Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Бесклеточный синтез белка из экзонуклеазно-дефицитных клеточных экстрактов с использованием линейных шаблонов ДНК

Published: August 9, 2022 doi: 10.3791/64236
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2,3, 4, 1
1INRAe, AgroParisTech, Micalis Institute, Université Paris-Saclay, 2Helmholtz Institute for RNA-based Infection Research (HIRI), Helmholtz-Centre for Infection Research (HZI), 3Medical Faculty, University of Würzburg, 4Centre de Biochimie Structurale, INSERM U1054, CNRS UMR 5048, University of Montpellier
* These authors contributed equally

Summary

Здесь представлен протокол получения и буферной калибровки клеточных экстрактов из нокаутирующих штаммов экзонуклеазы V Escherichia coli BL21 Rosetta2 (ΔrecBCD и ΔrecB). Это быстрый, простой и прямой подход к экспрессии в бесклеточных системах синтеза белка с использованием линейных шаблонов ДНК.

Abstract

Бесклеточный синтез белка (CFPS) в последнее время стал очень популярным в области синтетической биологии благодаря своим многочисленным преимуществам. Использование линейных шаблонов ДНК для CFPS позволит технологии достичь своего полного потенциала, уменьшая время эксперимента за счет устранения этапов клонирования, трансформации и экстракции плазмид. Линейная ДНК может быть быстро и легко амплифицирована с помощью ПЦР для получения высоких концентраций шаблона, избегая потенциальной токсичности экспрессии in vivo . Однако линейные шаблоны ДНК быстро разлагаются экзонуклеазами, которые естественным образом присутствуют в клеточных экстрактах. Существует несколько стратегий, которые были предложены для решения этой проблемы, такие как добавление ингибиторов нуклеазы или химическая модификация линейных концов ДНК для защиты. Все эти стратегии стоят дополнительного времени и ресурсов и еще не достигли почти плазмидных уровней экспрессии белка. Подробный протокол для альтернативной стратегии представлен здесь для использования линейных шаблонов ДНК для CFPS. Используя клеточные экстракты из нокаут-клеток с дефицитом экзонуклеазы, линейные шаблоны ДНК остаются нетронутыми, не требуя каких-либо конечных модификаций. Представлены этапы получения клеточного лизата из штамма Escherichia coli BL21 Rosetta2 ΔrecBCD методом лизиса ультразвуком и калибровки буфера для Mg-глутамата (Mg-glu) и K-глутамата (K-glu) специально для линейной ДНК. Этот метод способен достичь уровней экспрессии белка, сопоставимых с уровнями плазмидной ДНК в CFPS E. coli .

Introduction

Системы бесклеточного синтеза белка (CFPS) все чаще используются в качестве быстрого, простого и эффективного метода для биосенсорной инженерии, децентрализованного производства и прототипирования генетических схем1. Благодаря своему большому потенциалу, системы CFPS регулярно используются в области синтетической биологии. Однако до сих пор системы CFPS полагаются на круговые плазмиды, которые могут ограничить технологию от достижения ее полного потенциала. Подготовка плазмидной ДНК зависит от многих трудоемких этапов во время клонирования и большого количества выделения ДНК. С другой стороны, амплификация ПЦР из плазмиды или синтезированного шаблона ДНК может быть использована для простого приготовления шаблонов CFPS в течение нескольких часов 2,3. Поэтому применение линейной ДНК предлагает перспективное решение для CFPS. Однако линейная ДНК быстро разлагается экзонуклеазами, естественным образом присутствующими в клеточных экстрактах4. Существуют решения, которые решают эту проблему, такие как использование λ-фагового белка GamS5 или ДНК, содержащей сайты Chi6 в качестве защитных агентов, или прямая защита линейной ДНК путем химической модификации ее концов 2,7,8,9. Все эти методы требуют добавок к клеточному экстракту, которые являются дорогостоящими и трудоемкими. Давно известно, что комплекс экзонуклеазы V (RecBCD) разрушает линейную ДНК в клеточных лизатах4. Недавно мы показали, что линейная ДНК может быть гораздо лучше защищена в лизатах из клеток, выбитых для генов экзонуклеазы (recBCD)10.

В этом протоколе подробно описаны этапы получения бесклеточных лизатов из штамма E. coli BL21 Rosetta2 ΔrecBCD методом лизиса ультразвуком. Лизис ультразвуком является распространенным и доступным методом, используемым несколькими лабораториями11,12. Экстракты, полученные из этого штамма, не нуждаются в добавлении какого-либо дополнительного компонента или модификации шаблона ДНК для поддержки экспрессии из линейных шаблонов ДНК. Метод опирается на существенный этап оптимизации буфера для клеточных экстрактов специально для линейной экспрессии ДНК из нативных промоторов E. coli. Было показано, что эта специфическая оптимизация буфера для линейной экспрессии ДНК является ключом к тому, чтобы нативные промоторы σ70 давали высокую выработку белка без белка GamS или добавок ДНК Chi, даже избегая очистки продуктов ПЦР10. Было обнаружено, что оптимальная концентрация Mg-клея для линейной экспрессии ДНК аналогична концентрации для плазмидной ДНК. Однако оптимальная концентрация K-клея показала существенную разницу между линейной и плазмидной ДНК, вероятно, из-за механизма10, связанного с транскрипцией. Функциональность белков, экспрессируемых с помощью этого метода, была продемонстрирована для нескольких применений, таких как быстрый скрининг переключателей пальцев ног и оценка активности вариантов ферментов10.

Этот протокол обеспечивает простое, эффективное и экономичное решение для использования линейных шаблонов ДНК в бесклеточных системах E. coli путем простого использования мутантных экстрактов клеток ΔrecBCD и специальной калибровки для линейной ДНК в качестве шаблона.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Подготовка среды и буфера

  1. Приготовление среды 2xYT+P (твердой и жидкой)
    1. Готовят жидкие и твердые среды, как описано в таблице 1, а затем стерилизуют автоклавированием.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого протокола требуется одна агаровая пластина 2xYT+P, содержащая хлорамфеникол (10 мкг/мл). Объем жидких сред пропорционален объему требуемого лизата. Здесь используется начальный объем 5 л жидкой среды 2xYT+P. Тем не менее, объем может быть отрегулирован по мере необходимости, зная, что 1 л клеточной культуры приводит к образованию от 2 до 3 мл конечного лизата клеток.
  2. Приготовление хлорамфеникола (34 мг/мл)
    1. Взвесьте 0,34 г хлорамфеникола, добавьте этанол до 10 мл и растворите путем смешивания. Aliquot по 1 мл в несколько пробирок и хранить при -20 °C для последующего использования.
  3. Подготовка буфера S30A
    1. Подготовьте буфер S30A в соответствии с таблицей 2, нацеливаясь на 2 л этого буфера.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Опять же, объем этого буфера пропорционален объему требуемого лизата.
    2. Перед автоклавированием отрегулируйте рН буфера до 7,7 с помощью ледниковой уксусной кислоты.
    3. Автоклавируйте буфер.
    4. Сохраните этот буфер при температуре 4 °C после автоклавирования.
    5. Перед использованием добавьте DTT (отфильтрованный мембранным фильтром 0,22 мкм) в буфер S30A для достижения конечной концентрации 2 мМ (2 мл запаса 1 M DTT до 1 л буфера S30A).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Опять же, объем этого буфера пропорционален объему требуемого лизата.
  4. Приготовление энергетического раствора
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот энергетический раствор основан на статье Sun et al. 13 (концентрация запаса 14x). В таблице 3 кратко излагаются компоненты, необходимые для подготовки запасов энергетического раствора, с каталожными номерами для всех химических веществ, используемых в настоящем протоколе.
    1. Подготовьте запасы растворов согласно таблице 3 и держите их на льду.
    2. Откалибруют pH в соответствии с требованиями для указанных компонентов либо с буфером Tris 2 M (60,57 г основания Tris в объеме стерильной воды 250 мл), либо KOH 15% (15 г KOH в объеме стерильной воды 100 мл), как указано в таблице 3.
    3. В пробирке объемом 15 мл добавьте объем каждого компонента в порядке, указанном в таблице 3.
    4. Аликвота энергетического раствора, 150 мкл на трубку.
    5. Аликвоты мгновенной заморозки на сухом льду и хранение при -80 °C.
  5. Приготовление раствора аминокислоты (АА)
    ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор аминокислот готовится с помощью комплекта RHS Amino Acid Sampler. Каждая из 20 аминокислот поставляется в этом наборе в виде объема 1,5 мл при 168 мМ, за исключением лейцина, который составляет 140 мМ. Здесь приготовленный стоковый раствор является 4x концентрированным, а не требуемым рабочим раствором. Конечная концентрация раствора аминокислоты составляет 6 мМ для всех аминокислот, за исключением лейцина, который составляет 5 мМ.
    1. Разморозьте 20 аминокислотных трубок путем вихря и инкубируйте при 37 °C до полного растворения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Cys не может растворяться полностью.
    2. В пробирку объемом 50 мл добавляют по 12 мл стерильной воды и по 1,5 мл каждой аминокислоты в порядке, указанном в таблице 4.
    3. Вихрь до тех пор, пока раствор не станет достаточно прозрачным, инкубируя при 37 °C при необходимости.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Cys не может растворяться полностью.
    4. Аликвота 500 мкл раствора аминокислоты на пробирку на льду.
    5. Заморозьте аликвоты на сухом льду и храните при -80 °C.
  6. Подготовка растворов для калибровки буфера
    1. Подготовьте бульонный раствор для Mg-клея (100 мМ) и К-клея (3 М), как указано в таблице 5. Производят последовательное разбавление (в объеме 1 мл) из этих запасов для Mg-клея (от 0 до 20 мМ) и К-клея (от 20 до 300 мМ), как указано в Дополнительном файле 1 для этапов калибровки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эти концентрации запасов предназначены для этапа калибровки и, возможно, потребуется изменить при настройке окончательного эксперимента. Самые высокие концентрации запасов, протестированных для этого протокола, составляют 1 М и 4,5 М для Mg-клея и К-глю соответственно.
  7. Подготовка запаса раствора ПЭГ8000
    1. Готовят 50 мл 40% раствора ПЭГ8000 (20 г ПЭГ8000 в 50 мл стерильной воды).

2. Клеточная культура и препарат лизата (4-дневный эксперимент)

  1. День 1
    1. Полосовой штамм BL21 Rosetta2 ΔrecBCD (Таблица 6) из запаса глицерина -80 °C на агаровую пластину 2xYT +P, содержащую 10 мкг/мл хлорамфеникола. Альтернативно, BL21 Rosetta2 ΔrecB (таблица 6) также может быть использован10.
    2. Инкубировать в течение ночи при 37 °C.
  2. День 2
    1. Инокулируйте одну колонию из вышеупомянутой агаровой пластины в 10 мл 2xYT + P, дополненное 10 мкг / мл хлорамфеникола.
    2. Инкубировать в течение ночи при 37 °C с встряхиванием 200 об/мин.
  3. День 3
    1. Создают субкультуру, разбавляя культуру на ночь 100 раз в 4 л свежей среды 2xYT+P, содержащей 10 мкг/мл хлорамфеникола.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Например, 40 мл ночной культуры добавляют в 3960 мл свежих сред. После разбавления 4 л среды делят на 4 колбы (объем 5 л) таким образом, чтобы каждая колба содержала 1 л.
    2. Инкубируют при 37 °C, 200 об/мин в течение примерно 3-4 ч роста, чтобы достичь OD600 1,5-2,0. Разбавляют культуру в 4 раза при измерении ОД600 > 0,8.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Точное время инкубации может варьироваться в зависимости от штамма, исходного инокулята, лабораторной посуды и используемых инструментов. Нокаутирующие штаммы ΔrecB/ΔrecBCD имеют темпы роста, сопоставимые с родительскими BL21 Rosetta2 (дополнительный рисунок 1).
    3. Положите культуру на лед.
    4. Раскрутите ячейки при 5000 х г в течение 12 мин при 4 °C, а затем выбросьте супернатант путем декантирования.
    5. Повторное суспендирование клеточных гранул в 800 мл охлажденного S30A+DTT.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Объем S30A+DTT в 5 раз меньше, чем исходный объем клеточной культуры. Например, для стартового объема 1 л клеточной культуры повторно суспендируют клеточные гранулы в 200 мл S30A+DTT. Также рекомендуется проводить этот этап в холодном помещении при 4 °C, а также держать все материалы на льду.
    6. Раскрутите ячейки при 5000 х г в течение 12 мин при 4 °C, а затем выбросьте супернатант путем декантирования.
    7. Повторите шаги 2.3.5 и 2.3.6.
    8. Повторное суспендирование клеточных гранул в 160 мл охлажденного S30A+DTT.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На этот раз объем S30A+DTT в 25 раз меньше, чем исходный объем клеточной культуры. Например, для стартового объема 1 л клеточной культуры повторно суспендируют клеточные гранулы в 40 мл S30A+DTT. Опять же, рекомендуется проводить этот шаг в холодном помещении при 4 °C, а также держать материалы на льду.
    9. Переложите ячейки в охлажденные и предварительно взвешенные трубки объемом 50 мл.
    10. Раскрутите ячейки при 2000 х г в течение 8 мин при 4 °C, а затем выбросьте супернатант путем декантирования.
    11. Раскрутите ячейки при 2000 х г в течение 4 мин при 4 °C, а затем осторожно удалите оставшийся супернатант с помощью пипетки.
    12. Повторно измерьте вес трубки, чтобы рассчитать вес ячейки гранулы.
    13. Выдерживайте гранулы ячейки при температуре -80 °C.
  4. День 4
    1. Возьмите гранулы ячейки от -80 °C и разморозьте их на льду в течение 1-2 ч.
    2. Повторно суспендируйте гранулы клеток в 0,9 мл буфера S30A+DTT на грамм веса гранул. Пипетка медленно ресуспендирует клетки, избегая верхней пены как можно больше, если таковая имеется.
    3. Поместите 1 мл аликвоты повторно суспендированных клеток в микротрубки объемом 1,5 мл и держите их на льду или предварительно охлажденной холодной глыбе при 4 °C (предпочтительно использовать металлические блоки).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если последняя аликвота намного меньше 1 мл, лучше отбросить ее, чем обрабатывать ультразвуком неоптимальный объем. Оптимальный объем (1 мл) для обработки ультразвуком был определен для этой установки (трубка, ультразвук и зонд) и может варьироваться для другой.
    4. Обработайте каждую трубку ультразвуком в ультразвуке (зонд 3 мм, частота 20 кГц), с установкой амплитуды 20% в течение трех циклов (30 с ультразвуком, 1 мин пауза).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Общая энергия, полученная в течение трех циклов, составила ~266 Джоулей (~80-110 Дж за цикл). Во время этого шага держите трубки на холодной глыбе, которая окружена льдом. Чередуйте два холодных блока, чтобы избежать перегрева зонда (резервный холодный блок также остается холодным на льду). Оба холодных блока были предварительно охлаждены в холодильнике за день до обработки ультразвуком.
    5. Открутите лизат при 12 000 х г в течение 10 мин при 4 °C.
    6. Соберите супернатант (клеточный лизат) пипеткой и переложите в трубку объемом 50 мл.
    7. Инкубируют лизат клеток при 37 °C при перемешивании 200 об/мин в течение 80 мин.
    8. Открутите лизат при 12 000 х г в течение 10 мин при 4 °C.
    9. Соберите супернатант и аликвоту по 30 мкл в предварительно охлажденные микротрубки объемом 1,5 мл, сохраняя при этом все трубки на льду.
    10. Заморозьте аликвоты лизата на сухом льду и храните при -80 °C.

3. Бесклеточная калибровка буфера для линейной ДНК

ПРИМЕЧАНИЕ: Бесклеточный буфер калибровали для оптимальных концентраций Mg-клея и К-клея, как описано в Sun et al.13. Для этапов калибровки необходим дополнительный файл 1 . Реакции были установлены на конечный объем 10,5 мкл каждая. Экстракты калибровали с использованием 1 нМ линейной (см. раздел 4 ниже) или плазмидной ДНК. Эксперименты могут быть выполнены в тот же день, когда подготовлены буферы, или подготовленные буферы могут быть заморожены при -80 °C для проведения эксперимента в другой день. На всех этапах калибровки каждый компонент размораживался на льду перед смешиванием и пипеткой в пластину с 384 скважинами.

  1. Приготовьте Мастер-микс в соответствии с вкладкой «Буферная подготовка» в дополнительном файле 1 файла Excel, содержащий: (a) клеточный экстракт (33% от общего объема реакции), (b) репортерную ДНК (в виде линейной и/или плазмидной ДНК) до конечной концентрации 1 нМ, (c) бесклеточный буфер (PEG8000, раствор AA и энергетический раствор) и (d) K-клей до конечной концентрации 80 мМ.
  2. Для реакционного объема 10,5 мкл берут 1,05 мкл (10% общей реакции) различных концентраций Mg-клея 10x концентрированных запасов (конечные диапазоны концентраций: 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 и 20 мМ) и добавляют 9,45 мкл (90% общей реакции) Мастер-микса. Аккуратно перемешать.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте восьмиполосные трубки ПЦР для приготовления разведения и смешивания с многоканальной пипеткой. При необходимости может быть использован другой диапазон концентраций Mg-клея.
  3. Пипетка 10 мкл вышеуказанных реакций превращается в 384-луночную микропластину с квадратным дном, покрывает ее с помощью уплотнения клейкой пластины и измеряет экспрессию генов в качестве выхода флуоресценции. Запись флуоресцентных данных с помощью пластинчатого считывателя (например: 485 нм; Em: 528 нм) через равные промежутки времени (например, 5 мин) в течение 8 ч инкубации при 30 °C с непрерывным встряхиванием орбиты при 307 cpm.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости открутите 384-луночную микропластину (<2 500 х г, 1 мин, комнатная температура) перед началом сбора данных. Измерения конечных точек использовались для сравнения выражений GFP в различных буферных композициях. Значения флуоресценции могут быть преобразованы в стандартизированные единицы для построения графиков (см. ниже).
  4. Определите концентрацию Mg-клея, которая приводит к наибольшему значению флуоресценции в конечной точке.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если вы не уверены в оптимальной концентрации Mg-клея, повторите этап 3.2 с более разнообразными диапазонами концентраций.
  5. С оптимизированной концентрацией Mg-клея перейдите к калибровке K-клея для диапазона концентраций (20, 40, 60, 80, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 220 и 240 мМ), используя те же объемы, которые указаны на этапе 3.2. Запустите эксперимент и определите самое высокое значение флуоресценции среди протестированных концентраций K-клея. Это указывает на оптимальный буферный состав для Mg-клея и K-клея для этого лизата.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если вы не уверены в полученной оптимальной концентрации K-клея, повторите этап с более разнообразными диапазонами концентраций.
  6. После того, как значения Mg-glu и K-glu установлены, подготовьте бульочные трубки оптимизированного буферного состава в соответствии с полученным объемом партии. Используйте вкладку «Подготовка буфера» в дополнительном файле 1 для расчета необходимого количества буферных пробирок, аликвоты 38 мкл на пробирку и хранения при -80 °C.

4. Линейная подготовка ДНК

ПРИМЕЧАНИЕ: Для калибровки лизата используется плазмида P70a-deGFP. Эта плазмида поддерживалась в E. coli KL740 cl857+ (таблица 6) для минипрепа с использованием комплекта Plasmid Miniprep kit или maxiprep с использованием Plasmid Maxiprep Kit. Линейные фрагменты ДНК, используемые в качестве шаблонов экспрессии в бесклеточных реакциях, аплодировали ПЦР с использованием праймеров и шаблонов, перечисленных в таблицах 7 и 8.

  1. ПЦР амплируют из плазмиды P70a-deGFP с использованием ДНК-полимеразы с олигопраймерами, перечисленными в таблице 7. Настройте реакции ПЦР в объеме 50 мкл в соответствии с протоколом производителя, используя программу термоциклера: [98 °C в течение 2 мин; 40 циклов x (98 °C в течение 30 с → 66 °C в течение 30 с → 72 °C в течение 60 с); 72 °C в течение 10 мин; 4 °C для ∞].
  2. Переварить шаблон ДНК в реакциях ПЦР путем добавления 1 мкл фермента рестрикции DpnI на 50 мкл ПЦР-реакции и инкубировать при 37 °C в течение 1 ч. Затем очистите реакцию ПЦР с помощью набора для очистки ПЦР и ДНК и элюируйте в воде без нуклеаз.
  3. Перед использованием проверьте продукты ПЦР на 1% агарозном геле (1x TAE).
  4. Количественно оценить очищенные продукты ПЦР (или плазмидные препы) с помощью Nanodrop (ND-1000).
    ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании ДНК-полимеразы/буфера, который непосредственно совместим с последующей бесклеточной реакцией, этап очистки (этап 2) может быть полностью пропущен, а концентрация неочищенной ДНК измерена флуорометрическим анализом с ДНК-связывающим красителем (см. Batista et al.10).

5. Экспериментальное исполнение

ПРИМЕЧАНИЕ: В дополнение к использованию дополнительного файла 1 для калибровки буферного запаса для каждой подготовленной партии лизата (выше), рекомендуется использовать вкладку «Подготовка реакции» в файле для настройки последующих бесклеточных реакций. Как и прежде, объем реакций устанавливается на уровне 10,5 мкл на реакцию, из которых только 10 мкл окончательно пипетируется в 384-луночную пластину для сбора данных. Здесь 5 нМ каждого шаблона используется для бесклеточной экспрессии. Важно быть последовательным при пипетке реакций – используйте одну и ту же пипетку и тип наконечников. Дозируйте осторожно, чтобы избежать пузырьков в колодце или жидкости, прилипшей к стенкам колодца. При необходимости открутите пластину (<2 500 х г, 1 мин, комнатная температура).

  1. Рассчитайте объемы пипетки, введя описания образцов и реплики, необходимые для каждого образца, на вкладке «Подготовка реакции» дополнительного файла 1.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если требуется реакционный объем, отличный от 10,5 мкл, он также может быть введен в Дополнительный файл 1. В файле будет рассчитано количество трубок ранее оптимизированных буферных запасов и клеток экстракционных трубок, подлежащих размораживанию на льду.
  2. Нанесите метку на микротрубку объемом 1,5 мл для приготовления Optimal Master Mix (отдельно для линейной и плазмидной ДНК), добавьте правильные объемы буфера и лизата и аккуратно перемешайте.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за различий в оптимальных концентрациях K-клея в их буферах копии вкладки «Подготовка реакции» следует использовать отдельно для линейной и плазмидной ДНК.
  3. Сначала пипетка берет образцы ДНК, затем воду без нуклеазы и, наконец, оптимальную мастер-смесь (MM) из шага 5.2. Осторожно перемешайте бесклеточную реакцию с пипеткой непосредственно перед добавлением в считыватель пластин и избегайте пузырьков.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте восьмиполосную трубку ПЦР для смешивания реакционного объема для дополнительной репликации. Например, если предназначены технические трипликаты, подготовьте смесь для четырех реакций и оставьте мертвый объем в трубке, чтобы уменьшить ошибки пипетирования при добавлении образцов на пластину.
  4. Настройка реакций в пластинчатом считывателе (Ex 485 нм; Эм 528 нм). Кинетические прогоны регистрировали данные флуоресценции через равные промежутки времени (например, 5 мин) в течение 8 ч инкубации при 30 °C с непрерывным встряхиванием орбиты при 307 cpm.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Измерения конечной точки были представлены как 8-часовая временная точка. Собранные значения флуоресценции находятся в произвольных единицах (а.е.), но они могут быть преобразованы в стандартизированные единицы для построения графиков (см. Ниже).

6. Относительная количественная оценка FITC и GFP

ПРИМЕЧАНИЕ: Выражение GFP экспортируется пластинчатым считывателем в произвольных флуоресцентных единицах (a.u.). Тем не менее, рекомендуется использовать стандартизированные единицы измерения для сравнения значений флуоресценции между различными настройками (партиями, оборудованием, пользователями и лабораториями). Здесь представлены подробные шаги по преобразованию значений флуоресценции (a.u.) в значения, эквивалентные FITC, и значения eGFP (μM) с использованием стандартных кривых NIST-FITC и рекомбинантного eGFP. Храните раствор NIST-FITC при 4 °C и храните рекомбинантный eGFP при -20 °C. Убедитесь, что запасной раствор и серийные разбавления защищены от света. При доставке рекомендуется аликвоцитировать рекомбинантный eGFP на меньшие объемы, чтобы избежать многократных циклов замораживания-оттаивания.

  1. Готовят раствор бората натрия 100 мМ, рН 9,5, и хранят при комнатной температуре или при 4 °C.
  2. Подготовьте 12 разведений (70 мкл каждое) для стандартной кривой, 2 раза на шаг (50, 25, 12,5, 6,25, 3,125, 1,562, 0,781, 0,390, 0,195, 0,097, 0,048 и 0 мкМ) стандарта FITC, отслеживаемого NIST, из запаса 50 мкМ с использованием раствора бората натрия. Подготовьте серию разбавления в трех экземплярах.
  3. Аналогично этапу 6.2, готовят последовательные разведения (по 70 мкл каждое) из рекомбинантного eGFP с использованием раствора бората натрия (1,2, 0,3, 0,075, 0,0188, 0,0047, 0,0012, 0,0003, 0,00007 и 0 мкМ). Для расчета молярности учитывайте полный размер белка (28 кДа) и концентрацию очищенного eGFP (1 г/л). Подготовьте серию разбавления в трех экземплярах.
  4. Добавьте 20 мкл каждого разбавления (девять скважин в каждой = три серии разбавления x три технические реплики) в микропластинку с квадратным дном из 384 скважин, покрытую уплотнением клейкой пластины, и инкубируйте в пластинчатом считывателе для измерения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь использовались настройки Возбуждение: 485/20, Излучение: 528/20, с коэффициентом усиления 50. Однако дополнительные комбинации длины волны/усиления также могут быть использованы для калибровки для других флуоресцентных молекул и/или настроек усиления. Для расчета коэффициента преобразования требуются одинаковые настройки длины волны и коэффициента усиления для получения данных флуоресценции GFP из бесклеточных экспериментов и стандартных данных кривой.
  5. Используйте линейный диапазон сигналов (здесь, например, [FITC] ≤ 0,781 мкМ), чтобы соответствовать наклону [y = ax иR2] для каждого условия.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Ассортимент может отличаться для разных машин и стандартных используемых решений.
  6. Сохраните данные для калибровки FITC и eGFP для расчета относительных измерений для лаборатории, следуя примеру, приведенному в таблице 9. Разделите значения, полученные в произвольных единицах флуоресценции (a.u.) на значение наклона кривой "a" (y = ax), чтобы оценить производство GFP в терминах FITC или eGFP.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Репрезентативные результаты показаны здесь после калибровки лизата для оптимальных уровней Mg-глутамата и K-глутамата отдельно для линейной и плазмидной ДНК (рисунок 1). Оптимальная концентрация Mg-глутамата аналогична для экстрактов ΔrecB и ΔrecBCD при 8 мМ (рисунок 1B). Однако оптимальная концентрация K-глутамата для плазмидной ДНК составляет 140 мМ, тогда как оптимальная концентрация K-глутамата для линейной ДНК для того же экстракта составляет 20 мМ (рисунок 1C). В сравнительном анализе экспрессии GFP в экстрактах из клеток WT и ΔrecBCD было замечено, что буферный состав экстрактов должен быть специально откалиброван для оптимальной экспрессии из линейной и плазмидной ДНК, используемой в экстрасодержащих экстрактах экзонуклеазы V.

После этапов калибровки уровни экспрессии GFP сравнивали с линейной и плазмидной ДНК (5 нМ) в экстракте WT и ΔrecBCD (рисунок 1D). Экспрессия GFP из линейной ДНК достигла 102% и 138% экспрессии из плазмидной ДНК в экстрактах штаммов ΔrecB и ΔrecBCD соответственно. Вместе эти результаты показывают, что экспрессия из линейной ДНК с использованием нативного промотора E. coli σ70 может достигать того же уровня, что и экспрессия плазмиды, когда клеточный лизат получают из таких мутантов, а бесклеточный буфер специально калибруется для линейной ДНК.

Figure 1
Рисунок 1: Дифференциальная оптимизация буфера для линейной и плазмидной ДНК в экстрактах ΔrecB/ΔrecBCD . (A) Линейный ампликон ДНК 1361 bp ампликон амплифицировали из плазмиды p70a-deGFP и использовали в качестве шаблона для экспрессии генов для калибровки буфера. (B) Калибровка буфера Mg-глутамата с 1 нМ каждого типа ДНК с использованием различных концентраций от 0 до 20 мМ (с фиксацией К-глутамата на 80 мМ). Квадратные поля указывают выбранные точки концентрации. P = плазмидная ДНК, L = линейная ДНК. (C) После выбора оптимальной концентрации Mg-глутамата для каждого лизата К-глутамат титровали от 20 до 240 мМ. Квадратные поля указывают выбранные точки концентрации. P = плазмидная ДНК, L = линейная ДНК. Данные, показанные на тепловых картах (B) и (C), взяты из одного эксперимента. (D) После калибровки буфера проводили бесклеточные реакции с 5 нМ каждого типа ДНК. Экстракт BL21 Rosetta2 не поддерживает линейную экспрессию ДНК, тогда как дифференциально оптимизированные экстракты из штаммов ΔrecB и ΔrecBCD демонстрируют линейную экспрессию ДНК (зеленую), аналогичную уровням плазмидной ДНК (синий). Показанные данные конечных точек представляют собой среднее ± SD для трех реплик, сделанных в один и тот же день и собранных после 8 ч инкубации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Визуальное представление протокола. Рабочий процесс получения лизата клеток и оптимизации лизата для линейной ДНК в качестве шаблона в синтезе CFPS. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Таблица 1: Перечень компонентов для приготовления жидких и твердых сред 2xYT+P. Количество (в граммах) каждого компонента указывается для 1 л среды. Масштабируйте пропорционально по мере необходимости. Перед использованием носители должны быть автоклавированы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Таблица 2: Перечень компонентов для подготовки буфера S30A+DTT. Количество (в граммах) каждого компонента указывается для 1 л буфера S30A. Масштабируйте пропорционально по мере необходимости. Буфер S30A должен быть автоклавирован, а затем охлажден (4 °C) перед использованием. Буфер DTT должен быть подготовлен и отфильтрован отдельно, как указано (в пробирке 15 мл) и храниться при -20 °C. Непосредственно перед использованием буфера S30A добавьте 2 мл DTT (от 1 мл запаса) к 1 л буфера S30A. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Таблица 3: Перечень компонентов для приготовления энергетического раствора. Количество (в граммах) или объем каждого компонента указывается (в колонке G) для приготовления указанного объема (в колонке Н) исходных растворов для указанной концентрации (в колонке F). При необходимости pH каждого компонента должен быть скорректирован, как это указано (в колонках I и J). 14x запас энергетического раствора готовят путем смешивания указанного объема каждого компонента (в столбце K) в указанном порядке. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Таблица 4: Перечень компонентов для приготовления раствора аминокислотного сырья. Для приготовления 4x аминокислотного раствора все аминокислоты должны быть смешаны в указанном порядке. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Таблица 5. Перечень компонентов для приготовления калибровочных растворов лизата. Количество (в граммах) исходных растворов Mg-глутамата и К-глутамата указывают для получения 50 мл указанной концентрации каждого буфера. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Таблица 6: Список бактериальных штаммов, используемых в этом протоколе. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Таблица 7: Перечень грунтовок, используемых в данном протоколе. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Таблица 8: Плазмида используется в этом протоколе для калибровки лизата и в качестве шаблона для линейной амплификации ДНК методом ПЦР. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Таблица 9: Преобразование FITC и eGFP. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Дополнительный файл 1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок 1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Здесь мы показываем, что клеточный лизат, полученный из E. coli BL21 Rosetta2 с геномным нокаутом для оперона recB или recBCD , поддерживает высокую экспрессию белка из линейных шаблонов ДНК. Этот протокол разрабатывает пошаговую процедуру калибровки лизата, специфичную для линейных шаблонов ДНК (рисунок 2), которая является критическим шагом, который приводит к высокой экспрессии промоторов σ70 в линейной ДНК, достигая почти плазмидных уровней для концентраций эквимолярной ДНК. Этот протокол подчеркивает важность калибровки буфера в соответствии с типом ДНК (линейной или плазмидной), которая будет использоваться в конечном применении.

Протокол может помочь избежать клонирования плазмид, что обеспечивает значительную экономию времени и затрат. Линейные фрагменты ДНК могут быть синтезированы коммерческими поставщиками и/или амплированы с помощью ПЦР в лаборатории. Тот же процесс с использованием плазмидной ДНК займет не менее 1 недели больше, принимая во внимание клонирование, проверку последовательности и этапыподготовки ДНК 10. Рекомендуется готовить большие объемы клеточного экстракта и линейные шаблоны ДНК, чтобы свести к минимуму вариабельность от партии к партии между экспериментами14,15.

Было показано, что этот метод является надежным и используется в лабораториях10. Результаты этих экстрактов были согласованы между биологическими репликами, различными партиями экстрактов, а также на разных фонах штаммов10. Надежность протокола также была проверена на различных экспериментальных параметрах: методах лизиса клеток, температурах, шаблонах ДНК и различных концентрациях ДНК. Метод уже использовался для быстрого скрининга и характеристики генетических конструкций для двух соответствующих применений: характеристика библиотеки переключателей пальцев ног и скрининг активности ферментов10.

Хотя высокие уровни экспрессии были получены в этом исследовании из линейной ДНК в экстрактах ΔrecB / ΔrecBCD из высокопродуктивного родительского штамма E. coli BL21 Rosetta2, методология потребует геномной инженерии для нового штамма, представляющего интерес. Напротив, добавки с защитными агентами для линейной ДНК, такими как GamS5 или Chi DNA6, легче применять для нового штамма, но они дороже и трудоемки.

Протокол, представленный здесь, облегчит использование линейных шаблонов ДНК в бесклеточных системах и ускорит циклы проектирования-сборки-тестирования для сообщества синтетической биологии. Более простая бесклеточная экспрессия из линейных шаблонов ДНК в экстрактах ΔrecB/ΔrecBCD может быть использована для производства малых молекул, представляющих интерес, биоаналогов и других приложений по требованию в местах оказания медицинской помощи.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Никакой

Acknowledgments

ACB и JLF признают финансовую поддержку гранта ANR SINAPUV (ANR-17-CE07-0046). JLF и JB признают финансовую поддержку гранта ANR SynBioDiag (ANR-18-CE33-0015). MSA и JLF признают финансовую поддержку гранта ANR iCFree (ANR-20-BiopNSE). JB подтверждает поддержку со стороны ERC, начиная с "COMPUCELL" (номер гранта 657579). Centre de Biochimie Structurale признает поддержку со стороны Французской инфраструктуры интегрированной структурной биологии (FRISBI) (ANR-10-INSB-05-01). МК признает финансовую поддержку со стороны департамента MICA INRAe, Университета Париж-Сакле, DIM-RFSI региона Иль-де-Франс (IdF) и ANR DREAMY (ANR-21-CE48-003). Эта работа была поддержана финансированием через Премию консолидатора Европейского исследовательского совета (865973 CLB).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-YT Broth Invitrogen 22712020
1.5 mL Safe-Lock tubes Eppendorf 30120086 1.5 mL microtube
384-well square-bottom microplate Thermo Scientific Nunc 142761
3PGA (D-(-)-3-Phosphoglyceric acid disodium) Sigma-Aldrich P8877
adhesive plate seal Thermo Scientific Nunc 232701
Agar Invitrogen 30391023
ATP (Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate) Sigma-Aldrich A8937
BL21 Rosetta2 Merck Millipore 71402
BL21 Rosetta2 ΔrecB Addgene 176582
BL21 Rosetta2 ΔrecBCD Addgene 176583
cAMP (Adenosine 3' 5'-cyclic monophosphate) Sigma-Aldrich  A9501
Chloramphenicol  Sigma-Aldrich C0378
CoA (Coenzyme A hydrate) Sigma-Aldrich C4282
Corning 15 mL PP Centrifuge Tubes, Rack Packed with CentriStar Cap, Sterile Corning 430790 15 mL tube
Corning 50 mL PP Centrifuge Tubes, Conical Bottom with CentriStar Cap, Sterile Corning 430828 50 mL tube
CTP (Cytidine 5'-triphosphate, disodium salt hydrate) Alfa Aesar  J62238
DpnI NEB R0176S
DTT (DL-Dithiothreitol) Sigma-Aldrich D0632
Folinic acid (solid folinic acid calcium salt) Sigma-Aldrich F7878
GTP (Guanosine 5?-Triphosphate,  Disodium Salt) Sigma-Aldrich 371701
HEPES Sigma-Aldrich  H3375
K phosphate dibasic (K2HPO4) Carl Roth 231-834-5
K phosphate monobasic (H2KO4P) Sigma-Aldrich P5655
K-glutamate Alfa Aesar A17232
Mg-glutamate  Sigma-Aldrich 49605
Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm, polyethersulfone Merck Millipore SLGP033RB membrane filter 0.22 µm
Monarch PCR & DNA Cleanup Kit NEB T1030S PCR & DNA cleanup Kit
Monarch Plasmid Miniprep Kit NEB T1010S Plasmid Miniprep Kit
NAD (B-nicotinamide adenine dinucleotide hydrate)  Sigma-Aldrich  N6522
NIST-traceable FITC standard Invitrogen F36915 NIST-FITC
NucleoBond Xtra Maxi kit Macherey-Nagel 740414.1 Plasmid Maxiprep Kit
PEG 8000 Sigma-Aldrich 89510
plate reader Biotek  Synergy HTX
Purified Recombinant EGFP Protein Chromotek egfp-250 recombinant eGFP
Q5 High-Fidelity 2X Master Mix NEB M0492S DNA polymerase
Q5 High-Fidelity 2X Master Mix New England Biolabs M0492L DNA polymerase
Qubit dsDNA BR Assay Kit Thermo Q32850 fluorometric assay with DNA-binding dye
RTS Amino Acid Sampler biotechrabbit BR1401801
Spermidine Sigma-Aldrich 85558
Sterile water Purified water from the Millipore RiOs 8 system, sterilized by autoclaving.
Tris base Life Science products Cytiva 17-1321-01 
tRNA Roche 10109550001
Ultrasonic processor Vibra cell VC-505 SONICS VC505 sonicator
UTP Na3 (Uridine 5'- triphosphate, trisodium salt hydrate) Acros Organics  226310010
Water, nuclease-free Thermo R0581 nuclease-free water

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Silverman, A. D., Karim, A. S., Jewett, M. C. Cell-free gene expression: an expanded repertoire of applications. Nature Reviews Genetics. 21 (3), 151-170 (2020).
  2. McSweeney, M. A., Styczynski, M. P. Effective use of linear DNA in cell-free expression systems. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, 715328 (2021).
  3. Schinn, S. -M. Protein synthesis directly from PCR: progress and applications of cell-free protein synthesis with linear DNA. New Biotechnology. 33 (4), 8 (2016).
  4. Prell, A., Wackernagel, W. Degradation of linear and circular DNA with gaps by the recBC enzyme of Escherichia coli. Effects of gap length and the presence of cell-free extracts. European Journal of Biochemistry. 105 (1), 109-116 (1980).
  5. Sitaraman, K., et al. A novel cell-free protein synthesis system. Journal of Biotechnology. 110 (3), 257-263 (2004).
  6. Marshall, R., Maxwell, C. S., Collins, S. P., Beisel, C. L., Noireaux, V. Short DNA containing χ sites enhances DNA stability and gene expression in E. coli cell-free transcription-translation systems. Biotechnology and Bioengineering. 114 (9), 2137-2141 (2017).
  7. Yim, S. S., Johns, N. I., Noireaux, V., Wang, H. H. Protecting linear DNA templates in cell-free expression systems from diverse bacteria. ACS Synthetic Biology. 9 (10), 2851-2855 (2020).
  8. Norouzi, M., Panfilov, S., Pardee, K. High-efficiency protection of linear DNA in cell-free extracts from Escherichia coli and Vibrio natriegens. ACS Synthetic Biology. 10 (7), 1615-1624 (2021).
  9. Zhu, B., et al. Increasing cell-free gene expression yields from linear templates in Escherichia coli and Vibrio natriegens extracts by using DNA-binding proteins. Biotechnology and Bioengineering. 117 (12), 3849-3857 (2020).
  10. Batista, A. C., et al. Differentially optimized cell-free buffer enables robust expression from unprotected linear DNA in exonuclease-deficient extracts. ACS Synthetic Biology. 11 (2), 732-746 (2022).
  11. Levine, M. Z., Gregorio, N. E., Jewett, M. C., Watts, K. R., Oza, J. P. Escherichia coli-based cell-free protein synthesis: protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology. JoVE. (144), e58882 (2019).
  12. Kwon, Y. -C., Jewett, M. C. High-throughput preparation methods of crude extract for robust cell-free protein synthesis. Scientific Reports. 5 (1), 8663 (2015).
  13. Sun, Z. Z., et al. Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology. Journal of Visualized Experiments. (79), e50762 (2013).
  14. Dopp, J. L., Jo, Y. R., Reuel, N. F. Methods to reduce variability in E. Coli-based cell-free protein expression experiments. Synthetic and Systems Biotechnology. 4 (4), 204-211 (2019).
  15. Cole, S. D., et al. Quantification of interlaboratory cell-free protein synthesis variability. ACS Synthetic Biology. 8 (9), 2080-2091 (2019).

Tags

Биоинженерия выпуск 186
Бесклеточный синтез белка из экзонуклеазно-дефицитных клеточных экстрактов с использованием линейных шаблонов ДНК
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sabeti Azad, M., Cardoso Batista,… More

Sabeti Azad, M., Cardoso Batista, A., Faulon, J. L., Beisel, C. L., Bonnet, J., Kushwaha, M. Cell-Free Protein Synthesis from Exonuclease-Deficient Cellular Extracts Utilizing Linear DNA Templates. J. Vis. Exp. (186), e64236, doi:10.3791/64236 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter