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Bioengineering

इन विट्रो में ड्रग डिलीवरी सिस्टम और कोशिकाओं के बीच बातचीत का प्रयोगात्मक परिमाणीकरण: प्रीक्लिनिकल नैनोमेडिसिन मूल्यांकन के लिए एक गाइड

Published: September 28, 2022 doi: 10.3791/64259
Automatic Translation
1, 2, 2,3,4, 5, 6
1Department of Microbiology and Immunology, The University of Melbourne at the Peter Doherty Institute for Infection and Immunity, 2Department of Infectious Diseases, The University of Melbourne at the Peter Doherty Institute for Infection and Immunity, 3Victorian Infectious Diseases Service, Royal Melbourne Hospital at the Peter Doherty Institute for Infection and Immunity, 4Department of Infectious Diseases, Alfred Hospital and Monash University, 5Department of Chemical Engineering, The University of Melbourne, 6Department of Biomedical Engineering, The University of Melbourne

Summary

नई दवा वितरण प्रणालियों के बेहतर तर्कसंगत मूल्यांकन की अनुमति देने के लिए फ्लो साइटोमेट्री का उपयोग करके दवा वाहक-सेल इंटरैक्शन की पूर्ण मात्रा का ठहराव करने के लिए एक वर्कफ़्लो का प्रदर्शन किया जाता है। यह वर्कफ़्लो किसी भी प्रकार के दवा वाहक पर लागू होता है।

Abstract

दवा वितरण प्रणालियों को डिजाइन करने का एक प्रमुख घटक यह चिंता करता है कि विशिष्ट सेल प्रकारों के साथ बातचीत को कैसे बढ़ाया या क्षीण किया जाए। उदाहरण के लिए, एक कीमोथेरेपी को कैंसर कोशिकाओं ("लक्ष्यीकरण") के बंधन को बढ़ाने के लिए एक एंटीबॉडी के साथ कार्यात्मक किया जा सकता है या प्रतिरक्षा कोशिका पहचान ("स्टील्थ") से बचने में मदद करने के लिए पॉलीथीन ग्लाइकोल के साथ कार्यात्मक किया जा सकता है। सेलुलर स्तर पर भी, दवा वाहक के बंधन और उत्थान को अनुकूलित करना एक जटिल जैविक डिजाइन समस्या है। इस प्रकार, यह अलग करना मूल्यवान है कि एक नया वाहक उस सेल में वितरित होने के बाद वाहक के कार्गो की कार्यात्मक प्रभावकारिता से सेल के साथ कितनी दृढ़ता से बातचीत करता है।

कीमोथेरेपी उदाहरण को जारी रखने के लिए, "यह कैंसर कोशिका को कितनी अच्छी तरह बांधता है" "यह कैंसर कोशिका को कितनी अच्छी तरह मारता है" से एक अलग समस्या है। उत्तरार्द्ध के लिए मात्रात्मक इन विट्रो परख अच्छी तरह से स्थापित हैं और आमतौर पर व्यवहार्यता को मापने पर निर्भर करते हैं। हालांकि, सेल-वाहक इंटरैक्शन पर अधिकांश प्रकाशित शोध गुणात्मक या अर्ध-मात्रात्मक है। आम तौर पर, ये माप वाहक के फ्लोरोसेंट लेबलिंग पर भरोसा करते हैं और, परिणामस्वरूप, सापेक्ष या मनमानी इकाइयों में कोशिकाओं के साथ बातचीत की रिपोर्ट करते हैं। हालांकि, इस काम को मानकीकृत किया जा सकता है और लक्षण वर्णन प्रयोगों की एक छोटी संख्या के साथ बिल्कुल मात्रात्मक बनाया जा सकता है। इस तरह का पूर्ण परिमाणीकरण मूल्यवान है, क्योंकि यह विभिन्न दवा वितरण प्रणालियों-नैनोकणों, माइक्रोपार्टिकल्स, वायरस, एंटीबॉडी-ड्रग संयुग्म, इंजीनियर चिकित्सीय कोशिकाओं, या बाह्य पुटिकाओं की तर्कसंगत, अंतर-और इंट्रा-क्लास तुलना की सुविधा प्रदान करता है।

इसके अलावा, बाद के मेटा-विश्लेषण या सिलिको मॉडलिंग दृष्टिकोण में परिमाणीकरण एक शर्त है। इस लेख में, वीडियो गाइड, साथ ही वाहक दवा वितरण प्रणालियों के लिए इन विट्रो परिमाणीकरण कैसे प्राप्त किया जाए, इसके लिए एक निर्णय वृक्ष प्रस्तुत किया गया है, जो वाहक आकार और लेबलिंग पद्धति में अंतर को ध्यान में रखता है। इसके अतिरिक्त, उन्नत दवा वितरण प्रणालियों के मात्रात्मक मूल्यांकन के लिए आगे के विचारों पर चर्चा की जाती है। यह दवा की अगली पीढ़ी के लिए तर्कसंगत मूल्यांकन और डिजाइन में सुधार के लिए एक मूल्यवान संसाधन के रूप में सेवा करने का इरादा है।

Introduction

दवा वितरण संरचनाओं के डिजाइन जो विशिष्ट, डिज़ाइन किए गए व्यवहार को प्रदर्शित करते हैं, इस बात पर निर्भर करता है कि वे किस सेल प्रकार का सामना करते हैं, ने पर्याप्त शोध रुचि को आकर्षित किया है। संभावित दवा वितरण संरचनाओं या "वाहक" में लिपिड फॉर्मूलेशन, नैनो-विकसित अकार्बनिक, बहुलक असेंबली, बाह्य पुटिका, कार्यात्मक जीवाणु कोशिकाएं या संशोधित वायरस शामिल हैं। ये सभी भौतिक गुणों, सतह गुणों, या इंजीनियर रासायनिक कार्यात्मकता जैसे एंटीबॉडी अटैचमेंट 1,2 के कारण अंग, ऊतक या सेल विशिष्टता प्रदर्शित कर सकते हैं।

इन विट्रो वाहक मूल्यांकन में एक लगभग सर्वव्यापी कदम यह है कि दवा से भरे वाहक वाले निलंबन के साथ कोशिकाओं को इनक्यूबेट किया जाए। इनक्यूबेशन के बाद, वाहक प्रदर्शन को दवा कार्गो के प्रदर्शन के कार्यात्मक रीडआउट के माध्यम से मापा जाता है, उदाहरण के लिए, अभिकर्मक दक्षता या विषाक्तता। कार्यात्मक रीडआउट उपयोगी हैं, क्योंकि वे वाहक प्रभावशीलता का एक डाउनस्ट्रीम उपाय हैं। हालांकि, अधिक जटिल दवा वितरण संरचनाओं के लिए, कार्यात्मक रीडआउट से परे जाना और ब्याज के सेल के साथ वाहक बातचीत की डिग्री को अलग से निर्धारित करना महत्वपूर्ण है। इसके कुछ कारण हैं।

सबसे पहले, "प्लेटफ़ॉर्म" वाहक प्रौद्योगिकियों की खोज (और पुनरावृत्ति में सुधार) में रुचि बढ़ रही है, जो विभिन्न प्रकार के कार्गो ले जा सकते हैं। उदाहरण के लिए, आरएनए को समाहित करने के लिए डिज़ाइन किए गए लिपिड नैनोकणों (एलएनपी) कुछचेतावनियों के साथ एक आरएनए अनुक्रम को दूसरे के लिए आदान-प्रदान कर सकते हैं। इस प्रकार, वाहक प्रौद्योगिकी में पुनरावर्ती रूप से सुधार करने के लिए, कार्गो कार्यक्षमता से स्वतंत्र इसके प्रदर्शन को निर्धारित करना महत्वपूर्ण है। दूसरा, कार्यात्मक रीडआउट ब्याज के कार्गो के लिए सरल नहीं हो सकता है, वाहक योगों को तेजी से संशोधित करने और मूल्यांकन करने की क्षमता से समझौता कर सकता है। जबकि कोई एक सरल कार्यात्मक रीडआउट (उदाहरण के लिए, प्रतिदीप्ति) के साथ एक मॉडल कार्गो का उपयोग करके इन विट्रो अनुकूलन कर सकता है, कार्गो को बदलने से वाहक4 के लिए जैविक प्रतिक्रिया बदल सकती है और इस प्रकार, प्रतिनिधि परिणाम नहीं मिल सकते हैं। तीसरा, कई वाहक ों को एक विशिष्ट सेल प्रकार के साथ बातचीत करने और लेने के लिए डिज़ाइन किया गया है। वाहक की ऐसी लक्ष्यीकरण क्षमता को इसके चिकित्सीय कार्गो पोस्ट लक्ष्यीकरण के प्रदर्शन से अलग किया जा सकता है और किया जाना चाहिए। एलएनपी उदाहरण को जारी रखने के लिए, एक आरएनए कार्गो बेहद शक्तिशाली हो सकता है, लेकिन यदि एलएनपी सेल को बांधने, आंतरिक रूप से और आरएनए को छोड़ने में असमर्थ है, तो कोई डाउनस्ट्रीम कार्यात्मक प्रभाव नहीं देखा जाएगा। यह विशेष रूप से वाहक के लिए एक मुद्दा हो सकता है जिसका उद्देश्य हार्ड-टू-ट्रांसेक्ट सेल प्रकारों को लक्षित करना है, जैसे कि टी सेल5। इसके विपरीत, एक एलएनपी बेहद प्रभावी ढंग से लक्षित कर सकता है, लेकिन आरएनए कार्गो कार्य नहीं कर सकता है। एक डाउनस्ट्रीम परख जो सिर्फ कार्गो कार्यक्षमता को मापता है, इन दो स्थितियों के बीच अंतर करने में असमर्थ होगा, इस प्रकार वाहक दवा वितरण प्रणालियों के विकास और अनुकूलन को जटिल करेगा।

इस काम में, वाहक संघ को पूरी तरह से कैसे निर्धारित किया जाए, इस पर चर्चा की जाती है। एसोसिएशन एक शब्द है जो एक वाहक और एक सेल के बीच बातचीत की प्रयोगात्मक रूप से मापी गई डिग्री को संदर्भित करता है। एसोसिएशन झिल्ली बंधन और आंतरिककरण के बीच अंतर नहीं करता है- एक वाहक जुड़ा हो सकता है क्योंकि यह कोशिका की सतह से बंधा होता है या क्योंकि कोशिका ने इसे आंतरिक रूप दिया है। एसोसिएशन को आमतौर पर सेल-वाहक इनक्यूबेशन प्रयोगों के हिस्से के रूप में मापा जाता है। ऐतिहासिक रूप से, एसोसिएशन को या तो मनमानी फ्लोरोसेंट इकाइयों (आमतौर पर "औसत प्रतिदीप्ति तीव्रता" या एमएफआई) या "प्रतिशत एसोसिएशन" के रूप में रिपोर्टकिया गया है, मैट्रिक्स जिनकी सीमाओं पर पहले चर्चा की गई है। संक्षेप में, प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल, प्रवाह साइटोमीटर सेटिंग्स और विभिन्न वाहकों की लेबलिंग तीव्रता में अंतर के कारण ये माप प्रयोगों, प्रयोगशालाओं और दवा वाहकों के बीच तुलनीय नहीं हैं। साइटोमीटर को कैलिब्रेट करके पूर्व को दूर करने के प्रयास किए गए हैं, जिससे एमएफआई के सापेक्ष माप को प्रतिदीप्ति 7 के बिल्कुल मात्रात्मक माप में परिवर्तित कियाजा सके। हालांकि, यह विधि विभिन्न वाहकों की लेबलिंग तीव्रता में परिवर्तनशीलता के लिए जिम्मेदार नहीं है और इस प्रकार, विकल्प8 के लक्ष्य सेल में विभिन्न वाहक प्रदर्शनों की तर्कसंगत तुलना की अनुमति नहीं देती है।

यहां, सापेक्ष, मनमाने फ्लोरोसेंट इकाइयों से "प्रति सेल वाहक की संख्या" के पूर्ण मात्रात्मक मीट्रिक में व्यावहारिक रूप से कैसे परिवर्तित किया जाए, अतिरिक्त लक्षण वर्णन प्रयोगों की एक छोटी संख्या का प्रदर्शन करके प्रदर्शित किया जाता है। यदि वाहक एकाग्रता का एक और मीट्रिक वांछित है (उदाहरण के लिए, प्रति सेल वाहक द्रव्यमान या प्रति सेल वाहक मात्रा), तो वाहक प्रति सेल वाहक से परिवर्तित करना सरल है, बशर्ते वाहक लक्षण वर्णन किया गया हो। संक्षिप्तता के लिए और शब्दजाल से बचने के लिए, "वाहक" शब्द का उपयोग इस काम के भीतर दवा वितरण संरचनाओं के विशाल वर्गीकरण को संदर्भित करने के लिए किया जाता है। ये परिमाणीकरण तकनीक समान रूप से लागू होती हैं, चाहे नैनो-इंजीनियर सोने के कण या जैव-इंजीनियर बैक्टीरिया पर लागू हो।

कुछ तथ्य मनमाने फ्लोरोसेंट इकाइयों से प्रति सेल वाहक में रूपांतरण को सक्षम करते हैं। सबसे पहले, मापा प्रतिदीप्ति तीव्रता एकफ्लोरोफोरे 9 (या फ्लोरोसेंटली लेबल वाहक) की एकाग्रता के समानुपाती है, यह मानते हुए कि प्रतिदीप्ति उपकरण की पहचान सीमा के भीतर है और इंस्ट्रूमेंटेशन सेटिंग्स समान हैं। इस प्रकार, यदि एक वाहक की प्रतिदीप्ति और एक नमूने की प्रतिदीप्ति ज्ञात है, तो कोई यह निर्धारित कर सकता है कि उस नमूने में कितने वाहक मौजूद हैं यदि सभी माप समान सेटिंग्स और शर्तों के तहत किए गए थे। हालांकि, विशेष रूप से छोटे वाहकों के लिए, वाहक प्रतिदीप्ति, सेल ऑटोफ्लोरेसेंस, और सेल-संबद्ध-वाहक प्रतिदीप्ति को एक ही उपकरण पर समान सेटिंग्स के साथ मापना संभव नहीं हो सकता है। इस मामले में, एक उपकरण पर मापा प्रतिदीप्ति और दूसरे पर मापा प्रतिदीप्ति के बीच परिवर्तित करना संभव बनाने के लिए एक दूसरी आवश्यकता है। ऐसा करने के लिए, समतुल्य घुलनशील फ्लोरोक्रोम (एमईएसएफ) मानक 9 के अणुओं का लाभ उठाते हुए, दोनों उपकरणों पर प्रतिदीप्ति तीव्रता को मापने के लिए फ्लोरोफोर एकाग्रता का एक मानक वक्र स्थापितकिया जा सकता है। यह तब एक गैर-साइटोमीटर पर थोक में वाहक प्रतिदीप्ति के माप की अनुमति देता है, एक माप जो किसी भी आकार या विशेषता के वाहक पर किया जा सकता है। जब ज्ञात एकाग्रता के वाहक निलंबन पर इस तरह के थोक परिमाणीकरण किए जाते हैं, तो एक नमूने के प्रति सेल वाहक की संख्या, एक बार फिर से गणना की जा सकती है।

जबकि यह काम वाहक संघ को मापने की प्रक्रिया को प्रदर्शित करता है (जैसा कि मापा प्रतिदीप्ति तीव्रता द्वारा निर्धारित किया जाता है), सेल-वाहक बातचीत के अन्य उपायों के लिए एक अनुरूप प्रोटोकॉल किया जा सकता है (उदाहरण के लिए, एक प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल जो आंतरिक और झिल्ली-बाध्य वाहक को अलग करता है)। इसके अतिरिक्त, यह प्रोटोकॉल काफी हद तक समान होगा यदि एसोसिएशन को गैर-फ्लोरोसेंट परख (उदाहरण के लिए, मास साइटोमेट्री के माध्यम से) के माध्यम से मापा गया था।

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Protocol

1. उपयुक्त स्ट्रीम का चयन करना

  1. उपयोग किए गए प्रयोगात्मक सेटअप के लिए सर्वोत्तम वर्कफ़्लो (स्ट्रीम) (चित्रा 2) निर्धारित करने के लिए चित्रा 1 में उल्लिखित निर्णय वृक्ष का पालन करें। स्ट्रीम की इस पसंद पर आगे की टिप्पणियों के लिए चर्चा देखें।
  2. साइटोमीटर स्ट्रीम का अनुसरण करते समय, चरण 2.1.1-2.2.7 के साथ जारी रखें। यदि थोक स्ट्रीम का अनुसरण करते हैं, तो चरण 3.1.1.1-3.1.5.7 के साथ जारी रखें।

Figure 1
चित्र 1: वर्कस्ट्रीम निर्णय वृक्ष। किस स्ट्रीम का उपयोग करना है, यह निर्णय मुख्य रूप से वाहक प्रकार की रुचि पर निर्भर करता है। उच्च प्रकीर्णन गुणों वाले बड़े वाहक और वाहक अधिक आसानी से साइटोमीटर पर व्यक्तिगत रूप से पता लगाए जा सकते हैं, इस प्रकार उन्हें साइटोमीटर स्ट्रीम का उपयोग करके परिमाणीकरण के लिए उपयुक्त बनाता है। बल्क स्ट्रीम अन्य सभी वाहक प्रकारों के लिए उपयुक्त है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: वर्कस्ट्रीम का अवलोकन। यह प्रोटोकॉल दो अलग-अलग धाराओं में विभाजित है। साइटोमीटर स्ट्रीम निलंबन में वाहकों की गणना करने, उनके व्यक्तिगत प्रतिदीप्ति को मापने और फिर वाहक के साथ इनक्यूबेट की गई कोशिकाओं की प्रतिदीप्ति निर्धारित करने के लिए एक संवेदनशील साइटोमीटर का उपयोग करता है। बल्क स्ट्रीम निलंबन में वाहक की गणना करने के लिए नैनोपार्टिकल ट्रैकिंग विश्लेषण जैसे गैर-साइटोमेट्री-आधारित तकनीकों का उपयोग करता है। व्यक्तिगत वाहक प्रतिदीप्ति को तब माइक्रोप्लेट रीडर या स्पेक्ट्रोफ्लोरोमीटर का उपयोग करके परिमाणित किया जाता है। इसलिए, प्रवाह साइटोमीटर का उपयोग वाहक के साथ इनक्यूबेट की गई कोशिकाओं की अंतिम प्रतिदीप्ति को मापने तक सीमित है, एक माप जिसे साइटोमीटर की एक विस्तृत श्रृंखला पर किया जा सकता है और जो उपयोग किए जाने वाले वाहक प्रकार से स्वतंत्र है। संक्षिप्तीकरण: एमईएसएफ = समकक्ष घुलनशील फ्लोरोक्रोम के अणु; एमएफआई = औसत प्रतिदीप्ति तीव्रता। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

2. साइटोमीटर स्ट्रीम

  1. वाहक की गिनती
    नोट: इस माप के लिए किसी भी प्रवाह साइटोमीटर का उपयोग किया जा सकता है, बशर्ते प्रवाह दर (μL / s) ज्ञात हो। यदि प्रवाह दर अज्ञात है और निर्धारित नहीं की जा सकती है, तो इस चरण के साथ आगे न बढ़ें। इसके बजाय, चरण 3.1 के साथ आगे बढ़ें। निलंबन में वाहकों की गिनती प्रत्येक सेल प्रयोग में इनक्यूबेट किए गए वाहकों की संख्या के सटीक और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य निर्धारण की अनुमति देती है।
    1. वाहक का पता लगाने के लिए साइटोमीटर सेट करें, दोनों एक ऑप्टिकल स्कैटरिंग चैनल (आमतौर पर साइड स्कैटर [एसएससी]) और फ्लोरेसेंस द्वारा। वाहक का पता लगाने की अनुमति देने के लिए दहलीज को समायोजित करना सुनिश्चित करें।
      नोट: विभिन्न ऑप्टिकल प्रकीर्णन चैनलों के माध्यम से पुनरावृत्ति की आवश्यकता हो सकती है यदि एसएससी एक स्पष्ट संकेत प्रदान नहीं करता है (उदाहरण के लिए, फॉरवर्ड स्कैटर [एफएससी])।
    2. एसएससी और फ्लोरोसेंट चैनल दोनों में पृष्ठभूमि घटना की गिनती को निर्धारित करने के लिए एक डिल्यूएंट-ओनली नमूना चलाएं।
      नोट: आदर्श पृष्ठभूमि ईवेंट गणना <100 ईवेंट /
    3. प्रवाह साइटोमेट्री के लिए वाहक तैयार करें।
      1. सुनिश्चित करें कि वाहक शामिल वाहक प्रणाली के आधार पर भंवर या सोनिकेशन द्वारा वाहक अच्छी तरह से निलंबित हैं।
      2. यदि संभव हो, तो सुनिश्चित करें कि वाहक एकाग्रता 1,000 वाहक / μL और 10,000 वाहक / μL के बीच है। पृष्ठभूमि से अधिक परिमाण के एक से दो आदेशों की घटना की गिनती एक अच्छी शुरुआत है। यदि वाहक एकाग्रता के परिमाण का क्रम अज्ञात है, तो स्टॉक से 1: 1,000 कमजोर पड़ने की तैयारी करना एक अच्छी शुरुआत है। भविष्य के नमूना कमजोर पड़ने को सूचित करने के लिए प्रतिक्रिया के रूप में प्रारंभिक परिणामों का उपयोग करें।
        नोट: एक बादल निलंबन आम तौर पर बहुत केंद्रित होता है।
    4. साइटोमीटर पर पहला वाहक नमूना लोड करें और रिकॉर्डिंग शुरू करें।
    5. एसएससी और फ्लोरेसेंस चैनल दोनों से उत्पन्न घटना गणना की तुलना करें; ये लगभग बराबर (<10% अंतर) होना चाहिए। यदि नहीं, तो साइटोमीटर सेटिंग्स की जांच करें, उदाहरण के लिए, फ्लोरोसेंट चैनल के लिए फोटोमल्टीप्लायर ट्यूब (पीएमटी) सेटिंग्स और लेजर तीव्रता। वैकल्पिक रूप से, अन्य तरीकों जैसे कि कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करें ताकि यह सत्यापित किया जा सके कि वाहक का फ्लोरोसेंट लेबलिंग मौजूद और समान है।
    6. चरण 2.1.3-2.1.5 स्टॉक से अलग-अलग कमजोर पड़ने के साथ दो या अधिक अतिरिक्त बार दोहराएं। सुनिश्चित करें कि प्रत्येक नमूने में ईवेंट गणना पृष्ठभूमि ईवेंट गणना से कम से कम एक परिमाण अधिक है।
    7. सत्यापित करें कि तीन या अधिक नमूने एक रैखिक प्रवृत्ति दिखाते हैं, अर्थात, दो गुना नमूना कमजोर पड़ने के परिणामस्वरूप मापा वाहक एकाग्रता में दो गुना कमी होनी चाहिए।
    8. समीकरण (1) के अनुसार स्टॉक वाहक एकाग्रता की गणना करने के लिए रैखिक सीमा, संबंधित कमजोर पड़ने वाले कारकों और ज्ञात साइटोमीटर प्रवाह दर के भीतर नमूने का उपयोग करें:
      Equation 1(1)
      जहां सी वाहक / एमएल में स्टॉक वाहक एकाग्रता है। प्रतिदीप्ति के बजाय ऑप्टिकल स्कैटरिंग डिटेक्शन से प्राप्त इवेंट काउंट का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है।
  2. वाहक-सेल प्रयोग का फ्लो साइटोमेट्री रीडआउट, जिसमें प्रति वाहक प्रतिदीप्ति तीव्रता का निर्धारण शामिल है
    नोट: आदर्श रूप से, प्रति वाहक फ्लोरोसेंट तीव्रता वाहक-सेल प्रयोग के जितना संभव हो उतना करीब निर्धारित किया जाएगा। यह सुनिश्चित करने के लिए है कि व्यक्तिगत वाहक के लिए प्राप्त एमएफआई की तुलना सीधे वाहक से जुड़ी कोशिकाओं के एमएफआई से की जा सकती है। व्यवहार में, एक साइटोमीटर आमतौर पर समान पीएमटी वोल्टेज का उपयोग करके लगातार दिनों में उपयोग किए जाने पर समान परिणाम उत्पन्न करेगा, लेकिन इसकी गारंटी नहीं दी जा सकती है।
    1. वाहक-सेल प्रयोग डिजाइन करें। वाहक की वांछित खुराक को प्रशासित करने के लिए चरण 2.1 में निर्धारित वाहक एकाग्रता का उपयोग करें।
    2. संबंधित चैनलों में इष्टतम पीएमटी वोल्टेज सेटिंग्स निर्धारित करके अंतिम वाहक-सेल प्रयोग के लिए प्रवाह साइटोमीटर सेट करें। वाहक का पता लगाने की अनुमति देने के लिए थ्रेसहोल्ड सेट करें।
    3. वर्तमान पीएमटी सेटिंग्स के तहत प्रति वाहक प्रति प्रतिदीप्ति तीव्रता निर्धारित करने के लिए वाहक को निलंबन में चलाएं।
    4. यदि आवश्यक हो, तो कोशिकाओं का पता लगाने के लिए साइटोमीटर थ्रेसहोल्ड बदलें, न कि वाहक।
    5. कोशिकाओं की पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति (ऑटोफ्लोरेसेंस) निर्धारित करने के लिए वाहक के साथ इनक्यूबेट नहीं किए गए एक नकारात्मक नियंत्रण नमूना-कोशिकाओं को चलाएं।
    6. प्रति सेल प्रतिदीप्ति तीव्रता निर्धारित करने के लिए वाहक-सेल नमूने चलाएं। यह प्रतिदीप्ति सेलुलर ऑटोफ्लोरेसेंस और फ्लोरोसेंट वाहक की उपस्थिति का एक रैखिक संयोजन है।
    7. निम्नलिखित समीकरण (2) का उपयोग करके प्रति सेल वाहक की संख्या की गणना करें:
      Equation 2(2)
      जहां पीएसोचैम प्रति सेल जुड़े वाहकों की संख्या है, एफआईसेल वाहक के साथ इनक्यूबेट की गई कोशिकाओं का एमएफआई है, एफआईपृष्ठभूमि कोशिकाओं का एमएफआई है जो वाहक के साथ इनक्यूबेट नहीं किया जाता है, और एफआईवाहक निलंबन में वाहक का एमएफआई है।

3. बल्क स्ट्रीम

  1. वाहक गिनती: नैनोपार्टिकल ट्रैकिंग विश्लेषण
    नोट: बल्क स्ट्रीम में, वाहक गणना प्रति वाहक पूर्ण प्रतिदीप्ति तीव्रता को निर्धारित करने के लिए एक आवश्यक कदम है (चरण 3.1.4 देखें)। इसके अलावा, निलंबन में वाहक की गिनती प्रत्येक सेल प्रयोग में इनक्यूबेट किए गए वाहकों की संख्या के सटीक और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य निर्धारण की अनुमति देती है।
    1. तैयारी
      1. लेजर मॉड्यूल पर प्रवाह सेल माउंट करें और उपकरण के अंदर पूरे लेजर मॉड्यूल को लॉक करें।
      2. धीरे-धीरे (0.1 एमएल / एस से तेज नहीं) प्रवाह सेल को ~ 1 एमएल आसुत जल के साथ फ्लश करें। यदि प्रवाह सेल के भीतर बुलबुले बनते हैं, तो आगे बढ़ने से पहले बुलबुले को एयर-लिक्विड इंटरफ़ेस के साथ विलय करने के लिए निलंबन को आंशिक रूप से वापस लें।
      3. फ्लशिंग के माध्यम से कैमरे को लगभग आधे रास्ते में शुरू करें; यह पुष्टि करना सुनिश्चित करें कि वाहक मलबे बह गया है। कैप्चर सेटिंग्स टैब खोलने के लिए कैप्चर का चयन करें और कैमरा प्रारंभ करें क्लिक करें.
      4. सिस्टम को 1 एमएल हवा के साथ सुखाएं। यदि स्क्रीन पर कोई स्थिर वाहक दिखाई दे रहा है, तो निर्माता के निर्देशों के अनुसार प्रवाह सेल को साफ करें।
      5. नैनोपार्टिकल ट्रैकिंग विश्लेषण के लिए वाहक तैयार करें, यह सुनिश्चित करके कि वाहक शामिल वाहक प्रणाली के आधार पर भंवर या सोनिकेशन के माध्यम से अच्छी तरह से निलंबित हैं। यदि स्टॉक एकाग्रता के परिमाण का क्रम अज्ञात है, तो स्टॉक से 1: 100 कमजोर पड़ने की तैयारी करें और भविष्य के नमूना कमजोर पड़ने को सूचित करने के लिए प्रतिक्रिया के रूप में प्रारंभिक परिणामों का उपयोग करें। वाहक को पानी में पतला करें न कि फॉस्फेट-बफर्ड खारा (पीबीएस) ताकि प्रत्येक नमूने के कम से कम ~ 0.6-1 एमएल तैयार किया जा सके, जिसमें 1 × से 107 वाहक / एमएल और 1 × 109 वाहक / एमएल के बीच वाहक एकाग्रता हो।
        नोट: एक बादल निलंबन आम तौर पर बहुत केंद्रित होता है। बफर और लवण उच्च पृष्ठभूमि शोर उत्पन्न कर सकते हैं।
    2. माप
      1. लेजर मॉड्यूल को बाहर निकालें और इसे सीधा रखें।
      2. पहले वाहक नमूने को 1 एमएल सिरिंज में खींचें। सिरिंज को ट्यूब इनलेट से संलग्न करें और प्रवाह सेल में नमूने को सावधानीपूर्वक लोड करें। यदि प्रवाह सेल के भीतर बुलबुले बनते हैं, तो आगे बढ़ने से पहले बुलबुले को एयर-लिक्विड इंटरफ़ेस के साथ विलय करने के लिए निलंबन को आंशिक रूप से वापस लें। सुनिश्चित करें कि पूरा प्रवाह सेल तरल से भरा है, फिर रुकें।
      3. व्यक्तिगत वाहक की कल्पना करने के लिए यदि आवश्यक हो तो कैमरा फोकस समायोजित करें। उपकरण के दाईं ओर घूमने वाले नॉब के साथ मोटे फोकस समायोजन करें। हार्डवेयर टैब का चयन करके बेहतर समायोजन करें | पंप/स्टेज। फ़ोकस स्लाइडर समायोजित करके फ़ोकस बदलें.
      4. यह सुनिश्चित करने के लिए कैमरा स्तर समायोजित करें कि कोई ओवरसैचुरेशन नहीं है। कैप्चर टैब के भीतर, स्लाइडर समायोजित करके इष्टतम कैमरा स्तर का चयन करें।
      5. यदि उपकरण इस सहायक से लैस है, तो माप के दौरान निरंतर नमूना प्रवाह सुनिश्चित करने के लिए वाहक नमूने वाले सिरिंज को सिरिंज पंप में लोड करें।
      6. एसओपी टैब के तहत, 30 सेकंड के पांच कैप्चर लेने के लिए मानक माप का चयन करें। बेस फ़ाइल नाम दर्ज करें और, यदि वांछित हो, तो उन्नत बटन पर क्लिक करके अतिरिक्त नमूना जानकारी जोड़ें (जो विभिन्न विकल्पों के साथ एक मोडल संवाद खोलता है)।
        नोट: यदि एक कमजोर पड़ने वाला कारक दर्ज किया जाता है, तो अंतिम वाहक एकाग्रता माप सॉफ्टवेयर द्वारा स्वचालित रूप से समायोजित किया जाएगा। इस कारक को दर्ज करने के खिलाफ सलाह दी जाती है। इसके बजाय, समायोजन मैन्युअल रूप से करें, जो विश्लेषण की सुविधा प्रदान करता है और यह आकलन करने की अनुमति देता है कि क्या प्रत्येक कमजोर पड़ने उपकरण की गतिशील सीमा (चरण 3.1.3.4) के भीतर आता है।
      7. स्क्रिप्ट बनाएँ और चलाएँ दबाएँ और पॉप-अप प्रदर्शित होने की प्रतीक्षा करें और कृपया अग्रिम नमूना पूछें.
      8. सिरिंज पंप का उपयोग करते समय, हार्डवेयर टैब का चयन करें | सिरिंज पंप टैब | इन्फ्यूजन दर को 30-80 पर सेट करें और इन्फ्यूज़ दबाएं। यदि सिरिंज पंप का उपयोग नहीं कर रहे हैं, तो मैन्युअल रूप से नमूना अग्रिम करें।
      9. पॉप-अप विंडो में, कैप्चरिंग शुरू करने के लिए ठीक का चयन करें। पांच कैप्चर में से प्रत्येक के बाद, जब कृपया अग्रिम नमूना पॉप-अप फिर से प्रकट होता है, तो जांचें कि नमूना अभी भी प्रवाह सेल के माध्यम से आगे बढ़ रहा है, या तो मैन्युअल रूप से या सिरिंज पंप के माध्यम से। फिर, अगले कैप्चर के साथ आगे बढ़ने के लिए ठीक का चयन करें।
        नोट: पांच कैप्चर के बाद, सॉफ्टवेयर स्वचालित रूप से प्रक्रिया टैब खोलता है और प्रक्रिया सेटिंग्स को समायोजित करने के लिए एक पॉप-अप खोलता है।
    3. विश्लेषण
      1. प्रक्रिया टैब में, स्क्रीन पर दिखाई देने वाले अलग-अलग वाहकों की सही पहचान करने के लिए डिटेक्शन थ्रेशोल्ड स्लाइडर (4 और 8 के बीच) समायोजित करें। विज़ुअलाइज़ेशन में सहायता के लिए स्क्रीन लाभ भी समायोजित करें; यह डाउनस्ट्रीम विश्लेषण को प्रभावित नहीं करेगा। डिटेक्शन थ्रेशोल्ड सेटिंग में सहायता के लिए वीडियो के कई फ्रेम के माध्यम से स्क्रॉल करने के लिए कैप्चर स्क्रीन के नीचे स्लाइडर का उपयोग करें।
        नोट: पहचान सीमा एक बार निर्धारित की जानी चाहिए और बाद में, माप या नमूने के बीच नहीं बदला जाना चाहिए।
      2. पॉप-अप में (चरण 3.1.2.9 के बाद नोट करें), ट्रैकिंग विश्लेषण शुरू करने के लिए ठीक दबाएं। विश्लेषण टैब पर क्लिक करके विश्लेषण की प्रगति की निगरानी करें | एकल विश्लेषण टैब.
      3. एक बार विश्लेषण समाप्त हो जाने के बाद, प्रकट होने के लिए एक निर्यात सेटिंग्स प्रॉम्प्ट देखें, जिसमें पीडीएफ शामिल करें और प्रयोग सारांश शामिल करें डिफ़ॉल्ट रूप से चुना जाना चाहिए। इच्छानुसार किसी भी अन्य निर्यात प्रारूप का चयन करें।
      4. पीडीएफ डेटा निर्यात के परिणाम अनुभाग में, यह सुनिश्चित करने के लिए कि मापा गया एकाग्रता विश्वसनीय है, सत्यापित करें कि मापा वाहक एकाग्रता 1 × 107 वाहक / एमएल और 1 × 109 वाहक / एमएल के बीच है - उपकरण की गतिशील सीमा - और एकाग्रता माप परिणाम के तहत किसी भी त्रुटि संदेश या सावधानी के संदेशों की जांच करें।
      5. चरण 3.1.2.1-3.1.3.4 स्टॉक से अलग-अलग कमजोर पड़ने के साथ दो या अधिक बार दोहराएं। सुनिश्चित करें कि प्रत्येक नमूने की एकाग्रता उपकरण की रैखिक सीमा के भीतर आती है।
      6. तीन या अधिक नमूने चुनें जो एक रैखिक प्रवृत्ति दिखाते हैं, अर्थात, दो गुना नमूना कमजोर पड़ने के परिणामस्वरूप मापा वाहक एकाग्रता में दो गुना कमी होनी चाहिए। स्टॉक वाहक एकाग्रता की गणना करने के लिए चयनित नमूने और संबंधित कमजोर पड़ने वाले कारकों का उपयोग करें।
    4. प्रति वाहक पूर्ण प्रतिदीप्ति तीव्रता का निर्धारण
      नोट: चूंकि इस धारा में व्यक्तिगत वाहक की प्रतिदीप्ति को सीधे विशेषता नहीं दी जा सकती है, इसलिए प्रतिदीप्ति तीव्रता थोक में निर्धारित की जाती है। यह विधि इस तथ्य पर निर्भर करती है कि प्रतिदीप्ति तीव्रता लैम्बर्ट-बीयर कानून के अनुसार फ्लोरोक्रोम एकाग्रता से रैखिक रूप से संबंधित है। जब निलंबन में वाहकों की ऐसी थोक मात्रा ज्ञात वाहक एकाग्रता के निलंबन पर की जाती है (चरण 3.1 देखें), प्रति वाहक प्रतिदीप्ति प्राप्त की जा सकती है। यह चरण या तो फ्लोरेसेंस प्लेट रीडर या स्पेक्ट्रोफ्लोरोमीटर पर किया जा सकता है। फ्लोरेसेंस तीव्रता की तुलना ज्ञात पूर्ण प्रतिदीप्ति के साथ नमूनों के एक मानक वक्र से की जाती है, जो एमईएसएफ की संख्या में दी गई है।
      1. वाहक को लेबल करने के लिए मुक्त फ्लोरोक्रोम के समाधान का उपयोग करें: डाई को उपयुक्त बफर (जैसे, डीएमएसओ) में पुन: निलंबित करें और वाहक डिल्यूएंट के समान बफर में आगे कमजोर पड़ने का प्रदर्शन करें। वैकल्पिक रूप से, फ्लोरोक्रोम के संयुग्मित एंटीबॉडी के समाधान का उपयोग करें। समीकरण (3) का उपयोग करके mg/mL में सांद्रता, mg/mole में आणविक भार और Avogadro की संख्या से स्टॉक समाधान (MESF/mL) की सांद्रता की गणना करें। मानक वक्र नमूने उत्पन्न करने के लिए वाहक डिल्यूएंट में एक सीरियल कमजोर पड़ने का प्रदर्शन करें।
        Equation 3(3)
        नोट: फ्लोरोक्रोम-संयुग्मित एंटीबॉडी का उपयोग केवल तभी करें जब लेबलिंग की डिग्री, यानी, समाधान में फ्लोरोक्रोम और एंटीबॉडी के बीच दाढ़ अनुपात ज्ञात हो। प्रारंभ में, एक विस्तृत श्रृंखला के साथ एक मानक वक्र उत्पन्न करें, क्योंकि वाहक नमूने की प्रतिदीप्ति तीव्रता अभी भी अज्ञात है। यहां से, आवश्यक सीमा को शामिल करने के लिए इसे संकीर्ण करें।
      2. वाहक नमूने तैयार करें।
        नोट: सबसे अच्छा अभ्यास दो या दो से अधिक वाहक कमजोर पड़ने का परीक्षण करना है ताकि यह सत्यापित किया जा सके कि माप रैखिक हैं और मानक वक्र की सीमा के भीतर आते हैं।
      3. प्रत्येक नमूने के समान वॉल्यूम की प्रतिदीप्ति को मापें, यानी, वाहक और मानक वक्र दोनों।
      4. एक मानक वक्र उत्पन्न करें और मापा वाहक नमूनों के लिए एमईएसएफ / एमएल में थोक पूर्ण प्रतिदीप्ति तीव्रता में कटौती करें।
      5. समीकरण (4) के अनुसार वाहक एकाग्रता (वाहक/एमएल) द्वारा थोक प्रतिदीप्ति (एमईएसएफ/एमएल) को विभाजित करके प्रति वाहक (एमईएसएफ/वाहक) पूर्ण प्रतिदीप्ति तीव्रता की गणना करें:
        Equation 4(4)
    5. सेल प्रयोग (प्रति वाहक समकक्ष प्रतिदीप्ति तीव्रता के निर्धारण सहित)
      नोट: इस चरण में, फ्लो साइटोमेट्री मात्रा बीड्स का उपयोग एमईएसएफ और एमएफआई के बीच संबंधों के मानक वक्र को उत्पन्न करने के लिए किया जाता है। इन मात्रा के मोतियों में प्रति मोती एमईएसएफ की ज्ञात संख्या के साथ कई मोती आबादी होती है, और इन व्यक्तिगत मोतियों का पता किसी भी साइटोमीटर द्वारा लगाया जा सकता है। आदर्श रूप से, एमईएसएफ मानक वक्र वाहक-सेल प्रयोगों के रीडआउट के रूप में एक ही समय में निर्धारित किया जाता है। यह सुनिश्चित करने के लिए है कि व्यक्तिगत वाहक के लिए गणना किए गए एमएफआई मूल्यों की तुलना सीधे वाहक से जुड़े कोशिकाओं के एमएफआई से की जा सकती है। व्यवहार में, एक साइटोमीटर आमतौर पर समान पीएमटी वोल्टेज का उपयोग करके लगातार दिनों में उपयोग किए जाने पर समान परिणाम उत्पन्न करेगा, लेकिन इसकी गारंटी नहीं दी जा सकती है।
      1. वाहक-सेल प्रयोग डिजाइन करें। वाहक की वांछित खुराक को प्रशासित करने के लिए धारा 3.1.3 में निर्धारित वाहक एकाग्रता का उपयोग करें।
      2. संबंधित चैनलों में इष्टतम पीएमटी वोल्टेज सेटिंग्स निर्धारित करके अंतिम वाहक-सेल प्रयोग के लिए प्रवाह साइटोमीटर सेट करें।
      3. पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति निर्धारित करने के लिए एक नकारात्मक नियंत्रण नमूना चलाएं, अर्थात, कोशिकाओं को वाहक के साथ इनक्यूबेट नहीं किया जाता है।
      4. फ्लो साइटोमेट्री क्वांटिटेशन बीड्स तैयार करें और फिर से निलंबित करें। सेल नमूने (जैसे, पीबीएस) के लिए उपयोग किए जाने वाले एक ही बफर का उपयोग करें। यदि मोती आबादी अलग से प्रदान की जाती है, तो उन्हें एक साथ पूल करें।
      5. प्रवाह साइटोमेट्री मात्रा निर्धारण मोती नमूना चलाएं।
      6. प्रति सेल प्रतिदीप्ति तीव्रता निर्धारित करने के लिए वाहक-सेल नमूने चलाएं।
      7. पूर्ण प्रतिदीप्ति तीव्रता (एमईएसएफ) को एमएफआई में परिवर्तित करने वाले मानक वक्र उत्पन्न करने के लिए मात्रा बीड नमूने का उपयोग करें। वाहक के सैद्धांतिक एमएफआई की गणना करने के लिए इस मानक वक्र और चरण 3.1.4 के परिणामों का उपयोग करें। समीकरण (5) का उपयोग करके प्रति सेल वाहक की संख्या की गणना करें:
        Equation 5(5)
        जहां पीएसोचैम प्रति सेल जुड़े वाहकों की संख्या है, एफआईसेल वाहक के साथ इनक्यूबेट की गई कोशिकाओं का एमएफआई है, एफआईपृष्ठभूमि कोशिकाओं का एमएफआई है जो वाहक के साथ इनक्यूबेट नहीं किया जाता है, और एफआईवाहक निलंबन में वाहक की गणना एमएफआई है (चरण 3.1.4)।

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Representative Results

जैसा कि पहले चर्चा की गई है, विभिन्न दवा वाहक प्रकारों को सेल-वाहक संघ के पूर्ण परिमाणीकरण के लिए विभिन्न तकनीकों के उपयोग की आवश्यकता होती है। उदाहरण के लिए, 633 एनएम डाइसल्फ़ाइड-स्टेबलाइज्ड पॉली (मेथैक्रिलिक एसिड) (पीएमएएसएच) कोर-शेल कण एक संवेदनशील प्रवाह साइटोमीटर का उपयोग करके पता लगाने के लिए पर्याप्त बड़े और घने होते हैं। जैसे, इन कणों को फ्लोरोसेंटली लेबल किया गया था, फिर साइड-एंगल लाइट स्कैटरिंग (एसएएलएस, एसएससी के अनुरूप), साथ ही उपयुक्त फ्लोरोसेंट चैनल (चित्रा 3) का उपयोग करके गेटेड और गिना गया था। दोनों चैनलों में इवेंट काउंट में अंतर 1.98% था, जो स्वीकार्य सीमा के भीतर था।

इसके विपरीत, 100 एनएम सुपरपैरामैग्नेटिक आयरन ऑक्साइड नैनोकणों को व्यक्तिगत रूप से पता लगाने के लिए बहुत छोटा है और इस प्रकार, बल्क स्ट्रीम का उपयोग करके विश्लेषण किया गया था। इन नैनोकणों को नैनोपार्टिकल ट्रैकिंग विश्लेषण (चित्रा 4) का उपयोग करके गिना और विशेषता दी गई थी। 136 एनएम का औसत नैनोपार्टिकल आकार पानी में नैनोपार्टिकल के हाइड्रोडायनामिक व्यास को दर्शाता है। नैनोपार्टिकल एकाग्रता को मापा गया - अभी भी कमजोर पड़ने के लिए ठीक नहीं किया गया है - उपकरण की गतिशील सीमा के भीतर आता है, जो नैनोपार्टिकल एकाग्रता के सफल और सटीक निर्धारण का सुझाव देता है।

बल्क स्ट्रीम में जारी रखते हुए, वाहक निलंबन की पूर्ण प्रतिदीप्ति तीव्रता को अंतिम सेल-वाहक इनक्यूबेशन के लिए उपयोग किए जाने वाले प्रवाह साइटोमीटर पर एमएफआई मूल्य में परिवर्तित किया जाना है। इस प्रयोग में, वाहक के समान फ्लोरोसेंट डाई के साथ लेबल किए गए मात्रा बीड्स का उपयोग प्रवाह साइटोमीटर (चित्रा 5) पर मानक वक्र उत्पन्न करने के लिए कई दिनों में किया गया था। मापा एमएफआई और मात्रा की मात्रा के एमईएसएफ मूल्य के बीच सहसंबंध रैखिक है और मापी गई तारीखों के बीच काफी हद तक समान है। हालांकि, तिथियों के बीच मामूली अंतर देखा जा सकता है, और, इस तरह, वाहक-सेल प्रयोगों के रीडआउट के हिस्से के रूप में एक मानक वक्र को पुनर्जीवित करने की सिफारिश की जाती है।

एक बार जब व्यक्तिगत वाहक का एमएफआई निर्धारित हो जाता है, तो सेल-वाहक एसोसिएशन डेटा को पूरी तरह से परिमाणित और अधिक सटीक रूप से व्याख्या किया जा सकता है। टाइम कोर्स प्रयोगों का प्रदर्शन करना, उदाहरण के लिए, 0 घंटे और 24 घंटे (चित्रा 6) के बीच विभिन्न समय बिंदुओं के लिए 235 एनएम पीएमएएसएच कैप्सूल के साथ फ्लोरोसेंटली लेबल किए गए हेला कोशिकाओं को इनक्यूबेट करने की सिफारिश की जाती है। जैसा कि अपेक्षित था, औसत सेल फ्लोरेसेंस समय के साथ बढ़ता है, यह दर्शाता है कि कैप्सूल हेला कोशिकाओं के साथ जुड़ रहे हैं। जबकि इस तरह के प्रयोगों का उपयोग विभिन्न समय बिंदुओं पर सापेक्ष वाहक प्रदर्शन की तुलना करने के लिए किया जा सकता है, ये परिणाम बिल्कुल मात्रात्मक नहीं हैं।

पूर्ण मात्रा का महत्व, चाहे साइटोमीटर स्ट्रीम या बल्क स्ट्रीम के माध्यम से किया गया हो, दो वाहक प्रकारों के संघ की तुलना करते समय स्पष्ट हो जाता है। चित्रा 7 एक ही दो प्रयोगों को दर्शाता है, जिसका विश्लेषण या तो सापेक्ष मात्रा (चित्रा 7 ए) या पूर्ण मात्रा द्वारा किया जाता है। किए गए विश्लेषण के आधार पर वाहक के लिए स्पष्ट सेलुलर प्रतिक्रिया में अंतर स्पष्ट है; सापेक्ष परिमाणीकरण (चित्रा 7 ए) का उपयोग करते समय वाहक की तुलना सीधे नहीं की जानी चाहिए, जबकि पूर्ण परिमाणीकरण लेबलिंग तीव्रता से स्वतंत्र है और इस प्रकार, अधिक तुलनीय है (चित्रा 7 बी)।

Figure 3
चित्रा 3: प्रवाह साइटोमीटर (साइटोमीटर स्ट्रीम) का उपयोग करके कणों की गिनती। एक एपोजी प्रवाह साइटोमीटर का उपयोग किया गया था। (ए) ऑप्टिकल चैनल (एसएएलएस) का उपयोग करके कण गणना, जिसके परिणामस्वरूप 200,659 की घटना गणना होती है। (बी) वाहक के फ्लोरोसेंट चैनल का उपयोग करके वाहक गिनती, जिसके परिणामस्वरूप 204,636 की घटना गणना हुई। दोनों मामलों में, गेटिंग के बाद एक आर्कसिंह ट्रांसफॉर्म लागू किया गया था (क्रमशः 6 और 4 पर)। 633 एनएम कोर-शेल कणों के कच्चे डेटा से बनाए गए आंकड़े पहली बार फारिया एट अल.10 में प्रकाशित हुए थे। संक्षिप्त नाम: एसएएलएस = छोटे कोण प्रकाश बिखराव। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: नैनोपार्टिकल ट्रैकिंग विश्लेषण (बल्क स्ट्रीम) का उपयोग करके वाहक की गिनती। नैनोपार्टिकल ट्रैकिंग विश्लेषण का उपयोग करके आकार में 100 एनएम के सुपरपैरामैग्नेटिक आयरन ऑक्साइड नैनोकणों की विशेषता और गणना की गई थी। पांच प्रतिकृति मापों के व्यक्तिगत परिणामों के बाएं, एकाग्रता / आकार हिस्टोग्राम। सही, औसत एकाग्रता / आकार वितरण पांच प्रतिकृतियों के एसईएम ±। इस विशेष नमूने में, उपकरण की गतिशील सीमा के भीतर एकाग्रता प्राप्त करने के लिए स्टॉक से 1: 2,000 कमजोर पड़ने का प्रदर्शन किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: प्रवाह साइटोमीटर (बल्क स्ट्रीम) पर मात्रा की मात्रा मोतियों का उपयोग करके एमईएसएफ को एमएफआई में परिवर्तित करना। चार अलग-अलग एमईएसएफ मूल्यों वाले फ्लोरोसेंट मोतियों का विश्लेषण विभिन्न दिनों में एक प्रवाह साइटोमीटर पर किया गया था, और मानक वक्र तैयार किए गए थे। संक्षिप्तीकरण: एमईएसएफ = समकक्ष घुलनशील फ्लोरोक्रोम के अणु; एमएफआई = औसत प्रतिदीप्ति तीव्रता। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 6
चित्रा 6: प्रवाह साइटोमीटर-टाइम कोर्स श्रृंखला (साइटोमीटर स्ट्रीम और बल्क स्ट्रीम) पर अंतिम सेल प्रयोग। एक टाइम कोर्स प्रयोग से फ्लो साइटोमेट्री डेटा की प्रतिनिधि छवियां। टीएचपी -1 कोशिकाओं को 0 घंटे, 1 घंटे, 2 घंटे, 4 घंटे, 8 घंटे, 16 घंटे और 24 घंटे (बाएं से दाएं) के लिए 235 एनएम बहुलक कैप्सूल के साथ इनक्यूबेट किया गया था। वाहक प्रतिदीप्ति को एक्स-अक्ष पर दिखाया गया है, जबकि एक ऑप्टिकल चैनल वाई-अक्ष पर दिखाया गया है। सभी मामलों में, एक आर्कसिंह ट्रांसफॉर्म किया गया था। कोई गेटिंग नहीं की गई थी (ग्राफ की सीमाओं को चुनने के अलावा)। फारिया एट अल.10 में कच्चे डेटा से बनाया गया। संक्षिप्त नाम: एसएएलएस = छोटे कोण प्रकाश बिखराव। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 7
चित्रा 7: वाहक-सेल एसोसिएशन (साइटोमीटर स्ट्रीम और बल्क स्ट्रीम) का सापेक्ष बनाम पूर्ण परिमाणीकरण। दोनों आंकड़े एक ही दो प्रयोगों से डेटा की कल्पना करते हैं, रॉ 264.7 मैक्रोफेज और 150 एनएम (नीला) या 633 एनएम कोर-शेल वाहक (नारंगी) के बीच 24 घंटे का इनक्यूबेशन, जो फारिया एट अल.10 में कच्चे डेटा से बनाया गया है। दोनों तकनीकी प्रतिकृतियों के माध्य प्लॉट किए गए हैं। (ए) सापेक्ष परिमाणीकरण, जिसे यू.यू. (बी) में एमएफआई के रूप में सूचित किया गया है, प्रति सेल वाहकों की संख्या के रूप में सूचित किया गया है। संक्षेप: एमएफआई = औसत प्रतिदीप्ति तीव्रता; a.u. = मनमानी इकाइयाँ। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

दवा वाहक और कोशिकाओं के बीच बातचीत को चिह्नित करना नई दवा वितरण प्रणालियों के विकास में तेजी से महत्वपूर्ण होता जा रहा है। विशेष रूप से, विभिन्न वाहक संरचनाओं के तर्कसंगत मूल्यांकन और तुलना की अनुमति देने के लिए, लक्ष्य और ऑफ-टारगेट कोशिकाओं के साथ बातचीत करने के लिए उक्त वाहक के प्रदर्शन का पूर्ण परिमाणीकरण महत्वपूर्ण है। यह प्रोटोकॉल एक दो-स्ट्रीम पद्धति का वर्णन करता है जो दवा वाहक के साथ काम करने वाले किसी भी शोधकर्ता को सेल-वाहक एसोसिएशन पर सापेक्ष, अर्धमात्रात्मक प्रवाह साइटोमेट्री डेटा को पूर्ण मात्रात्मक परिणामों में परिवर्तित करने की अनुमति देता है। उल्लिखित प्रक्रिया किसी भी प्रकार के वाहक पर लागू होती है - छोटे, बड़े, कार्बनिक, अकार्बनिक - बशर्ते वे फ्लोरोसेंटली लेबल हों। हालांकि, विभिन्न वाहकों को प्रति सेल वाहक की गणना करने के लिए अलग-अलग दृष्टिकोण की आवश्यकता होती है। यह आवश्यक लक्षण वर्णन माप के लिए उपयोग किए जाने वाले विभिन्न इंस्ट्रूमेंटेशन की सीमाओं के कारण है।

जैसे, इस प्रोटोकॉल को दो धाराओं में विभाजित किया गया है: साइटोमीटर स्ट्रीम और बल्क स्ट्रीम। पहला, साइटोमीटर स्ट्रीम, अधिक सीधा दृष्टिकोण है और इसके लिए केवल एक प्रवाह साइटोमीटर की आवश्यकता होती है, लेकिन इस साइटोमीटर को उपयोग किए जाने वाले व्यक्तिगत वाहक का पता लगाने के लिए पर्याप्त संवेदनशील होने की आवश्यकता होती है, या, दूसरे शब्दों में, रुचि के दवा वाहक को पता लगाने के लिए पर्याप्त बड़ा और घना होना चाहिए। बल्क स्ट्रीम किसी भी वाहक प्रकार के साथ संगत है, क्योंकि वैकल्पिक इंस्ट्रूमेंटेशन के उपयोग के माध्यम से व्यक्तिगत वाहक का पता लगाने की आवश्यकता को दरकिनार कर दिया जाता है। हालांकि, बल्क स्ट्रीम को अधिक लक्षण वर्णन प्रयोगों की आवश्यकता होती है।

उपयुक्त स्ट्रीम (और इस तरह, उपयुक्त प्रौद्योगिकियों) को चुनने में सहायता करने के लिए, उपरोक्त विचारों को एक निर्णय वृक्ष (चित्रा 1) में संक्षेपित किया गया है। दोहराने के लिए, बल्क स्ट्रीम सभी शोधकर्ताओं के लिए उपयुक्त है, भले ही वाहक प्रकार का उपयोग किया गया हो और इस प्रकार, हमेशा बैकअप के रूप में वापस किया जा सकता है। दो धाराओं के वर्कफ़्लोज़ को चित्र 2 में रेखांकित किया गया है। विशेष रूप से, प्रवाह साइटोमीटर की संवेदनशीलता में चल रही प्रगति के साथ, यह संभव है कि साइटोमीटर स्ट्रीम का उपयोग <300 एनएम वाहक के लिए किया जा सकता है।

इस प्रक्रिया पर कुछ नोट्स बनाए जाने चाहिए। सबसे पहले, सेल फ्लोरेसेंस को प्रति सेल वाहक की पूर्ण संख्या में परिवर्तित करने के लिए वर्णित रणनीति निलंबन में व्यक्तिगत वाहक प्रतिदीप्ति के माप पर निर्भर करती है। हालांकि, फ्लोरोक्रोम के तत्काल रासायनिक वातावरण से प्रतिदीप्ति प्रभावित होती है (उदाहरण के लिए, वाहक डिल्यूएंट, सेल की सतह, या विभिन्न इंट्रासेल्युलर डिब्बे)। विशेष रूप से, एंडोसोमल डिब्बे का अम्लीय वातावरण कुछ मुख्य रूप से प्रोटीन-आधारित रंगों की प्रतिदीप्ति तीव्रता को प्रभावित करने के लिएजाना जाता है। जैसे, अध्ययन किए गए वाहक प्रकार के बावजूद, दवा वाहक के लेबलिंग के लिए पीएच-असंवेदनशील और अत्यधिक फोटोस्टेबल डाई रेंज का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है (सिफारिश के लिए सामग्री की तालिका देखें)। इस डाई रेंज का अतिरिक्त लाभ इसकी सामान्य चमक है, जो दवा वाहक का पता लगाने की संवेदनशीलता को बढ़ाता है।

दूसरा, ऊपर चर्चा की गई विधियों का उद्देश्य मार्गदर्शन प्रदान करना है, लेकिन किसी भी तरह से तकनीकों की एक विशेष सूची नहीं बनाते हैं जिनका उपयोग क्वांटिटेशन वर्कफ़्लो में विभिन्न चरणों को करने के लिए किया जा सकता है। विशेष रूप से, छोटे या कम प्रकीर्णन वाहक (बल्क स्ट्रीम में) की गिनती के लिए विभिन्न प्रकार की तकनीकें मौजूद हैं। इनमें एक ही नैनोपार्टिकल ट्रैकिंग विश्लेषण12 करने में सक्षम अन्य उपकरण शामिल हैं, साथ ही अन्य तरीके पूरी तरह से, जैसे कि बहु-कोण गतिशील प्रकाश प्रकीर्णन, द्रव्यमान स्पेक्ट्रोस्कोपी, इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी13, गुरुत्वाकर्षण, या ऑप्टिकल घनत्व माप (आगे शांग और गाओ14 द्वारा समीक्षा की गई)। इसके अलावा, यह प्रयोगात्मक परिमाणीकरण- मनमानी प्रतिदीप्ति इकाइयों से प्रति सेल वाहक की पूर्ण संख्या में आगे बढ़ना- केवल एक हिस्सा है जिसे "मात्रात्मक जीव विज्ञान वर्कफ़्लो" कहा जा सकता है। पूर्ण प्रयोगात्मक परिमाणीकरण आवश्यक है लेकिन पर्याप्त नहीं है। केवल वाहक संघ को निर्धारित करने और रिपोर्ट करने से प्रयोगात्मक सेटअप के कारण कण संघ में अंतर नहीं होता है, जैसे कि दवा वाहक की इनक्यूबेशन समय, खुराक और एकाग्रता, या प्रति प्रयोगात्मक कंटेनर उपयोग की जाने वाली कोशिकाओं की संख्या।

इसके अतिरिक्त, विभिन्न भौतिक रासायनिक गुणों वाले वाहकों में कोशिकाओं को बहुत अलग खुराक दी जा सकती है, भले ही प्रयोगात्मक सेटअप समानहो। वाहक प्रदर्शन-यहां तक कि इन विट्रो में- इन सभी कारकों के लिए लेखांकन के बिना निर्धारित नहीं किया जा सकता है। दूसरे शब्दों में, केवल वाहक-सेल एसोसिएशन को निर्धारित करना, सामान्य रूप से, शोधकर्ताओं और प्रयोगशालाओं के बीच वाहक की निष्पक्ष तुलना की अनुमति नहीं देता है। इस प्रकाश में, वाहक-सेल एसोसिएशन के समय-पाठ्यक्रम प्रयोगों के प्रदर्शन के महत्व की पूर्व चर्चा की गई है और बाद में सिलिको गणितीय मॉडलिंग में गतिज मापदंडों (यानी, दर स्थिरांक) को एक विशेष वाहक-सेल जोड़ी10 के बीच संबंध के निष्पक्ष और मात्रात्मक माप के रूप में प्राप्त करने के लिए। प्रयोगात्मक परिमाणीकरण सिलिको तकनीकों में अन्य लागू होने के लिए एक शर्त भी है, जैसे कि जैविक विषमता16 के संभावित स्रोतों की पहचान करना या एक जटिल जैविक मॉडल17 में प्रवेश कैनेटीक्स का निर्धारण करना। मानकीकृत रिपोर्टिंग के लिए जैव-नैनो प्रायोगिक साहित्य दिशानिर्देशों में न्यूनतमसूचना रिपोर्टिंग के साथ संयुक्त, वाहक प्रदर्शन का मात्रात्मक मूल्यांकन उपन्यास नैनोमेडिसिन के विकास में तेजी ला सकता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को ऑस्ट्रेलियाई राष्ट्रीय स्वास्थ्य और चिकित्सा अनुसंधान परिषद (एनएचएमआरसी) द्वारा समर्थित किया गया था; कार्यक्रम अनुदान संख्या जीएनटी 1149990, ऑस्ट्रेलियाई सेंटर फॉर एचआईवी एंड हेपेटाइटिस वायरोलॉजी रिसर्च (एसीएच2), साथ ही रेजेन लुईस लैंगलोइस की संपत्ति से एक उपहार। एफ.सी. राष्ट्रीय स्वास्थ्य और चिकित्सा अनुसंधान परिषद (एनएचएमआरसी) के वरिष्ठ प्रधान अनुसंधान फैलोशिप (जीएनटी 1135806) के पुरस्कार को स्वीकार करता है। चित्रा 1 और चित्रा 2 BioRender.com के साथ बनाए गए थे।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alexa Fluor 647 C2 Maleimide Invitrogen A20347 pH-stable dye used to label 150 nm, 235 nm, or 633 nm PMASH carriers; example of good dye to use in cell-carrier association studies
Apogee A50 Microflow Apogee Sensitive flow cytometer capable of detecting small carriers for counting
CytoFLEX S Flow Cytometer Beckman Coulter Sensitive flow cytometer capable of detecting small carriers for counting and read out for final cell-barrier experiments
FCS Express De Novo Software Software used to analyze flow cytometry data, i.e., perform gating and derive median fluorescence intensity values of populations of choice. Alternatives include FlowJo, OMIQ, Python
Infinite 200 PRO Tecan Lifesciences Standard microplate reader instrument used for bulk fluorescence measurements of carriers in solution
LSRFortessa Cell Analyzer BD Biosciences Less sensitive flow cytometer, but one more generally available to researchers. Can be used to read out final cell-carrier experiment
NanoSight NS300 Malvern Panalytical Instrument used for Nanoparticle Tracking Analysis
Prism 8 GraphPad Software used to graph and calculate standard curves. Alternatives include Microsoft Excel, Origin, Minitab, Python amongst many others
Quantum MESF kits Alexa Fluor 647 Bangs Laboratories 647 Absolute quantitation beads for flow cytometery. Used to convert fluorescence intensities measured in bulk on a microplate reader to fluorescence intensities measured on a flow cytometer using the MESF standard

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References

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<em>इन विट्रो में</em> ड्रग डिलीवरी सिस्टम और कोशिकाओं के बीच बातचीत का प्रयोगात्मक परिमाणीकरण: प्रीक्लिनिकल नैनोमेडिसिन मूल्यांकन के लिए एक गाइड
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Cevaal, P. M., Roche, M., Lewin, S. R., Caruso, F., Faria, M. Experimental Quantification of Interactions Between Drug Delivery Systems and Cells In Vitro: A Guide for Preclinical Nanomedicine Evaluation. J. Vis. Exp. (187), e64259, doi:10.3791/64259 (2022).

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