Här presenteras ett detaljerat immunhistokemiprotokoll för att identifiera, validera och rikta in sig på funktionellt relevanta caspaser i komplexa vävnader.
Familjen av kaspaser är känd för att förmedla många cellulära vägar bortom celldöd, inklusive celldifferentiering, axonal pathfinding och proliferation. Sedan identifieringen av familjen celldödsproteaser har det sökts efter verktyg för att identifiera och utöka funktionen hos specifika familjemedlemmar i utvecklings-, hälso- och sjukdomstillstånd. Många av de för närvarande kommersiellt tillgängliga caspaseverktygen som används i stor utsträckning är dock inte specifika för den riktade caspasen. I denna rapport avgränsar vi det tillvägagångssätt vi har använt för att identifiera, validera och rikta in oss på caspase-9 i nervsystemet med hjälp av en ny hämmare och genetiska metoder med immunohistokemiska avläsningar. Specifikt använde vi retinal neuronal vävnad som en modell för att identifiera och validera närvaron och funktionen av caspaser. Detta tillvägagångssätt möjliggör förhör av celltypspecifika apoptotiska och icke-apoptotiska caspase-9-funktioner och kan tillämpas på andra komplexa vävnader och caspaser av intresse. Att förstå kaspasernas funktioner kan bidra till att utöka nuvarande kunskap inom cellbiologi, och kan också vara fördelaktigt för att identifiera potentiella terapeutiska mål på grund av deras engagemang i sjukdom.
Caspaserna är en familj av proteaser som reglerar utvecklingscelldöd, immunsvar och avvikande celldöd vid sjukdom 1,2. Även om det är välkänt att medlemmar av caspase-familjen induceras i en mängd olika neurodegenerativa sjukdomar, är det mer utmanande att förstå vilken kaspase som driver sjukdomspatologi3. Sådana studier kräver verktyg för att identifiera, karakterisera och validera funktionen hos enskilda caspase-familjemedlemmar. Att analysera de relevanta individuella kaspaserna är viktigt både ur mekanistisk och terapeutisk synvinkel, eftersom litteraturen har flera studier som ger bevis på de olika rollerna hos caspaser 4,5. Således, om målet är att rikta in sig på en kaspas i en sjukdom för en terapeutisk fördel, är det viktigt att ha specifik inriktning på den relevanta familjemedlemmen / medlemmarna. Traditionella tekniker för att detektera caspasnivåer i vävnad inkluderar western blotting och enzymatiska och fluorometriska metoder 3,6. Ingen av dessa åtgärder möjliggör dock cellspecifik detektion av kaspasnivåer, och i vissa scenarier kan klyvda kaspaser ofta inte detekteras med traditionella proteinanalysåtgärder. Det är känt att kaspaser kan spela olika apoptotiska och icke-apoptotiska roller i samma vävnad7, därför behövs noggrann karakterisering av cellspecifika caspasnivåer för korrekt förståelse av utvecklings- och sjukdomsvägar.
Denna studie visar kaspasaktivering och funktion i en modell av neurovaskulär hypoxi-ischemi – retinal venocklusion (RVO)7,8. I en komplex vävnad som näthinnan finns det flera celltyper som kan påverkas av hypoxi-ischemi inducerad i RVO, inklusive gliaceller, neuroner och vaskulatur7. I den vuxna musens näthinna finns det mycket lite uttryck av caspaser som är uppenbara i frisk vävnad, mätt med immunhistokemi (IHC)7, men så är inte fallet under utveckling9 eller i modeller av näthinnesjukdom10,11. IHC är en teknik som är väl etablerad inom biomedicinsk forskning och har möjliggjort validering av sjukdomar och patologiska mål, identifiering av nya roller genom rumslig lokalisering och kvantifiering av proteiner. I de fall där klyvda caspasprodukter inte kan detekteras genom western blot- eller fluorometrisk analys, inte heller den specifika cellplaceringen av distinkta caspaser eller förhör av caspase-signalvägar genom lokalisering, bör IHC användas.
För att bestämma caspase(s) funktionellt relevant i RVO användes IHC med validerade antikroppar för caspaser och cellulära markörer. De tidigare studierna som utförts i labbet visade att caspase-9 snabbt aktiverades i en modell av ischemisk stroke och hämning av caspase-9 med en mycket specifik hämmare skyddad från neuronal dysfunktion och död12. Eftersom näthinnan är en del av centrala nervsystemet (CNS) fungerar det som ett modellsystem för att fråga och ytterligare undersöka rollen av caspase-9 vid neurovaskulära skador13. För detta ändamål användes musmodellen av RVO för att studera den cellspecifika platsen och fördelningen av caspase-9 och dess implikation i neurovaskulär skada. RVO är en vanlig orsak till blindhet hos vuxna i arbetsför ålder som beror på kärlskada14. Det visade sig att caspase-9 uttrycktes på ett icke-apoptotiskt sätt i endotelceller, men inte i neuroner.
Som vävnad har näthinnan fördelen att den visualiseras som antingen en flatmount, vilket möjliggör uppskattning av kärlnätverken, eller som tvärsnitt, vilket belyser de neuronala retinala skikten. Kvantifiering av caspaseproteinuttryck i tvärsnitt ger sammanhang, angående vilket kaspase som är potentiellt kritiskt i retinal neuronal anslutning och synfunktion genom att identifiera lokaliseringen av caspase (er) i näthinnan. Efter identifiering och validering uppnås inriktning på den kaspas av intresse med hjälp av inducerbar cellspecifik radering av det identifierade caspaset. För potentiella terapeutiska undersökningar testades relevansen av de kaspaser av intresse med hjälp av specifika verktyg för att hämma det aktiverade caspaset. För caspase-9 användes en cell permeant mycket selektiv hämmare 7,15, Pen1-XBIR3. För denna rapport användes 2 månader gammal, manlig C57BL / 6J-stam och tamoxifeninducerbar endotelkaspas-9 knockout (iEC Casp9KO) stam med en C57BL / 6J-bakgrund. Dessa djur exponerades för musmodellen av RVO och C57BL/6J behandlades med den selektiva caspase-9-hämmaren Pen1-XBir3. Den beskrivna metoden kan tillämpas på andra sjukdomsmodeller i centrala och perifera system 7,15.
Kaspaser är en flerledad familj av proteaser som bäst studeras för sina roller i celldöd och inflammation; på senare tid har dock en mängd olika icke-dödsfunktioner avslöjats för vissa familjemedlemmar 4,5. Mycket av vår förståelse av caspasfunktionen härrör från arbete i cellodling och från inferentiella data från mänsklig sjukdom. Även om det uppskattas att det finns avvikande induktion, aktivering eller inaktivering av kaspaser vid sjukdom, …
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program (NSF-GRFP) bidrag DGE – 1644869 och National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) från National Institutes of Health (NIH), prisnummer F99NS124180 NIH NINDS Diversity Specialized F99 (till CKCO), National Eye Institute (NEI) 5T32EY013933 (till AMP), National Institute of Neurological Disorders and Stroke (RO1 NS081333, R03 NS099920 till CMT) och försvarsdepartementets armé/flygvapen (DURIP till CMT).
anti-Caspase-7 488 | Novus Biologicals | NB-56529AF488 | use at 1:150 |
anti-cl-Caspase-9 | Cell Signaling | 9505-S | use at 1:800 |
anti-CD31 | BD Pharmingen | 553370 | use at 1:50 |
Confocal Spinning Disc Microscope | Biovision | ||
FIJI 2.3.0 | open source | ||
Fluormount G | Fisher | 50-187-88 | |
Forcep | Roboz | RS-5015 | |
iCasp9FL/FL X VECad-CreERT2 mice | lab generated | see Avrutsky 2020 | |
Isolectin (594, 649) | Vector | DL-1207 | use at 1:200 |
Ketamine Hydrochloride | Henry Schein | NDC: 11695-0702-1 | |
Perfusion pump | Masterflex | ||
Pen1-XBir3 | lab generated | see Avrutsky 2020 | |
Prism 9.1 | GraphPad | ||
Tissue-Tek O.C.T. | Fisher | 14-373-65 | |
Vis-a-View 4.0 | Visitron Systems | ||
Xylazine | Akorn | NDCL 59399-110-20 |