Summary
여기에 제시된 것은 복잡한 조직에서 기능적으로 관련된 카스파제를 식별, 검증 및 표적으로 삼기 위한 상세한 면역조직화학 프로토콜입니다.
Abstract
카스파제 계열은 세포 분화, 축삭 경로 찾기 및 증식을 포함하여 세포 사멸을 넘어 많은 세포 경로를 매개하는 것으로 알려져 있습니다. 세포 사멸 프로테아제 패밀리의 동정 이후, 발달, 건강 및 질병 상태에서 특정 가족 구성원의 기능을 식별하고 확장하는 도구에 대한 검색이 있었습니다. 그러나, 널리 사용되는 현재 상업적으로 이용가능한 카스파제 툴 중 다수는 표적화된 카스파제에 특이적이지 않다. 이 보고서에서 우리는 새로운 억제제를 사용하여 신경계에서 caspase-9를 식별, 검증 및 표적으로 삼는 데 사용한 접근 방식과 면역 조직 화학적 판독을 통한 유전 적 접근 방식을 설명합니다. 특히, 우리는 망막 신경 조직을 모델로 사용하여 카스파제의 존재와 기능을 확인하고 검증했습니다. 이 접근법은 세포 유형 특이적 세포사멸 및 비-아폽토시스 카스파제-9 기능의 질의를 가능하게 하고, 관심있는 다른 복잡한 조직 및 카스파제에 적용될 수 있다. 카스파제의 기능을 이해하면 세포 생물학에 대한 현재 지식을 확장하는 데 도움이 될 수 있으며 질병에 관여하기 때문에 잠재적인 치료 표적을 식별하는 데에도 유리할 수 있습니다.
Introduction
카스파제는 질병1,2에서 발달 세포 사멸, 면역 반응 및 비정상적인 세포 사멸을 조절하는 프로테아제 계열입니다. 카스파제 계열의 구성원이 다양한 신경퇴행성 질환에서 유도된다는 것은 잘 알려져 있지만, 어떤 카스파아제가 질병 병리를 유발하는지 이해하는 것은 더 어렵습니다3. 이러한 연구에는 개별 카스파제 가족 구성원의 기능을 식별, 특성화 및 검증하는 도구가 필요합니다. 관련 개별 카스파제를 파싱하는 것은 기계론적 관점과 치료적 관점 모두에서 중요한데, 이는 문헌에 카스파제 4,5의 다양한 역할에 대한 증거를 제공하는 여러 연구가 있기 때문입니다. 따라서, 목표가 치료 이익을 위해 질병에서 카스파아제를 표적화하는 것이라면, 관련 가족 구성원(들)의 특정 표적화를 갖는 것이 중요하다. 조직에서 카스파아제 수준을 검출하는 전통적인 기술에는 웨스턴 블로팅과 효소 및 형광 측정 접근법 3,6이 포함됩니다. 그러나 이러한 측정 중 어느 것도 카스파아제 수준의 세포 특이적 검출을 허용하지 않으며 일부 시나리오에서는 절단된 카스파아제를 기존 단백질 분석 측정으로 검출할 수 없는 경우가 많습니다. 카스파제는 동일한 조직에서 상이한 세포사멸 및 비-아폽토시스 역할을 할 수 있는 것으로 알려져 있다.7, 따라서 발달 및 질병 경로의 정확한 이해를 위해서는 세포-특이적 카스파아제 수준의 신중한 특성화가 필요하다.
이 연구는 신경 혈관 저산소증-허혈-망막 정맥 폐색 (RVO) 모델에서 카스파 아제 활성화 및 기능을 보여줍니다7,8. 망막과 같은 복잡한 조직에는 신경교 세포, 뉴런 및 혈관 구조7을 포함하여 RVO에서 유도 된 저산소증 허혈에 의해 영향을받을 수있는 여러 세포 유형이 있습니다. 성인 마우스 망막에서는 면역조직화학(IHC)7으로 측정한 건강한 조직에서 명백한 카스파제의 발현이 거의 없지만, 발달9 또는 망막 질환 모델10,11에서는 그렇지 않습니다. IHC는 생물 의학 연구에서 잘 확립 된 기술이며 질병 및 병리학 적 표적의 검증, 공간 국소화를 통한 새로운 역할 식별 및 단백질 정량화를 가능하게했습니다. 절단된 카스파아제 생성물이 웨스턴 블롯 또는 형광 분석으로 검출될 수 없는 경우, 또는 별개의 카스파제의 특정 세포 위치 또는 국소화를 통한 카스파아제 신호 전달 경로의 조사가 불가능한 경우, IHC를 사용해야 한다.
RVO에서 기능적으로 관련된 카스파제를 결정하기 위해, IHC를 카스파제 및 세포 마커에 대한 검증된 항체와 함께 사용하였다. 실험실에서 수행 된 이전 연구에 따르면 caspase-9는 허혈성 뇌졸중 모델에서 빠르게 활성화되고 신경 기능 장애 및 사망12로부터 보호되는 고도로 특이적인 억제제로 caspase-9를 억제했습니다. 망막은 중추 신경계 (CNS)의 일부이기 때문에 신경 혈관 손상에서 카스파 제 -9의 역할을 쿼리하고 추가로 조사하는 모델 시스템 역할을합니다13. 이를 위해 RVO의 마우스 모델을 사용하여 caspase-9의 세포 특이적 위치와 분포 및 신경혈관 손상에 미치는 영향을 연구했습니다. RVO는 혈관 손상으로 인한 근로 연령 성인의 실명의 일반적인 원인입니다14. caspase-9는 내피 세포에서 비 세포 사멸 방식으로 발현되었지만 뉴런에서는 발현되지 않는 것으로 밝혀졌습니다.
조직으로서 망막은 혈관 네트워크를 이해할 수있는 플랫 마운트 또는 신경 망막 층을 강조하는 단면으로 시각화되는 장점이 있습니다. 단면에서 카스파아제 단백질 발현의 정량화는 망막에서 카스파아제의 국소화를 식별함으로써 망막 뉴런 연결성 및 시력 기능에 잠재적으로 중요한 카스파아제에 관한 맥락을 제공합니다. 확인 및 검증 후, 관심있는 카스파아제의 표적화는 확인된 카스파아제의 유도성 세포 특이적 결실을 사용하여 달성된다. 잠재적인 치료 문의를 위해, 관심 있는 카스파제의 관련성은 활성화된 카스파제를 억제하기 위해 특정 도구를 사용하여 테스트되었습니다. 카스파제-9의 경우 세포 투과성 고도로 선택적인 억제제 7,15, Pen1-XBIR3이 사용되었다. 이 보고서에서는 C57BL/6J 배경을 가진 2개월 된 수컷 C57BL/6J 균주와 타목시펜 유도성 내피 카스파제-9 녹아웃(iEC Casp9KO) 균주가 사용되었습니다. 이들 동물을 RVO 및 C57BL/6J의 마우스 모델에 노출시키고 카스파제-9 선택적 억제제인 Pen1-XBir3으로 처리하였다. 설명된 방법론은 중앙 및 주변 시스템(7, 15)에서 질병의 다른 모델에 적용될 수 있다.
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Protocol
이 프로토콜은 안과 및 시력 연구에서 동물 사용에 대한 시력 및 안과 연구 협회 (ARVO) 성명서를 따릅니다. 설치류 실험은 컬럼비아 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되고 모니터링되었습니다.
1. 망막 조직의 제조 및 냉동 절제
- 복강 내 마취 (케타민 (80-100 mg / kg) 및 자일 라진 (5-10 mg / kg))를 투여하여 동물을 안락사시키고, 연동 펌프를 사용하여 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)로 RVO (자세한 내용은 8 참조)를받은 마우스를 관류합니다.
알림: 안락사 및 관류를 진행하기 전에 마취 깊이를 확인하기 위해 동물을 발가락으로 꼬집습니다. 관류에 대한 자세한 내용은16에서 찾을 수 있습니다. - 집게를 사용하여 조심스럽게 핵 제거하여 눈을 수확하고 지구본을 4 % PFA 1mL에 넣습니다. 눈을 4 ° C에서 밤새 그대로 두십시오. 10분 동안 눈을 세 번 씻고 1x PBS 1mL를 넣고 셰이커에 넣습니다.
- 눈을 30 % 자당 1mL에 3 일 동안 담그고 튜브 바닥에 정착하여 자당의 흡수를 나타냅니다.
- 눈이 둥근 모양(약 50μL)이 될 때까지 30G 주사기를 사용하여 최적의 절단 온도 화합물로 눈을 채웁니다.
- 눈을 덮을 때까지 최적의 절단 온도 화합물이 있는 저온에 눈을 넣고 냉동 절제 준비가 될 때까지 -80°C에서 얼립니다.
- 섹션은 저온 유지 장치를 사용하여 유리 슬라이드에 20μm의 눈을 내장했습니다.
- 저온 성형에서 최적의 절단 온도 화합물 블록을 제거합니다.
- 최적의 절단 온도 화합물을 추가하고 블록을 척에 놓아 저온 유지 장치 척에 놓습니다. 얼 때까지 저온 유지 장치 안에 두십시오.
- 망막 조직이 보일 때까지 블록을 20μm에서 절단하십시오.
참고: 이것은 30x 배율(3x 대물렌즈, 10x 접안렌즈)의 광학 현미경으로 확인할 수 있습니다. 조직은 색상 및 형상에 의해 OCT 배지와 구별될 수 있다. - 현미경 슬라이드에서 망막 조직을 슬라이드 당 일련의 4 개의 섹션으로 수집합니다.
참고: 망막 절편의 제안된 배치에 대해서는 그림 1A 를 참조하십시오.
- 슬라이드에 치료 및 유전자형을 식별하지 못하는 ID로 레이블을 지정합니다.
- 염색될 때까지 슬라이드를 -20°C에서 보관합니다.
2. 면역조직화학
참고: 세포 형태를 유지하기 위해 면역 조직 화학을 위해 고정 냉동 보존 조직을 사용하십시오. 생체 내7에서 획득한 광학 간섭 단층 촬영(OCT) 이미지 수준에 있는 섹션을 선택합니다. 저온 유지 장치 또는 150 μm의 절편에서 수집 한 처음 두 개의 슬라이드 시리즈를 망막 조직으로 사용하십시오.
- 슬라이드를 어둡고 습한 슬라이드 챔버에 놓습니다.
- 투과화 및 차단: 망막 단면을 300 μL의 1x PBS로 5분 동안 세척하여 OCT를 제거한 후 폐기한다.
- 실온(RT)에서 2시간 동안 0.1% 트리톤 X-100과 함께 300μL의 1x PBS를 첨가하여 조직을 투과화시킨 후 폐기합니다.
- 300 μL의 블로킹 완충액(10% 정상 염소 혈청(NGS), 1x PBS 중 1% 소 혈청 알부민(BSA), 여과)을 첨가하여 조직을 차단하고 4°C에서 밤새 방치한다.
- 1차 항체: 1차 항체를 차단 완충액에 희석합니다. 사용되는 1차 항체에는 1:800의 항-cl-카스파제-9, 1:50의 항-CD31, 및 1:150의 항-카스파제-7-488 (직접 표지된 항체)이 포함됩니다.
참고: 1차 항체의 적절한 희석에 대한 제조업체의 권장 사항을 따르십시오.- 블로킹 버퍼를 절편에서 붓고 100μL의 1차 항체 칵테일을 망막 슬라이드에 바릅니다.
- 횡단면을 4°C에서 밤새 배양한다.
- 300μL의 1x PBS로 5분 동안 절편을 4회 세척합니다.
알림: 조직 절편이 매우 깨지기 쉬운 경우 망막 절편이 변위되지 않도록 슬라이드 모서리에 티슈를 적용하여 모세관 작용을 사용하여 세척을 제거해야합니다. - 동일한 숙주 종에서 제기된 1차 항체의 교차 표지를 피하려면, 직접 표지된 항체를 적용하기 전에 2차 항체로 염색을 완료하십시오.
- 2차 항체: 2차 항체를 블로킹 완충액에 0.1% 농도로 희석한다. 예를 들어, 토끼에서 자란 항체 인 항 -cl-caspase-9를 검출하려면 염소 항 토끼 -568 보조를 사용하십시오.
- 200 μL의 2차 항체 칵테일을 망막에 바릅니다.
- RT에서 2 시간 동안 조직을 배양하십시오.
- 300μL의 1x PBS로 5분 동안 절편을 4회 세척합니다.
- 0.02%의 희석으로 300μL의 DAPI로 5분 동안 핵을 염색합니다.
- 300μL의 1x PBS로 5분 동안 한 번 세척합니다.
- 형광 신호를 보존하는 500μL의 fluoromount-G 배지를 사용하여 망막 섹션에 커버슬립을 놓고 버블을 피하면서 슬라이드 상단에 커버슬립을 조심스럽게 놓습니다.
3. 컨포칼 이미징
- 컨포칼 현미경으로 염색된 부분의 이미지를 획득합니다.
- 컨포칼 현미경을 켭니다.
- 슬라이드를 스테이지에 놓습니다.
- 망막 부분을 선명하게 볼 수 있도록 초점을 조정합니다.
참고: 섹션당 최소 4개의 이미지를 촬영하고 망막당 4개의 섹션을 이미지화합니다. 제안된 이미징 영역에 대한 망막 이미징 회로도를 참조하십시오(그림 1B, C).
- 이미지 카스파제, 혈관 및 핵 염색은 20x 또는 40x 대물렌즈를 사용하여 Z 스택 획득이 있는 컨포칼 현미경을 사용합니다.
참고: 이미징 매개변수 및 소프트웨어 설정은 실험의 모든 이미징에 대해 일정해야 합니다. 20x 대물렌즈는 핵 염색에 의해 잘 정의되는 망막층의 개요를 제공합니다. 40x 대물렌즈는 더 많은 셀룰러 디테일을 제공합니다.- 획득 설정을 클릭하여 채널당 적절한 노출 및 레이저 강도 시간을 설정합니다.
- Z 시리즈를 클릭하여 전체 섹션을 시각화하도록 Z 스택을 설정하고 조직의 깊이를 덮도록 매개 변수를 설정 및 축소합니다.
- 냉동 해부 중에 할당된 마스킹된 ID 다음에 이미지를 저장합니다.
4. 카스파아제 수준의 정량화
- 405, 470, 555 및 640 채널의 이미지 파일을 피지 콘솔로 드래그합니다.
- 이미지 > 색상 > 병합 채널을 클릭합니다.
- 빨간색에서 555, 녹색에서 470, 회색에서 405, 청록색에서 640으로 파일에 색상을 할당합니다.
- Z 프로젝트 > 이미지 > 스택을 클릭하여 Z 스택을 압축합니다.
- 투영 유형: 최대 강도를 클릭합니다.
- 채널 인터페이스를 클릭하여 이미지 > 색상 채널 도구를 엽니다.
- 밝기 및 대비 인터페이스를 엽니다.
- 채널당 파라미터를 선택합니다.
- 채널로 이동하여 하나의 채널을 선택합니다.
- caspase 표현 셀 위에 커서를 놓고 픽셀 값에 주석을 달 수 있습니다.
- 커서를 배경 위에 놓고 픽셀 값에 주석을 추가합니다.
- 테스트 매개 변수
- 밝기 및 대비 인터페이스로 이동합니다.
- 선택을 클릭합니다.
- 표시된 최소 값(카스파제 표현 셀의 주석이 달린 픽셀 값)을 연결합니다.
- 최대 표시 값(배경의 주석이 달린 픽셀 값)을 연결합니다.
- 확인을 클릭합니다.
- 모든 채널에 대해 4.8-4.9단계를 반복합니다.
- 맹검 조직에서 임의의 이미지를 선택하여 매개 변수를 테스트하십시오.
참고: 배경 값이 다른 이미지에 적합하지 않은 경우에만 밝기 및 대비 매개변수를 편집하십시오. - 매개변수가 설정되면 이미지 파일을 열고 Z 스택을 압축합니다.
- 카스파제 채널과 이소렉틴, 혈관 마커 채널에 대한 밝기 및 대비 파라미터를 추가합니다.
- 포인트 도구를 사용하여 양성 영역의 판독으로 카스파아제 발현과 혈관 마커의 공동 국소화를 사용하여 혈관 양성 영역의 수를 정량화합니다.
- 4.14 단계를 반복하되 Hoechst를 신경 양성 영역의 마커로 사용합니다.
- 이미지별로 스프레드시트의 값에 주석을 추가합니다.
- 섹션별 값의 평균을 구합니다.
- 섹션 값의 평균-이것은 눈당 판독값입니다.
5. 내피 세포 카스파제 -9의 관련성에 대한 유전 적 확인
- RVO7을 실시한 Casp9FL/FL-VECad-CreERT2 마우스로부터 얻은 망막을 사용한다.
- 섹션 2에 상기 기재된 바와 같이 카스파제-9 (결실된 카스파제), 카스파제-7 (다운스트림 이펙터 카스파제), 혈관 마커, 및 DAPI에 대한 망막을 면역염색한다.
- 위의 섹션 3 및 4에서 설명한 대로 이미지화하고 정량화합니다.
6. RVO에서 카스파제-9 표적화
- RVO를 받은 마우스로부터 눈을 얻은 다음, 도7에서와 같이 카스파제-9 억제제 Pen1-XBir3을 국소적으로 눈에 적용하였다.
- 상기 섹션 2에 기재된 바와 같이 caspase-7 (다운스트림 이펙터 카스파제), 혈관 마커, 및 DAPI에 대한 망막을 면역염색한다.
- 위의 섹션 3 및 4에서 설명한 대로 이미지화하고 정량화합니다.
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Representative Results
설명된 프로토콜을 통해 사용자는 망막 조직에서 카스파제-9 수준을 분석하고 정량화할 수 있습니다. 또한 caspase-9 및 다운스트림 기판을 추가로 식별, 검증 및 구체적으로 타겟팅하는 도구를 제공합니다. 요약된 단계를 통해 형광 현미경 사진에서 카스파아제 수준과 세포 특이성을 정량적으로 분석할 수 있습니다. 모든 그림은 손상되지 않은 1일 P-RVO 망막 단면에서 전체 망막, 내피 세포 및 뉴런에서 표시된 카스파아제 수준의 대표적인 현미경 사진 및 정량화를 보여줍니다. 망막 단면은 Hoechst로 염색 할 때 망막 신경절 층 (RGL), 내부 핵층 (INL) 및 외부 핵층 (ONL)의 망막 핵을 시각화 할 수 있습니다. 또한, 망막 혈관은 망막 플렉시 폼 층 또는 RGL과 INL 사이, INL과 ONL 사이에서 볼 수 있습니다. 혈관의 조직 학적 특성으로 인해 망막이 절편되면 혈관이 분리되고 분리 된 것처럼 보이며 플렉시 폼 층을 공급합니다. 그림 2 는 카스파제-9를 고도로 규제된 1일 P-RVO로 식별합니다. 도 3 은 유도성 내피 세포 녹아웃 마우스를 사용하여 내피 caspase-9의 기능적 관련성을 검증한다. 도 4 는 활성 카스파제-9를 표적화하는 것이 약리학적으로 카스파제-9-카스파제-7의 하류 표적의 유도를 차단한다는 것을 보여준다. 이 프로토콜은 카스파제의 세포 국소화와 카스파아제가 발현되는 뉴런 망막층을 식별합니다.
그림 1: 망막 영상 체계 . (A) 현미경 슬라이드에 망막 절편을 배치하는 것이 좋습니다. (B) 망막의 영상 영역 개요. (C) 20x 대물렌즈에서 망막 보기의 표현. 망막 층 : RGL = 망막 신경절 층, INL = 내부 핵층, ONL = 외부 핵층. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: RVO는 내피 세포와 뉴런에서 카스파제-9를 유도합니다. (A) cl-caspase-9 1:800(녹색), 아이솔렉틴 1:200(적색) 및 DAPI(흰색)로 염색된 손상되지 않은 1일 P-RVO의 대표적인 망막 단면. (B) cl-caspase-9를 사용한 뉴런 수의 정량화 (항체에 대한 자세한 내용은 재료 표 참조). (C) cl-caspase-9를 사용한 내피 세포 수의 정량화. (D) cl-카스파제-9를 발현하는 세포의 총 수. 부상 당하지 않음, n = 6; 1 일 P-RVO, n = 5. 오차 막대는 SEM± 평균을 나타냅니다. 단방향 분산 분석, 피셔의 LSD 테스트. 스케일 바 = 50 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 내피 카스파제-9의 내피 세포 결실은 카스파제-7의 RVO-유도를 차단합니다. (A) iEC Casp9WT 및 iEC Casp9KO 리터메이트 마우스로부터의 대표적인 망막 단면을 1-일 P-RVO로 염색하여 카스파제-7 (녹색), cl-카스파제-9 (청색), CD31, 혈관 마커 (적색) 및 DAPI(백색)로 염색하였다. (B) cl-카스파제-9 및 카스파제-7을 사용한 망막 내부의 세포 수의 정량화. (C) cl-카스파제-9 및 카스파제-7을 사용한 내피 세포 수의 정량화. (D) cl-카스파제-9 또는 카스파제-7을 발현하는 세포의 총 수. 아이EC 카스프9WT, n = 6-12; iEC 카스프9KO, n = 3-8. 오차 막대는 SEM± 평균을 나타냅니다. 단방향 분산 분석, 피셔의 LSD 테스트. 스케일 바 = 50 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 카스파제-9 활성의 억제는 카스파제-7 발현 P-RVO를 억제합니다. (A) 카스파제-7(녹색), 이소렉틴(적색) 및 DAPI(흰색)로 염색된 Pen1-XBIR3으로 치료 또는 치료되지 않은 손상되지 않은 1일 P-RVO로부터의 대표적인 망막 단면. (b) 카스파제-7을 사용한 내피 세포 수의 정량화. (C) 카스파제 -7을 사용한 백혈구 수의 정량화. (D) caspase-7을 사용한 뉴런 층 당 뉴런 수의 정량화. (E) 카스파제-7을 발현하는 세포의 총 수. 손상되지 않은 펜1 식염수, n = 6; 손상되지 않은 펜 1-XBIR3, n = 5; 1일 P-RVO 펜1 식염수, n=5; 1 일 P-RVO 펜 1-XBIR3, n = 3. 오차 막대는 SEM± 평균을 나타냅니다. 단방향 분산 분석, 피셔의 LSD 테스트. 약어 : RGL = 망막 신경절 층, INL = 내부 핵층, ONL = 외부 핵층. 스케일 바 = 50 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
Caspases는 세포 사멸 및 염증에서의 역할에 대해 가장 잘 연구 된 프로테아제의 다중 구성원 계열입니다. 그러나 최근에는 일부 가족 구성원에 대해 다양한 비 사망 기능이 발견되었습니다 4,5. 카스파아제 기능에 대한 우리의 이해의 대부분은 세포 배양에서의 작업과 인간 질병의 추론 데이터에서 파생됩니다. 질병에서 카스파제의 비정상적인 유도, 활성화 또는 불활성화가 있다는 것은 인식되지만, 카스파제가 질병 병리를 유발하는지 여부를 기능적으로 결정하는 것은 어려웠습니다. 특정 카스파제를 평가하기 위해 사용되는 많은 도구는 다수의 패밀리 구성원을 검출하여, 이들 시약(17)으로 수득된 데이터의 기능적 관련성을 약화시킨다. 여기에서는 망막을 예로 들어 복잡한 조직에서 카스파제를 연구하는 프로토콜을 제공합니다. 신경계에서 카스파아제 발현은 출생 전후에 하향 조절됩니다. 이를 통해 특정 항체를 사용하여 질병 모델에서 카스파아제 수준의 변화를 테스트할 수 있습니다.
프로토콜의 초점은 이미지 처리 및 분석에 있지만 이 기술의 성공은 데이터의 일관성, 유효성 및 신뢰성을 보장하기 위해 IHC 및 현미경 이미징뿐만 아니라 신중한 조직 준비에 달려 있습니다. 동일한 매개 변수를 사용하여 전체 데이터 세트를 이미지화하도록 주의해야 합니다. 이미지 품질이 낮고 대비가 낮고 초점이 흐릿하면 신뢰할 수 있는 데이터를 얻을 수 없습니다. 망막의 P-RVO 영역을 절편하고 이미징 할 때 찢어지거나 접히는 영역은 인공물을 초래할 수 있으므로 피해야합니다. 직접적인 손상 영역도 피해야합니다. 영상화를 수행하는 조사자는 조직의 치료에 대해 눈을 멀게 할 필요가 있습니다. 분석을 위해 치료 그룹에 맹검 된 두 명의 독립적 인 관찰자가 분석을 수행하는 것이 좋습니다. 또한, 1차 마우스 항체는 2차 항체가 비특이적으로 혈관구조에 결합하기 때문에 마우스 손상 모델에서 사용되어서는 안 된다. 대안은 직접 접합된 1차 항체를 사용하는 것이다.
세포 계수에 대한 대안적인 접근법은 발현 영역의 백분율을 정량화하는 것입니다. 이는 세포 계수가 불가능할 때 사용할 수 있습니다(예: 카스파아제 발현이 뉴런 과정 또는 광수용체 세그먼트에 국한된 경우). 중심 및 말초 망막은 다양한 손상 모델에서 차별적으로 영향을받습니다. 상기 방법은 상이한 망막 영역을 특이적으로 분석하도록 적응될 수 있다. BRVO를 수행하는 경우 눈의 손상된 부분에서 섹션을 선택해야합니다. 상기 프로토콜은 또한 카스파아제가 발현되는 위치를 확인하기 위해 상이한 세포 마커의 염색을 제공한다.
상기 방법의 한계는 주어진 세포에서 높은 레벨의 카스파제 신호와 낮은 레벨을 구별하지 않는다는 것을 포함한다. 또한 핵 염색을 사용하여 신경 층을 식별하는 것이 편리하지만 신경 세포 발현을 확실하게 나타내지는 않습니다 (아교 세포와 백혈구가이 층에도 존재합니다). 추가의 뉴런 마커를 사용하여 뉴런 발현을 검증할 수 있습니다. 또한 카스파아제 발현을 평가하기 위해 사용할 수 있는 다양한 항체가 있습니다. 이들은 전장/절단(Cl) 카스파제-9, 자가절단된 카스파제-9 및 카스파제-3-절단된 카스파제-9에 대한 항체가 있는 인간 카스파제-9에 대해 가장 잘 정의되었습니다.
IHC 신호의 평균 강도는 정량화 방법으로 자주 보고됩니다. 그러나 적혈구의 배경 소음이나 자가 형광은 부정확한 결과를 생성할 수 있습니다. 세포 특이적 정량화는 배경, 비특이적 염색 및 자가형광의 결정 및 식별을 가능하게 합니다.
이 프로토콜은 개별 카스파제 발현의 조직 전체 변화, 내피 세포와 같은 특정 세포 유형의 발현 변화 및 다른 망막 층의 뉴런과 같은 특정 위치의 특정 세포 유형의 변화를 측정하는 데 사용할 수 있습니다. 이러한 유연성을 통해 실험자는 질병 상태가 개별 카스파아제 수준을 어떻게 변경하는지 쿼리할 수 있습니다. 기존/대체 방법은 카스파제 신호전달의 반정량적 비교를 위해 웨스턴 블로팅 분석을 사용하지만, 이 프로토콜이 달성하는 세포 국소화의 명확한 분리를 제공하지는 않습니다. 특히, 도 3D에서, 카스파제-9 억제는 RGL에 비해 INL 및 ONL에서 뉴런 카스파제-9를 감소시키는데 더 효과적이다. 이러한 종류의 해상도는 다른 방법으로는 달성하기 어렵습니다. 또한 전체 조직을 생화학 적으로 분석 할 때 복잡한 조직에는 다양한 세포 유형이 있기 때문에 변화하는 카스파 아제의 수준이 너무 낮아서 포착 할 수 없습니다.
사용자가 검증해야 하는 항체는 프로빙된 카스파아제에 특이성을 제공합니다. Caspases는 캐스케이드에서 작용할 수 있습니다 (즉, 개시 자 활성화 효과기를 제거한 다음 결과로 이어짐 - 사망, 염증, 세포 신호 전달). 이 프로토콜은 손상 후 다른 시점에서 수집 된 샘플에 사용할 수 있습니다. 여기에 제시된 예에서 샘플은 RVO 이후 다른 시간에 수집됩니다. 이전에 발표 된 연구에서 카스파제 -9는 RVO7 이후 1 시간 이내에 증가하여 추가 검증 및 표적화 연구로 이어지는 것으로 나타났습니다. 내피 카스파제-9를 RVO 병리의 잠재적 동인으로 확인한 후, 내피 카스파제-9를 검증하기 위해 유도성 내피 세포 카스파제-9KO를 가진 마우스를 사용하였다. 유도성 세포 특이적 카스파아제 KO 마우스의 사용은 또 다른 수준의 특이성을 제공하고, 구성적 카스파제-9KO18에서 보이는 발달 사멸을 피한다. 이는 또한 구성적 카스파아제 KO 마우스19에서 발생하는 것으로 밝혀진 다른 패밀리 구성원의 보상적 변화를 피한다. 더욱이, 세포 특이적 유도성 카스파아제 KO 마우스의 사용은 카스파아제가 조직에서 병리를 조절하는 세포 유형의 동정을 허용한다. 이 프로토콜은 또한 RVO에서 활성 카스파제 -9를 표적으로하는 치료 접근법의 효능을 조사하는 단계를 제공합니다. 이 접근법은 뇌를 포함한 다른 조직에도 적용될 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 다음과 같은 경쟁 이익을 선언합니다 : C.M.T.는 다음과 같은 특허 출원 US20200164026, US20190142915 및 US20150165061을 보유하고 있습니다. C.M.T.와 SS는 미국 20140024597에 특허 출원을 하고 있습니다. C.M.T., A.M.P. 및 MIA는 특허 출원 US2020058683을 가지고 있습니다. C.M.T. 및 YJ는 특허 출원 WO2018013519를 가지고 있다. M.I.A와 C.M.T는 뉴욕시 컬럼비아 대학교 관리위원회의 특허 출원 WO/2020/223212에 발명자로 등재되어 있습니다. 나머지 저자는 경쟁 이익이 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
이 연구는 국립 과학 재단 대학원 연구 펠로우십 프로그램(NSF-GRFP) 보조금 DGE - 1644869 및 국립 보건원(NIH)의 국립 신경 장애 및 뇌졸중 연구소(NINDS), 수상 번호 F99NS124180 NIH NINDS 다양성 전문 F99(CKCO), 국립 안과 연구소(NEI) 5T32EY013933(AMP), 국립 신경 장애 및 뇌졸중 연구소(RO1 NS081333, R03 NS099920에서 CMT), 국방부 육군/공군(DURIP에서 CMT로).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| anti-Caspase-7 488 | Novus Biologicals | NB-56529AF488 | use at 1:150 |
| anti-cl-Caspase-9 | Cell Signaling | 9505-S | use at 1:800 |
| anti-CD31 | BD Pharmingen | 553370 | use at 1:50 |
| Confocal Spinning Disc Microscope | Biovision | ||
| FIJI 2.3.0 | open source | ||
| Fluormount G | Fisher | 50-187-88 | |
| Forcep | Roboz | RS-5015 | |
| iCasp9FL/FL X VECad-CreERT2 mice | lab generated | see Avrutsky 2020 | |
| Isolectin (594, 649) | Vector | DL-1207 | use at 1:200 |
| Ketamine Hydrochloride | Henry Schein | NDC: 11695-0702-1 | |
| Perfusion pump | Masterflex | ||
| Pen1-XBir3 | lab generated | see Avrutsky 2020 | |
| Prism 9.1 | GraphPad | ||
| Tissue-Tek O.C.T. | Fisher | 14-373-65 | |
| Vis-a-View 4.0 | Visitron Systems | ||
| Xylazine | Akorn | NDCL 59399-110-20 |
References
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