Summary
מוצג כאן פרוטוקול אימונוהיסטוכימיה מפורט כדי לזהות, לאמת ולמקד קספאזות רלוונטיות מבחינה תפקודית ברקמות מורכבות.
Abstract
ידוע כי משפחת הקספאזות מתווכת מסלולים תאיים רבים מעבר למוות תאי, כולל התמיינות תאים, איתור נתיבים אקסונאליים והתפשטות. מאז זיהוי משפחת הפרוטאזות של מוות תאי, קיים חיפוש אחר כלים לזיהוי והרחבת תפקודם של בני משפחה ספציפיים במצבי התפתחות, בריאות וחולי. עם זאת, רבים מכלי הקספאזה הזמינים כיום באופן מסחרי, הנמצאים בשימוש נרחב, אינם ספציפיים לקספאזה הממוקדת. בדו"ח זה אנו מפרטים את הגישה שבה השתמשנו כדי לזהות, לאמת ולמקד את caspase-9 במערכת העצבים באמצעות מעכב חדשני וגישות גנטיות עם קריאות אימונוהיסטוכימיות. באופן ספציפי, השתמשנו ברקמה העצבית ברשתית כמודל כדי לזהות ולאמת את נוכחותם ותפקודם של קספאזות. גישה זו מאפשרת לחקור תפקודים ספציפיים של קספאז-9 אפופטוטיים ולא-אפופטוטיים מסוג התא, וניתן ליישם אותה על רקמות מורכבות אחרות ועל קספאזות מעניינות. הבנת התפקודים של קספאזות יכולה לסייע בהרחבת הידע הקיים בביולוגיה של התא, ויכולה גם להיות יתרון בזיהוי מטרות טיפוליות פוטנציאליות בשל מעורבותן במחלות.
Introduction
הקספאזות הן משפחה של פרוטאזות המווסתות מוות התפתחותי של תאים, תגובות חיסוניות ומוות תאי סוטה במחלה 1,2. אמנם ידוע כי בני משפחת הקספאזה מושרים במגוון מחלות נוירודגנרטיביות, אך ההבנה איזה קספאז מניע פתולוגיה של מחלות מאתגרת יותר3. מחקרים כאלה דורשים כלים כדי לזהות, לאפיין ולאמת את תפקודם של בני משפחה קספאזיים בודדים. ניתוח הקספאזות האינדיבידואליות הרלוונטיות חשוב הן מבחינה מכניסטית והן מבחינה טיפולית, שכן בספרות יש מחקרים רבים המספקים עדות לתפקידים המגוונים של caspases 4,5. לכן, אם המטרה היא למקד קספאז במחלה לתועלת טיפולית, זה קריטי שיהיה מיקוד ספציפי של בני המשפחה הרלוונטיים. טכניקות מסורתיות לזיהוי רמות קספאז ברקמה כוללות כתם מערבי וגישות אנזימטיות ופלואורומטריות 3,6. עם זאת, אף אחד מהאמצעים הללו אינו מאפשר זיהוי ספציפי לתאים של רמות קספאזה, ובתרחישים מסוימים, לעתים קרובות לא ניתן לזהות קספאזות מבוקעות על ידי אמצעי ניתוח חלבונים מסורתיים. ידוע כי קספאזות יכולות למלא תפקידים אפופטוטיים ולא אפופטוטיים שונים באותה רקמה7, ולכן יש צורך באפיון זהיר של רמות הקספאז הספציפיות לתאים להבנה מדויקת של מסלולי התפתחות ומחלות.
מחקר זה מראה הפעלה ותפקוד של קספאז במודל של היפוקסיה-איסכמיה נוירו-וסקולרית - חסימת ורידים ברשתית (RVO)7,8. ברקמה מורכבת כמו הרשתית, ישנם מספר סוגי תאים שיכולים להיות מושפעים מההיפוקסיה-איסכמיה המושרה ב-RVO, כולל תאי גלייה, נוירונים וכלי דם7. ברשתית העכבר הבוגרת, יש מעט מאוד ביטוי של קספאזות הניכר ברקמה בריאה, כפי שנמדד על ידי אימונוהיסטוכימיה (IHC)7, אך זה לא המקרה במהלך התפתחות9 או במודלים של מחלת רשתית10,11. IHC היא טכניקה המבוססת היטב במחקר ביו-רפואי ואפשרה אימות של מחלות ומטרות פתולוגיות, זיהוי תפקידים חדשים באמצעות לוקליזציה מרחבית וכימות של חלבונים. במקרים בהם לא ניתן לזהות תוצרי קספאז שסועים על ידי כתם מערבי או ניתוח פלואורומטרי, וגם לא את מיקום התא הספציפי של קספאזות נפרדות או חקירה של מסלולי איתות קספאז באמצעות לוקליזציה, יש להשתמש ב- IHC.
על מנת לקבוע את הקספאזות הרלוונטיות מבחינה תפקודית ב-RVO, IHC שימש עם נוגדנים מאומתים עבור קספאזות וסמנים תאיים. המחקרים הקודמים שבוצעו במעבדה הראו כי caspase-9 הופעל במהירות במודל של שבץ איסכמי ועיכוב של caspase-9 עם מעכב ספציפי מאוד מוגן מפני תפקוד לקוי של נוירונים ומוות12. מכיוון שהרשתית היא חלק ממערכת העצבים המרכזית (CNS), היא משמשת כמערכת מודל לחקירה וחקירה נוספת של תפקידו של קספאז-9 בפציעות נוירו-וסקולריות13. לשם כך, נעשה שימוש במודל העכבר של RVO כדי לחקור את המיקום וההתפלגות הספציפיים לתא של caspase-9 ואת משמעותו בפגיעה נוירו-וסקולרית. RVO הוא גורם נפוץ לעיוורון בקרב מבוגרים עובדים הנובע מפגיעה בכלי הדם14. נמצא כי קספאז-9 התבטא באופן לא אפופטוטי בתאי אנדותל, אך לא בתאי עצב.
כרקמה, הרשתית יש את היתרון של להיות חזותית כמו שטוח, אשר מאפשר הערכה של רשתות כלי הדם, או כמו חתכים, אשר מדגיש את שכבות הרשתית העצבית. כימות ביטוי חלבון הקספאזה בחתכים מספק הקשר, לגביו קספאז עשוי להיות קריטי בקישוריות העצבית ברשתית ובתפקוד הראייה על ידי זיהוי לוקליזציה של הקספאזה ברשתית. לאחר זיהוי ואימות, מיקוד של caspase של עניין מושגת באמצעות מחיקה ספציפית לתא inducible של caspase מזוהה. עבור פניות טיפוליות פוטנציאליות, הרלוונטיות של הקספאזות המעניינות נבדקה באמצעות כלים ספציפיים כדי לעכב את הקספאזה המופעלת. עבור caspase-9 תא היה מעכב סלקטיבי מאוד 7,15, Pen1-XBIR3 שימש. לצורך דו"ח זה, נעשה שימוש בזן C57BL/6J זכרי בן חודשיים ובזן נוקאאוט אנדותל קספאז-9 הניתן לטמוקסיפן (iEC Casp9KO) עם רקע C57BL/6J. בעלי חיים אלה נחשפו למודל העכבר של RVO ו-C57BL/6J טופלו במעכב הסלקטיבי קספאז-9, Pen1-XBir3. ניתן ליישם את המתודולוגיה המתוארת על מודלים אחרים של מחלות במערכות המרכזיות וההיקפיות 7,15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
פרוטוקול זה תואם את הצהרת האגודה לחקר ראייה ועיניים (ARVO) לשימוש בבעלי חיים בחקר העיניים והראייה. ניסויים במכרסמים אושרו ונוטרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) של אוניברסיטת קולומביה.
1. הכנת רקמת רשתית והקפאה
- להרדים את בעלי החיים על ידי מתן הרדמה תוך-צפקית (קטמין (80-100 מ"ג/ק"ג) וקסילזין (5-10 מ"ג/ק"ג)), ולחדור לעכברים הנתונים ל-RVO (ראו8 פרטים) עם 4% פרפורמלדהיד (PFA) באמצעות משאבה פריסטלטית.
הערה: צבוט את הבוהן של החיה כדי לאשר את עומק ההרדמה לפני שתמשיך בהמתת חסד וזליפה. פרטים על זלוף ניתן למצוא ב16. - לקצור את העיניים על ידי enucleation זהיר באמצעות מלקחיים ולשים את כדור הארץ 1 מ"ל של 4% PFA. השאירו את העיניים ללילה ב 4 מעלות צלזיוס. שטפו את העיניים שלוש פעמים במשך 10 דקות, הוסיפו 1 מ"ל של 1x PBS והניחו אותן בשייקר.
- לטבול את העיניים ב 1 מ"ל של 30% סוכרוז במשך 3 ימים, עד שהם לשקוע לתחתית הצינור, המציין ספיגה של סוכרוז.
- מלאו את העיניים בתרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית באמצעות מזרק של 30 גרם, עד שהעין בעלת מראה מעוגל (כ-50 μL).
- הטמע את העיניים בקריומולד עם תרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית עד שהעיניים מכוסות וקופאות ב -80 מעלות צלזיוס עד שהן מוכנות לקריוסקציה.
- חתך הטביע את העיניים ב-20 מיקרומטר על שקופיות זכוכית באמצעות קריוסטאט.
- הסר את בלוק טמפרטורת החיתוך האופטימלית מן cryomold.
- מניחים אותו על צ'אק קריוסטאט על ידי הוספת תרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית והנחת הבלוק על הצ'אק. השאירו אותו בתוך cryostat עד שהוא קופא.
- המשך לחתוך את הבלוק ב 20 μm עד רקמת הרשתית הוא נראה.
הערה: ניתן לאשר זאת באמצעות מיקרוסקופ אור בהגדלה של 30x (3x מטרה, 10x עיניות). ניתן להבחין בין רקמות לבין מדיית OCT לפי צבע וצורה. - לאסוף את רקמת הרשתית במיקרוסקופ שקופיות בסדרה של ארבעה חלקים בכל שקופית.
הערה: ראו איור 1A להצבה מוצעת של מקטעי רשתית.
- תייג את השקופיות עם מזהה שמבטל את זיהוי הטיפול והגנוטיפ.
- יש לאחסן את השקופיות בטמפרטורה של -20°C עד להכתמת.
2. אימונוהיסטוכימיה
הערה: השתמש ברקמה קבועה בהקפאה לאימונוהיסטוכימיה כדי לשמור על מורפולוגיה של התא. בחר מקטעים ברמה של תמונות טומוגרפיה קוהרנטית אופטית (OCT) שנרכשו ב- vivo7. השתמש בשתי הסדרות הראשונות של שקופיות שנאספו מהקריוסטאט או מקטעים של 150 מיקרומטר לתוך רקמת הרשתית.
- מקם את המגלשות בתא שקופיות חשוך ולח.
- חלחול וחסימה: שטפו את חתכי הרשתית עם 300 μL של 1x PBS למשך 5 דקות כדי להסיר את ה-OCT ולהשליך לאחר מכן.
- חלחלו לרקמה על ידי הוספת 300 μL של 1x PBS עם 0.1% Triton X-100 למשך שעתיים בטמפרטורת החדר (RT) והשליכו לאחר מכן.
- חסום את הרקמה על ידי הוספת 300 μL של מאגר חוסם (10% סרום עזים רגיל (NGS), 1% אלבומין בסרום בקר (BSA) ב-PBS אחד, מסונן) ולהשאיר למשך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
- נוגדנים ראשוניים: דילול נוגדנים ראשוניים בחסימת חיץ. נוגדנים עיקריים בשימוש כוללים אנטי-קל-קספאז-9 ב-1:800, אנטי-CD31 ב-1:50 ואנטי-קספאז-7-488 (נוגדן עם תווית ישירה) ב-1:150.
הערה: עקוב אחר המלצת היצרן לדילול מתאים של נוגדנים ראשוניים.- יוצקים את המאגר החוסם מהמקטעים ומחילים 100 μL של קוקטייל הנוגדנים העיקרי על החלקות הרשתית.
- לדגום את חתכי הרוחב במשך הלילה ב 4 מעלות צלזיוס.
- לשטוף את החלקים ארבע פעמים במשך 5 דקות עם 300 μL של 1x PBS.
הערה: אם מקטעי הרקמה שבירים מאוד, יש להסיר את השטיפות באמצעות פעולה נימית על ידי החלת רקמה על פינת המגלשה כדי למנוע תזוזה של מקטעי הרשתית. - כדי להימנע מתיוג צולב של נוגדנים ראשוניים שגודלו באותו מין פונדקאי, השלימו את ההכתמה עם נוגדנים משניים לפני הפעלת הנוגדנים המסומנים ישירות.
- נוגדנים משניים: לדלל את הנוגדנים המשניים בחסימת חיץ בריכוז של 0.1%. לדוגמה, כדי לזהות anti-cl-caspase-9, נוגדן שגדל בארנב, השתמש עז-אנטי-ארנב-568 משני.
- יש למרוח 200 μL של קוקטייל הנוגדנים המשני על הרשתיות.
- דגירה של הרקמה למשך שעתיים ב-RT.
- לשטוף את החלקים ארבע פעמים במשך 5 דקות עם 300 μL של 1x PBS.
- הכתימו את הגרעינים במשך 5 דקות עם 300 μL של DAPI בדילול של 0.02%.
- יש לשטוף פעם אחת במשך 5 דקות עם 300 μL של PBS אחד.
- הניחו כיסוי על חלקי הרשתית באמצעות 500 μL של מדיה פלואורומאונט-G, המשמרת את האות הפלואורסצנטי, והניחו בזהירות את הכיסוי על החלק העליון של המגלשה, תוך הימנעות מבועות.
3. הדמיה קונפוקלית
- קבל תמונות של החלקים המוכתמים עם מיקרוסקופיה קונפוקלית.
- הפעל את המיקרוסקופ הקונפוקלי.
- הנח את השקופית על הבמה.
- כוונן את המיקוד כדי לראות את מקטע הרשתית בבירור.
הערה: צלם לפחות ארבע תמונות לכל מקטע ותמונה ארבעה מקטעים לכל רשתית. ראו את סכמת הדמיית הרשתית עבור אזורי הדמיה מוצעים (איור 1B, C).
- תמונה של קספאזה, כלי דם והכתמה גרעינית באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי בעל רכישת מחסנית Z, תוך שימוש במטרה של פי 20 או 40.
הערה: פרמטרי ההדמיה והגדרת התוכנה צריכים להיות קבועים עבור כל ההדמיה בניסוי. מטרת 20x מספקת סקירה כללית של שכבות הרשתית, המוגדרות היטב על ידי הכתם הגרעיני. המטרה 40x מספקת יותר פרטים סלולריים.- הגדר זמני חשיפה ועוצמת לייזר מתאימים לכל ערוץ על-ידי לחיצה על הגדרות רכישה.
- הגדר את ערימת Z כדי להמחיש את כל הקטע על-ידי לחיצה על סדרת Z והגדר פרמטרים למעלה ולמטה כדי לכסות את עומק הרקמה.
- שמור את התמונות בהתאם למזהה עם המסיכה שהוקצה במהלך ההקפאה.
4. כימות רמות הקספאזה
- גרור קובצי תמונה של ערוצי 405, 470, 555 ו- 640 לקונסולה של FIJI.
- לחצו על ' תמונה' > 'צבע' > 'מיזוג ערוצים'.
- הקצה צבעים לקבצים באופן הבא: אדום ל- 555, ירוק ל- 470, אפור ל- 405, ציאן ל- 640.
- דחוס את מחסנית Z על-ידי לחיצה על Image > Stack > Z Project.
- לחץ על סוג הקרנה: עוצמה מרבית.
- פתחו את ממשק הערוצים בלחיצה על הכלי תמונה > ערוצים צבעוניים.
- פתח את ממשק הבהירות והניגודיות .
- בחר פרמטרים לכל ערוץ.
- עבור אל ערוצים ובחר ערוץ אחד.
- מקם את הסמן מעל התא המבוטא caspase והוסף ביאורים לערך הפיקסלים.
- מקם את הסמן על גבי הרקע והוסף ביאורים לערך הפיקסלים.
- פרמטרים לבדיקה
- עבור אל ממשק הבהירות והניגודיות.
- לחץ על בחר.
- חבר את הערך המינימלי המוצג (ערך פיקסלים מבואר של תא מבוטא caspase).
- חבר את הערך המרבי המוצג (ערך הפיקסלים המבואר של הרקע).
- לחץ על אישור.
- חזור על שלבים 4.8-4.9 עבור כל הערוצים.
- בדוק את הפרמטרים על ידי בחירת תמונות אקראיות מרקמה עיוורת.
הערה: ערוך פרמטרי בהירות וניגודיות רק אם ערך הרקע אינו מתאים לתמונות אחרות. - לאחר הגדרת הפרמטרים, פתח את קובצי התמונה ודחוס את Z-stack.
- הוסף את פרמטרי הבהירות והניגודיות עבור ערוץ caspase ואת איזולקטין, ערוץ סמן כלי הדם.
- השתמש בכלי הנקודה כדי לכמת את מספר האזורים החיוביים של כלי הדם באמצעות קולוקליזציה של סמן כלי הדם עם ביטוי קספאז כקריאה של אזורים חיוביים.
- חזור על שלב 4.14 אך השתמש ב- Hoechst כסמן של אזורים חיוביים עצביים.
- הוסף ביאורים לערכים בגיליון אלקטרוני לכל תמונה.
- ממוצע הערכים לפי סעיף.
- ממוצע ערכי המקטע - זו תהיה הקריאה לכל עין.
5. אישור גנטי של הרלוונטיות של תא האנדותל caspase-9
- השתמש ברשתיות שהתקבלו מעכברי Casp9FL/FL-VECad-CreERT2 שהיו נתונים ל-RVO7.
- אימונוסטין הרשתיות עבור caspase-9 (caspase שנמחק), caspase-7 (קספאז בעל השפעה במורד הזרם), סמני כלי דם ו- DAPI כמתואר לעיל בסעיף 2.
- תמונה וכימות כמתואר לעיל בסעיפים 3 ו-4.
6. מיקוד קספאז-9 ב-RVO
- יש להשיג עיניים מהעכברים הנתונים ל-RVO ולאחר מכן למרוח את מעכב הקספאז-9 Pen1-XBir3 באופן מקומי על העיניים כמוב-7.
- אימונוסטין הרשתיות עבור caspase-7 (קספאז בעל השפעה במורד הזרם), סמני כלי דם ו- DAPI כמתואר לעיל בסעיף 2.
- תמונה וכימות כמתואר לעיל בסעיפים 3 ו-4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הפרוטוקול המתואר מאפשר למשתמש לנתח ולכמת את רמות caspase-9 ברקמת הרשתית. בנוסף, הוא מציג כלים לזיהוי, אימות והתמקדות ספציפית במצעי קספאז-9 ובמורד הזרם. הצעדים המסוכמים מאפשרים ניתוח ניתן לכימות של רמות הקספאז והספציפיות התאית בפוטומיקרוגרפים פלואורסצנטיים. כל הנתונים מראים פוטומיקרוגרפים מייצגים וכימות של רמות הקספאז המצוינות ברשתית הכוללת, בתאי האנדותל ובנוירונים בחתכי רשתית P-RVO לא מנוצלים וחד-יומיים. חתך הרשתית מאפשר הדמיה של גרעיני הרשתית בשכבת הגנגליון הרשתית (RGL), בשכבה הגרעינית הפנימית (INL) ובשכבה הגרעינית החיצונית (ONL) כאשר הם מוכתמים ב-Hoechst. בנוסף, כלי הדם ברשתית נראים בשכבות הפרספקס ברשתית או בין RGL ל-INL, ובין ה-INL ל-ONL. בגלל האופי ההיסטולוגי של כלי הדם, כאשר הרשתית נחתכת, כלי הדם יופיעו כמנותקים ונפרדים, ויספקו את שכבות הפרספקספורם. איור 2 מזהה את caspase-9 כ-P-RVO בעל מווסת גבוהה של יום אחד. איור 3 מאמת את הרלוונטיות התפקודית של אנדותל קספאז-9 על-ידי שימוש בעכברי נוקאאוט של תאי אנדותל. איור 4 מראה שהתמקדות בקספאז-9 פעיל חוסמת מבחינה פרמקולוגית את האינדוקציה של מטרה במורד הזרם של קספאז-9-קספאז-7. הפרוטוקול מזהה את הלוקליזציה התאית של הקספאזות ואת שכבות הרשתית העצביות שבהן מתבטאות הקספאזות.
איור 1: ערכת הדמיית רשתית. (A) מיקום מומלץ של מקטעי רשתית בשקופית המיקרוסקופ. (B) סקירה כללית של אזורי ההדמיה ברשתית. (ג) ייצוג של ראיית הרשתית ב-20x אובייקטיבי. שכבות רשתית: RGL = שכבת גנגליון רשתית, INL = שכבה גרעינית פנימית, ONL = שכבה גרעינית חיצונית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: RVO משרה קספאז-9 בתאי אנדותל ובנוירונים. (A) חתכי רשתית מייצגים מ-P-RVO לא נגוע ויום אחד מוכתמים ב-cl-caspase-9 1:800 (ירוק), איזולקטין 1:200 (אדום) ו-DAPI (לבן). (B) כימות מספר תאי העצב עם cl-caspase-9 (ראו טבלת חומרים לפרטים על הנוגדנים). (C) כימות מספר תאי האנדותל עם cl-caspase-9. (D) המספר הכולל של תאים המבטאים cl-caspase-9. לא נפגע, n = 6; יום אחד P-RVO, n = 5. קווי שגיאה מייצגים את הממוצע ± SEM; ANOVA חד כיווני, מבחן האל-אס-די של פישר. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: מחיקת תאי אנדותל של האנדותל קספאז-9 חוסמת RVO-אינדוקציה של קספאז-7. (A) חתכי רשתית מייצגים מעכברי iEC Casp9WT ו-iEC Casp9KO המוכתמים ב-p-RVO ליום אחד מוכתמים בקספאז-7 (ירוק), cl-caspase-9 (כחול), CD31, סמן כלי דם (אדום) ו-DAPI (לבן). (B) כימות מספר התאים ברשתית הפנימית עם cl-caspase-9 ועם caspase-7. (C) כימות מספר תאי האנדותל עם cl-caspase-9 ועם caspase-7. (D) המספר הכולל של תאים המבטאים cl-caspase-9 או caspase-7. iEC Casp9WT, n = 6-12; iEC Casp9KO, n = 3-8. קווי שגיאה מייצגים את הממוצע ± SEM; ANOVA חד כיווני, מבחן האל-אס-די של פישר. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 4: עיכוב פעילות קספאז-9 מעכב את ביטוי ה-P-RVO של קספאז-7. (A) חתכי רשתית מייצגים מ-P-RVO שלא טופלו או לא טופלו ב-Pen1-XBIR3 שהוכתמו ב-caspase-7 (ירוק), איזולקטין (אדום) ו-DAPI (לבן). (B) כימות מספר תאי האנדותל עם קספאז-7. (C) כימות מספר הלוקוציטים עם קספאז-7. (D) כימות מספר תאי העצב לכל שכבה עצבית עם קספאז-7. (E) המספר הכולל של תאים המבטאים קספאז-7. עט לא מנוצל1 מלוח, n = 6; עט1-XBIR3 שלא נפגע, n = 5; 1-יום P-RVO עט1 מלוח, n = 5; 1-יום P-RVO עט1-XBIR3, n = 3. קווי שגיאה מייצגים את הממוצע ± SEM; ANOVA חד כיווני, מבחן האל-אס-די של פישר. קיצורים: RGL = שכבת גנגליון רשתית, INL = שכבה גרעינית פנימית, ו- ONL = שכבה גרעינית חיצונית. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
קספזות הן משפחה מרובת חברים של פרוטאזות הנחקרות בצורה הטובה ביותר בשל תפקידן במוות של תאים ובדלקת; עם זאת, לאחרונה נחשפו מגוון פונקציות שאינן מוות עבור חלק מבני המשפחה 4,5. חלק גדול מהבנתנו את תפקוד הקספאז נגזר מעבודה בתרבית תאים ומנתונים הסקה ממחלות אנושיות. אמנם מעריכים כי קיימת אינדוקציה, הפעלה או השבתה חריגה של קספאזות במחלה, אך היה מאתגר לקבוע באופן פונקציונלי אם הקספאזות מניעות פתולוגיה של מחלות. כלים רבים המשמשים להערכת קספאזות ספציפיות מזהים בני משפחה מרובים, ומערערים את הרלוונטיות הפונקציונלית של הנתונים המתקבלים עם ריאגנטיםאלה 17. כאן אנו מספקים פרוטוקול לחקר קספאזות ברקמה מורכבת, תוך שימוש ברשתית כדוגמה. במערכת העצבים, ביטוי הקספאז מווסת לפני ואחרי הלידה. זה מאפשר שימוש בנוגדנים ספציפיים כדי לבדוק שינויים ברמות caspase במודל מחלה.
בעוד שהמיקוד של הפרוטוקול הוא בעיבוד וניתוח תמונה, הצלחת הטכניקה מסתמכת גם על הכנת רקמות קפדנית, כמו גם IHC והדמיה מיקרוסקופית כדי להבטיח עקביות, תוקף ואמינות של הנתונים. יש להקפיד על שימוש באותם פרמטרים כדי לדמות מערך נתונים שלם. תמונות באיכות ירודה, ניגודיות נמוכה ומיקוד מטושטש לא יספקו נתונים אמינים. בעת חיתוך והדמיה של אזורי P-RVO ברשתית, יש להימנע מקרעים וקיפולים מכיוון שאזורים אלה עלולים לגרום לממצאים. יש להימנע גם מאזורים של נזק ישיר. החוקר המבצע את ההדמיה צריך להיות עיוור לטיפול ברקמה. לצורך ניתוח, מומלץ כי שני משקיפים בלתי תלויים, עיוורים לקבוצת הטיפול, יבצעו את הניתוח. בנוסף, אין להשתמש בנוגדנים ראשוניים לעכבר במודלים של פגיעות עכברים מכיוון שהנוגדנים המשניים נקשרים באופן לא ספציפי לכלי הדם. חלופה אחרת היא להשתמש בנוגדנים ראשוניים מצומדים ישירות.
גישה חלופית לספירת תאים היא כימות אחוז שטח הביטוי. זה יכול לשמש כאשר ספירת תאים אינה אפשרית (למשל, אם ביטוי caspase הוא מקומי לתהליכים עצביים או מקטעי פוטורצפטור). הרשתית המרכזית וההיקפית מושפעות באופן דיפרנציאלי במודלים שונים של פציעות. ניתן להתאים את השיטה לניתוח ספציפי של אזורי רשתית שונים. אם מבצעים BRVO, יש לבחור קטעים מהחלק הפגוע של העין. הפרוטוקול מספק גם צביעה של סמני תאים שונים כדי לזהות היכן מתבטא הקספאזה.
מגבלות השיטה כוללות כי היא אינה מבדילה בין רמות גבוהות ונמוכות של אות קספאז בתא נתון. בנוסף, שימוש בכתם גרעיני לזיהוי שכבות עצביות הוא נוח אך אינו מצביע באופן סופי על ביטוי עצבי (גליה ולויקוציטים נמצאים גם בשכבות אלה). ניתן להשתמש בסמנים עצביים נוספים כדי לאמת ביטוי עצבי. ישנם גם מגוון נוגדנים זמינים להערכת ביטוי קספאז; אלה הוגדרו בצורה הטובה ביותר עבור caspase-9 אנושי, שבו ישנם נוגדנים עבור אורך מלא/clost (CL) caspase-9, autocleaved caspase-9, ו caspase-3-cleaved caspase-9.
העוצמה הממוצעת של אות IHC מדווחת לעתים קרובות כשיטת כימות. עם זאת, רעשי רקע או פלואורסצנציה אוטומטית של כדוריות דם אדומות יכולים להניב תוצאות לא מדויקות. כימות ספציפי לתא מאפשר קביעה והבחנה של רקע, צביעה לא ספציפית ואוטופלואורסצנטיות.
פרוטוקול זה יכול לשמש למדידת שינויים רחבים ברקמה בביטוי של קספאזות בודדות, שינויים בביטוי בסוג תא מסוים, כגון תא אנדותל, ושינויים בסוגי תאים ספציפיים במקומות ספציפיים, כגון נוירונים בשכבות רשתית שונות. גמישות זו מאפשרת לנסיין לשאול כיצד מצב המחלה משנה את רמות הקספאזה האינדיבידואליות. שיטות קיימות/אלטרנטיביות משתמשות בניתוח כתמים מערביים להשוואה חצי-קוונטית של איתות קספאז, אם כי שיטות לא יספקו את ההפרדה הברורה של לוקליזציה תאית שפרוטוקול זה כואב. יש לציין שבאיור 3D, עיכוב קספאז-9 יעיל יותר בהפחתת קספאז-9 עצבי ב-INL וב-ONL, בהשוואה ל-RGL. פתרון מסוג זה מאתגר להשגה בשיטות אחרות. בנוסף, כאשר רקמה שלמה מנותחת באופן ביוכימי, רמות הקספאזות המשתנות עשויות להיות נמוכות מכדי להרים אותן, שכן ישנם סוגי תאים רבים ושונים ברקמה מורכבת.
הנוגדנים, אשר חייבים להיות מאומתים על ידי המשתמש, מספקים ספציפיות עבור caspase נבדק. Caspases יכול לפעול מפלים (כלומר, יוזם מפעיל אפקט ולאחר מכן מוביל לתוצאה - מוות, דלקת, איתות תאי). ניתן להשתמש בפרוטוקול זה בדגימות שנאספו בנקודות זמן שונות לאחר נזק; בדוגמאות המוצגות כאן, דגימות נאספות בזמנים שונים לאחר RVO. בעבודה שפורסמה בעבר, נמצא כי caspase-9 הוגדל תוך שעה אחת לאחר RVO7, מה שהוביל לאימות נוסף ולמחקרי מיקוד. לאחר זיהוי אנדותל caspase-9 כמניע פוטנציאלי של פתולוגיה RVO, נעשה שימוש בעכבר עם קספאז-9KO של תאי אנדותל אינדוקטיביים כדי לאמת את האנדותל caspase-9. השימוש בעכברי CASPASE KO ספציפיים לתאים אינדוקטיביים מספק רמה נוספת של ספציפיות ומונע את המוות ההתפתחותי שנראה עם caspase-9KO18 מכונן. זה גם מונע שינויים מפצים אצל בני משפחה אחרים שהוכחו כמתרחשים בעכברי CASPASE KO19. יתר על כן, השימוש בעכברי CASPASE KO אינדוקטיביים ספציפיים לתאים מאפשר זיהוי של סוג התא שבו הקספאז מווסת את הפתולוגיה ברקמה. הפרוטוקול מספק גם את השלבים לחקר היעילות של גישה טיפולית, המכוונת נגד caspase-9 פעיל ב- RVO. גישה זו יכולה להיות מיושמת גם על רקמות אחרות, כולל המוח.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים על האינטרסים המתחרים הבאים: ל- C.M.T. יש את בקשות הפטנט הבאות US20200164026, US20190142915, ו- US20150165061. ל-C.M.T. ול-S.S. יש בקשת פטנט בארה"ב 20140024597. ל-C.M.T., A.M.P. ול-M.I.A. יש בקשת פטנט US2020058683. ל-C.M.T. ול-Y.Y.J. יש בקשת פטנט WO2018013519. M.I.A ו- C.M.T רשומים כממציאים בבקשת פטנט WO/2020/223212 על ידי נאמני אוניברסיטת קולומביה בעיר ניו יורק. שאר המחברים מצהירים שאין אינטרסים מתחרים.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי תוכנית עמיתי המחקר לתארים מתקדמים של הקרן הלאומית למדע (NSF-GRFP) מענק DGE - 1644869 והמכון הלאומי להפרעות נוירולוגיות ושבץ מוחי (NINDS) של המכונים הלאומיים לבריאות (NIH), פרס מספר F99NS124180 NIH NINDS גיוון מיוחד F99 (ל- CKCO), מכון העיניים הלאומי (NEI) 5T32EY013933 (ל- AMP), המכון הלאומי להפרעות נוירולוגיות ושבץ מוחי (RO1 NS081333, R03 NS099920 ל-CMT), ומשרד ההגנה צבא/חיל האוויר (DURIP ל-CMT).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| anti-Caspase-7 488 | Novus Biologicals | NB-56529AF488 | use at 1:150 |
| anti-cl-Caspase-9 | Cell Signaling | 9505-S | use at 1:800 |
| anti-CD31 | BD Pharmingen | 553370 | use at 1:50 |
| Confocal Spinning Disc Microscope | Biovision | ||
| FIJI 2.3.0 | open source | ||
| Fluormount G | Fisher | 50-187-88 | |
| Forcep | Roboz | RS-5015 | |
| iCasp9FL/FL X VECad-CreERT2 mice | lab generated | see Avrutsky 2020 | |
| Isolectin (594, 649) | Vector | DL-1207 | use at 1:200 |
| Ketamine Hydrochloride | Henry Schein | NDC: 11695-0702-1 | |
| Perfusion pump | Masterflex | ||
| Pen1-XBir3 | lab generated | see Avrutsky 2020 | |
| Prism 9.1 | GraphPad | ||
| Tissue-Tek O.C.T. | Fisher | 14-373-65 | |
| Vis-a-View 4.0 | Visitron Systems | ||
| Xylazine | Akorn | NDCL 59399-110-20 |
References
- Van Opdenbosch, N., Lamkanfi, M. Caspases in cell death, inflammation, and disease. Immunity. 50 (6), 1352-1364 (2019).
- Ramirez, M. L. G., Salvesen, G. S. A primer on caspase mechanisms. Seminars in Cell & Developmental Biology. 82, Academic Press. 79-85 (2018).
- Troy, C. M., Jean, Y. Y. Caspases: therapeutic targets in neurologic disease. Neurotherapeutics. 12 (1), 42-48 (2015).
- Avrutsky, M. I., Troy, C. M. Caspase-9: a multimodal therapeutic target with diverse cellular expression in human disease. Frontiers in Pharmacology. 12, 1728 (2021).
- Fuchs, Y., Steller, H. Programmed cell death in animal development and disease. Cell. 147 (4), 742-758 (2011).
- Troy, C. M., Akpan, N., Jean, Y. Y. Regulation of caspases in the nervous system: implications for functions in health and disease. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 99, 265-305 (2011).
- Avrutsky, M. I., et al. Endothelial activation of caspase-9 promotes neurovascular injury in retinal vein occlusion. Nature Communications. 11 (1), 3173 (2020).
- Colon Ortiz, C., Potenski, A., Lawson, J. M., Smart, J., Troy, C. M. Optimization of the retinal vein occlusion mouse model to limit variability. Journal of Visualized Experiments. (174), e62980 (2021).
- Tisch, N., et al. Caspase-8 modulates physiological and pathological angiogenesis during retina development. The Journal of Clinical Investigation. 129 (12), 5092-5107 (2019).
- Chi, W., et al. HMGB1 promotes the activation of NLRP3 and caspase-8 inflammasomes via NF-kappaB pathway in acute glaucoma. Journal of Neuroinflammation. 12, 137 (2015).
- Thomas, C. N., et al. Caspase-2 mediates site-specific retinal ganglion cell death after blunt ocular injury. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 59 (11), 4453-4462 (2018).
- Akpan, N., et al. Intranasal delivery of caspase-9 inhibitor reduces caspase-6-dependent axon/neuron loss and improves neurological function after stroke. Journal of Neuroscience. 31 (24), 8894-8904 (2011).
- London, A., Benhar, I., Schwartz, M. The retina as a window to the brain-from eye research to CNS disorders. Nature Reviews Neurology. 9 (1), 44-53 (2013).
- Song, P., Xu, Y., Zha, M., Zhang, Y., Rudan, I. Global epidemiology of retinal vein occlusion: a systematic review and meta-analysis of prevalence, incidence, and risk factors. Journal of Global Health. 9 (1), 010427 (2019).
- Akpan, N., et al. Intranasal delivery of caspase-9 inhibitor reduces caspase-6-dependent axon/neuron loss and improves neurological function after stroke. The Journal of neuroscience. 31 (24), 8894-8904 (2011).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- McStay, G. P., Salvesen, G. S., Green, D. R. Overlapping cleavage motif selectivity of caspases: implications for analysis of apoptotic pathways. Cell Death & Differentiation. 15 (2), 322-331 (2007).
- Kuida, K., et al. Reduced apoptosis and cytochrome c-mediated caspase activation in mice lacking caspase 9. Cell. 94 (3), 325-337 (1998).
- Troy, C. M., et al. Death in the balance: alternative participation of the caspase-2 and -9 pathways in neuronal death induced by nerve growth factor deprivation. Journal of Neuroscience. 21 (14), 5007-5016 (2001).
