En arbejdsgang demonstreres for den absolutte kvantificering af lægemiddelbærer-celleinteraktioner ved hjælp af flowcytometri for at muliggøre bedre rationel evaluering af nye lægemiddelafgivelsessystemer. Denne arbejdsgang gælder for lægemiddelbærere af enhver art.
En vigtig komponent i design af lægemiddelleveringssystemer vedrører, hvordan man forstærker eller dæmper interaktioner med specifikke celletyper. For eksempel kan en kemoterapeutisk funktionaliseres med et antistof for at forbedre bindingen til kræftceller (“målretning”) eller funktionaliseres med polyethylenglycol for at hjælpe med at undgå immuncellegenkendelse (“stealth”). Selv på celleniveau er optimering af bindingen og optagelsen af en lægemiddelbærer et komplekst biologisk designproblem. Det er således værdifuldt at adskille, hvor stærkt en ny transportør interagerer med en celle fra den funktionelle effektivitet af en transportørs last, når den er leveret til den celle.
For at fortsætte det kemoterapeutiske eksempel er “hvor godt det binder til en kræftcelle” et særskilt problem fra “hvor godt det dræber en kræftcelle”. Kvantitative in vitro-assays for sidstnævnte er veletablerede og er normalt afhængige af måling af levedygtighed. Imidlertid er de fleste offentliggjorte undersøgelser af cellebærerinteraktioner kvalitative eller semikvantitative. Generelt er disse målinger afhængige af fluorescerende mærkning af bæreren og rapporterer følgelig interaktioner med celler i relative eller vilkårlige enheder. Dette arbejde kan imidlertid standardiseres og gøres absolut kvantitativt med et lille antal karakteriseringseksperimenter. En sådan absolut kvantificering er værdifuld, da den letter rationelle, inter- og intra-klasse sammenligninger af forskellige lægemiddelleveringssystemer-nanopartikler, mikropartikler, vira, antistof-lægemiddelkonjugater, konstruerede terapeutiske celler eller ekstracellulære vesikler.
Desuden er kvantificering en forudsætning for efterfølgende metaanalyser eller in silico-modelleringsmetoder . I denne artikel præsenteres videoguider samt et beslutningstræ for, hvordan man opnår in vitro-kvantificering for transportørlægemiddelleveringssystemer, der tager højde for forskelle i bærerstørrelse og mærkningsmodalitet. Derudover diskuteres yderligere overvejelser om kvantitativ vurdering af avancerede lægemiddelleveringssystemer. Dette er beregnet til at tjene som en værdifuld ressource til forbedring af rationel evaluering og design til den næste generation af medicin.
Designet af lægemiddelleveringskonstruktioner, der udviser specifik, designet adfærd afhængigt af hvilken celletype de støder på, har tiltrukket betydelig forskningsinteresse. Potentielle lægemiddelleveringskonstruktioner eller “bærere” inkluderer lipidformuleringer, nano-dyrkede uorganiske stoffer, polymere samlinger, ekstracellulære vesikler, funktionaliserede bakterieceller eller modificerede vira. Alle disse kan udvise organ-, vævs- eller cellespecificitet på grund af fysiske egenskaber, overfladeegenskaber eller konstruerede kemiske funktionaliseringer såsom antistoffastgørelse 1,2.
Et næsten allestedsnærværende skridt i in vitro-bærerevaluering er at inkubere celler med en suspension, der indeholder den lægemiddelbelastede bærer. Efter inkubation måles bærerens ydeevne via en funktionel aflæsning af lægemiddellastens ydeevne, for eksempel transfektionseffektivitet eller toksicitet. Funktionelle udlæsninger er nyttige, da de er et downstream-mål for bærereffektivitet. For mere komplekse lægemiddelleveringskonstruktioner er det imidlertid stadig vigtigere at bevæge sig ud over funktionelle udlæsninger og separat kvantificere graden af bærerinteraktion med cellen af interesse. Der er et par grunde til dette.
For det første er der stigende interesse for at opdage (og iterativt forbedre) “platform” -transportteknologier, som kan transportere en række forskellige laster. For eksempel kan lipidnanopartikler (LNP’er) designet til at indkapsle RNA udveksle en RNA-sekvens til en anden med få forbehold3. For iterativt at forbedre bærerteknologien er det således afgørende at kvantificere dens ydeevne uafhængigt af lastfunktionaliteten. For det andet er funktionelle udlæsninger muligvis ikke ligetil for lasten af interesse, hvilket kompromitterer evnen til hurtigt at gentage og evaluere bærerformuleringer. Mens man kunne udføre in vitro-optimering ved hjælp af en modellast med en ligetil funktionel udlæsning (for eksempel fluorescens), kan ændring af lasten ændre det biologiske respons på en bærer4 og kan således ikke give repræsentative resultater. For det tredje er mange bærere designet til at interagere med og blive optaget af en bestemt celletype. En sådan målretningsevne hos et luftfartsselskab kan og bør differentieres fra udførelsen af dets terapeutiske lastpostmålretning. For at fortsætte LNP-eksemplet kan en RNA-last være ekstremt potent, men hvis LNP ikke er i stand til at binde til cellen, internaliseres og frigive RNA’et, vil der ikke blive observeret nogen nedstrøms funktionel effekt. Dette kan være et problem, især for bærere, der er beregnet til at målrette mod svært transficerede celletyper, såsom T-celler5. Omvendt kunne en LNP målrette ekstremt effektivt, men RNA-lasten fungerer muligvis ikke. Et downstream-assay, der kun måler lastfunktionalitet, vil ikke være i stand til at skelne mellem disse to situationer, hvilket komplicerer udviklingen og optimeringen af transportørens lægemiddelleveringssystemer.
I dette arbejde diskuteres det, hvordan man absolut kvantificerer transportørforeningen . Association er et udtryk, der refererer til den eksperimentelt målte grad af interaktion mellem en bærer og en celle. Association skelner ikke mellem membranbinding og internalisering – en bærer kan være forbundet, fordi den er bundet til celleoverfladen, eller fordi cellen har internaliseret den. Association måles almindeligvis som en del af cellebærerinkubationseksperimenter. Historisk set er association blevet rapporteret enten i vilkårlige fluorescerende enheder (typisk “median fluorescensintensitet” eller MFI) eller som “procentforening”, målinger, hvis begrænsninger tidligere er blevet diskuteret6. Kort sagt er disse målinger ikke sammenlignelige mellem eksperimenter, laboratorier og lægemiddelbærere på grund af forskelle i eksperimentelle protokoller, flowcytometerindstillinger og mærkningsintensiteter for forskellige bærere. Der er gjort en indsats for at overvinde førstnævnte ved at kalibrere cytometeret og derved omdanne det relative mål for MFI til et absolut kvantitativt mål for fluorescens7. Denne metode tager imidlertid ikke højde for variationen i mærkningsintensiteten for forskellige bærere og tillader således ikke en rationel sammenligning af forskellige bærerpræstationer i en målcelle efter eget valg8.
Her demonstreres det, hvordan man praktisk talt konverterer fra relative, vilkårlige fluorescerende enheder til den absolutte kvantitative metrik for “antallet af bærere pr. Celle” ved at udføre et lille antal yderligere karakteriseringseksperimenter. Hvis der ønskes en anden metrik af bærerkoncentration (f.eks. bærermasse pr. celle eller bærervolumen pr. celle), er det ligetil at konvertere fra bærere pr. celle, forudsat at bærerkarakterisering er udført. For korthed og for at undgå jargon bruges ordet “bærer” inden for dette arbejde til at henvise til det store udvalg af lægemiddelleveringskonstruktioner. Disse kvantificeringsteknikker er lige anvendelige, uanset om de anvendes på en nano-manipuleret guldpartikel eller en bio-manipuleret bakterie.
Nogle få fakta muliggør konvertering fra vilkårlige fluorescerende enheder til bærere pr. Celle. For det første er den målte fluorescensintensitet proportional med koncentrationen af en fluorafore9 (eller en fluorescerende mærket bærer), forudsat at fluorescensen er inden for instrumentets detektionsgrænser, og instrumenteringsindstillingerne er de samme. Hvis fluorescensen af en bærer og fluorescensen af en prøve er kendt, kan man således bestemme, hvor mange bærere der er til stede i den prøve, hvis alle målinger blev udført under de samme indstillinger og betingelser. Men især for mindre bærere er det muligvis ikke muligt at måle bærerfluorescens, celleautofluorescens og celle-associeret-med-bærere fluorescens på det samme instrument med de samme indstillinger. I dette tilfælde er der et andet krav om at gøre det muligt at konvertere mellem målt fluorescens på et instrument og målt fluorescens på et andet. For at gøre dette kan der etableres en standardkurve for fluoroforkoncentration for at måle fluorescensintensiteten på begge instrumenter ved at drage fordel af molekylerne af ækvivalent opløselig fluorkrom (MESF) standard9. Dette tillader derefter måling af bærerfluorescensen i bulk på et ikke-cytometer, en måling, der kan udføres på bærere af enhver størrelse eller egenskab. Når en sådan bulkkvantificering udføres på en bærersuspension af kendt koncentration, kan antallet af bærere pr. celle i en prøve igen beregnes.
Mens dette arbejde demonstrerer processen til måling af bærerforening (som bestemt ved målt fluorescensintensitet), kan en analog protokol udføres for andre målinger af cellebærerinteraktion (f.eks. En eksperimentel protokol, der differentierer internaliserede og membranbundne bærere). Derudover ville denne protokol stort set være den samme, hvis foreningen blev målt gennem et ikke-fluorescerende assay (for eksempel gennem massecytometri).
Karakterisering af interaktionerne mellem lægemiddelbærere og celler bliver stadig vigtigere i udviklingen af nye lægemiddelleveringssystemer. Specifikt for at muliggøre rationel evaluering og sammenligning af forskellige bærerkonstruktioner er absolut kvantificering af bærerens ydeevne til at interagere med mål- og off-target-celler kritisk. Denne protokol beskriver en to-strøms metode, der gør det muligt for enhver forsker, der arbejder med en lægemiddelbærer, at konvertere relative, semikvantitative flowcyt…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af Australian National Health and Medical Research Council (NHMRC; Programbevilling nr. GNT1149990), det australske center for hiv- og hepatitisvirologiforskning (ACH2) samt en gave fra boet efter Réjane Louise Langlois. F.C. anerkender tildelingen af et National Health and Medical Research Council (NHMRC) Senior Principal Research Fellowship (GNT1135806). Figur 1 og figur 2 blev oprettet med BioRender.com.
Alexa Fluor 647 C2 Maleimide | Invitrogen | A20347 | pH-stable dye used to label 150 nm, 235 nm, or 633 nm PMASH carriers; example of good dye to use in cell-carrier association studies |
Apogee A50 Microflow | Apogee | Sensitive flow cytometer capable of detecting small carriers for counting | |
CytoFLEX S Flow Cytometer | Beckman Coulter | Sensitive flow cytometer capable of detecting small carriers for counting and read out for final cell-barrier experiments | |
FCS Express | De Novo Software | Software used to analyze flow cytometry data, i.e., perform gating and derive median fluorescence intensity values of populations of choice. Alternatives include FlowJo, OMIQ, Python | |
Infinite 200 PRO | Tecan Lifesciences | Standard microplate reader instrument used for bulk fluorescence measurements of carriers in solution | |
LSRFortessa Cell Analyzer | BD Biosciences | Less sensitive flow cytometer, but one more generally available to researchers. Can be used to read out final cell-carrier experiment | |
NanoSight NS300 | Malvern Panalytical | Instrument used for Nanoparticle Tracking Analysis | |
Prism 8 | GraphPad | Software used to graph and calculate standard curves. Alternatives include Microsoft Excel, Origin, Minitab, Python amongst many others | |
Quantum MESF kits Alexa Fluor 647 | Bangs Laboratories | 647 | Absolute quantitation beads for flow cytometery. Used to convert fluorescence intensities measured in bulk on a microplate reader to fluorescence intensities measured on a flow cytometer using the MESF standard |