Summary
여기에 제시된 것은 대장 균 BL21 Rosetta2 (ΔrecBCD 및 ΔrecB)의 엑소 뉴 클레아 제 V 녹아웃 균주로부터 세포 추출물의 제조 및 완충액 교정을위한 프로토콜입니다. 이것은 선형 DNA 주형을 사용하는 무세포 단백질 합성 시스템에서 발현을 위한 빠르고 쉽고 직접적인 접근 방식입니다.
Abstract
무세포 단백질 합성(CFPS)은 최근 수많은 장점으로 인해 합성 생물학 분야에서 매우 인기를 얻고 있습니다. CFPS에 선형 DNA 템플릿을 사용하면 클로닝, 형질 전환 및 플라스미드 추출 단계를 제거하여 실험 시간을 단축하여 기술이 잠재력을 최대한 발휘할 수 있습니다. 선형 DNA는 PCR에 의해 빠르고 쉽게 증폭되어 고농도의 주형을 얻을 수 있으므로 잠재적인 생체 내 발현 독성을 피할 수 있습니다. 그러나, 선형 DNA 주형은 세포 추출물에 자연적으로 존재하는 엑소뉴클레아제에 의해 빠르게 분해된다. 이 문제를 해결하기 위해 뉴클레아제 억제제를 추가하거나 보호를 위한 선형 DNA 말단의 화학적 변형과 같은 몇 가지 전략이 제안되었습니다. 이러한 모든 전략은 추가 시간과 자원을 소비하며 아직 플라스미드에 가까운 수준의 단백질 발현을 얻지 못했습니다. CFPS에 선형 DNA 템플릿을 사용하기 위한 대체 전략에 대한 자세한 프로토콜이 여기에 제시되어 있습니다. 엑소뉴클레아제 결핍 녹아웃 세포의 세포 추출물을 사용하면 선형 DNA 주형이 최종 변형 없이 그대로 유지됩니다. 우리는 선형 DNA에 대해 특히 Mg-글루타메이트 (Mg-glu) 및 K- 글루타메이트 (K-glu)에 대한 초음파 용해 및 완충액 보정에 의한 대장균 BL21 Rosetta2 ΔrecBCD 균주에서 세포 용해물의 준비 단계를 제시합니다. 이 방법은 대장균 CFPS의 플라스미드 DNA와 유사한 단백질 발현 수준을 달성할 수 있습니다.
Introduction
무세포 단백질 합성(CFPS) 시스템은 바이오센서 엔지니어링, 분산 제조 및 유전자 회로의 프로토타이핑을 위한 빠르고 간단하며 효율적인 방법으로 점점 더 많이사용되고 있습니다1. CFPS 시스템은 큰 잠재력으로 인해 합성 생물학 분야에서 정기적으로 사용됩니다. 그러나 지금까지 CFPS 시스템은 기술이 잠재력을 최대한 발휘하는 것을 제한할 수 있는 원형 플라스미드에 의존합니다. 플라스미드 DNA를 준비하는 것은 클로닝 및 다량의 DNA 분리 중 많은 시간이 소요되는 단계에 따라 달라집니다. 반면에, 플라스미드 또는 합성된 DNA 주형으로부터의 PCR 증폭은 몇 시간 내에 CFPS 주형을 간단히 제조하는데 사용될 수 있다(2,3). 따라서 선형 DNA의 적용은 CFPS에 대한 유망한 솔루션을 제공합니다. 그러나, 선형 DNA는 세포 추출물4에 자연적으로 존재하는 엑소뉴클레아제에 의해 빠르게 분해된다. λ- 파지 GamS 단백질5 또는 카이 사이트6을 포함하는 DNA를 보호제로 사용하거나 말단 2,7,8,9의 화학적 변형으로 선형 DNA를 직접 보호하는 것과 같이이 문제를 해결하는 솔루션이 있습니다. 이러한 모든 방법은 세포 추출물에 대한 보충이 필요하며 비용과 시간이 많이 소요됩니다. 엑소 뉴 클레아 제 V 복합체 (RecBCD)가 세포 용해물4에서 선형 DNA를 분해한다는 것은 오랫동안 알려져 왔습니다. 최근에 우리는 선형 DNA가 엑소뉴클레아제 유전자(recBCD)10에 대해 녹아웃된 세포의 용해물에서 훨씬 더 잘 보호될 수 있음을 보여주었습니다.
이 프로토콜에서는 초음파 용해에 의한 대장균 BL21 Rosetta2 ΔrecBCD 균주로부터 무세포 용해물을 제조하는 단계를 자세히 설명합니다. 초음파 처리 용해는 여러 실험실11,12에서 사용하는 일반적이고 저렴한 기술입니다. 이 균주에서 생산된 추출물은 선형 DNA 주형으로부터의 발현을 지원하기 위해 추가 성분 또는 DNA 주형 변형을 추가할 필요가 없습니다. 이 방법은 특히 천연 대장균 프로모터의 선형 DNA 발현을 위한 세포 추출물에 대한 완충액 최적화의 필수 단계에 의존합니다. 선형 DNA 발현을 위한 이러한 특이적 완충액 최적화는 천연 σ70 프로모터가 PCR 산물10의 정제를 피하더라도 GamS 단백질 또는 Chi DNA 보충 없이 높은 단백질 생산을 산출하는 열쇠인 것으로 나타났습니다. 선형 DNA 발현을 위한 Mg-glu의 최적 농도는 플라스미드 DNA에 대한 농도와 유사한 것으로 밝혀졌다. 그러나, K-glu의 최적 농도는 전사 관련 메커니즘10에 기인 한 선형 및 플라스미드 DNA 사이에 상당한 차이를 보였다. 이 방법을 사용하여 발현된 단백질의 기능은 토홀드 스위치의 신속한 스크리닝 및 효소 변이체10의 활성 평가와 같은 여러 응용 분야에서 입증되었습니다.
이 프로토콜은 돌연변이 ΔrecBCD 세포 추출물과 선형 DNA에 대한 특정 보정을 주형으로 사용하여 대장균 무세포 시스템에서 선형 DNA 주형을 사용하기 위한 간단하고 효율적이며 비용 효율적인 솔루션을 제공합니다.
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Protocol
1. 배지 및 완충액 준비
- 2xYT+P 배지(고체 및 액체)의 제조
- 표 1에 설명된 대로 액체 및 고체 매체를 준비한 다음 고압멸균으로 멸균합니다.
참고: 이 프로토콜에는 클로람페니콜(10μg/mL)을 포함하는 2xYT+P 한천 플레이트 1개가 필요합니다. 액체 매체의 부피는 필요한 용해물의 부피에 비례합니다. 여기서, 5 L의 액체 2xYT+P 매체의 시작 부피가 사용된다. 그러나 1L의 세포 배양이 2 내지 3mL의 최종 세포 용해물을 생성한다는 것을 알고 필요에 따라 부피를 조정할 수 있습니다.
- 표 1에 설명된 대로 액체 및 고체 매체를 준비한 다음 고압멸균으로 멸균합니다.
- 클로람페니콜의 제조 (34 mg / mL)
- 클로람페니콜 0.34g을 달아서 에탄올 10mL를 넣고 혼합하여 녹인다. 각각 1 mL를 여러 개의 튜브에 분취하고, 나중에 사용하기 위해 -20°C에서 보관한다.
- S30A 완충액의 제조
- 이 버퍼의 2L를 목표로 표 2에 따라 S30A 버퍼를 준비합니다.
참고: 다시 한번,이 완충액의 부피는 필요한 용해물의 부피에 비례합니다. - 오토클레이빙하기 전에 빙초산을 사용하여 완충액의 pH를 7.7로 조정합니다.
- 버퍼를 오토클레이브합니다.
- 오토클레이빙 후 이 완충액을 4°C로 유지하십시오.
- 사용하기 전에 DTT(0.22μm 멤브레인 필터로 필터링)를 S30A 버퍼에 추가하여 최종 농도 2mM(스톡 2mL 1M DTT에서 S30A 버퍼 1L까지)에 도달합니다.
참고: 다시 한번,이 완충액의 부피는 필요한 용해물의 부피에 비례합니다.
- 이 버퍼의 2L를 목표로 표 2에 따라 S30A 버퍼를 준비합니다.
- 에너지 용액 준비
참고: 이 에너지 솔루션은 Sun et al. 논문13(14x 스톡 농도)을 기반으로 합니다. 표 3은 에너지 솔루션 스톡을 준비하는 데 필요한 구성 요소를 이 프로토콜에 사용된 모든 화학 물질에 대한 카탈로그 번호와 함께 요약한 것입니다.- 표 3에 따라 저장 용액을 준비하고 얼음 위에 보관하십시오.
- 표 3에 표시된 대로 Tris 버퍼 2M(250mL 부피의 멸균수에 60.57g의 트리스 염기) 또는 KOH 15%(100mL 부피의 멸균수에서 15g의 KOH)를 사용하여 표시된 성분에 대해 요청된 대로 pH를 보정합니다.
- 15mL 튜브에 표 3에 표시된 순서대로 각 성분의 부피를 추가합니다.
- 에너지 용액을 분취하고, 튜브당 150 μL.
- 분취량을 드라이아이스에 급속 동결시키고 -80°C에서 보관합니다.
- 아미노산(AA) 용액의 제조
참고: 아미노산 용액은 RTS 아미노산 샘플러 키트로 준비됩니다. 20개의 아미노산 각각은 140mM인 류신을 제외하고 168mM에서 1.5mL 부피로 이 키트에 제공됩니다. 여기서, 준비된 저장 용액은 필요한 작업 용액이 아닌 4x 농축된다. 아미노산 용액의 최종 농도는 5mM인 류신을 제외한 모든 아미노산에 대해 6mM입니다.- 20개의 아미노산 튜브를 볼텍싱하여 해동하고 완전히 용해될 때까지 37°C에서 배양합니다.
알림: Cys는 완전히 용해되지 않을 수 있습니다. - 50mL 튜브에 멸균수 12mL와 아미노산 각각 1.5mL를 표 4에 표시된 순서대로 추가합니다.
- 용액이 상당히 투명해질 때까지 와동시키고, 필요한 경우 37°C에서 배양한다.
알림: Cys는 완전히 용해되지 않을 수 있습니다. - 얼음 위의 튜브당 아미노산 용액 500μL를 분취합니다.
- 분취량을 드라이아이스에 급속 동결하고 -80°C에서 보관한다.
- 20개의 아미노산 튜브를 볼텍싱하여 해동하고 완전히 용해될 때까지 37°C에서 배양합니다.
- 버퍼 교정을 위한 용액 준비
- 표 5에 표시된 바와 같이 Mg-glu(100mM) 및 K-glu(3M)용 원액을 준비합니다. 교정 단계에 대한 보충 파일 1에 표시된 대로 Mg-glu(0 - 20mM) 및 K-glu(20 - 300mM)에 대해 이러한 스톡에서 연속 희석(1mL 부피)을 수행합니다.
알림: 이러한 스톡 농도는 보정 단계를 위한 것이며 최종 실험을 설정할 때 변경해야 할 수 있습니다. 이 프로토콜에 대해 테스트 된 주식의 최고 농도는 각각 Mg-glu 및 K-glu에 대해 1M 및 4.5M입니다.
- 표 5에 표시된 바와 같이 Mg-glu(100mM) 및 K-glu(3M)용 원액을 준비합니다. 교정 단계에 대한 보충 파일 1에 표시된 대로 Mg-glu(0 - 20mM) 및 K-glu(20 - 300mM)에 대해 이러한 스톡에서 연속 희석(1mL 부피)을 수행합니다.
- PEG8000 용액 원산의 제조
- 50mL의 40% PEG8000 용액(50mL 부피의 멸균수에 PEG8000 20g)을 준비합니다.
2. 세포 배양 및 용해물 준비 (4 일 실험)
- 1일차
- 줄무늬 균주 BL21 Rosetta2 ΔrecBCD (표 6)를 -80 ° C 글리세롤 스톡에서 10 μg / mL 클로람페니콜이 포함 된 2xYT + P 한천 플레이트에 넣습니다. 대안적으로, BL21 Rosetta2 ΔrecB (표 6)도10을 사용할 수 있다.
- 37°C에서 밤새 배양한다.
- 2일차
- 위의 한천 플레이트에서 단일 콜로니를 10μg/mL 클로람페니콜이 보충된 10mL의 2xYT+P에 접종합니다.
- 37°C에서 200rpm 진탕으로 밤새 배양한다.
- 3일차
- 하룻밤 배양액을 10μg/mL 클로람페니콜이 포함된 신선한 2xYT+P 배지 4L에 100배 희석하여 계대배양을 만듭니다.
참고: 예를 들어, 40mL의 야간 배양물을 3960mL의 새 배지에 추가합니다. 희석 후, 4 L 매체는 4 개의 플라스크 (5 L 부피)로 나누어 각 플라스크에 1 L가 포함되도록한다. - 37°C, 200 rpm에서 약 3 내지 4 시간 동안 배양하여 1.5-2.0의OD600 에 도달한다. OD600 > 0.8을 측정하는 경우 배양액을 4배 희석합니다.
알림: 정확한 배양 시간은 균주, 초기 접종물, 실험기구 및 사용된 기기에 따라 다를 수 있습니다. ΔrecB/ΔrecBCD 녹아웃 균주는 BL21 Rosetta2 부모와 유사한 성장률을 보입니다(보충 그림 1). - 문화를 얼음 위에 올려 놓으십시오.
- 세포를 4°C에서 12분 동안 5,000 x g 로 스핀다운한 다음, 디캔팅하여 상청액을 버린다.
- 식힌 S30A+DTT 800mL에 세포 펠릿을 재현탁합니다.
참고: S30A+DTT의 부피는 원래 세포 배양 부피보다 5배 적습니다. 예를 들어, 세포 배양 시작 부피 1L의 경우 200mL의 S30A+DTT에 세포 펠릿을 재현탁합니다. 또한 4 ° C의 차가운 방에서이 단계를 수행하고 모든 재료를 얼음 위에 보관하는 것이 좋습니다. - 세포를 4°C에서 12분 동안 5,000 x g 로 스핀다운한 다음, 디캔팅하여 상청액을 버린다.
- 2.3.5단계와 2.3.6단계를 반복합니다.
- 식힌 S30A+DTT 160mL에 세포 펠릿을 재현탁합니다.
참고: 이번에는 S30A+DTT의 부피가 원래 세포 배양 부피보다 25배 적습니다. 예를 들어, 세포 배양 시작 부피 1L의 경우 S30A+DTT 40mL에 세포 펠릿을 재현탁합니다. 다시 말하지만, 재료를 얼음 위에 유지하기 위해 4 ° C의 차가운 방에서이 단계를 수행하는 것이 좋습니다. - 세포를 냉장 및 사전 칭량된 50mL 튜브로 옮깁니다.
- 세포를 4°C에서 8분 동안 2,000 x g 로 스핀다운한 다음, 디캔팅하여 상청액을 버린다.
- 세포를 2,000 x g 에서 4°C에서 4분 동안 스핀다운한 다음, 피펫을 사용하여 나머지 상청액을 조심스럽게 제거한다.
- 튜브의 무게를 다시 측정하여 셀 펠릿의 무게를 계산합니다.
- 세포 펠릿을 -80°C에서 유지하십시오.
- 하룻밤 배양액을 10μg/mL 클로람페니콜이 포함된 신선한 2xYT+P 배지 4L에 100배 희석하여 계대배양을 만듭니다.
- 4 일째
- 셀 펠릿을 -80 ° C에서 취하여 얼음에서 1-2 시간 동안 해동합니다.
- 펠릿 무게 그램당 S30A+DTT 버퍼 0.9mL에 세포 펠릿을 재현탁합니다. 피펫을 천천히 사용하여 세포를 재현탁시키고 가능한 한 상단 거품을 피하십시오.
- 재현탁된 세포 1mL 분취량을 1.5mL 마이크로튜브에 넣고 4°C의 얼음 또는 사전 냉각된 콜드 블록에 보관합니다(금속 블록을 사용하는 것이 바람직함).
참고: 마지막 부분 표본량이 1mL보다 훨씬 작 으면 최적이 아닌 부피를 초음파 처리하는 것보다 폐기하는 것이 좋습니다. 초음파 처리를위한 최적의 부피 (1mL)는이 설정 (튜브, 초음파 처리기 및 프로브)에 대해 결정되었으며 다른 것에 대해 다를 수 있습니다. - 초음파 처리기 (3mm 프로브, 주파수 20kHz)에서 각 튜브를 초음파 처리하고, 3주기 (30 초 초음파 처리, 1 분 일시 중지) 동안 20 % 진폭을 설정합니다.
알림: 세 사이클 동안 전달된 총 에너지는 ~266줄(사이클당 ~80-110줄)이었습니다. 이 단계에서 튜브를 얼음으로 둘러싸인 차가운 블록에 보관하십시오. 프로브의 과열을 방지하기 위해 두 개의 콜드 블록을 번갈아 가며 사용하십시오 (대기 콜드 블록도 얼음 위에서 차갑게 유지됩니다). 두 차가운 블록은 초음파 처리 전날 냉장고에서 미리 냉각되었습니다. - 용해물을 12,000 x g 에서 4°C에서 10분 동안 스핀 다운합니다.
- 피펫으로 상청액(세포 용해물)을 수집하고 50mL 튜브로 옮깁니다.
- 세포 용해물을 37°C에서 200 rpm 교반으로 80분 동안 인큐베이션한다.
- 용해물을 12,000 x g 에서 4°C에서 10분 동안 스핀 다운합니다.
- 모든 튜브를 얼음 위에 유지하면서 사전 냉각된 1.5mL 마이크로튜브에 상청액 및 분취량 각각 30μL를 수집합니다.
- 용해물 분취량을 드라이아이스에 급속 동결하고 -80°C에서 보관한다.
3. 선형 DNA를 위한 무세포 완충액 교정
참고: 무세포 완충액은 Sun et al.13에 설명된 대로 최적의 Mg-glu 및 K-glu 농도에 대해 보정되었습니다. 보정 단계를 위해 보충 파일 1 이 필요합니다. 반응은 각각 10.5 μL의 최종 부피로 설정하였다. 추출물은 1 nM의 선형 (하기 섹션 4 참조) 또는 플라스미드 DNA를 사용하여 보정하였다. 실험은 완충액이 준비되는 당일에 수행될 수 있거나, 또는 제조된 완충액이 -80°C에서 동결되어 다른 날에 실험을 수행할 수 있다. 모든 교정 단계에서 각 성분은 384웰 플레이트에 혼합하고 피펫팅하기 전에 얼음에서 해동되었습니다.
- Excel 파일 보충 파일 1의 '완충액 준비' 탭에 따라 (a) 세포 추출물(총 반응 부피의 33%), (b) 최종 농도 1nM까지의 리포터 DNA(선형 및/또는 플라스미드 DNA), (c) 무세포 완충액(PEG8000, AA 용액 및 에너지 용액), (d) K-glu를 최종 농도 80mM로 포함하는 마스터 믹스를 준비합니다.
- 반응 부피가 10.5μL인 경우 다양한 농도의 Mg-glu 10x 농축 스톡(최종 농도 범위: 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 및 20mM)의 1.05μL(총 반응 10%)를 취하고 마스터 믹스의 9.45μL(총 반응 90%)를 추가합니다. 부드럽게 섞는다.
알림: PCR 8 스트립 튜브를 사용하여 희석액을 준비하고 다중 채널 피펫과 혼합하십시오. 필요한 경우 다른 범위의 Mg-glu 농도를 사용할 수 있습니다. - 상기 반응물 10 μL를 384웰 사각바닥 마이크로플레이트에 피펫팅하고, 접착판 밀봉을 이용하여 커버하고, 유전자 발현을 형광 출력으로 측정하였다. 플레이트 리더로 형광 데이터 기록(예: 485 nm; Em: 528 nm)를 일정한 간격으로(예를 들어, 5분) 동안 30°C에서 8시간 동안 인큐베이션하고 307 cpm에서 연속 오비탈 진탕.
참고: 필요한 경우 데이터 수집을 시작하기 전에 384웰 마이크로플레이트(<2,500 x g, 1분, 실온)를 스핀다운합니다. 종말점 측정은 상이한 완충액 조성물에서의 GFP 발현을 비교하기 위해 사용되었다. 형광 값은 플로팅을 위해 표준화된 단위로 변환할 수 있습니다(아래 참조). - 종말점에서 가장 높은 형광 값을 생성하는 Mg-glu 농도를 식별합니다.
알림: 얻은 최적의 Mg-glu 농도가 확실하지 않은 경우 더 다양한 농도 범위로 3.2단계를 반복합니다. - 최적화된 Mg-glu 농도로 3.2단계에 표시된 동일한 부피를 사용하여 농도 범위(20, 40, 60, 80, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 220 및 240mM)에 대한 K-glu 보정을 진행합니다. 실험을 실행하고 테스트된 K-glu 농도 중에서 가장 높은 형광 값을 식별합니다. 이는 이 용해물에 대한 Mg-glu 및 K-glu에 대한 최적의 완충액 조성을 나타낸다.
알림: 얻은 최적의 K-glu 농도가 확실하지 않은 경우 더 다양한 농도 범위로 단계를 반복하십시오. - Mg-glu 및 K-glu 값이 설정되면 얻은 배치 부피에 따라 최적화된 완충액 조성의 스톡 튜브를 준비합니다. 보충 파일 1의 '완충액 준비' 탭을 사용하여 필요한 완충 튜브의 수를 계산하고 튜브당 38μL를 분취한 후 -80°C에서 보관하십시오.
4. 선형 DNA 준비
참고: 용해물 보정을 위해 플라스미드 P70a-deGFP가 사용됩니다. 이 플라스미드는 플라스미드 미니프렙 키트를 사용한 미니프렙 또는 플라스미드 맥시프렙 키트를 사용한 맥시프렙을 위해 대장균 KL740 cl857+(표 6)에서 유지되었습니다. 무세포 반응에서 발현 주형으로서 사용된 선형 DNA 단편을 표 7 및 표 8에 열거된 프라이머 및 주형을 사용하여 PCR 증폭하였다.
- PCR은 표 7에 나열된 올리고 프라이머와 함께 DNA 중합효소를 사용하여 플라스미드 P70a-deGFP로부터 증폭합니다. 제조업체의 프로토콜에 따라 써모사이클러 프로그램을 사용하여 PCR 반응을 50μL 부피로 설정합니다: [2분 동안 98°C; 40사이클 x (30초 동안 98°C → 30초 동안 66°C → 60초 동안 72°C); 72°C에서 10분; 4°C 동안 ∞].
- 50 μL PCR 반응당 1 μL의 DpnI 제한효소를 첨가하여 PCR 반응에서 주형 DNA를 분해하고 37°C에서 1시간 동안 배양한다. 다음으로, PCR 및 DNA 클린업 키트를 사용하여 PCR 반응을 정제하고 뉴클레아제가 없는 물에서 용리시킨다.
- 사용하기 전에 1% 아가로스 겔(1x TAE)에서 PCR 산물을 확인하십시오.
- 나노드롭(ND-1,000)을 사용하여 정제된 PCR 산물(또는 플라스미드 제제)을 정량화합니다.
참고: 다운스트림 무세포 반응과 직접 호환되는 DNA 중합효소/완충액을 사용하는 경우 정제 단계(2단계)를 완전히 건너뛰고 대신 DNA 결합 염료를 사용한 형광 측정법으로 정제되지 않은 DNA의 농도를 측정할 수 있습니다(Batista et al.10 참조).
5. 실험적 실행
참고: 보충 파일 1을 사용하여 준비된 각 용해물 배치(위)에 대한 버퍼 스톡을 보정하는 것 외에도 파일의 '반응 준비' 탭을 사용하여 후속 무세포 반응을 설정하는 것이 좋습니다. 이전과 마찬가지로 반응의 부피는 반응당 10.5μL로 설정되며, 그 중 10μL만 데이터 수집을 위해 최종적으로 384웰 플레이트에 피펫팅됩니다. 여기서, 각 주형의 5 nM은 무세포 발현을 위해 사용된다. 반응을 피펫팅할 때 일관성을 유지하는 것이 중요합니다-동일한 피펫과 팁 유형을 사용하십시오. 우물의 기포나 우물 벽에 액체가 달라붙지 않도록 조심스럽게 분배하십시오. 필요한 경우 플레이트를 아래로 돌립니다(<2,500 x g, 1분, 실온).
- 보충 파일 1의 '반응 준비' 탭에 샘플당 필요한 샘플 설명 및 반복을 입력하여 파이펫에 대한 부피를 계산합니다.
참고: 10.5 μL 이외의 반응 부피가 필요한 경우 보충 파일 1에도 입력할 수 있습니다. 이 파일은 이전에 최적화된 버퍼 스톡의 튜브 수와 얼음에서 해동할 세포 추출 튜브의 수를 계산합니다. - 옵티멀 마스터 믹스 준비(선형 및 플라스미드 DNA에 대해 별도)를 위해 1.5mL 마이크로튜브에 라벨을 붙이고 정확한 부피의 버퍼와 용해물을 추가한 다음 부드럽게 혼합합니다.
참고: 완충액의 최적 K-glu 농도의 차이로 인해 '반응 준비' 탭의 사본을 만들어 선형 및 플라스미드 DNA에 대해 별도로 사용해야 합니다. - 먼저 DNA 샘플을 피펫팅한 다음 뉴클레아제가 없는 물을 피펫팅하고 마지막으로 5.2단계의 옵티멀 마스터 믹스(MM)를 피펫팅합니다. 플레이트 리더에 추가하기 직전에 무세포 반응을 피펫과 부드럽게 혼합하고 기포를 피하십시오.
참고: PCR 8스트립 튜브를 사용하여 추가 복제를 위해 반응 부피를 혼합합니다. 예를 들어, 기술적 삼중 반응을 계획하는 경우 샘플을 플레이트에 추가하는 동안 피펫팅 오류를 줄이기 위해 4가지 반응에 대한 혼합물을 준비하고 튜브에 죽은 부피를 남겨 둡니다. - 플레이트 리더에서 반응을 설정합니다(Ex 485 nm; Em 528 nm). 키네틱 런은 30°C에서 8시간 동안 일정한 간격(예: 5분)으로 형광 데이터를 기록했으며, 307cpm에서 연속 오비탈 쉐이킹을 수행했습니다.
참고: 엔드포인트 측정은 8시간 시점으로 보고되었습니다. 수집된 형광 값은 임의의 단위(a.u.)이지만 플로팅을 위해 표준화된 단위로 변환할 수 있습니다(아래 참조).
6. FITC 및 GFP 상대 정량화
참고: GFP 표현은 플레이트 리더에 의해 임의의 형광 단위(a.u.)로 내보내집니다. 그러나 서로 다른 설정(배치, 장비, 사용자 및 실험실) 간의 형광 값을 비교하기 위해 표준화된 측정 단위를 사용하는 것이 좋습니다. 다음은 NIST-FITC 및 재조합 eGFP의 표준 곡선을 사용하여 형광 값(a.u.)을 FITC 당량 및 eGFP(μM) 값으로 변환하는 자세한 단계입니다. NIST-FITC 원액을 4°C에서 보관하고 재조합 eGFP를 -20°C에서 보관합니다. 원액과 연속 희석액이 빛으로부터 보호되는지 확인하십시오. 배송 시 여러 번의 동결-해동 주기를 피하기 위해 재조합 eGFP를 더 작은 부피로 분취하는 것이 좋습니다.
- 100 mM 붕산나트륨, pH 9.5의 용액을 제조하고, 실온 또는 4°C에서 저장한다.
- 붕산나트륨 용액을 사용하여 50μM 스톡에서 NIST 추적 가능한 FITC 표준물질의 단계당 2회(50, 25, 12.5, 6.25, 3.125, 1.562, 0.781, 0.390, 0.195, 0.097, 0.048 및 0μM)의 표준 곡선에 대해 12개의 희석액(각각 70μL)을 준비합니다. 희석 시리즈를 3 배로 준비하십시오.
- 단계 6.2와 유사하게, 붕산나트륨 용액(1.2, 0.3, 0.075, 0.0188, 0.0047, 0.0012, 0.,0003, 0.,00007 및 0μM)을 사용하여 재조합 eGFP로부터 연속 희석액(각각 70μL)을 준비합니다. 몰 농도 계산을 위해 단백질의 전체 크기(28kDa)와 정제된 eGFP의 농도(1g/L)를 고려하십시오. 희석 시리즈를 3 배로 준비하십시오.
- 각 희석액 20μL(각 9웰 = 3개의 희석 시리즈 x 3개의 기술 복제)를 접착 플레이트 씰로 덮인 384웰 정사각형 바닥 마이크로플레이트에 추가하고 측정을 위해 플레이트 리더에서 배양합니다.
참고: 여기서 사용된 설정은 여기: 485/20, 방출: 528/20, 게인 50입니다. 그러나, 추가적인 파장/이득 조합은 또한 다른 형광 분자 및/또는 이득 설정을 교정하기 위해 사용될 수 있다. 변환 계수를 계산하려면 무세포 실험에서 GFP 형광 데이터와 표준 곡선 데이터를 획득하기 위해 동일한 파장 및 게인 설정이 필요합니다. - 선형 신호 범위(예: [FITC] ≤ 0.781μM)를 사용하여 각 조건에 대한 기울기 [y = ax 및R2]를 피팅합니다.
알림: 범위는 사용되는 기계 및 표준 솔루션에 따라 다를 수 있습니다. - FITC 및 eGFP 보정을 위한 데이터를 저장하여 표 9의 예에 따라 실험실에 대한 상대 측정값을 계산합니다. 형광 임의 단위(a.u.)로 얻은 값을 곡선 기울기 "a" 값(y = ax)으로 나누어 FITC 또는 eGFP로 GFP 생산을 추정합니다.
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Representative Results
대표적인 결과는 선형 및 플라스미드 DNA에 대해 별도로 최적의 Mg-글루타메이트 및 K-글루타메이트 수준에 대한 용해물을 보정한 후 여기에 표시됩니다(그림 1). Mg- 글루타메이트 최적 농도는 8mM에서 Δ recB 및 ΔrecBCD 추출물에서 유사합니다 (그림 1B). 그러나 플라스미드 DNA에 대한 최적의 K- 글루타메이트 농도는 140mM인 반면, 동일한 추출물에 대한 선형 DNA의 최적 K- 글루타메이트 농도는 20mM입니다 (그림 1C). WT 및 ΔrecBCD 세포로부터의 추출물에서의 GFP 발현의 비교 분석에서, 추출물의 완충액 조성은 엑소뉴클레아제 V 결실 추출물에 사용된 선형 및 플라스미드 DNA로부터 최적의 발현을 위해 특이적으로 보정되어야 한다는 것을 알 수 있었다.
보정 단계 후, WT 및 ΔrecBCD 추출물의 선형 및 플라스미드 DNA(5nM)로부터 GFP 발현 수준을 비교하였다(도 1D). 선형 DNA로부터의 GFP 발현은 각각 ΔrecB 및 ΔrecBCD 균주의 추출물에서 플라스미드 DNA로부터의 발현의 102% 및 138%에 도달하였다. 함께, 이러한 결과는 천연 대장균 σ70 프로모터를 사용하는 선형 DNA로부터의 발현이 세포 용해물이 그러한 돌연변이체로부터 제조되고 무세포 완충액이 선형 DNA에 대해 특이적으로 보정될 때 플라스미드 발현으로부터의 발현과 동일한 수준에 도달할 수 있음을 보여준다.
그림 1: ΔrecB/ΔrecBCD 추출물의 선형 및 플라스미드 DNA에 대한 차등 완충액 최적화. (A) 플라스미드 p70a-deGFP로부터 1361bp 선형 DNA 앰플리콘을 증폭하고 완충액 보정을 위한 유전자 발현을 위한 주형으로 사용하였다. (B) 0에서 20 mM까지 다른 농도를 사용하여 각 DNA 유형의 1 nM으로 Mg- 글루타메이트 완충액 보정 (K- 글루타메이트가 80 mM으로 고정 됨). 사각형 상자는 선택한 집중점을 나타냅니다. P = 플라스미드 DNA, L = 선형 DNA. (c) 각 용해물에 대한 최적의 Mg-글루타메이트 농도를 선택한 후, K-글루타메이트를 20 내지 240 mM로 적정하였다. 사각형 상자는 선택한 집중점을 나타냅니다. P = 플라스미드 DNA, L = 선형 DNA. 히트 맵 (B) 및 (C)에 표시된 데이터는 단일 실험에서 얻은 것입니다. (d) 완충액 보정 후, 각 DNA 유형의 5 nM로 무세포 반응을 수행하였다. 추출물 BL21 Rosetta2는 선형 DNA 발현을 지원하지 않는 반면, ΔrecB 및 ΔrecBCD 균주에서 차등적으로 최적화된 추출물은 플라스미드 DNA(파란색) 수준과 유사한 선형 DNA(녹색) 발현을 나타냅니다. 표시된 엔드포인트 데이터는 같은 날에 수행되고 배양 8시간 후에 수집된 3번의 반복실험에 대한 평균 ± SD입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 프로토콜의 시각적 표현. CFPS 합성의 주형으로 선형 DNA를 위한 세포 용해물 준비 및 용해물 최적화를 위한 워크플로우. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
표 1: 액체 및 고체 2xYT+P 배지 준비를 위한 구성 요소 목록. 각 구성 요소의 수량(그램)은 1L의 용지에 대해 지정됩니다. 필요에 따라 비례적으로 확장합니다. 사용하기 전에 미디어를 오토클레이브해야 합니다. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
표 2: 버퍼 S30A+DTT 준비를 위한 구성 요소 목록. 각 성분의 수량 (그램)은 버퍼 S30A의 1L에 대해 지정됩니다. 필요에 따라 비례적으로 확장합니다. S30A 완충액은 사용하기 전에 오토클레이브한 다음 냉각(4°C)해야 합니다. DTT 완충액은 지시된 대로 별도로 준비 및 여과하고(15mL 튜브에서) -20°C에 보관해야 합니다. 버퍼 S30A를 사용하기 직전에 2mL의 DTT(1M 스톡에서)를 1L의 S30A 버퍼에 추가합니다. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
표 3: 에너지 용액 준비를 위한 구성 요소 목록. 각 성분의 양 (그램) 또는 부피는 표시된 농도 (F 열)에 대한 저장 용액의 지정된 부피 (H 열)를 준비하기 위해 지정됩니다 (G 열). 각 성분의 pH는 필요한 경우 표시된대로 조정해야합니다 (열 I 및 J). 14x 에너지 솔루션 스톡은 나열된 각 구성 요소(열 K)의 나열된 부피를 나열된 순서대로 혼합하여 준비됩니다. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
표 4: 아미노산 원액의 제조를 위한 성분 목록. 4x 아미노산 원액을 준비하려면 모든 아미노산을 나열된 순서대로 혼합해야 합니다. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
표 5. 용해물 교정 용액 준비를위한 구성 요소 목록. Mg- 글루타메이트 및 K- 글루타메이트 스톡 용액의 양 (그램)은 각 완충액의 표시된 농도 50mL를 준비하도록 지정됩니다. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
표 6: 이 프로토콜에 사용된 박테리아 균주 목록. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
표 7: 이 프로토콜에 사용된 프라이머 목록. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
표 8: 용해물 보정을 위해 이 프로토콜에서 PCR에 의한 선형 DNA 증폭을 위한 주형으로 사용되는 플라스미드. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
표 9: FITC 및 eGFP 변환. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
여기에서 우리는 recB 또는 recBCD 오페론에 대한 게놈 녹아웃을 가진 대장균 BL21 Rosetta2에서 준비된 세포 용해물이 선형 DNA 주형에서 높은 단백질 발현을 지원한다는 것을 보여줍니다. 이 프로토콜은 선형 DNA 템플릿에 특이적인 단계별 용해물 보정 절차(그림 2)를 정교하게 설명하며, 이는 선형 DNA의 σ70 프로모터에서 높은 발현을 유도하여 등몰 DNA 농도에 대한 플라스미드 근처 수준에 도달하는 중요한 단계입니다. 이 프로토콜은 최종 응용 분야에서 사용되는 DNA 유형(선형 또는 플라스미드)에 따른 버퍼 교정의 중요성을 강조합니다.
이 프로토콜은 플라스미드 클로닝을 방지하는 데 도움이 될 수 있으며, 이는 시간과 비용면에서 상당한 이점을 제공합니다. 선형 DNA 단편은 상업적 제공자에 의해 합성되거나 실험실에서 PCR에 의해 증폭될 수 있다. 플라스미드 DNA를 사용하는 동일한 프로세스는 클로닝, 서열 확인 및 DNA 준비 단계10을 고려하여 최소 1주일이 더 걸립니다. 실험14,15 사이의 배치 간 변동성을 최소화하기 위해 대량의 세포 추출물과 선형 DNA 주형을 준비하는 것이 좋습니다.
이 방법은 견고하고 실험실10에서 사용되는 것으로 나타났습니다. 이러한 추출물의 결과는 생물학적 복제물, 다양한 추출물 배치 및 다양한 균주 배경에서 일관되었습니다10. 프로토콜의 견고성은 세포 용해 방법, 온도, DNA 주형 및 다양한 DNA 농도와 같은 다양한 실험 매개변수에서도 테스트되었습니다. 이 방법은 이미 두 가지 관련 응용 분야에 대한 유전자 구축물의 신속한 스크리닝 및 특성화에 사용되었습니다 : 토홀드 스위치 라이브러리 특성화 및 효소 활성 스크리닝10.
이 연구에서 생산성이 높은 모 균주 E. coli BL21 Rosetta2의 ΔrecB/ΔrecBCD 추출물의 선형 DNA에서 높은 발현 수준을 얻었지만 이 방법론은 새로운 관심 균주에 대한 게놈 엔지니어링이 필요합니다. 대조적으로, GamS5 또는 Chi DNA6과 같은 선형 DNA 보호제를 보충하면 새로운 균주에 적용하기가 더 쉽지만 비용이 많이 들고 시간이 많이 걸립니다.
여기에 제공된 프로토콜은 무세포 시스템에서 선형 DNA 템플릿의 사용을 용이하게 하고 합성 생물학 커뮤니티의 설계-구축-테스트 주기를 가속화합니다. ΔrecB/ΔrecBCD 추출물의 선형 DNA 템플릿에서 보다 쉽게 무세포 발현을 하여 관심 있는 저분자, 바이오시밀러 및 기타 주문형 현장 진료 애플리케이션을 생산할 수 있습니다.
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Disclosures
없음
Acknowledgments
ACB와 JLF는 ANR SINAPUV 보조금(ANR-17-CE07-0046)의 자금 지원을 인정합니다. JLF와 JB는 ANR SynBioDiag 보조금(ANR-18-CE33-0015)의 자금 지원을 인정합니다. MSA와 JLF는 ANR iCFree 보조금(ANR-20-BiopNSE)의 자금 지원을 인정합니다. JB는 "COMPUCELL"(보조금 번호 657579)을 시작하는 ERC의 지원을 인정합니다. Centre de Biochimie Structurale은 프랑스 통합 구조 생물학 인프라 (FRISBI) (ANR-10-INSB-05-01)의 지원을 인정합니다. MK는 INRAe의 MICA 부서, Université Paris-Saclay, Ile-de-France (IdF) 지역의 DIM-RFSI 및 ANR DREAMY (ANR-21-CE48-003)의 자금 지원을 인정합니다. 이 연구는 유럽 연구위원회 통합 상 (865973 CLB)을 통한 자금 지원으로 지원되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-YT Broth | Invitrogen | 22712020 | |
| 1.5 mL Safe-Lock tubes | Eppendorf | 30120086 | 1.5 mL microtube |
| 384-well square-bottom microplate | Thermo Scientific Nunc | 142761 | |
| 3PGA (D-(-)-3-Phosphoglyceric acid disodium) | Sigma-Aldrich | P8877 | |
| adhesive plate seal | Thermo Scientific Nunc | 232701 | |
| Agar | Invitrogen | 30391023 | |
| ATP (Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate) | Sigma-Aldrich | A8937 | |
| BL21 Rosetta2 | Merck Millipore | 71402 | |
| BL21 Rosetta2 ΔrecB | Addgene | 176582 | |
| BL21 Rosetta2 ΔrecBCD | Addgene | 176583 | |
| cAMP (Adenosine 3' 5'-cyclic monophosphate) | Sigma-Aldrich | A9501 | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | |
| CoA (Coenzyme A hydrate) | Sigma-Aldrich | C4282 | |
| Corning 15 mL PP Centrifuge Tubes, Rack Packed with CentriStar Cap, Sterile | Corning | 430790 | 15 mL tube |
| Corning 50 mL PP Centrifuge Tubes, Conical Bottom with CentriStar Cap, Sterile | Corning | 430828 | 50 mL tube |
| CTP (Cytidine 5'-triphosphate, disodium salt hydrate) | Alfa Aesar | J62238 | |
| DpnI | NEB | R0176S | |
| DTT (DL-Dithiothreitol) | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| Folinic acid (solid folinic acid calcium salt) | Sigma-Aldrich | F7878 | |
| GTP (Guanosine 5?-Triphosphate, Disodium Salt) | Sigma-Aldrich | 371701 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| K phosphate dibasic (K2HPO4) | Carl Roth | 231-834-5 | |
| K phosphate monobasic (H2KO4P) | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| K-glutamate | Alfa Aesar | A17232 | |
| Mg-glutamate | Sigma-Aldrich | 49605 | |
| Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm, polyethersulfone | Merck Millipore | SLGP033RB | membrane filter 0.22 µm |
| Monarch PCR & DNA Cleanup Kit | NEB | T1030S | PCR & DNA cleanup Kit |
| Monarch Plasmid Miniprep Kit | NEB | T1010S | Plasmid Miniprep Kit |
| NAD (B-nicotinamide adenine dinucleotide hydrate) | Sigma-Aldrich | N6522 | |
| NIST-traceable FITC standard | Invitrogen | F36915 | NIST-FITC |
| NucleoBond Xtra Maxi kit | Macherey-Nagel | 740414.1 | Plasmid Maxiprep Kit |
| PEG 8000 | Sigma-Aldrich | 89510 | |
| plate reader | Biotek | Synergy HTX | |
| Purified Recombinant EGFP Protein | Chromotek | egfp-250 | recombinant eGFP |
| Q5 High-Fidelity 2X Master Mix | NEB | M0492S | DNA polymerase |
| Q5 High-Fidelity 2X Master Mix | New England Biolabs | M0492L | DNA polymerase |
| Qubit dsDNA BR Assay Kit | Thermo | Q32850 | fluorometric assay with DNA-binding dye |
| RTS Amino Acid Sampler | biotechrabbit | BR1401801 | |
| Spermidine | Sigma-Aldrich | 85558 | |
| Sterile water | Purified water from the Millipore RiOs 8 system, sterilized by autoclaving. | ||
| Tris base | Life Science products Cytiva | 17-1321-01 | |
| tRNA | Roche | 10109550001 | |
| Ultrasonic processor Vibra cell VC-505 | SONICS | VC505 | sonicator |
| UTP Na3 (Uridine 5'- triphosphate, trisodium salt hydrate) | Acros Organics | 226310010 | |
| Water, nuclease-free | Thermo | R0581 | nuclease-free water |
References
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