Summary
Här presenteras ett detaljerat immunhistokemiprotokoll för att identifiera, validera och rikta in sig på funktionellt relevanta caspaser i komplexa vävnader.
Abstract
Familjen av kaspaser är känd för att förmedla många cellulära vägar bortom celldöd, inklusive celldifferentiering, axonal pathfinding och proliferation. Sedan identifieringen av familjen celldödsproteaser har det sökts efter verktyg för att identifiera och utöka funktionen hos specifika familjemedlemmar i utvecklings-, hälso- och sjukdomstillstånd. Många av de för närvarande kommersiellt tillgängliga caspaseverktygen som används i stor utsträckning är dock inte specifika för den riktade caspasen. I denna rapport avgränsar vi det tillvägagångssätt vi har använt för att identifiera, validera och rikta in oss på caspase-9 i nervsystemet med hjälp av en ny hämmare och genetiska metoder med immunohistokemiska avläsningar. Specifikt använde vi retinal neuronal vävnad som en modell för att identifiera och validera närvaron och funktionen av caspaser. Detta tillvägagångssätt möjliggör förhör av celltypspecifika apoptotiska och icke-apoptotiska caspase-9-funktioner och kan tillämpas på andra komplexa vävnader och caspaser av intresse. Att förstå kaspasernas funktioner kan bidra till att utöka nuvarande kunskap inom cellbiologi, och kan också vara fördelaktigt för att identifiera potentiella terapeutiska mål på grund av deras engagemang i sjukdom.
Introduction
Caspaserna är en familj av proteaser som reglerar utvecklingscelldöd, immunsvar och avvikande celldöd vid sjukdom 1,2. Även om det är välkänt att medlemmar av caspase-familjen induceras i en mängd olika neurodegenerativa sjukdomar, är det mer utmanande att förstå vilken kaspase som driver sjukdomspatologi3. Sådana studier kräver verktyg för att identifiera, karakterisera och validera funktionen hos enskilda caspase-familjemedlemmar. Att analysera de relevanta individuella kaspaserna är viktigt både ur mekanistisk och terapeutisk synvinkel, eftersom litteraturen har flera studier som ger bevis på de olika rollerna hos caspaser 4,5. Således, om målet är att rikta in sig på en kaspas i en sjukdom för en terapeutisk fördel, är det viktigt att ha specifik inriktning på den relevanta familjemedlemmen / medlemmarna. Traditionella tekniker för att detektera caspasnivåer i vävnad inkluderar western blotting och enzymatiska och fluorometriska metoder 3,6. Ingen av dessa åtgärder möjliggör dock cellspecifik detektion av kaspasnivåer, och i vissa scenarier kan klyvda kaspaser ofta inte detekteras med traditionella proteinanalysåtgärder. Det är känt att kaspaser kan spela olika apoptotiska och icke-apoptotiska roller i samma vävnad7, därför behövs noggrann karakterisering av cellspecifika caspasnivåer för korrekt förståelse av utvecklings- och sjukdomsvägar.
Denna studie visar kaspasaktivering och funktion i en modell av neurovaskulär hypoxi-ischemi - retinal venocklusion (RVO)7,8. I en komplex vävnad som näthinnan finns det flera celltyper som kan påverkas av hypoxi-ischemi inducerad i RVO, inklusive gliaceller, neuroner och vaskulatur7. I den vuxna musens näthinna finns det mycket lite uttryck av caspaser som är uppenbara i frisk vävnad, mätt med immunhistokemi (IHC)7, men så är inte fallet under utveckling9 eller i modeller av näthinnesjukdom10,11. IHC är en teknik som är väl etablerad inom biomedicinsk forskning och har möjliggjort validering av sjukdomar och patologiska mål, identifiering av nya roller genom rumslig lokalisering och kvantifiering av proteiner. I de fall där klyvda caspasprodukter inte kan detekteras genom western blot- eller fluorometrisk analys, inte heller den specifika cellplaceringen av distinkta caspaser eller förhör av caspase-signalvägar genom lokalisering, bör IHC användas.
För att bestämma caspase(s) funktionellt relevant i RVO användes IHC med validerade antikroppar för caspaser och cellulära markörer. De tidigare studierna som utförts i labbet visade att caspase-9 snabbt aktiverades i en modell av ischemisk stroke och hämning av caspase-9 med en mycket specifik hämmare skyddad från neuronal dysfunktion och död12. Eftersom näthinnan är en del av centrala nervsystemet (CNS) fungerar det som ett modellsystem för att fråga och ytterligare undersöka rollen av caspase-9 vid neurovaskulära skador13. För detta ändamål användes musmodellen av RVO för att studera den cellspecifika platsen och fördelningen av caspase-9 och dess implikation i neurovaskulär skada. RVO är en vanlig orsak till blindhet hos vuxna i arbetsför ålder som beror på kärlskada14. Det visade sig att caspase-9 uttrycktes på ett icke-apoptotiskt sätt i endotelceller, men inte i neuroner.
Som vävnad har näthinnan fördelen att den visualiseras som antingen en flatmount, vilket möjliggör uppskattning av kärlnätverken, eller som tvärsnitt, vilket belyser de neuronala retinala skikten. Kvantifiering av caspaseproteinuttryck i tvärsnitt ger sammanhang, angående vilket kaspase som är potentiellt kritiskt i retinal neuronal anslutning och synfunktion genom att identifiera lokaliseringen av caspase (er) i näthinnan. Efter identifiering och validering uppnås inriktning på den kaspas av intresse med hjälp av inducerbar cellspecifik radering av det identifierade caspaset. För potentiella terapeutiska undersökningar testades relevansen av de kaspaser av intresse med hjälp av specifika verktyg för att hämma det aktiverade caspaset. För caspase-9 användes en cell permeant mycket selektiv hämmare 7,15, Pen1-XBIR3. För denna rapport användes 2 månader gammal, manlig C57BL / 6J-stam och tamoxifeninducerbar endotelkaspas-9 knockout (iEC Casp9KO) stam med en C57BL / 6J-bakgrund. Dessa djur exponerades för musmodellen av RVO och C57BL/6J behandlades med den selektiva caspase-9-hämmaren Pen1-XBir3. Den beskrivna metoden kan tillämpas på andra sjukdomsmodeller i centrala och perifera system 7,15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Detta protokoll följer Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) uttalande för användning av djur i oftalmisk och synforskning. Gnagarförsök godkändes och övervakades av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) vid Columbia University.
1. Beredning av näthinnevävnad och kryosektion
- Avliva djuren genom administrering av intraperitoneal anestesi (ketamin (80-100 mg/kg) och xylazin (5-10 mg/kg)) och perfusa mössen som utsätts för RVO (se8 för detaljer) med 4% paraformaldehyd (PFA) med hjälp av en peristaltisk pump.
OBS: Tå-nyp djuret för att bekräfta anestesidjupet innan du fortsätter med avlivning och perfusion. Detaljer om perfusion finns i16. - Skörda ögonen genom noggrann enucleation med pincett och lägg jordklotet i 1 ml 4% PFA. Låt ögonen stå över natten vid 4 °C. Tvätta ögonen tre gånger i 10 min, tillsätt 1 ml 1x PBS och placera dem i shakern.
- Sänk ner ögonen i 1 ml 30% sackaros i 3 dagar tills de sätter sig i botten av röret, vilket indikerar absorption av sackaros.
- Fyll ögonen med optimal skärtemperaturförening med en 30 G spruta tills ögat har ett rundat utseende (cirka 50 μL).
- Bädda in ögonen i ett kryomrör med optimal skärtemperaturförening tills ögonen är täckta och frys vid -80 °C tills de är klara för kryosektion.
- Sektionen inbäddade ögonen vid 20 μm på glasskivor med en kryostat.
- Ta bort det optimala skärtemperaturföreningsblocket från kryomolden.
- Placera den på kryostatchucken genom att tillsätta optimal skärtemperaturförening och placera blocket på chucken. Lämna den inuti kryostaten tills den fryser.
- Fortsätt att skära blocket vid 20 μm tills näthinnevävnaden ses.
OBS: Detta kan bekräftas med ett ljusmikroskop med 30x förstoring (3x mål, 10x okular). Vävnader kan särskiljas från OCT-media genom färg och form. - Samla näthinnevävnaden i mikroskopglas i en serie av fyra sektioner per bild.
OBS: Se figur 1A för föreslagen placering av näthinnesektioner.
- Märk bilderna med ett ID som avidentifierar behandlingen och genotypen.
- Förvara objektglasen vid -20 °C tills de färgas.
2. Immunhistokemi
OBS: Använd fast kryokonserverad vävnad för immunhistokemi för att upprätthålla cellmorfologi. Välj sektioner som ligger på nivån för de optiska koherenstomografibilderna (OCT) som erhållits in vivo7. Använd de två första serierna av bilder som samlats in från kryostaten eller sektioner från 150 μm till näthinnevävnaden.
- Placera bilderna i en mörk och fuktig glidkammare.
- Permeabilisering och blockering: Tvätta näthinnans tvärsnitt med 300 μL 1x PBS i 5 min för att ta bort OCT och kassera efter.
- Permeabilisera vävnaden genom att tillsätta 300 μL 1x PBS med 0,1% Triton X-100 i 2 timmar vid rumstemperatur (RT) och kassera efter.
- Blockera vävnaden genom att tillsätta 300 μL blockerande buffert (10% Normal Goat Serum (NGS), 1% Bovine Serum Albumin (BSA) i 1x PBS, filtrerat) och låt stå över natten vid 4 °C.
- Primära antikroppar: Späd primära antikroppar i blockerande buffert. Primära antikroppar som används inkluderar anti-cl-caspase-9 vid 1:800, anti-CD31 vid 1:50 och anti-caspase-7-488 (direkt märkt antikropp) vid 1:150.
OBS: Följ tillverkarens rekommendation för lämplig utspädning av primära antikroppar.- Häll blockeringsbufferten från sektioner och applicera 100 μL av den primära antikroppscocktailen på retinalglasen.
- Inkubera tvärsnitten över natten vid 4 °C.
- Tvätta sektionerna fyra gånger i 5 min med 300 μL 1x PBS.
OBS: Om vävnadssektionerna är mycket ömtåliga, bör tvättar avlägsnas med kapillärverkan genom att applicera en vävnad i hörnet av bilden för att undvika att förskjuta näthinnesektionerna. - För att undvika korsmärkning av primära antikroppar uppfödda i samma värdart, slutför färgningen med sekundära antikroppar innan du applicerar de direkt märkta antikropparna.
- Sekundära antikroppar: Späd de sekundära antikropparna i blockerande buffert i en koncentration av 0,1%. Till exempel, för att detektera anti-cl-caspase-9, en antikropp uppvuxen i kanin, använd get-anti-kanin-568 sekundär.
- Applicera 200 μL av den sekundära antikroppscocktailen på näthinnorna.
- Inkubera vävnaden i 2 timmar vid RT.
- Tvätta sektionerna fyra gånger i 5 min med 300 μL 1x PBS.
- Färga kärnorna i 5 minuter med 300 μl DAPI vid en utspädning av 0,02%.
- Tvätta en gång i 5 min med 300 μL 1x PBS.
- Placera ett täckglas på näthinnesektionerna med 500 μL fluoromount-G-media, som bevarar den fluorescerande signalen, och placera försiktigt täckglaset på toppen av bilden och undvik bubblor.
3. Konfokal avbildning
- Skaffa bilder av de färgade sektionerna med konfokalmikroskopi.
- Slå på konfokalmikroskopet.
- Placera bilden på scenen.
- Justera fokus för att se näthinnesektionen tydligt.
OBS: Ta minst fyra bilder per avsnitt och bild fyra sektioner per näthinna. Se retinal bildschema för föreslagna bildområden (figur 1B, C).
- Bildkaspas, vaskulär och kärnfärgning med hjälp av ett konfokalmikroskop som har Z-stack-förvärv, med ett 20x eller 40x mål.
Bildparametrarna och programvarukonfigurationen bör vara konstanta för all avbildning i ett experiment. 20x-målet ger en översikt över näthinneskikten, som är väldefinierade av kärnfärgningen. 40x-målet ger mer cellulära detaljer.- Ställ in lämpliga exponerings- och laserintensitetstider per kanal genom att klicka på hämta inställningar.
- Ställ in Z-stacken för att visualisera hela avsnittet genom att klicka på Z-serien och ställ in upp och ner parametrar för att täcka vävnadens djup.
- Spara bilderna efter det maskerade ID som tilldelats under kryosektion.
4. Kvantifiering av kaspashalter
- Dra bildfiler med 405-, 470-, 555- och 640-kanaler till FIJI:s konsol.
- Klicka på Bild > färg > Slå samman kanaler.
- Tilldela färger till filerna enligt följande: röd till 555, grön till 470, grå till 405, cyan till 640.
- Komprimera Z-stacken genom att klicka på Image > Stack > Z Project.
- Klicka på Projektionstyp: Maximal intensitet.
- Öppna kanalgränssnittet genom att klicka på Verktyg Bild > Färgkanaler.
- Öppna gränssnittet Ljusstyrka och kontrast .
- Välj parametrar per kanal.
- Gå till Kanaler och välj en kanal.
- Placera markören ovanpå den caspase-uttryckta cellen och kommentera pixelvärdet.
- Placera markören ovanpå bakgrunden och kommentera pixelvärdet.
- Testa parametrar
- Gå till Ljusstyrka och kontrast gränssnitt.
- Klicka på Välj.
- Anslut det lägsta visade värdet (kommenterat pixelvärde för den caspase-uttryckta cellen).
- Anslut det maximala visningsvärdet (kommenterat pixelvärde i bakgrunden).
- Klicka på Ok.
- Upprepa steg 4.8-4.9 för alla kanaler.
- Testa parametrarna genom att välja slumpmässiga bilder från blindad vävnad.
Redigera endast parametrar för ljusstyrka och kontrast om bakgrundsvärdet inte är tillräckligt för andra bilder. - När parametrarna är inställda öppnar du bildfilerna och komprimerar Z-stacken.
- Lägg till parametrarna ljusstyrka och kontrast för caspasekanalen och isolektin, vaskulär markörkanal.
- Använd punktverktyget för att kvantifiera antalet vaskulära positiva områden med hjälp av samlokalisering av kärlmarkören med caspaseuttryck som avläsning av positiva områden.
- Upprepa steg 4.14 men använd Hoechst som markör för neuronala positiva områden.
- Kommentera värdena i ett kalkylblad per bild.
- Medelvärdet av värdena per sektion.
- Medelvärdet av sektionsvärdena - detta kommer att vara avläsningen per öga.
5. Genetisk bekräftelse av relevansen av endotelcellen caspase-9
- Använd näthinnor som erhållits från Casp9FL/FL-VECad-CreERT2-mössen som utsattes för RVO7.
- Immunostaina näthinnorna för caspase-9 (det borttagna caspaset), caspase-7 (en nedströms effektorkaspas), vaskulära markörer och DAPI enligt beskrivningen ovan i avsnitt 2.
- Bild och kvantifiering enligt beskrivningen ovan i avsnitten 3 och 4.
6. Inriktning på caspase-9 i RVO
- Få ögon från mössen som utsätts för RVO följt av applicering av caspase-9-hämmaren Pen1-XBir3 lokalt på ögonen som i7.
- Immunostain näthinnorna för caspase-7 (en nedströms effektor caspase), vaskulära markörer och DAPI enligt beskrivningen ovan i avsnitt 2.
- Bild och kvantifiering enligt beskrivningen ovan i avsnitten 3 och 4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det beskrivna protokollet tillåter användaren att analysera och kvantifiera caspase-9-nivåer i retinalvävnaden. Dessutom presenterar den verktyg för att ytterligare identifiera, validera och specifikt rikta in sig på caspase-9 och nedströms substrat. De sammanfattade stegen möjliggör kvantifierbar analys av caspasnivåer och cellulär specificitet i fluorescerande fotomikrografer. Alla figurer visar representativa fotomikrografer och kvantifiering av de angivna caspasnivåerna i den totala näthinnan, endotelceller och neuroner i oskadade och 1-dagars P-RVO näthinnetvärsnitt. Retinaltvärsnittet möjliggör visualisering av retinala kärnor i retinal ganglionskiktet (RGL), inre kärnskikt (INL) och yttre kärnskikt (ONL) när det färgas med Hoechst. Dessutom är retinala blodkärl synliga i retinala plexiformskikten eller mellan RGL och INL och mellan INL och ONL. På grund av blodkärlens histologiska natur, när näthinnan är sektionerad, kommer blodkärlen att framstå som frånkopplade och separata, vilket ger de plexiforma skikten. Figur 2 identifierar caspase-9 som starkt reglerad 1-dagars P-RVO. Figur 3 validerar den funktionella relevansen av endotelkaspas-9 genom att använda inducerbara endotelcell knockout-möss. Figur 4 visar att inriktning på aktivt kaspas-9 farmakologiskt blockerar induktionen av ett nedströmsmål för caspase-9-caspase-7. Protokollet identifierar den cellulära lokaliseringen av caspaserna och de neuronala retinala skikten i vilka caspaserna uttrycks.
Figur 1: Retinal avbildningsschema . (A) Rekommenderad placering av näthinnesektioner i mikroskopglaset. (B) Översikt över avbildningsområdena i näthinnan. (C) Representation av retinal vy vid 20x mål. Retinala lager: RGL = retinal ganglionskikt, INL = inre kärnskikt, ONL = yttre kärnskikt. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: RVO inducerar caspase-9 i endotelceller och neuroner. (A) Representativa näthinnetvärsnitt från oskadade och 1-dagars P-RVO färgade med cl-caspase-9 1:800 (grön), isolektin 1:200 (röd) och DAPI (vit). (B) Kvantifiering av antalet nervceller med cl-caspase-9 (se materialförteckningen för detaljer om antikropparna). C) Kvantifiering av antalet endotelceller med cl-caspase-9. (D) Totalt antal celler som uttrycker cl-caspase-9. Oskadad, n = 6; 1-dagars P-RVO, n = 5. Felstaplar representerar medelvärdet ± SEM; Enkelriktad ANOVA, Fishers LSD-test. Skalstreck = 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Endotelcellradering av endotelkaspas-9 blockerar RVO-induktion av caspase-7. (A) Representativa näthinnetvärsnitt från iEC Casp9WT och iEC Casp9KO kullmöss 1-dagars P-RVO färgade med caspase-7 (grön), cl-caspase-9 (blå), CD31, en vaskulär markör (röd) och DAPI (vit). (B) Kvantifiering av antalet celler i den inre näthinnan med cl-caspase-9 och med caspase-7. C) Kvantifiering av antalet endotelceller med cl-caspase-9 och med caspase-7. (D) Totalt antal celler som uttrycker cl-caspase-9 eller caspase-7. iEC Casp9WT, n = 6-12; iEC Casp9KO, n = 3-8. Felstaplar representerar medelvärdet ± SEM; Enkelriktad ANOVA, Fishers LSD-test. Skalstreck = 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Hämning av caspase-9-aktivitet hämmar caspase-7-uttryck P-RVO. (A) Representativa näthinnetvärsnitt från oskadade och 1-dagars P-RVO behandlade eller obehandlade med Pen1-XBIR3 färgad med caspase-7 (grön), isolektin (röd) och DAPI (vit). (B) Kvantifiering av antalet endotelceller med caspase-7. C) Kvantifiering av antalet leukocyter med kaspas-7. (D) Kvantifiering av antalet neuroner per neuronalt skikt med caspase-7. (E) Totalt antal celler som uttrycker caspase-7. Oskadad penna1 saltlösning, n = 6; oskadad Pen1-XBIR3, n = 5; 1-dagars P-RVO Pen1 Saltlösning, n = 5; 1-dagars P-RVO Pen1-XBIR3, n = 3. Felstaplar representerar medelvärdet ± SEM; Enkelriktad ANOVA, Fishers LSD-test. Förkortningar: RGL = retinal ganglionskikt, INL = inre kärnskikt och ONL = yttre kärnskikt. Skalstreck = 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kaspaser är en flerledad familj av proteaser som bäst studeras för sina roller i celldöd och inflammation; på senare tid har dock en mängd olika icke-dödsfunktioner avslöjats för vissa familjemedlemmar 4,5. Mycket av vår förståelse av caspasfunktionen härrör från arbete i cellodling och från inferentiella data från mänsklig sjukdom. Även om det uppskattas att det finns avvikande induktion, aktivering eller inaktivering av kaspaser vid sjukdom, har det varit utmanande att funktionellt avgöra om caspaserna driver sjukdomspatologi. Många verktyg som används för att bedöma specifika kaspaser upptäcker flera familjemedlemmar, vilket underskrider den funktionella relevansen av data som erhållits med dessa reagenser17. Här tillhandahåller vi ett protokoll för att studera kaspaser i komplex vävnad, med näthinnan som exempel. I nervsystemet är caspasuttrycket nedreglerat före och postnatalt. Detta möjliggör användning av specifika antikroppar för att testa förändringar i kaspasnivåer i en sjukdomsmodell.
Medan protokollets fokus ligger på bildbehandling och analys, är teknikens framgång också beroende av noggrann vävnadsberedning, liksom IHC och mikroskopisk avbildning för att säkerställa konsistens, validitet och tillförlitlighet hos data. Man måste vara noga med att använda samma parametrar för att avbilda en hel datauppsättning. Bilder av dålig kvalitet, låg kontrast och suddigt fokus ger inte tillförlitliga data. Vid sektionering och avbildning av P-RVO-regioner i näthinnan bör tårar och vikning undvikas eftersom dessa områden kan leda till artefakter. Områden med direkt skada bör också undvikas. Utredaren som utför avbildningen måste förblindas för behandlingen av vävnaden. För analys rekommenderas att två oberoende observatörer, blindade för behandlingsgruppen, utför analysen. Dessutom bör primära musantikroppar inte användas i musskademodeller eftersom de sekundära antikropparna binder icke-specifikt till kärlen. Ett alternativ är att använda direkt konjugerade primära antikroppar.
Ett alternativt tillvägagångssätt för cellräkning är kvantifiering av procentandelen av uttrycksområdet. Detta kan användas när cellräkning inte är möjlig (t.ex. om caspasuttryck är lokaliserat till neuronala processer eller fotoreceptorsegment). Central och perifer näthinna påverkas differentiellt i olika skademodeller. Metoden kan anpassas för att specifikt analysera olika näthinneregioner. Om du utför BRVO, bör sektioner väljas från den skadade delen av ögat. Protokollet föreskriver också färgning av olika cellmarkörer för att identifiera var kaspaset uttrycks.
Begränsningar av metoden inkluderar att den inte skiljer mellan höga och låga nivåer av caspassignal i en given cell. Dessutom är det bekvämt att använda en kärnfläck för att identifiera neuronala lager men indikerar inte definitivt neuronalt uttryck (glia och leukocyter finns också i dessa lager). Ytterligare neuronala markörer kan användas för att validera neuronala uttryck. Det finns också en mängd olika antikroppar tillgängliga för att utvärdera caspasuttryck; Dessa har bäst definierats för humant caspase-9, där det finns antikroppar för full längd / klyvd (CL) caspase-9, autoklyvd caspase-9 och caspase-3-klyvd caspase-9.
IHC-signalens medelintensitet rapporteras ofta som en kvantifieringsmetod. Bakgrundsbrus eller autofluoresens från röda blodkroppar kan dock ge felaktiga resultat. Cellspecifik kvantifiering möjliggör bestämning och diskriminering av bakgrund, icke-specifik färgning och autofluoresens.
Detta protokoll kan användas för att mäta vävnadsomfattande förändringar i uttrycket av enskilda caspaser, förändringar i uttryck i en specifik celltyp, såsom en endotelcell, och förändringar i specifika celltyper på specifika platser, såsom neuroner i olika näthinneskikt. Denna flexibilitet gör det möjligt för experimenteraren att fråga hur sjukdomstillståndet förändrar individuella caspasenivåer. Befintliga/alternativa metoder använder western blotting-analys för semikvantitativ jämförelse av caspase-signalering, även om metoder inte kommer att ge den tydliga separation av cellulär lokalisering som detta protokoll värker. I figur 3D är kaspas-9-hämning mer effektiv för att minska neuronal kaspas-9 i INL och ONL, jämfört med RGL. Denna typ av upplösning är utmanande att uppnå med andra metoder. Dessutom, när en hel vävnad analyseras biokemiskt, kan nivåerna av caspaser som förändras vara för låga för att plocka upp, eftersom det finns många olika celltyper i en komplex vävnad.
Antikropparna, som måste valideras av användaren, ger specificitet för den undersökta kaspasen. Kaspaser kan verka i kaskader (dvs. initiator som aktiverar effektorn och sedan leder till resultat - död, inflammation, cellsignalering). Detta protokoll kan användas i prover som samlats in vid olika tidpunkter efter skada; I exemplen som presenteras här samlas prover in vid olika tidpunkter efter RVO. I tidigare publicerat arbete har det visat sig att caspase-9 ökades inom 1 h efter RVO7, vilket ledde till ytterligare validering och riktade studier. Efter att ha identifierat endotelkaspas-9 som en potentiell drivkraft för RVO-patologi användes en mus med inducerbar endotelcellkaspas-9KO för att validera endotelkaspas-9. Användningen av inducerbara cellspecifika kaspase KO-möss ger en annan nivå av specificitet och undviker utvecklingsdöden som ses med konstitutivt caspase-9KO18. Det undviker också kompensationsförändringar hos andra familjemedlemmar som har visat sig förekomma hos konstitutiv kaspase KO-möss19. Dessutom möjliggör användningen av cellspecifika inducerbara kaspase KO-möss identifiering av celltypen där kaspaset reglerar patologi i vävnaden. Protokollet ger också stegen för att förhöra effekten av ett terapeutiskt tillvägagångssätt, riktat mot aktiv caspase-9 i RVO. Detta tillvägagångssätt kan också tillämpas på andra vävnader, inklusive hjärnan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar följande konkurrerande intressen: C.M.T. har följande patentansökningar US20200164026, US20190142915 och US20150165061. C.M.T. och S.S. har en patentansökan US 20140024597. C.M.T., A.M.P. och M.I.A. har en patentansökan US2020058683. C.M.T. och Y.Y.J. har en patentansökan WO2018013519. M.I.A och C.M.T är listade som uppfinnare på en patentansökan WO/2020/223212 av Trustees of Columbia University i Staden New York. De återstående författarna förklarar inga konkurrerande intressen.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program (NSF-GRFP) bidrag DGE - 1644869 och National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) från National Institutes of Health (NIH), prisnummer F99NS124180 NIH NINDS Diversity Specialized F99 (till CKCO), National Eye Institute (NEI) 5T32EY013933 (till AMP), National Institute of Neurological Disorders and Stroke (RO1 NS081333, R03 NS099920 till CMT) och försvarsdepartementets armé/flygvapen (DURIP till CMT).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| anti-Caspase-7 488 | Novus Biologicals | NB-56529AF488 | use at 1:150 |
| anti-cl-Caspase-9 | Cell Signaling | 9505-S | use at 1:800 |
| anti-CD31 | BD Pharmingen | 553370 | use at 1:50 |
| Confocal Spinning Disc Microscope | Biovision | ||
| FIJI 2.3.0 | open source | ||
| Fluormount G | Fisher | 50-187-88 | |
| Forcep | Roboz | RS-5015 | |
| iCasp9FL/FL X VECad-CreERT2 mice | lab generated | see Avrutsky 2020 | |
| Isolectin (594, 649) | Vector | DL-1207 | use at 1:200 |
| Ketamine Hydrochloride | Henry Schein | NDC: 11695-0702-1 | |
| Perfusion pump | Masterflex | ||
| Pen1-XBir3 | lab generated | see Avrutsky 2020 | |
| Prism 9.1 | GraphPad | ||
| Tissue-Tek O.C.T. | Fisher | 14-373-65 | |
| Vis-a-View 4.0 | Visitron Systems | ||
| Xylazine | Akorn | NDCL 59399-110-20 |
References
- Van Opdenbosch, N., Lamkanfi, M. Caspases in cell death, inflammation, and disease. Immunity. 50 (6), 1352-1364 (2019).
- Ramirez, M. L. G., Salvesen, G. S. A primer on caspase mechanisms. Seminars in Cell & Developmental Biology. 82, Academic Press. 79-85 (2018).
- Troy, C. M., Jean, Y. Y. Caspases: therapeutic targets in neurologic disease. Neurotherapeutics. 12 (1), 42-48 (2015).
- Avrutsky, M. I., Troy, C. M. Caspase-9: a multimodal therapeutic target with diverse cellular expression in human disease. Frontiers in Pharmacology. 12, 1728 (2021).
- Fuchs, Y., Steller, H. Programmed cell death in animal development and disease. Cell. 147 (4), 742-758 (2011).
- Troy, C. M., Akpan, N., Jean, Y. Y. Regulation of caspases in the nervous system: implications for functions in health and disease. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 99, 265-305 (2011).
- Avrutsky, M. I., et al. Endothelial activation of caspase-9 promotes neurovascular injury in retinal vein occlusion. Nature Communications. 11 (1), 3173 (2020).
- Colon Ortiz, C., Potenski, A., Lawson, J. M., Smart, J., Troy, C. M. Optimization of the retinal vein occlusion mouse model to limit variability. Journal of Visualized Experiments. (174), e62980 (2021).
- Tisch, N., et al. Caspase-8 modulates physiological and pathological angiogenesis during retina development. The Journal of Clinical Investigation. 129 (12), 5092-5107 (2019).
- Chi, W., et al. HMGB1 promotes the activation of NLRP3 and caspase-8 inflammasomes via NF-kappaB pathway in acute glaucoma. Journal of Neuroinflammation. 12, 137 (2015).
- Thomas, C. N., et al. Caspase-2 mediates site-specific retinal ganglion cell death after blunt ocular injury. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 59 (11), 4453-4462 (2018).
- Akpan, N., et al. Intranasal delivery of caspase-9 inhibitor reduces caspase-6-dependent axon/neuron loss and improves neurological function after stroke. Journal of Neuroscience. 31 (24), 8894-8904 (2011).
- London, A., Benhar, I., Schwartz, M. The retina as a window to the brain-from eye research to CNS disorders. Nature Reviews Neurology. 9 (1), 44-53 (2013).
- Song, P., Xu, Y., Zha, M., Zhang, Y., Rudan, I. Global epidemiology of retinal vein occlusion: a systematic review and meta-analysis of prevalence, incidence, and risk factors. Journal of Global Health. 9 (1), 010427 (2019).
- Akpan, N., et al. Intranasal delivery of caspase-9 inhibitor reduces caspase-6-dependent axon/neuron loss and improves neurological function after stroke. The Journal of neuroscience. 31 (24), 8894-8904 (2011).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- McStay, G. P., Salvesen, G. S., Green, D. R. Overlapping cleavage motif selectivity of caspases: implications for analysis of apoptotic pathways. Cell Death & Differentiation. 15 (2), 322-331 (2007).
- Kuida, K., et al. Reduced apoptosis and cytochrome c-mediated caspase activation in mice lacking caspase 9. Cell. 94 (3), 325-337 (1998).
- Troy, C. M., et al. Death in the balance: alternative participation of the caspase-2 and -9 pathways in neuronal death induced by nerve growth factor deprivation. Journal of Neuroscience. 21 (14), 5007-5016 (2001).
