Lineer DNA Şablonlarını Kullanarak Ekzonükleaz Eksikliği Olan Hücresel Ekstraktlardan Hücresiz Protein Sentezi

Summary

Burada sunulan, Escherichia coli BL21 Rosetta2'nin (ΔrecBCD ve ΔrecB) ekzonükleaz V nakavt suşlarından hücre ekstraktlarının hazırlanması ve tampon kalibrasyonu için bir protokoldür. Bu, lineer DNA şablonlarını kullanarak hücresiz protein sentez sistemlerinde ekspresyon için hızlı, kolay ve doğrudan bir yaklaşımdır.

Abstract

Hücresiz protein sentezi (CFPS), sayısız avantajı nedeniyle sentetik biyoloji alanında son zamanlarda çok popüler hale gelmiştir. CFPS için lineer DNA şablonlarının kullanılması, klonlama, transformasyon ve plazmid ekstraksiyonu adımlarını ortadan kaldırarak deneysel süreyi azaltarak teknolojinin tam potansiyeline ulaşmasını sağlayacaktır. Lineer DNA, şablonun yüksek konsantrasyonlarını elde etmek için PCR ile hızlı ve kolay bir şekilde çoğaltılabilir, böylece potansiyel in vivo ekspresyon toksisitesi önlenir. Bununla birlikte, lineer DNA kalıpları hücre ekstraktlarında doğal olarak bulunan ekzonükleazlar tarafından hızla parçalanır. Bu problemin üstesinden gelmek için, nükleaz inhibitörlerinin eklenmesi veya korunma için lineer DNA uçlarının kimyasal modifikasyonu gibi önerilen birkaç strateji vardır. Tüm bu stratejiler ekstra zamana ve kaynaklara mal olur ve henüz plazmid protein ekspresyonu seviyelerini elde edememiştir. CFPS için lineer DNA kalıplarını kullanmak için alternatif bir strateji için ayrıntılı bir protokol burada sunulmuştur. Ekzonükleaz eksikliği olan nakavt hücrelerinden hücre ekstraktlarını kullanarak, lineer DNA şablonları herhangi bir son modifikasyon gerektirmeden bozulmadan kalır. Özellikle lineer DNA için Mg-glutamat (Mg-glu) ve K-glutamat (K-glu) için sonikasyon lizisi ve tampon kalibrasyonu ile Escherichia coli BL21 Rosetta2 ΔrecBCD suşundan hücre lizatının hazırlık adımlarını sunuyoruz. Bu yöntem, E. coli CFPS'deki plazmid DNA'sından elde edilenle karşılaştırılabilir protein ekspresyon seviyelerine ulaşabilir.

Introduction

Hücresiz protein sentezi (CFPS) sistemleri, biyosensör mühendisliği, merkezi olmayan üretim ve genetik devrelerin prototiplenmesi için hızlı, basit ve verimli bir yöntem olarak giderek daha fazla kullanılmaktadır¹. CFPS sistemleri büyük potansiyelleri nedeniyle sentetik biyoloji alanında düzenli olarak kullanılmaktadır. Bununla birlikte, şimdiye kadar CFPS sistemleri, teknolojinin tam potansiyeline ulaşmasını sınırlayabilen dairesel plazmidlere dayanmaktadır. Plazmid DNA'sının hazırlanması, klonlama sırasında birçok zaman alıcı adıma ve büyük miktarda DNA izolasyonuna bağlıdır. Öte yandan, bir plazmidden veya sentezlenmiş bir DNA şablonundan PCR amplifikasyonu, CFPS şablonlarını birkaç saat içinde hazırlamak için kullanılabilir ^2,3. Bu nedenle, lineer DNA uygulaması CFPS için umut verici bir çözüm sunmaktadır. Bununla birlikte, lineer DNA, hücresel ekstraktlarda doğal olarak bulunan ekzonükleazlar tarafından hızla parçalanır⁴. λ-faj GamS proteini^5'i veya Chi bölgeleri^6'yı içeren DNA'yı koruyucu ajanlar olarak kullanmak veya uçlarının kimyasal modifikasyonu ile doğrusal ^DNA'yı doğrudan korumak gibi bu sorunu ele alan çözümler vardır ^2,7,8,9. Tüm bu yöntemler, pahalı ve zaman alıcı olan hücre ekstraktına takviyeler gerektirir. Ekzonükleaz V kompleksinin (RecBCD) hücre lizatlarındaki lineer DNA'yı bozduğu uzun zamandır bilinmektedir⁴. Son zamanlarda, lineer DNA'nın, ekzonükleaz genleri (recBCD)¹⁰ için nakavt edilen hücrelerden lizatlarda çok daha iyi korunabileceğini gösterdik.

Bu protokolde, E. coli BL21 Rosetta2 ΔrecBCD suşundan sonikasyon lizisi ile hücresiz lizatların hazırlanması için adımlar ayrıntılı olarak açıklanmaktadır. Sonication lizis birkaç laboratuar tarafından kullanılan yaygın ve uygun fiyatlı bir tekniktir^11,12. Bu suştan üretilen ekstraktlar, lineer DNA kalıplarından gelen ifadeyi desteklemek için herhangi bir ekstra bileşenin veya DNA kalıbı modifikasyonunun eklenmesine ihtiyaç duymaz. Yöntem, özellikle yerli E. coli promotörlerinden doğrusal DNA ekspresyonu için hücre ekstraktları için tampon optimizasyonunun temel adımına dayanır. Lineer DNA ekspresyonu için bu spesifik tampon optimizasyonunun, yerel σ70 promotörlerinin GamS proteini veya Chi DNA takviyesi olmadan yüksek protein üretimi sağlaması için anahtar olduğu, hatta PCR ürünlerinin saflaştırılmasından kaçındığı gösterilmiştir¹⁰. Lineer DNA ekspresyonu için optimal Mg-glu konsantrasyonunun, plazmid DNA'sına benzer olduğu bulunmuştur. Bununla birlikte, optimal K-glu konsantrasyonu, muhtemelen transkripsiyonla ilgili bir mekanizma^10'dan dolayı doğrusal ve plazmid DNA'sı arasında önemli bir fark göstermiştir. Bu yöntem kullanılarak ifade edilen proteinlerin işlevselliği, ayak parmağı anahtarlarının hızlı bir şekilde taranması ve enzim varyantlarının aktivite değerlendirmesi¹⁰ gibi çeşitli uygulamalar için gösterilmiştir.

Bu protokol, sadece mutant ΔrecBCD hücre ekstraktlarını ve lineer DNA için spesifik kalibrasyonu şablon olarak kullanarak E. coli hücresiz sistemlerde lineer DNA şablonlarını kullanmak için basit, verimli ve uygun maliyetli bir çözüm sunar.

Protocol

1. Ortam ve tampon hazırlama

1. 2xYT+P ortamının hazırlanması (katı ve sıvı)
   1. Sıvı ve katı maddeleri Tablo 1'de açıklandığı gibi hazırlayın ve ardından otoklavlama ile sterilize edin.
      NOT: Bu protokol, kloramfenikol (10 μg / mL) içeren bir adet 2xYT + P agar plakası gerektirir. Sıvı ortamın hacmi, gerekli lizatın hacmi ile orantılıdır. Burada, 5 L sıvı 2xYT + P ortamın başlangıç hacmi kullanılır. Bununla birlikte, hücre kültürünün 1 L'sinin nihai hücre lizatının 2 ila 3 mL'si ile sonuçlandığını bilerek hacim gerektiği gibi ayarlanabilir.
2. Kloramfenikol hazırlanması (34 mg/mL)
   1. 0.34 g kloramfenikol ağırlığında, 10 mL'ye etanol ekleyin ve karıştırarak çözün. Aliquot 1 mL her biri birkaç tüp halinde ve daha sonra kullanmak üzere -20 ° C'de saklayın.
3. S30A tamponunun hazırlanması
   1. S30A tamponunu Tablo 2'ye göre hazırlayın ve bu tamponun 2 L'sini hedefleyin.
      NOT: Bir kez daha, bu arabelleğin hacmi, gerekli lizatın hacmiyle orantılıdır.
   2. Otoklavlamadan önce, buzul asetik asit kullanarak tamponun pH'ını 7,7'ye ayarlayın.
   3. Arabelleği otoklav edin.
   4. Otoklavlamadan sonra bu tamponu 4 °C'de tutun.
   5. Kullanmadan önce, 2 mM'lik son konsantrasyona (2 mL stok 1 M DTT ila 1 L S30A tamponu) ulaşmak için S30A tamponuna DTT (0,22 μm membran filtre ile filtrelenmiş) ekleyin.
      NOT: Bir kez daha, bu arabelleğin hacmi, gerekli lizatın hacmiyle orantılıdır.
4. Enerji çözeltisinin hazırlanması
   NOT: Bu enerji çözümü, Sun et al. paper^{13'e (14x} stok konsantrasyonu) dayanmaktadır. Tablo 3, enerji çözeltisi stoğunun hazırlanması için gerekli bileşenleri, bu protokolde kullanılan tüm kimyasalların katalog numaralarıyla özetlemektedir.
   1. Stok çözeltilerini Tablo 3'e göre hazırlayın ve buz üzerinde tutun.
   2. Tablo 3'te belirtildiği gibi Tris tamponu 2 M (250 mL steril su hacminde 60,57 g Tris baz) veya %15 KOH (100 mL steril su hacminde 15 g KOH) ile belirtilen bileşenler için istenen pH değerini kalibre edin.
   3. 15 mL'lik bir tüpte, her bileşenin hacmini Tablo 3'te belirtilen sırayla ekleyin.
   4. Aliquot enerji çözeltisi, tüp başına 150 μL.
   5. Alikotları kuru buz üzerinde flaşla dondurun ve -80 ° C'de saklayın.
5. Amino asit (AA) çözeltisinin hazırlanması
   NOT: Amino asit çözeltisi, RTS Amino Asit Örnekleyici kiti tarafından hazırlanır. Bu kitte 20 amino asidin her biri, 140 mM'de bulunan lösin hariç, 168 mM'de 1.5 mL hacim olarak sağlanır. Burada, hazırlanan stok çözeltisi, gerekli çalışma çözeltisi yerine 4x konsantredir. Amino asit çözeltisinin nihai konsantrasyonu, 5 mM'de olan lösin hariç, tüm amino asitler için 6 mM'dir.
   1. 20 amino asit tüpünü vorteks yaparak çözün ve tamamen çözünene kadar 37 ° C'de inkübe edin.
      NOT: Cys tamamen erimeyebilir.
   2. 50 mL'lik bir tüpte, Tablo 4'te belirtilen sırayla 12 mL steril su ve amino asitlerin her birine 1,5 mL ekleyin.
   3. Çözelti oldukça berrak olana kadar vorteks, gerekirse 37 ° C'de inkübe edilir.
      NOT: Cys tamamen erimeyebilir.
   4. Aliquot 500 μL buz üzerinde tüp başına amino asit çözeltisi.
   5. Alikotları kuru buz üzerinde flaşla dondurun ve -80 ° C'de saklayın.
6. Tampon kalibrasyonu için çözeltilerin hazırlanması
   1. Stok çözeltisini Tablo 5'te belirtildiği gibi Mg-glu (100 mM) ve K-glu (3 M) için hazırlayın. Kalibrasyon adımları için Ek Dosya 1'de belirtildiği gibi Mg-glu (0 ila 20 mM) ve K-glu (20 ila 300 mM) için bu stoklardan seri seyreltme ( 1 mL hacimde) yapın.
      NOT: Bu stok konsantrasyonları kalibrasyon adımı içindir ve son deneyi kurarken değiştirilmesi gerekebilir. Bu protokol için test edilen stokların en yüksek konsantrasyonları, Mg-glu ve K-glu için sırasıyla 1 M ve 4.5 M'dir.
7. PEG8000 çözelti stoğunun hazırlanması
   1. 50 mL% 40 PEG8000 çözeltisi hazırlayın (50 mL steril su hacminde 20 g PEG8000).

2. Hücre kültürü ve lizat hazırlama (4 günlük deney)

1. 1. Gün
   1. Streak suşu BL21 Rosetta2 ΔrecBCD (Tablo 6) -80 °C gliserol stoğundan 10 μg / mL kloramfenikol içeren 2xYT + P agar plakasına kadar. Alternatif olarak, BL21 Rosetta2 ΔrecB (Tablo 6) da kullanılabilir¹⁰.
   2. Gece boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
2. 2. Gün
   1. Yukarıdaki agar plakasından tek bir koloniyi, 10 μg / mL kloramfenikol ile desteklenmiş 10 mL 2xYT + P'ye aşılayın.
   2. 200 rpm sallama ile 37 ° C'de gece boyunca inkübe edin.
3. 3. Gün
   1. Gece kültürünü 100 kez 10 μg / mL kloramfenikol içeren 4 L taze 2xYT + P ortama seyrelterek bir alt kültür yapın.
      NOT: Örneğin, 3960 mL taze ortama 40 mL gecelik kültür eklenir. Seyreltmeden sonra, 4 L ortam 4 şişeye (5 L hacim) bölünür, böylece her şişe 1 L içerir.
   2. 1.5-2.0'lık bir OD 600'e ulaşmak için yaklaşık 3 ila 4 saatlik büyüme için 37 ° C,₂₀₀ rpm'de inkübe edin. OD_{600 > 0,8} ölçülüyorsa kültürü 4 kat seyreltin.
      NOT: Tam inkübasyon süresi gerinim, ilk inokulum, laboratuvar yazılımı ve kullanılan aletlere göre değişebilir. ΔrecB / ΔrecBCD nakavt suşları, BL21 Rosetta2 ebeveyni ile karşılaştırılabilir büyüme oranlarına sahiptir (Ek Şekil 1).
   3. Kültürü buza koyun.
   4. Hücreleri 5.000 x g'de 4 ° C'de 12 dakika boyunca döndürün ve ardından dekantı boşaltarak atın.
   5. Hücre peletlerini 800 mL soğutulmuş S30A+DTT içinde yeniden askıya alın.
      NOT: S30A+DTT'nin hacmi, orijinal hücre kültürü hacminden 5 kat daha azdır. Örneğin, hücre kültürünün 1 L'lik bir başlangıç hacmi için, hücre peletlerini 200 mL S30A + DTT'de yeniden askıya alın. Bu adımın 4 ° C'de soğuk bir odada yapılması ve tüm malzemelerin buz üzerinde tutulması da önerilir.
   6. Hücreleri 5.000 x g'de 4 ° C'de 12 dakika boyunca döndürün ve ardından dekantı boşaltarak atın.
   7. 2.3.5 ve 2.3.6 numaralı adımları yineleyin.
   8. Hücre peletlerini 160 mL soğutulmuş S30A+DTT'de yeniden askıya alın.
      NOT: Bu kez S30A+DTT'nin hacmi, orijinal hücre kültürü hacminden 25 kat daha azdır. Örneğin, hücre kültürünün 1 L'lik bir başlangıç hacmi için, hücre peletlerini 40 mL S30A + DTT'de yeniden askıya alın. Yine, bu adımın 4 ° C'de soğuk bir odada yapılması ve malzemelerin buz üzerinde tutulması önerilir.
   9. Hücreleri soğutulmuş ve önceden tartılmış 50 mL tüplere aktarın.
   10. Hücreleri 4 ° C'de 8 dakika boyunca 2.000 x g'de döndürün ve ardından dekantı boşaltarak atın.
   11. Hücreleri 4 ° C'de 4 dakika boyunca 2.000 x g'de döndürün ve ardından bir pipet kullanarak kalan süpernatantı dikkatlice çıkarın.
   12. Hücre peletinin ağırlığını hesaplamak için tüpün ağırlığını yeniden ölçün.
   13. Hücre peletlerini -80 °C'de tutun.
4. 4. Gün
   1. Hücre peletlerini -80 ° C'den alın ve 1-2 saat boyunca buz üzerinde çözün.
   2. Hücre peletlerini, pelet ağırlığının gramı başına 0,9 mL S30A+DTT tamponunda yeniden askıya alın. Hücreleri yeniden askıya almak için yavaşça pipet çekin, varsa üst köpükten mümkün olduğunca kaçının.
   3. Yeniden askıya alınan hücrelerin 1 mL'lik alikotlarını 1,5 mL mikrotüplere yerleştirin ve bunları 4 ° C'de buz veya önceden soğutulmuş bir soğuk blok üzerinde tutun (metal blokların kullanılması tercih edilir).
      NOT: Son aliquot 1 mL'den çok daha azsa, optimal olmayan bir hacmi sonikleştirmekten ziyade atmak daha iyidir. Sonikasyon için en uygun ses seviyesi (1 mL) bu kurulum (tüp, sonikatör ve prob) için belirlenmiştir ve farklı bir kurulum için değişebilir.
   4. Üç döngü için% 20 genlik kurulumu ile (3 mm prob, frekans 20 kHz) her tüpü bir sonikatörde (30 s sonikasyon, 1 dakikalık duraklama) sonikleştirin.
      NOT: Üç döngü boyunca verilen toplam enerji ~ 266 Joule (döngü başına ~ 80-110 Joule) idi. Bu adım sırasında, tüpleri buzla çevrili soğuk blokta tutun. Probun aşırı ısınmasını önlemek için iki soğuk blok arasında geçiş yapın (beklemedeki soğuk blok da buz üzerinde soğuk tutulur). Her iki soğuk blok da sonikasyondan bir gün önce buzdolabında önceden soğutuldu.
   5. Lisatı 4 ° C'de 10 dakika boyunca 12.000 x g'de döndürün.
   6. Süpernatantı (hücre lizat) bir pipetle toplayın ve 50 mL'lik bir tüpe aktarın.
   7. Hücre lizatını 37 ° C'de 200 rpm ajitasyonda 80 dakika boyunca inkübe edin.
   8. Lisatı 4 ° C'de 10 dakika boyunca 12.000 x g'de döndürün.
   9. Tüm tüpleri buz üzerinde tutarken, her biri önceden soğutulmuş 1,5 mL mikrotüplerde süpernatant ve aliquot 30 μL'yi toplayın.
   10. Lisat alikotlarını kuru buz üzerinde flaşla dondurun ve -80 ° C'de saklayın.

3. Lineer DNA için hücresiz tampon kalibrasyonu

NOT: Hücresiz tampon, Sun ve ^ark.13'te açıklandığı gibi optimal Mg-glu ve K-glu konsantrasyonları için kalibre edilmiştir. Kalibrasyon adımları için Ek Dosya 1 gereklidir. Reaksiyonlar her biri 10.5 μL'lik bir son hacme ayarlandı. Ekstraktlar 1 nM lineer (aşağıdaki bölüm 4'e bakınız) veya plazmid DNA kullanılarak kalibre edildi. Deneyler, tamponların hazırlandığı gün yapılabilir veya hazırlanan tamponlar -80 °C'de dondurularak deneyi başka bir günde gerçekleştirebilir. Tüm kalibrasyon adımları için, her bir bileşen 384 delikli bir plakaya karıştırılmadan ve pipetlenmeden önce buz üzerinde çözüldü.

1. Excel dosyası Ek Dosya 1'deki 'Tampon Hazırlama' sekmesine göre, aşağıdakileri içeren bir Ana Karışım hazırlayın: (a) hücre ekstraktı (toplam reaksiyon hacminin% 33'ü), (b) raporlayıcı DNA (doğrusal ve / veya plazmid DNA'sı olarak) 1 nM'lik bir nihai konsantrasyona, (c) hücresiz tampon (PEG8000, AA çözeltisi ve enerji çözeltisi) ve (d) K-glu 80 mM'lik bir nihai konsantrasyona.
2. 10.5 μL'lik bir reaksiyon hacmi için, farklı konsantrasyonlarda Mg-glu 10x konsantre stoklarından (nihai konsantrasyon aralıkları: 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 ve 20 mM) 1.05 μL (% 10 toplam reaksiyon) alın ve Master Mix'in 9.45 μL'sini (% 90 toplam reaksiyon) ekleyin. Yavaşça karıştırın.
   NOT: Dillüzyonları hazırlamak için PCR sekiz şeritli tüpler kullanın ve çok kanallı pipetle karıştırın. Gerekirse, farklı bir Mg-glu konsantrasyonu aralığı kullanılabilir.
3. Yukarıdaki reaksiyonların 10 μL'sini 384 kuyucuklu kare tabanlı bir mikro plakaya pipetleyin, yapışkan bir plaka contası kullanarak örtün ve floresan çıkışı olarak gen ekspresyonunu ölçün. Floresan verilerini bir plaka okuyucu ile kaydetme (Ör. 485 nm; Em: 528 nm) düzenli aralıklarla (örneğin, 5 dakika) 30 ° C'de 8 saatlik inkübasyon için 307 cpm'de sürekli yörüngesel sarsıntı ile.
   NOT: Gerekirse, veri toplamaya başlamadan önce 384 delikli mikro plakayı (<2.500 x g, 1 dakika, oda sıcaklığı) aşağı doğru döndürün. Farklı tampon bileşimlerindeki GFP ekspresyonunu karşılaştırmak için son nokta ölçümleri kullanıldı. Floresan değerleri, çizim için standartlaştırılmış birimlere dönüştürülebilir (aşağıya bakınız).
4. Son noktada en yüksek floresan değeri ile sonuçlanan Mg-glu konsantrasyonunu tanımlayın.
   NOT: Elde edilen optimal Mg-glu konsantrasyonundan emin değilseniz, adım 3.2'yi daha çeşitli konsantrasyon aralıklarıyla tekrarlayın.
5. Optimize edilmiş Mg-glu konsantrasyonu ile, adım 3.2'de belirtilen hacimleri kullanarak bir dizi konsantrasyon (20, 40, 60, 80, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 220 ve 240 mM) için K-glu kalibrasyonuna geçin. Deneyi çalıştırın ve test edilen K-glu konsantrasyonları arasından en yüksek floresan değerini belirleyin. Bu, bu lizat için Mg-glu ve K-glu için en uygun tampon bileşimini gösterir.
   NOT: Elde edilen optimum K-glu konsantrasyonundan emin değilseniz, adımı daha çeşitli konsantrasyon aralıklarıyla tekrarlayın.
6. Mg-glu ve K-glu değerleri belirlendikten sonra, elde edilen parti hacmine göre optimize edilmiş tampon bileşiminin stok tüplerini hazırlayın. Gerekli tampon tüp sayısını hesaplamak için Ek Dosya 1'deki 'Tampon Hazırlama' sekmesini kullanın, tüp başına 38 μL aliquot ve -80 ° C'de saklayın.

4. Lineer DNA hazırlığı

NOT: Lisat kalibrasyonu için plazmid P70a-deGFP kullanılır. Bu plazmid, Plazmid Miniprep Kiti kullanılarak miniprep için E. coli KL740 cl857+ (Tablo 6) veya Plasmid Maxiprep Kiti kullanılarak maxiprep olarak muhafaza edilmiştir. Hücresiz reaksiyonlarda ekspresyon şablonları olarak kullanılan lineer DNA fragmanları, Tablo 7 ve Tablo 8'de listelenen primerler ve şablonlar kullanılarak PCR güçlendirildi.

1. PCR, Tablo 7'de listelenen oligo primerleri ile DNA polimeraz kullanarak plazmid P70a-deGFP'den amplifikasyon yapar. PCR reaksiyonlarını, üreticinin protokolüne göre, termosikler programını kullanarak 50 μL'lik bir hacimde ayarlayın: [2 dakika boyunca 98 °C; 40 döngü x (30 s için 98 °C → 30 s için 66 °C → 60 s için 72 °C); 10 dakika için 72 °C; ∞ için 4 °C].
2. 50 μL PCR reaksiyonu başına 1 μL DpnI kısıtlama enzimi ekleyerek PCR reaksiyonlarındaki şablon DNA'yı sindirin ve 1 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin. Daha sonra, bir PCR ve DNA temizleme kiti kullanarak PCR reaksiyonunu saflaştırın ve nükleaz içermeyen suda salın.
3. Kullanmadan önce PCR ürünlerini %1 agaroz jeli (1x TAE) üzerinde doğrulayın.
4. Nanodrop (ND-1,000) kullanarak saflaştırılmış PCR ürünlerini (veya plazmid preparatlarını) ölçün.
   NOT: Aşağı akış hücresiz reaksiyonu ile doğrudan uyumlu bir DNA polimeraz / tampon kullanılıyorsa, saflaştırma adımı (adım 2) tamamen atlanabilir ve saflaştırılmamış DNA konsantrasyonu, DNA bağlayıcı boya ile florometrik bir tahlil ile ölçülebilir (^bkz.

5. Deneysel yürütme

NOT: Hazırlanan her lizat partisi için tampon stoğunu kalibre etmek üzere Ek Dosya 1'i kullanmanın yanı sıra (yukarıda), sonraki hücresiz reaksiyonları ayarlamak için dosyadaki 'Reaksiyon Hazırlama' sekmesinin kullanılması önerilir. Daha önce olduğu gibi, reaksiyonların hacmi reaksiyon başına 10,5 μL'ye ayarlanır, bunun sadece 10 μL'si veri toplama için 384 delikli plakaya pipetlenir. Burada, hücresiz ifade için her şablonun 5 nM'si kullanılır. Reaksiyonları pipetlerken tutarlı olmak önemlidir – aynı pipeti ve uçların türünü kullanın. Kuyudaki kabarcıkların veya kuyunun duvarlarına yapışan herhangi bir sıvının önlenmesi için dikkatlice dağıtın. Gerekirse, plakayı aşağı doğru çevirin (<2.500 x g, 1 dakika, oda sıcaklığı).

1. Ek Dosya 1'in 'Reaksiyon Hazırlama' sekmesine numune başına gereken numune açıklamalarını ve replikalarını girerek pipet hacimlerini hesaplayın.
   NOT: 10,5 μL'den farklı bir reaksiyon hacmi gerekiyorsa, bu Ek Dosya 1'e de girilebilir. Dosya, daha önce optimize edilmiş tampon stoklarının tüp sayısını ve buz üzerinde çözülecek hücre ekstrakt tüplerini hesaplayacaktır.
2. Optimal Master Mix preparatı için 1,5 mL'lik bir mikrotüpü etiketleyin (lineer ve plazmid DNA için ayrı ayrı), Tampon ve Lisat'ın doğru hacimlerini ekleyin ve yavaşça karıştırın.
   NOT: Tamponlarındaki optimal K-glu konsantrasyonlarındaki farklılıklar nedeniyle, lineer ve plazmid DNA'sı için ayrı ayrı kullanılmak üzere 'Reaksiyon Hazırlama' sekmesinin kopyaları yapılmalıdır.
3. Önce DNA örneklerini pipetleyin, ardından nükleaz içermeyen su ve son olarak adım 5.2'den itibaren Optimal Master Mix (MM). Plaka okuyucuya eklemeden hemen önce hücresiz reaksiyonu pipetle nazikçe karıştırın ve kabarcıklardan kaçının.
   NOT: Ek bir çoğaltma için reaksiyon hacmini karıştırmak üzere bir PCR sekiz şeritli tüp kullanın. Örneğin, teknik üçlü dosyalar amaçlanıyorsa, dört reaksiyon için bir karışım hazırlayın ve numuneleri plakaya eklerken pipetleme hatalarını azaltmak için tüpte ölü bir hacim bırakın.
4. Plaka okuyucudaki reaksiyonları ayarlayın (Ex 485 nm; Em 528 nm). Kinetik çalışmalar, 30 ° C'de 8 saatlik inkübasyon için düzenli aralıklarla (örneğin, 5 dakika) floresan verilerini kaydetti ve 307 cpm'de sürekli yörüngesel sarsıntı yaptı.
   NOT: Son nokta ölçümleri 8 saatlik zaman noktası olarak bildirilmiştir. Toplanan floresan değerleri rastgele birimlerdedir (a.u.), ancak çizim için standartlaştırılmış birimlere dönüştürülebilirler (aşağıya bakınız).

6. FITC ve GFP bağıl nicelleştirme

NOT: GFP ifadesi, plaka okuyucu tarafından keyfi floresan ünitelerinde (a.u.) dışa aktarılır. Bununla birlikte, farklı ortamlar (partiler, ekipmanlar, kullanıcılar ve laboratuvarlar) arasındaki floresan değerlerini karşılaştırmak için standartlaştırılmış ölçü birimlerinin kullanılması önerilir. Burada, NIST-FITC ve rekombinant eGFP'nin standart eğrilerini kullanarak floresan değerlerini (a.u.) FITC eşdeğeri ve eGFP (μM) değerlerine dönüştürmek için ayrıntılı adımlar sunulmaktadır. NIST-FITC stok solüsyonunu 4 °C'de ve rekombinant eGFP'yi -20 °C'de saklayın. Stok çözeltisinin ve seri seyreltmelerin ışıktan korunduğundan emin olun. Teslimattan sonra, birden fazla donma-çözülme döngüsünü önlemek için rekombinant eGFP'nin daha küçük hacimlere ayrılması önerilir.

1. 100 mM sodyum borat, pH 9.5'lik bir çözelti hazırlayın ve oda sıcaklığında veya 4 ° C'de saklayın.
2. Standart eğri için 12 seyreltme (her biri 70 μL), sodyum borat çözeltisini kullanarak 50 μM stoktan NIST-izlenebilir FITC standardının adım başına 2x (50, 25, 12.5, 6.25, 3.125, 1.562, 0.781, 0.390, 0.195, 0.097, 0.048 ve 0 μM) hazırlayın. Seyreltme serisini üçlü olarak hazırlayın.
3. Adım 6.2'ye benzer şekilde, sodyum borat çözeltisini (1.2, 0.3, 0.075, 0.0188, 0.0047, 0.0012, 0.0003, 0.00007 ve 0 μM) kullanarak rekombinant eGFP'den seri seyreltmeler (her biri 70 μL) hazırlayın. Molarite hesaplaması için, proteinin tam boyutunu (28 kDa) ve saflaştırılmış eGFP'nin konsantrasyonunu (1 g / L) göz önünde bulundurun. Seyreltme serisini üçlü olarak hazırlayın.
4. Her seyreltmeden 20 μL (her biri dokuz kuyucuk = üç seyreltme serisi x üç teknik kopya) yapışkan bir plaka contası ile kaplanmış 384 kuyucuklu kare tabanlı bir mikro plakaya ekleyin ve ölçüm için bir plaka okuyucuda inkübe edin.
   NOT: Burada kullanılan ayarlar Uyarılma: 485/20, Emisyon: 528/20, kazanç 50 idi. Bununla birlikte, diğer floresan molekülleri ve / veya kazanç ayarlarını kalibre etmek için ek dalga boyu / kazanç kombinasyonları da kullanılabilir. Dönüşüm faktörünü hesaplamak için, GFP floresan verilerini hücresiz deneylerden ve standart eğri verilerinden elde etmek için aynı dalga boyu ve kazanç ayarları gereklidir.
5. Her koşul için [y = eksen ve R²] eğimine uyması için doğrusal sinyal aralığını (örneğin, [FITC] ≤ 0,781 μM) kullanın.
   NOT: Ürün yelpazesi, kullanılan farklı makineler ve standart çözümler için farklılık gösterebilir.
6. Tablo 9'daki örneği izleyerek laboratuvarın bağıl ölçümlerini hesaplamak üzere FITC ve eGFP kalibrasyonu için verileri kaydedin. GFP üretimini FITC veya eGFP cinsinden tahmin etmek için floresan keyfi birimlerinde (a.u.) elde edilen değerleri eğri eğimi "a" değerine (y = ax) bölün.

Representative Results

Lineer ve plazmid DNA için ayrı ayrı optimal Mg-glutamat ve K-glutamat seviyeleri için lizatın kalibrasyonundan sonra temsili sonuçlar burada gösterilmiştir (Şekil 1). Mg-glutamat optimal konsantrasyonu, 8 mM'de Δ recB ve ΔrecBCD ekstraktları arasında benzerdir (Şekil 1B). Bununla birlikte, plazmid DNA'sı için optimal K-glutamat konsantrasyonu 140 mM'dir, oysa aynı ekstrakt için lineer DNA için optimal K-glutamat konsantrasyonu 20 mM'dir (Şekil 1C). WT ve ΔrecBCD hücrelerinden elde edilen ekstraktlarda GFP ekspresyonunun karşılaştırmalı bir analizinde, ekstraktların tampon bileşiminin, ekzonükleaz V silinmiş ekstraktlarda kullanılan lineer ve plazmid DNA'sından optimal ekspresyon için özel olarak kalibre edilmesi gerektiği görülmüştür.

Kalibrasyon adımlarından sonra, GFP ekspresyon seviyeleri, WT ve ΔrecBCD ekstraktındaki lineer ve plazmid DNA'sından (5 nM) karşılaştırıldı (Şekil 1D). Lineer DNA'dan GFP ekspresyonu, sırasıyla ΔrecB ve ΔrecBCD suşlarından elde edilen ekstraktlarda plazmid DNA'sından ekspresyonun% 102 ve% 138'ine ulaştı. Birlikte, bu sonuçlar, doğal bir E. coli σ70 promotörü kullanılarak lineer DNA'dan gelen ekspresyonun, hücre lizatı bu tür mutantlardan hazırlandığında ve hücresiz tampon lineer DNA için özel olarak kalibre edildiğinde plazmid ekspresyonununkiyle aynı seviyeye ulaşabileceğini göstermektedir.

Şekil 1: ΔrecB/ΔrecBCD ekstraktlarında lineer ve plazmid DNA için diferansiyel tampon optimizasyonu. (A) Bir 1361 bp lineer DNA amplikonu, plazmid p70a-deGFP'den yükseltildi ve tampon kalibrasyonu için gen ekspresyonu için bir şablon olarak kullanıldı. (B) 0 ila 20 mM arasında farklı konsantrasyonlar kullanarak her DNA tipinin 1 nM'si ile mg-glutamat tampon kalibrasyonu (K-glutamat 80 mM'de sabitlenmiş). Kare kutular seçilen konsantrasyon noktalarını gösterir. P = plazmid DNA, L = lineer DNA. (C) Her lizat için optimal Mg-glutamat konsantrasyonunu seçtikten sonra, K-glutamat 20 ila 240 mM arasında titre edildi. Kare kutular seçilen konsantrasyon noktalarını gösterir. P = plazmid DNA, L = lineer DNA. Isı haritalarında (B) ve (C) gösterilen veriler tek bir deneyden alınmıştır. (D) Tampon kalibrasyonundan sonra, her DNA tipinin 5 nM'si ile hücresiz reaksiyonlar gerçekleştirildi. Ekstrakt BL21 Rosetta2 lineer DNA ekspresyonunu desteklemezken, ΔrecB ve ΔrecBCD suşlarından farklı olarak optimize edilmiş ekstraktlar, plazmid DNA (mavi) seviyelerine benzer lineer DNA (yeşil) ekspresyonu sergiler. Gösterilen uç nokta verileri, aynı gün içinde yapılan ve 8 saatlik inkübasyondan sonra toplanan üç çoğaltma için ortalama ± SD'dir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Protokolün görsel gösterimi. CFPS sentezinde bir şablon olarak lineer DNA için hücre lizat hazırlama ve lizat optimizasyonu için iş akışı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: Sıvı ve katı 2xYT+P ortamın hazırlanması için bileşenlerin listesi. Her bileşenin miktarı (gram cinsinden) 1 L ortam için belirtilmiştir. Ölçeği gerektiğinde orantılı olarak artırın. Medya kullanılmadan önce otoklavlanmalıdır. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Tablo 2: S30A+DTT tamponunun hazırlanması için bileşenlerin listesi. Her bileşenin miktarı (gram cinsinden) 1 L tampon S30A için belirtilmiştir. Ölçeği gerektiğinde orantılı olarak artırın. S30A tamponu kullanılmadan önce otoklavlanmalı ve daha sonra soğutulmalıdır (4 °C). DTT tamponu, belirtildiği gibi (15 mL tüpte) ayrı ayrı hazırlanmalı ve filtrelenmeli ve -20 ° C'de saklanmalıdır. S30A tamponunu kullanmadan hemen önce, 1 L S30A arabelleğine 2 mL DTT (1 M stoktan) ekleyin. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Tablo 3: Enerji çözeltisi hazırlama bileşenlerinin listesi. Her bir bileşenin miktarı (gram cinsinden) veya hacmi, belirtilen konsantrasyon (F sütununda) için belirli bir stok çözeltisi hacminin (H sütununda) hazırlanması için (G sütununda) belirtilir. Her bileşenin pH'ı, belirtildiği gibi gerekirse ayarlanmalıdır (sütun I ve J'de). 14x enerji çözeltisi stoğu, her bir bileşenin listelenen hacminin (K sütununda) listelenen sırayla karıştırılmasıyla hazırlanır. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Tablo 4: Amino asit stok çözeltisinin hazırlanması için bileşenlerin listesi. 4x amino asit stok çözeltisinin hazırlanması için, tüm amino asitler listelenen sırayla karıştırılmalıdır. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Tablo 5. Lisat kalibrasyon çözeltilerinin hazırlanması için bileşenlerin listesi. Mg-glutamat ve K-glutamat stok çözeltilerinin miktarı (gram cinsinden), her tamponun belirtilen konsantrasyonunun 50 mL'sini hazırlamak için belirtilmiştir. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Tablo 6: Bu protokolde kullanılan bakteri suşlarının listesi. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Tablo 7: Bu protokolde kullanılan primerlerin listesi. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Tablo 8: Bu protokolde lizat kalibrasyonu için ve PCR ile lineer DNA amplifikasyonu için bir şablon olarak kullanılan plazmid. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Tablo 9: FITC ve eGFP dönüşümü. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Dosya 1. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Şekil 1. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Discussion

Burada, E. coli BL21 Rosetta2'den hazırlanan hücre lizatının, recB veya recBCD operon için genomik nakavt ile doğrusal DNA şablonlarından yüksek protein ekspresyonunu desteklediğini gösteriyoruz. Bu protokol, lineer DNA şablonlarına özgü adım adım lizat kalibrasyon prosedürünü detaylandırır (Şekil 2), bu da lineer DNA'daki σ70 promotörlerinden yüksek ekspresyona yol açan ve equimolar DNA konsantrasyonları için plazmid seviyelerine ulaşan kritik bir adımdır. Bu protokol, son uygulamada kullanılacak DNA tipine (lineer veya plazmid) göre tampon kalibrasyonunun önemini vurgulamaktadır.

Protokol, zaman ve maliyette önemli kazanımlar sağlayan plazmid klonlamasını önlemeye yardımcı olabilir. Lineer DNA fragmanları ticari sağlayıcılar tarafından sentezlenebilir ve/veya laboratuvarda PCR ile güçlendirilebilir. Plazmid DNA'sını kullanan aynı işlem, klonlama, sekans doğrulama ve DNA hazırlama adımları¹⁰ dikkate alınarak en az 1 hafta daha uzun sürecektir. Deneyler arasında partiden partiye değişkenliği en aza indirmek için büyük hacimlerde hücre ekstraktı ve doğrusal DNA şablonlarının hazırlanması önerilir^14,15.

Bu yöntemin sağlam olduğu ve laboratuvarlarda kullanıldığı gösterilmiştir¹⁰. Bu ekstraktlardan elde edilen sonuçlar, biyolojik replikalar, farklı ekstrakt partileri ve farklı suş arka planları arasında tutarlı olmuştur¹⁰. Protokolün sağlamlığı farklı deneysel parametrelerde de test edilmiştir: hücre lizis yöntemleri, sıcaklıklar, DNA şablonları ve farklı DNA konsantrasyonları. Yöntem, iki ilgili uygulama için genetik yapıların hızlı taranması ve karakterizasyonu için zaten kullanılmıştır: ayak parmağı anahtar kütüphanesi karakterizasyonu ve enzim aktivitesi taraması¹⁰.

Bu çalışmada, yüksek verimli ebeveyn suşu E. coli BL21 Rosetta2'den elde edilen ΔrecB / ΔrecBCD ekstraktlarındaki doğrusal DNA'dan yüksek ekspresyon seviyeleri elde edilmesine rağmen, metodoloji yeni bir ilgi alanı için genom mühendisliği gerektirecektir . Buna karşılık, GamS⁵ veya Chi DNA⁶ gibi lineer DNA için koruyucu ajanlarla takviye, yeni bir suş için daha kolaydır, ancak daha pahalı ve daha zaman alıcıdır.

Burada sağlanan protokol, hücresiz sistemlerde lineer DNA şablonlarının kullanımını kolaylaştıracak ve sentetik biyoloji topluluğu için tasarla-inşa et-test döngülerini hızlandıracaktır. ΔrecB/ΔrecBCD ekstraktlarındaki lineer DNA şablonlarından daha kolay hücresiz ifade, ilgilenilen küçük moleküllerin, biyobenzerlerin ve diğer isteğe bağlı bakım noktası uygulamalarının üretimi için kullanılabilir.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-YT Broth	Invitrogen	22712020
1.5 mL Safe-Lock tubes	Eppendorf	30120086	1.5 mL microtube
384-well square-bottom microplate	Thermo Scientific Nunc	142761
3PGA (D-(-)-3-Phosphoglyceric acid disodium)	Sigma-Aldrich	P8877
adhesive plate seal	Thermo Scientific Nunc	232701
Agar	Invitrogen	30391023
ATP (Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate)	Sigma-Aldrich	A8937
BL21 Rosetta2	Merck Millipore	71402
BL21 Rosetta2 ΔrecB	Addgene	176582
BL21 Rosetta2 ΔrecBCD	Addgene	176583
cAMP (Adenosine 3' 5'-cyclic monophosphate)	Sigma-Aldrich	A9501
Chloramphenicol	Sigma-Aldrich	C0378
CoA (Coenzyme A hydrate)	Sigma-Aldrich	C4282
Corning 15 mL PP Centrifuge Tubes, Rack Packed with CentriStar Cap, Sterile	Corning	430790	15 mL tube
Corning 50 mL PP Centrifuge Tubes, Conical Bottom with CentriStar Cap, Sterile	Corning	430828	50 mL tube
CTP (Cytidine 5'-triphosphate, disodium salt hydrate)	Alfa Aesar	J62238
DpnI	NEB	R0176S
DTT (DL-Dithiothreitol)	Sigma-Aldrich	D0632
Folinic acid (solid folinic acid calcium salt)	Sigma-Aldrich	F7878
GTP (Guanosine 5?-Triphosphate,  Disodium Salt)	Sigma-Aldrich	371701
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
K phosphate dibasic (K2HPO4)	Carl Roth	231-834-5
K phosphate monobasic (H2KO4P)	Sigma-Aldrich	P5655
K-glutamate	Alfa Aesar	A17232
Mg-glutamate	Sigma-Aldrich	49605
Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm, polyethersulfone	Merck Millipore	SLGP033RB	membrane filter 0.22 µm
Monarch PCR & DNA Cleanup Kit	NEB	T1030S	PCR & DNA cleanup Kit
Monarch Plasmid Miniprep Kit	NEB	T1010S	Plasmid Miniprep Kit
NAD (B-nicotinamide adenine dinucleotide hydrate)	Sigma-Aldrich	N6522
NIST-traceable FITC standard	Invitrogen	F36915	NIST-FITC
NucleoBond Xtra Maxi kit	Macherey-Nagel	740414.1	Plasmid Maxiprep Kit
PEG 8000	Sigma-Aldrich	89510
plate reader	Biotek	Synergy HTX
Purified Recombinant EGFP Protein	Chromotek	egfp-250	recombinant eGFP
Q5 High-Fidelity 2X Master Mix	NEB	M0492S	DNA polymerase
Q5 High-Fidelity 2X Master Mix	New England Biolabs	M0492L	DNA polymerase
Qubit dsDNA BR Assay Kit	Thermo	Q32850	fluorometric assay with DNA-binding dye
RTS Amino Acid Sampler	biotechrabbit	BR1401801
Spermidine	Sigma-Aldrich	85558
Sterile water			Purified water from the Millipore RiOs 8 system, sterilized by autoclaving.
Tris base	Life Science products Cytiva	17-1321-01
tRNA	Roche	10109550001
Ultrasonic processor Vibra cell VC-505	SONICS	VC505	sonicator
UTP Na3 (Uridine 5'- triphosphate, trisodium salt hydrate)	Acros Organics	226310010
Water, nuclease-free	Thermo	R0581	nuclease-free water