | |
| Sterile water | Purified water from the Millipore RiOs 8 system, sterilized by autoclaving. | ||
| Tris base | Life Science products Cytiva | 17-1321-01 | |
| tRNA | Roche | 10109550001 | |
| Ultrasonic processor Vibra cell VC-505 | SONICS | VC505 | sonicator |
| UTP Na3 (Uridine 5'- triphosphate, trisodium salt hydrate) | Acros Organics | 226310010 | |
| Water, nuclease-free | Thermo | R0581 | nuclease-free water |
References
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