Summary
这里介绍的是用于制备和缓冲液校准大 肠杆菌 BL21 Rosetta2（ΔrecBCD 和 ΔrecB）核酸外切酶 V 敲除菌株细胞提取物的方案。这是一种使用线性DNA模板在无细胞蛋白质合成系统中表达的快速、简单和直接的方法。
Abstract
无细胞蛋白质合成（CFPS）由于其众多优点，最近在合成生物学领域变得非常流行。使用用于CFPS的线性DNA模板将进一步使该技术充分发挥其潜力，通过消除克隆，转化和质粒提取步骤来减少实验时间。线性DNA可以通过PCR快速轻松地扩增以获得高浓度的模板，避免潜在的 体内 表达毒性。然而，线性DNA模板被天然存在于细胞提取物中的核酸外切酶迅速降解。已经提出了几种策略来解决这个问题，例如添加核酸酶抑制剂或对线性DNA末端进行化学修饰以保护。所有这些策略都需要额外的时间和资源，并且尚未获得接近质粒水平的蛋白质表达。本文介绍了使用线性DNA模板进行CFPS的替代策略的详细方案。通过使用来自核酸外切酶缺陷敲除细胞的细胞提取物，线性DNA模板保持完整，无需任何末端修饰。我们介绍了来自 大肠杆菌 BL21 Rosetta2 ΔrecBCD 菌株的细胞裂解物的制备步骤，通过超声裂解和缓冲液校准专门用于线性DNA的Mg-谷氨酸（Mg-glu）和K-谷氨酸（K-glu）。该方法能够达到与 大肠杆菌 CFPS中质粒DNA相当的蛋白质表达水平。
Introduction
无细胞蛋白质合成 （CFPS） 系统越来越多地被用作生物传感器工程、分散制造和遗传电路原型设计的快速、简单和高效的方法1。由于其巨大的潜力，CFPS系统经常用于合成生物学领域。然而，到目前为止，CFPS系统依赖于环状质粒，这可能会限制该技术充分发挥其潜力。质粒DNA的制备取决于克隆过程中许多耗时的步骤和大量的DNA分离。另一方面，质粒或合成的DNA模板的PCR扩增可用于在几个小时内简单地制备CFPS模板2，3。因此，线性DNA的应用为CFPS提供了有希望的解决方案。然而，线性DNA被天然存在于细胞提取物中的核酸外切酶迅速降解4。有一些解决方案可以解决这个问题，例如使用λ噬菌体GamS蛋白5或含有Chi位点6的DNA作为保护剂，或通过对其末端2，7，8，9进行化学修饰直接保护线性DNA。所有这些方法都需要补充细胞提取物，这是昂贵且耗时的。人们早就知道核酸外切酶V复合物（RecBCD）降解细胞裂解物中的线性DNA4。最近，我们发现线性DNA在核酸外切酶基因（recBCD）敲除细胞的裂解物中可以得到更好的保护10。
在该协议中，详细描述了通过超声裂解从 大肠杆菌 BL21 Rosetta2 ΔrecBCD 菌株制备无细胞裂解物的步骤。超声裂解是几个实验室采用的常见且经济实惠的技术11，12。该菌株产生的提取物不需要添加任何额外的组分或DNA模板修饰来支持线性DNA模板的表达。该方法依赖于细胞提取物缓冲液优化的基本步骤，专门针对天然 大肠杆菌 启动子的线性DNA表达。已经表明，这种针对线性DNA表达的特异性缓冲液优化是天然σ70启动子在没有补充GamS蛋白或Chi DNA的情况下产生高蛋白产量的关键，即使避免了PCR产物的纯化10。发现线性DNA表达的最佳Mg-glu浓度与质粒DNA相似。然而，K-glu的最佳浓度显示线性DNA和质粒DNA之间存在显着差异，这可能是由于转录相关机制10。使用该方法表达的蛋白质的功能已在多种应用中得到证明，例如快速筛选脚趾开关和酶变体的活性评估10。
该协议提供了一种简单，高效且具有成本效益的解决方案，只需使用突变的ΔrecBCD细胞提取物和线性DNA的特异性校准作为模板，即可在大肠杆菌无细胞系统中使用线性DNA模板。
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Protocol
1. 培养基和缓冲液制备
- 2xYT+P培养基（固体和液体）的制备
- 如 表1所述制备液体和固体培养基，然后通过高压灭菌灭菌。
注意：该方案需要一个含有氯霉素（10μg/ mL）的2xYT + P琼脂平板。液体介质的体积与所需裂解物的体积成正比。在这里，使用起始体积为 5 L 的液体 2xYT+P 培养基。但是，可以根据需要调整体积，因为知道 1 L 的细胞培养物会产生 2 至 3 mL 的最终细胞裂解物。
- 如 表1所述制备液体和固体培养基，然后通过高压灭菌灭菌。
- 氯霉素的制备（34毫克/毫升）
- 称取氯霉素0.34g，加乙醇至10mL，混合溶解。将每个试样1mL分装到几个管中，并储存在-20°C以备后用。
- S30A缓冲液的制备
- 根据 表2制备S30A缓冲液，目标是2L该缓冲液。
注意：同样，该缓冲液的体积与所需裂解物的体积成正比。 - 高压灭菌前，使用冰醋酸将缓冲液的pH值调节至7.7。
- 高压灭菌缓冲液。
- 高压灭菌后将该缓冲液保持在4°C。
- 使用前，将DTT（由0.22μm膜过滤器过滤）添加到S30A缓冲液中，以达到2 mM的终浓度（2 mL库存1 M DTT至1 L S30A缓冲液）。
注意：同样，该缓冲液的体积与所需裂解物的体积成正比。
- 根据 表2制备S30A缓冲液，目标是2L该缓冲液。
- 能源溶液的制备
注意：此能量解决方案基于 Sun 等人的 论文13（14 倍原液浓度）。 表3 概述了制备能源溶液储备所需的组分，以及该协议中使用的所有化学品的目录号。- 根据 表3 制备储备溶液并将其放在冰上。
- 按照要求校准指定组分的pH值，使用Tris缓冲液2 M（60.57 g Tris碱在250 mL体积的无菌水中）或KOH 15%（100 mL体积的无菌水中的15 g KOH）如 表3所示。
- 在 15 mL 管中，按 表 3 所示的顺序加入每种组分的体积。
- 等分能量溶液，每管 150 μL。
- 在干冰上快速冷冻等分试样并储存在-80°C。
- 氨基酸（AA）溶液的制备
注意：氨基酸溶液由RTS氨基酸采样器试剂盒制备。该试剂盒中 20 种氨基酸中的每一种都以 1.5 mL 体积的形式提供，浓度为 168 mM，亮氨酸为 140 mM。在这里，制备的储备溶液是4倍浓缩的，而不是所需的工作溶液。所有氨基酸的氨基酸溶液的最终浓度为6mM，亮氨酸除外，亮氨酸为5mM。- 通过涡旋解冻20个氨基酸管并在37°C下孵育直至它们完全溶解。
注意：Cys可能无法完全溶解。 - 在 50 mL 管中，按 表 4 所示的顺序加入 12 mL 无菌水和每种 1.5 mL 氨基酸。
- 涡旋直至溶液相当澄清，必要时在37°C下孵育。
注意：Cys可能无法完全溶解。 - 在冰上每管等分试样 500 μL 氨基酸溶液。
- 将等分试样在干冰上快速冷冻并储存在-80°C。
- 通过涡旋解冻20个氨基酸管并在37°C下孵育直至它们完全溶解。
- 缓冲液校准溶液的制备
- 如 表5所示制备Mg-glu（100mM）和K-glu（3M）的储备溶液。如校准步骤补充 文件1所示，从这些储备液中连续稀释（1 mL体积）以Mg-glu（0至20 mM）和K-glu（20至300 mM）进行稀释。
注意：这些储备浓度用于校准步骤，在设置最终实验时可能需要更改。为该协议测试的最高储量浓度分别为Mg-glu和K-glu的1 M和4.5 M。
- 如 表5所示制备Mg-glu（100mM）和K-glu（3M）的储备溶液。如校准步骤补充 文件1所示，从这些储备液中连续稀释（1 mL体积）以Mg-glu（0至20 mM）和K-glu（20至300 mM）进行稀释。
- PEG8000溶液储备液的制备
- 准备 50 mL 的 40% PEG8000 溶液（20 g PEG8000 在 50 mL 体积的无菌水中）。
2. 细胞培养和裂解物制备（4天实验）
- 第一天
- 将菌株BL21 Rosetta2 ΔrecBCD （表6）从-80°C甘油原液划到含有10μg/ mL氯霉素的2xYT + P琼脂平板上。可选地，也可以使用BL21 Rosetta2 ΔrecB （表6）10。
- 在37°C孵育过夜。
- 第二天
- 将上述琼脂平板中的单个菌落接种到 10 mL 补充有 10 μg/mL 氯霉素的 2xYT+P 中。
- 在37°C下以200rpm振荡孵育过夜。
- 第三天
- 通过将过夜培养物稀释 100 倍到含有 10 μg/mL 氯霉素的 4 L 新鲜 2xYT+P 培养基中来制作传代培养物。
注意：例如，将40 mL的过夜培养物添加到3960 mL新鲜培养基中。稀释后，将4L培养基分成4个烧瓶（5L体积），使得每个烧瓶含有1L。 - 在37°C，200rpm下孵育约3至4小时的生长，以达到OD600 的1.5-2.0。如果测量OD600> 0.8，则将培养物稀释4倍。
注意：确切的孵育时间可能因菌株、初始接种物、实验室器具和所用仪器而异。ΔrecB/ΔrecBCD敲除菌株的生长速率与BL21 Rosetta2亲本相当（补充图1）。 - 将培养物放在冰上。
- 在4°C下以5，000× g 旋转细胞12分钟，然后通过倾析弃去上清液。
- 将细胞沉淀重悬于 800 mL 冷冻的 S30A+DTT 中。
注意：S30A+DTT的体积比原始细胞培养体积小5倍。例如，对于起始体积为 1 L 的细胞培养物，将细胞沉淀重悬于 200 mL 的 S30A+DTT 中。还建议在4°C的冷藏室中进行此步骤，并将所有材料保持在冰上。 - 在4°C下以5，000× g 旋转细胞12分钟，然后通过倾析弃去上清液。
- 重复步骤 2.3.5 和 2.3.6。
- 将细胞沉淀重悬于 160 mL 冷藏的 S30A+DTT 中。
注意：这次S30A + DTT的体积比原始细胞培养体积小25倍。例如，对于起始体积为 1 L 的细胞培养物，将细胞沉淀重悬于 40 mL 的 S30A+DTT 中。同样，建议在4°C的冷藏室中进行此步骤，并将材料保持在冰上。 - 将细胞转移到冷藏并预先称重的 50 mL 管中。
- 在4°C下以2，000× g 旋转细胞8分钟，然后通过倾析弃去上清液。
- 在4°C下以2，000× g 旋转细胞4分钟，然后使用移液管小心除去剩余的上清液。
- 重新测量试管的重量以计算细胞沉淀的重量。
- 将细胞沉淀保持在-80°C。
- 通过将过夜培养物稀释 100 倍到含有 10 μg/mL 氯霉素的 4 L 新鲜 2xYT+P 培养基中来制作传代培养物。
- 第四天
- 从-80°C取出细胞沉淀，并在冰上解冻1-2小时。
- 将细胞沉淀重悬于每克沉淀重量的 0.9 mL S30A+DTT 缓冲液中。缓慢移液以重悬细胞，尽可能避免顶部泡沫（如果有）。
- 将1mL等分试样的重悬细胞放入1.5mL微管中，并将它们保持在4°C的冰或预冷冷块上（最好使用金属块）。
注意：如果最后的等分试样远小于 1 mL，则最好丢弃它，而不是超声处理次优体积。超声处理的最佳体积（1 mL）是针对此设置（试管、超声仪和探头）确定的，并且可能因不同的体积而异。 - 在超声仪（3 mm探头，频率20 kHz）中对每个管进行超声处理，三个周期（30 s超声处理，1分钟暂停）的振幅设置为20%。
注意：三个周期传递的总能量为~266焦耳（每个周期~80-110焦耳）。在此步骤中，将管子放在被冰包围的冷块上。在两个冷块之间交替以避免探头过热（备用冷块也在冰上保持冷）。两个冷块都是在超声处理前一天在冰箱中预先冷却的。 - 在4°C下以12，000× g 旋转裂解物10分钟。
- 用移液管收集上清液（细胞裂解物）并转移到50 mL管中。
- 将细胞裂解物在37°C以200rpm搅拌孵育80分钟。
- 在4°C下以12，000× g 旋转裂解物10分钟。
- 收集上清液，并在预冷的 1.5 mL 微管中各等分 30 μL，同时将所有试管放在冰上。
- 将裂解物等分试样在干冰上快速冷冻并储存在-80°C。
3. 线性DNA的无细胞缓冲液校准
注意：将无细胞缓冲液校准为最佳Mg-glu和K-glu浓度，如Sun等人13中所述。校准步骤需要 补充文件 1 。将反应设置为每次反应的最终体积为10.5 μL。使用1 nM线性（见下文第4节）或质粒DNA校准提取物。实验可以在制备缓冲液的同一天进行，也可以将制备的缓冲液冷冻在-80°C以在另一天进行实验。对于所有校准步骤，在混合并移液到384孔板之前，将每个组分在冰上解冻。
- 根据Excel文件 补充文件1中的“缓冲液制备”选项卡制备预混液，其中包含：（a）细胞提取物（占总反应体积的33%），（b）报告DNA（作为线性和/或质粒DNA），终浓度为1 nM，（c）无细胞缓冲液（PEG8000，AA溶液和能量溶液），以及（d）K-glu至终浓度为80 mM。
- 对于 10.5 μL 的反应体积，取 1.05 μL（总反应量为 10%）不同浓度的 Mg-glu 10x 浓缩储备液（最终浓度范围：0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15 和 20 mM），加入 9.45 μL（90% 总反应）预混液。轻轻混合。
注意：使用PCR八条管制备稀释液并与多通道移液器混合。如果需要，可以使用不同范围的Mg-glu浓度。 - 将上述反应的 10 μL 移液到 384 孔方底微孔板中，使用粘性板密封盖住它，并测量基因表达作为荧光输出。用酶标仪记录荧光数据（例如：485 nm;Em：528nm）在30°C下定期（例如5分钟）孵育8小时，以307cpm连续轨道振荡。
注意：如果需要，在开始数据采集之前旋转384孔微孔板（<2，500 x g ，1分钟，室温）。终点测量用于比较不同缓冲液组合物中的GFP表达。荧光值可以转换为标准化单位进行绘图（见下文）。 - 确定在终点产生最高荧光值的Mg-glu浓度。
注意：如果不确定获得的最佳Mg-glu浓度，请以更多样化的浓度范围重复步骤3.2。 - 使用优化的 Mg-glu 浓度，使用步骤 3.2 中指示的相同体积对一系列浓度（20、40、60、80、100、120、140、160、180、200、220 和 240 mM）进行 K-glu 校准。运行实验并从测试的K-glu浓度中鉴定出最高的荧光值。这表明该裂解物的Mg-glu和K-glu的最佳缓冲液组成。
注意：如果不确定获得的最佳K-glu浓度，请以更多样化的浓度范围重复该步骤。 - 一旦确定了Mg-glu和K-glu值，根据获得的批次体积准备优化缓冲液组合物的储备管。使用 补充文件1中的“缓冲液制备”选项卡计算所需的缓冲液管数量，每管38 μL，并储存在-80°C。
4. 线性DNA制备
注意：对于裂解物校准，使用质粒P70a-deGFP。将该质粒保存在大肠杆菌KL740 cl857+（表6）中，用于使用质粒小型制备试剂盒进行小型制备，或使用最大质粒试剂盒进行maxiprep。使用表7和表8中列出的引物和模板对在无细胞反应中用作表达模板的线性DNA片段进行PCR扩增。
- 使用DNA聚合酶和 表7中列出的寡核苷酸引物从质粒P70a-deGFP进行PCR扩增。根据制造商的方案，使用热循环仪程序，在50μL体积中设置PCR反应：[98°C2分钟;40次循环x（98°C持续30秒→66°C持续30秒→72°C持续60秒）;72°C持续10分钟;4°C为∞]。
- 通过每 50 μL PCR 反应加入 1 μL DpnI 限制性内切酶来消化 PCR 反应中的模板 DNA，并在 37 °C 下孵育 1 小时。接下来，使用PCR和DNA净化试剂盒纯化PCR反应，并在无核酸酶水中洗脱。
- 使用前在1%琼脂糖凝胶（1x TAE）上验证PCR产物。
- 使用Nanodrop（ND-1，000）定量纯化的PCR产物（或质粒制备）。
注意：如果使用与下游无细胞反应直接相容的DNA聚合酶/缓冲液，则可以完全跳过纯化步骤（步骤2），并通过使用DNA结合染料的荧光测定法测量未纯化的DNA的浓度（参见Batista等人10）。
5. 实验执行
注意：除了使用 补充文件1校准制备的每个裂解物批次的缓冲液储备液（上文）外，建议使用文件中的“反应制备”选项卡来设置后续的无细胞反应。与以前一样，每次反应的反应体积设置为10.5 μL，其中只有10 μL最终移液到384孔板中进行数据采集。在这里，每个模板的5 nM用于无细胞表达。移液反应时保持一致很重要 - 使用相同的移液器和吸头类型。小心分配，以避免孔中的任何气泡或任何液体粘在井壁上。如果需要，旋转板（<2，500 x g ，1分钟，室温）。
- 通过将每个样品所需的样品描述和重复次数输入 补充文件1的“反应制备”选项卡来计算移液体积。
注意：如果需要 10.5 μL 以外的反应体积，也可以将其输入 到补充文件 1 中。该文件将计算先前优化的缓冲液储备液的管数和要在冰上解冻的细胞提取物管的数量。 - 标记用于最佳预混液制备的 1.5 mL 微管（分别用于线性和质粒 DNA），加入正确体积的缓冲液和裂解物，然后轻轻混合。
注意：由于缓冲液中最佳K-glu浓度的差异，应制作“反应制备”选项卡的副本，以分别用于线性和质粒DNA。 - 首先移取DNA样品，然后是无核酸酶水，最后是步骤5.2中的最佳预混液（MM）。在加入酶标仪之前，用移液器轻轻混合无细胞反应，避免任何气泡。
注意：使用PCR八条管混合反应体积以进行额外的重复。例如，如果打算进行技术一式三份，则准备用于四个反应的混合物，并在管中留下一个死体积，以减少将样品添加到板中的移液错误。 - 在酶标仪中设置反应（例如485 nm;Em 528 nm）。动力学运行以固定间隔（例如5分钟）记录荧光数据，在30°C孵育8小时，以307cpm连续振荡轨道。
注意：终点测量报告为8小时时间点。收集的荧光值以任意单位（a.u.）为单位，但可以转换为标准化单位进行绘图（见下文）。
6. FITC与GFP的相对量化
注意：GFP表达由酶标仪以任意荧光单位（a.u.）导出。但是，建议使用标准化的测量单位来比较不同设置（批次、设备、用户和实验室）之间的荧光值。这里介绍的是使用NIST-FITC和重组eGFP的标准曲线将荧光值（a.u.）转换为FITC等效值和eGFP（μM）值的详细步骤。将NIST-FITC储备溶液储存在4°C，并将重组eGFP储存在-20°C。 确保储备溶液和连续稀释液避光。交付时，建议将重组eGFP等分到较小的体积中，以避免多次冻融循环。
- 制备100mM硼酸钠溶液，pH 9.5，并在室温或4°C下储存。
- 使用硼酸钠溶液从 50 μM 原液中为标准曲线准备 12 种稀释液（每次 70 μL），每步 2 次（50、25、12.5、6.25、3.125、1.562、0.781、0.390、0.195、0.097、0.048 和 0 μM）NIST 可追溯 FITC 标准品。准备稀释系列一式三份。
- 与步骤6.2类似，使用硼酸钠溶液（1.2、0.3、0.075、0.0188、0.0047、0.0012、0.，0003、0.，00007和0μM）从重组eGFP制备连续稀释液（每个70μL）。对于摩尔浓度计算，请考虑蛋白质的全尺寸 （28 kDa） 和纯化的 eGFP 浓度 （1 g/L）。准备稀释系列一式三份。
- 将 20 μL 的每种稀释液（每个 9 个孔 = 三个稀释液系列 x 三个技术重复）加入 384 孔方底微孔板中，用粘性板密封覆盖，并在酶标器中孵育以进行测量。
注意：此处使用的设置是激励：485/20，发射：528/20，增益50。但是，其他波长/增益组合也可用于校准其他荧光分子和/或增益设置。为了计算转换因子，需要相同的波长和增益设置来获取无细胞实验中的GFP荧光数据和标准曲线数据。 - 使用线性信号范围（例如，此处的 [FITC] ≤ 0.781 μM）来拟合每个条件的斜率 [y = ax 和 R2]。
注意：对于所使用的不同机器和标准解决方案，范围可能有所不同。 - 按照 表 9 中的示例保存 FITC 和 eGFP 校准的数据，以计算实验室的相对测量值。将以荧光任意单位（a.u.）获得的值除以曲线斜率“a” 值（y = ax），以FITC或eGFP估计GFP产生。
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Representative Results
此处显示了裂解物的代表性结果，分别针对线性和质粒DNA获得最佳Mg-谷氨酸和K-谷氨酸水平（图1）。ΔrecB 和 ΔrecBCD 提取物在 8 mM 时的 Mg-谷氨酸最佳浓度相似（图 1B）。然而，质粒DNA的最佳K-谷氨酸浓度为140mM，而同一提取物的线性DNA的最佳K-谷氨酸浓度为20mM（图1C）。在WT和ΔrecBCD 细胞提取物中GFP表达的比较分析中，发现提取物的缓冲液组成必须经过专门校准，以实现核酸外切酶V删除提取物中使用的线性和质粒DNA的最佳表达。
校准步骤后，比较WT和ΔrecBCD提取物中线性和质粒DNA（5 nM）的GFP表达水平（图1D）。线性DNA的GFP表达量分别达到ΔrecB和ΔrecBCD菌株提取物中质粒DNA表达量的102%和138%。总之，这些结果表明，当从这种突变体制备细胞裂解物并且针对线性DNA专门校准无细胞缓冲液时，使用天然大肠杆菌σ70启动子的线性DNA表达可以达到与质粒表达相同的水平。
图 1：ΔrecB/ΔrecBCD 提取物中线性和质粒 DNA 的差异缓冲液优化。 （A）从质粒p70a-deGFP扩增1361 bp线性DNA扩增子，并用作用于缓冲液校准的基因表达模板。（B）使用0至20mM的不同浓度（K-谷氨酸固定在80mM）的每种DNA类型使用1nM进行镁谷氨酸缓冲液校准。方框表示选择的集中点。P = 质粒 DNA，L = 线性 DNA。（C）在为每种裂解物选择最佳Mg-谷氨酸浓度后，将K-谷氨酸从20滴定至240mM。方框表示选择的集中点。P = 质粒 DNA，L = 线性 DNA。热图（B）和（C）中显示的数据来自单个实验。（D）缓冲液校准后，用每种DNA类型的5nM进行无细胞反应。提取物BL21 Rosetta2不支持线性DNA表达，而来自ΔrecB和ΔrecBCD菌株的差异优化提取物表现出类似于质粒DNA（蓝色）水平的线性DNA（绿色）表达。所示的终点数据是同一天进行的三次重复的平均±SD，并在孵育8小时后收集。请点击此处查看此图的大图。
图 2：协议的可视化表示。 细胞裂解物制备和裂解物优化的工作流程，用于线性DNA作为CFPS合成的模板。 请点击此处查看此图的大图。
表1：用于制备液体和固体2xYT+P培养基的组分列表。每种成分的数量（以克为单位）指定为 1 L 培养基。根据需要按比例扩展。介质在使用前必须高压灭菌。 请按此下载此表格。
表2：用于制备缓冲液S30A+DTT的组分列表。 每种组分的数量（以克为单位）指定为1L缓冲液S30A。根据需要按比例扩展。S30A缓冲液在使用前必须高压灭菌，然后冷却（4°C）。DTT缓冲液必须按照指示单独制备和过滤（在15 mL管中），并储存在-20°C。 在使用缓冲液 S30A 之前，将 2 mL DTT（来自 1 M 储备液）加入 1 L S30A 缓冲液中。 请按此下载此表格。
表 3：用于能量溶液制备的组件列表。 指定每种组分的数量（以克为单位）或体积（在G列中），以制备指定体积（在H列中）的指定浓度（在F列中）的储备溶液。如果需要，必须调整每种组分的pH值，如第I列和J所示（在列I和J中）。通过按所列顺序混合列出的每种组分（在K列中）的体积来制备14x能量溶液储备。 请按此下载此表格。
表4：制备氨基酸储备溶液的组分列表。 为了制备4x氨基酸储备溶液，必须按所列顺序混合所有氨基酸。 请按此下载此表格。
表 5.用于制备裂解液校准溶液的组分列表。 指定Mg-谷氨酸和K-谷氨酸储备溶液的量（以克为单位），以制备50mL的每种缓冲液的指定浓度。 请按此下载此表格。
表6：本协议中使用的细菌菌株列表。请按此下载此表格。
表7：本协议中使用的引物列表。请按此下载此表格。
表8：本协议中用于裂解物校准的质粒，并作为PCR线性DNA扩增的模板。请按此下载此表格。
表9：FITC和eGFP转换。请按此下载此表格。
补充文件 1.请点击此处下载此文件。
补充图1。请点击此处下载此文件。
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Discussion
在这里，我们表明由大肠杆菌BL21 Rosetta2制备的细胞裂解物具有recB或recBCD操纵子的基因组敲除，支持来自线性DNA模板的高蛋白表达。该协议详细阐述了特定于线性DNA模板的分步裂解物校准程序（图2），这是导致线性DNA中σ70启动子高表达的关键步骤，达到等摩尔DNA浓度的接近质粒水平。该协议强调了根据最终应用中使用的DNA（线性或质粒）类型进行缓冲液校准的重要性。
该方案可以帮助避免质粒克隆，从而显著节省时间和成本。线性DNA片段可以由商业提供者合成和/或在实验室中通过PCR扩增。考虑到克隆、序列验证和 DNA 制备步骤10，使用质粒 DNA 的相同过程至少需要 1 周时间。建议制备大量的细胞提取物和线性DNA模板，以尽量减少实验之间的批次间差异14，15。
该方法已被证明是稳健的，并在实验室中使用10。这些提取物的结果在生物重复、不同提取物批次以及不同菌株背景中是一致的10。该方案的稳健性也在不同的实验参数中进行了测试：细胞裂解方法、温度、DNA 模板和不同的 DNA 浓度。该方法已用于两种相关应用的遗传构建体的快速筛选和表征：脚趾开关文库表征和酶活性筛选10。
尽管在这项研究中，来自高产亲本菌株 BL21 Rosetta2 的 ΔrecB/ΔrecBCD 提取物中的线性 DNA 获得了高表达水平，但该方法需要对感兴趣的新菌株进行基因组工程。相比之下，补充线性DNA的保护剂，如GamS 5或Chi DNA6，更容易申请新菌株，但更昂贵，更耗时。
此处提供的协议将促进在无细胞系统中使用线性DNA模板，并加快合成生物学界的设计-构建-测试周期。 ΔrecB/ΔrecBCD 提取物中线性 DNA 模板更容易的无细胞表达可用于生产目标小分子、生物仿制药和其他按需即时应用。
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Disclosures
没有
Acknowledgments
ACB和JLF承认ANR SINAPUV赠款（ANR-17-CE07-0046）的资金支持。JLF和JB承认ANR SynBioDiag拨款（ANR-18-CE33-0015）的资金支持。MSA和JLF承认ANR iCFree拨款（ANR-20-BiopNSE）的资金支持。JB承认ERC的支持，从“COMPUCELL”（授权号657579）开始。生物化学结构中心感谢法国综合结构生物学基础设施（FRISBI）（ANR-10-INSB-05-01）的支持。MK感谢INRAe的MICA部门，巴黎萨克雷大学，法兰西岛（IdF）地区的DIM-RFSI和ANR DREAMY（ANR-21-CE48-003）的资金支持。这项工作得到了欧洲研究理事会整合者奖（CLB 865973）的资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-YT Broth | Invitrogen | 22712020 | |
| 1.5 mL Safe-Lock tubes | Eppendorf | 30120086 | 1.5 mL microtube |
| 384-well square-bottom microplate | Thermo Scientific Nunc | 142761 | |
| 3PGA (D-(-)-3-Phosphoglyceric acid disodium) | Sigma-Aldrich | P8877 | |
| adhesive plate seal | Thermo Scientific Nunc | 232701 | |
| Agar | Invitrogen | 30391023 | |
| ATP (Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate) | Sigma-Aldrich | A8937 | |
| BL21 Rosetta2 | Merck Millipore | 71402 | |
| BL21 Rosetta2 ΔrecB | Addgene | 176582 | |
| BL21 Rosetta2 ΔrecBCD | Addgene | 176583 | |
| cAMP (Adenosine 3' 5'-cyclic monophosphate) | Sigma-Aldrich | A9501 | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | |
| CoA (Coenzyme A hydrate) | Sigma-Aldrich | C4282 | |
| Corning 15 mL PP Centrifuge Tubes, Rack Packed with CentriStar Cap, Sterile | Corning | 430790 | 15 mL tube |
| Corning 50 mL PP Centrifuge Tubes, Conical Bottom with CentriStar Cap, Sterile | Corning | 430828 | 50 mL tube |
| CTP (Cytidine 5'-triphosphate, disodium salt hydrate) | Alfa Aesar | J62238 | |
| DpnI | NEB | R0176S | |
| DTT (DL-Dithiothreitol) | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| Folinic acid (solid folinic acid calcium salt) | Sigma-Aldrich | F7878 | |
| GTP (Guanosine 5?-Triphosphate, Disodium Salt) | Sigma-Aldrich | 371701 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| K phosphate dibasic (K2HPO4) | Carl Roth | 231-834-5 | |
| K phosphate monobasic (H2KO4P) | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| K-glutamate | Alfa Aesar | A17232 | |
| Mg-glutamate | Sigma-Aldrich | 49605 | |
| Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm, polyethersulfone | Merck Millipore | SLGP033RB | membrane filter 0.22 µm |
| Monarch PCR & DNA Cleanup Kit | NEB | T1030S | PCR & DNA cleanup Kit |
| Monarch Plasmid Miniprep Kit | NEB | T1010S | Plasmid Miniprep Kit |
| NAD (B-nicotinamide adenine dinucleotide hydrate) | Sigma-Aldrich | N6522 | |
| NIST-traceable FITC standard | Invitrogen | F36915 | NIST-FITC |
| NucleoBond Xtra Maxi kit | Macherey-Nagel | 740414.1 | Plasmid Maxiprep Kit |
| PEG 8000 | Sigma-Aldrich | 89510 | |
| plate reader | Biotek | Synergy HTX | |
| Purified Recombinant EGFP Protein | Chromotek | egfp-250 | recombinant eGFP |
| Q5 High-Fidelity 2X Master Mix | NEB | M0492S | DNA polymerase |
| Q5 High-Fidelity 2X Master Mix | New England Biolabs | M0492L | DNA polymerase |
| Qubit dsDNA BR Assay Kit | Thermo | Q32850 | fluorometric assay with DNA-binding dye |
| RTS Amino Acid Sampler | biotechrabbit | BR1401801 | |
| Spermidine | Sigma-Aldrich | 85558 | |
| Sterile water | Purified water from the Millipore RiOs 8 system, sterilized by autoclaving. | ||
| Tris base | Life Science products Cytiva | 17-1321-01 | |
| tRNA | Roche | 10109550001 | |
| Ultrasonic processor Vibra cell VC-505 | SONICS | VC505 | sonicator |
| UTP Na3 (Uridine 5'- triphosphate, trisodium salt hydrate) | Acros Organics | 226310010 | |
| Water, nuclease-free | Thermo | R0581 | nuclease-free water |
References
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