नई दवा वितरण प्रणालियों के बेहतर तर्कसंगत मूल्यांकन की अनुमति देने के लिए फ्लो साइटोमेट्री का उपयोग करके दवा वाहक-सेल इंटरैक्शन की पूर्ण मात्रा का ठहराव करने के लिए एक वर्कफ़्लो का प्रदर्शन किया जाता है। यह वर्कफ़्लो किसी भी प्रकार के दवा वाहक पर लागू होता है।
दवा वितरण प्रणालियों को डिजाइन करने का एक प्रमुख घटक यह चिंता करता है कि विशिष्ट सेल प्रकारों के साथ बातचीत को कैसे बढ़ाया या क्षीण किया जाए। उदाहरण के लिए, एक कीमोथेरेपी को कैंसर कोशिकाओं (“लक्ष्यीकरण”) के बंधन को बढ़ाने के लिए एक एंटीबॉडी के साथ कार्यात्मक किया जा सकता है या प्रतिरक्षा कोशिका पहचान (“स्टील्थ”) से बचने में मदद करने के लिए पॉलीथीन ग्लाइकोल के साथ कार्यात्मक किया जा सकता है। सेलुलर स्तर पर भी, दवा वाहक के बंधन और उत्थान को अनुकूलित करना एक जटिल जैविक डिजाइन समस्या है। इस प्रकार, यह अलग करना मूल्यवान है कि एक नया वाहक उस सेल में वितरित होने के बाद वाहक के कार्गो की कार्यात्मक प्रभावकारिता से सेल के साथ कितनी दृढ़ता से बातचीत करता है।
कीमोथेरेपी उदाहरण को जारी रखने के लिए, “यह कैंसर कोशिका को कितनी अच्छी तरह बांधता है” “यह कैंसर कोशिका को कितनी अच्छी तरह मारता है” से एक अलग समस्या है। उत्तरार्द्ध के लिए मात्रात्मक इन विट्रो परख अच्छी तरह से स्थापित हैं और आमतौर पर व्यवहार्यता को मापने पर निर्भर करते हैं। हालांकि, सेल-वाहक इंटरैक्शन पर अधिकांश प्रकाशित शोध गुणात्मक या अर्ध-मात्रात्मक है। आम तौर पर, ये माप वाहक के फ्लोरोसेंट लेबलिंग पर भरोसा करते हैं और, परिणामस्वरूप, सापेक्ष या मनमानी इकाइयों में कोशिकाओं के साथ बातचीत की रिपोर्ट करते हैं। हालांकि, इस काम को मानकीकृत किया जा सकता है और लक्षण वर्णन प्रयोगों की एक छोटी संख्या के साथ बिल्कुल मात्रात्मक बनाया जा सकता है। इस तरह का पूर्ण परिमाणीकरण मूल्यवान है, क्योंकि यह विभिन्न दवा वितरण प्रणालियों-नैनोकणों, माइक्रोपार्टिकल्स, वायरस, एंटीबॉडी-ड्रग संयुग्म, इंजीनियर चिकित्सीय कोशिकाओं, या बाह्य पुटिकाओं की तर्कसंगत, अंतर-और इंट्रा-क्लास तुलना की सुविधा प्रदान करता है।
इसके अलावा, बाद के मेटा-विश्लेषण या सिलिको मॉडलिंग दृष्टिकोण में परिमाणीकरण एक शर्त है। इस लेख में, वीडियो गाइड, साथ ही वाहक दवा वितरण प्रणालियों के लिए इन विट्रो परिमाणीकरण कैसे प्राप्त किया जाए, इसके लिए एक निर्णय वृक्ष प्रस्तुत किया गया है, जो वाहक आकार और लेबलिंग पद्धति में अंतर को ध्यान में रखता है। इसके अतिरिक्त, उन्नत दवा वितरण प्रणालियों के मात्रात्मक मूल्यांकन के लिए आगे के विचारों पर चर्चा की जाती है। यह दवा की अगली पीढ़ी के लिए तर्कसंगत मूल्यांकन और डिजाइन में सुधार के लिए एक मूल्यवान संसाधन के रूप में सेवा करने का इरादा है।
दवा वितरण संरचनाओं के डिजाइन जो विशिष्ट, डिज़ाइन किए गए व्यवहार को प्रदर्शित करते हैं, इस बात पर निर्भर करता है कि वे किस सेल प्रकार का सामना करते हैं, ने पर्याप्त शोध रुचि को आकर्षित किया है। संभावित दवा वितरण संरचनाओं या “वाहक” में लिपिड फॉर्मूलेशन, नैनो-विकसित अकार्बनिक, बहुलक असेंबली, बाह्य पुटिका, कार्यात्मक जीवाणु कोशिकाएं या संशोधित वायरस शामिल हैं। ये सभी भौतिक गुणों, सतह गुणों, या इंजीनियर रासायनिक कार्यात्मकता जैसे एंटीबॉडी अटैचमेंट 1,2 के कारण अंग, ऊतक या सेल विशिष्टता प्रदर्शित कर सकते हैं।
इन विट्रो वाहक मूल्यांकन में एक लगभग सर्वव्यापी कदम यह है कि दवा से भरे वाहक वाले निलंबन के साथ कोशिकाओं को इनक्यूबेट किया जाए। इनक्यूबेशन के बाद, वाहक प्रदर्शन को दवा कार्गो के प्रदर्शन के कार्यात्मक रीडआउट के माध्यम से मापा जाता है, उदाहरण के लिए, अभिकर्मक दक्षता या विषाक्तता। कार्यात्मक रीडआउट उपयोगी हैं, क्योंकि वे वाहक प्रभावशीलता का एक डाउनस्ट्रीम उपाय हैं। हालांकि, अधिक जटिल दवा वितरण संरचनाओं के लिए, कार्यात्मक रीडआउट से परे जाना और ब्याज के सेल के साथ वाहक बातचीत की डिग्री को अलग से निर्धारित करना महत्वपूर्ण है। इसके कुछ कारण हैं।
सबसे पहले, “प्लेटफ़ॉर्म” वाहक प्रौद्योगिकियों की खोज (और पुनरावृत्ति में सुधार) में रुचि बढ़ रही है, जो विभिन्न प्रकार के कार्गो ले जा सकते हैं। उदाहरण के लिए, आरएनए को समाहित करने के लिए डिज़ाइन किए गए लिपिड नैनोकणों (एलएनपी) कुछचेतावनियों के साथ एक आरएनए अनुक्रम को दूसरे के लिए आदान-प्रदान कर सकते हैं। इस प्रकार, वाहक प्रौद्योगिकी में पुनरावर्ती रूप से सुधार करने के लिए, कार्गो कार्यक्षमता से स्वतंत्र इसके प्रदर्शन को निर्धारित करना महत्वपूर्ण है। दूसरा, कार्यात्मक रीडआउट ब्याज के कार्गो के लिए सरल नहीं हो सकता है, वाहक योगों को तेजी से संशोधित करने और मूल्यांकन करने की क्षमता से समझौता कर सकता है। जबकि कोई एक सरल कार्यात्मक रीडआउट (उदाहरण के लिए, प्रतिदीप्ति) के साथ एक मॉडल कार्गो का उपयोग करके इन विट्रो अनुकूलन कर सकता है, कार्गो को बदलने से वाहक4 के लिए जैविक प्रतिक्रिया बदल सकती है और इस प्रकार, प्रतिनिधि परिणाम नहीं मिल सकते हैं। तीसरा, कई वाहक ों को एक विशिष्ट सेल प्रकार के साथ बातचीत करने और लेने के लिए डिज़ाइन किया गया है। वाहक की ऐसी लक्ष्यीकरण क्षमता को इसके चिकित्सीय कार्गो पोस्ट लक्ष्यीकरण के प्रदर्शन से अलग किया जा सकता है और किया जाना चाहिए। एलएनपी उदाहरण को जारी रखने के लिए, एक आरएनए कार्गो बेहद शक्तिशाली हो सकता है, लेकिन यदि एलएनपी सेल को बांधने, आंतरिक रूप से और आरएनए को छोड़ने में असमर्थ है, तो कोई डाउनस्ट्रीम कार्यात्मक प्रभाव नहीं देखा जाएगा। यह विशेष रूप से वाहक के लिए एक मुद्दा हो सकता है जिसका उद्देश्य हार्ड-टू-ट्रांसेक्ट सेल प्रकारों को लक्षित करना है, जैसे कि टी सेल5। इसके विपरीत, एक एलएनपी बेहद प्रभावी ढंग से लक्षित कर सकता है, लेकिन आरएनए कार्गो कार्य नहीं कर सकता है। एक डाउनस्ट्रीम परख जो सिर्फ कार्गो कार्यक्षमता को मापता है, इन दो स्थितियों के बीच अंतर करने में असमर्थ होगा, इस प्रकार वाहक दवा वितरण प्रणालियों के विकास और अनुकूलन को जटिल करेगा।
इस काम में, वाहक संघ को पूरी तरह से कैसे निर्धारित किया जाए, इस पर चर्चा की जाती है। एसोसिएशन एक शब्द है जो एक वाहक और एक सेल के बीच बातचीत की प्रयोगात्मक रूप से मापी गई डिग्री को संदर्भित करता है। एसोसिएशन झिल्ली बंधन और आंतरिककरण के बीच अंतर नहीं करता है- एक वाहक जुड़ा हो सकता है क्योंकि यह कोशिका की सतह से बंधा होता है या क्योंकि कोशिका ने इसे आंतरिक रूप दिया है। एसोसिएशन को आमतौर पर सेल-वाहक इनक्यूबेशन प्रयोगों के हिस्से के रूप में मापा जाता है। ऐतिहासिक रूप से, एसोसिएशन को या तो मनमानी फ्लोरोसेंट इकाइयों (आमतौर पर “औसत प्रतिदीप्ति तीव्रता” या एमएफआई) या “प्रतिशत एसोसिएशन” के रूप में रिपोर्टकिया गया है, मैट्रिक्स जिनकी सीमाओं पर पहले चर्चा की गई है। संक्षेप में, प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल, प्रवाह साइटोमीटर सेटिंग्स और विभिन्न वाहकों की लेबलिंग तीव्रता में अंतर के कारण ये माप प्रयोगों, प्रयोगशालाओं और दवा वाहकों के बीच तुलनीय नहीं हैं। साइटोमीटर को कैलिब्रेट करके पूर्व को दूर करने के प्रयास किए गए हैं, जिससे एमएफआई के सापेक्ष माप को प्रतिदीप्ति 7 के बिल्कुल मात्रात्मक माप में परिवर्तित कियाजा सके। हालांकि, यह विधि विभिन्न वाहकों की लेबलिंग तीव्रता में परिवर्तनशीलता के लिए जिम्मेदार नहीं है और इस प्रकार, विकल्प8 के लक्ष्य सेल में विभिन्न वाहक प्रदर्शनों की तर्कसंगत तुलना की अनुमति नहीं देती है।
यहां, सापेक्ष, मनमाने फ्लोरोसेंट इकाइयों से “प्रति सेल वाहक की संख्या” के पूर्ण मात्रात्मक मीट्रिक में व्यावहारिक रूप से कैसे परिवर्तित किया जाए, अतिरिक्त लक्षण वर्णन प्रयोगों की एक छोटी संख्या का प्रदर्शन करके प्रदर्शित किया जाता है। यदि वाहक एकाग्रता का एक और मीट्रिक वांछित है (उदाहरण के लिए, प्रति सेल वाहक द्रव्यमान या प्रति सेल वाहक मात्रा), तो वाहक प्रति सेल वाहक से परिवर्तित करना सरल है, बशर्ते वाहक लक्षण वर्णन किया गया हो। संक्षिप्तता के लिए और शब्दजाल से बचने के लिए, “वाहक” शब्द का उपयोग इस काम के भीतर दवा वितरण संरचनाओं के विशाल वर्गीकरण को संदर्भित करने के लिए किया जाता है। ये परिमाणीकरण तकनीक समान रूप से लागू होती हैं, चाहे नैनो-इंजीनियर सोने के कण या जैव-इंजीनियर बैक्टीरिया पर लागू हो।
कुछ तथ्य मनमाने फ्लोरोसेंट इकाइयों से प्रति सेल वाहक में रूपांतरण को सक्षम करते हैं। सबसे पहले, मापा प्रतिदीप्ति तीव्रता एकफ्लोरोफोरे 9 (या फ्लोरोसेंटली लेबल वाहक) की एकाग्रता के समानुपाती है, यह मानते हुए कि प्रतिदीप्ति उपकरण की पहचान सीमा के भीतर है और इंस्ट्रूमेंटेशन सेटिंग्स समान हैं। इस प्रकार, यदि एक वाहक की प्रतिदीप्ति और एक नमूने की प्रतिदीप्ति ज्ञात है, तो कोई यह निर्धारित कर सकता है कि उस नमूने में कितने वाहक मौजूद हैं यदि सभी माप समान सेटिंग्स और शर्तों के तहत किए गए थे। हालांकि, विशेष रूप से छोटे वाहकों के लिए, वाहक प्रतिदीप्ति, सेल ऑटोफ्लोरेसेंस, और सेल-संबद्ध-वाहक प्रतिदीप्ति को एक ही उपकरण पर समान सेटिंग्स के साथ मापना संभव नहीं हो सकता है। इस मामले में, एक उपकरण पर मापा प्रतिदीप्ति और दूसरे पर मापा प्रतिदीप्ति के बीच परिवर्तित करना संभव बनाने के लिए एक दूसरी आवश्यकता है। ऐसा करने के लिए, समतुल्य घुलनशील फ्लोरोक्रोम (एमईएसएफ) मानक 9 के अणुओं का लाभ उठाते हुए, दोनों उपकरणों पर प्रतिदीप्ति तीव्रता को मापने के लिए फ्लोरोफोर एकाग्रता का एक मानक वक्र स्थापितकिया जा सकता है। यह तब एक गैर-साइटोमीटर पर थोक में वाहक प्रतिदीप्ति के माप की अनुमति देता है, एक माप जो किसी भी आकार या विशेषता के वाहक पर किया जा सकता है। जब ज्ञात एकाग्रता के वाहक निलंबन पर इस तरह के थोक परिमाणीकरण किए जाते हैं, तो एक नमूने के प्रति सेल वाहक की संख्या, एक बार फिर से गणना की जा सकती है।
जबकि यह काम वाहक संघ को मापने की प्रक्रिया को प्रदर्शित करता है (जैसा कि मापा प्रतिदीप्ति तीव्रता द्वारा निर्धारित किया जाता है), सेल-वाहक बातचीत के अन्य उपायों के लिए एक अनुरूप प्रोटोकॉल किया जा सकता है (उदाहरण के लिए, एक प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल जो आंतरिक और झिल्ली-बाध्य वाहक को अलग करता है)। इसके अतिरिक्त, यह प्रोटोकॉल काफी हद तक समान होगा यदि एसोसिएशन को गैर-फ्लोरोसेंट परख (उदाहरण के लिए, मास साइटोमेट्री के माध्यम से) के माध्यम से मापा गया था।
दवा वाहक और कोशिकाओं के बीच बातचीत को चिह्नित करना नई दवा वितरण प्रणालियों के विकास में तेजी से महत्वपूर्ण होता जा रहा है। विशेष रूप से, विभिन्न वाहक संरचनाओं के तर्कसंगत मूल्यांकन और तुलना की अनुमति ?…
The authors have nothing to disclose.
इस काम को ऑस्ट्रेलियाई राष्ट्रीय स्वास्थ्य और चिकित्सा अनुसंधान परिषद (एनएचएमआरसी) द्वारा समर्थित किया गया था; कार्यक्रम अनुदान संख्या जीएनटी 1149990, ऑस्ट्रेलियाई सेंटर फॉर एचआईवी एंड हेपेटाइटिस वायरोलॉजी रिसर्च (एसीएच2), साथ ही रेजेन लुईस लैंगलोइस की संपत्ति से एक उपहार। एफ.सी. राष्ट्रीय स्वास्थ्य और चिकित्सा अनुसंधान परिषद (एनएचएमआरसी) के वरिष्ठ प्रधान अनुसंधान फैलोशिप (जीएनटी 1135806) के पुरस्कार को स्वीकार करता है। चित्रा 1 और चित्रा 2 BioRender.com के साथ बनाए गए थे।
Alexa Fluor 647 C2 Maleimide | Invitrogen | A20347 | pH-stable dye used to label 150 nm, 235 nm, or 633 nm PMASH carriers; example of good dye to use in cell-carrier association studies |
Apogee A50 Microflow | Apogee | Sensitive flow cytometer capable of detecting small carriers for counting | |
CytoFLEX S Flow Cytometer | Beckman Coulter | Sensitive flow cytometer capable of detecting small carriers for counting and read out for final cell-barrier experiments | |
FCS Express | De Novo Software | Software used to analyze flow cytometry data, i.e., perform gating and derive median fluorescence intensity values of populations of choice. Alternatives include FlowJo, OMIQ, Python | |
Infinite 200 PRO | Tecan Lifesciences | Standard microplate reader instrument used for bulk fluorescence measurements of carriers in solution | |
LSRFortessa Cell Analyzer | BD Biosciences | Less sensitive flow cytometer, but one more generally available to researchers. Can be used to read out final cell-carrier experiment | |
NanoSight NS300 | Malvern Panalytical | Instrument used for Nanoparticle Tracking Analysis | |
Prism 8 | GraphPad | Software used to graph and calculate standard curves. Alternatives include Microsoft Excel, Origin, Minitab, Python amongst many others | |
Quantum MESF kits Alexa Fluor 647 | Bangs Laboratories | 647 | Absolute quantitation beads for flow cytometery. Used to convert fluorescence intensities measured in bulk on a microplate reader to fluorescence intensities measured on a flow cytometer using the MESF standard |