Summary
Ett arbetsflöde demonstreras för absolut kvantifiering av läkemedelsbärar-cellinteraktioner med hjälp av flödescytometri för att möjliggöra bättre rationell utvärdering av nya drug delivery-system. Detta arbetsflöde är tillämpligt på läkemedelsbärare av vilken typ som helst.
Abstract
En viktig komponent i utformningen av drug delivery-system handlar om hur man förstärker eller dämpar interaktioner med specifika celltyper. Till exempel kan en kemoterapeutisk funktionaliseras med en antikropp för att förbättra bindningen till cancerceller ("inriktning") eller funktionaliseras med polyetylenglykol för att undvika immuncellsigenkänning ("stealth"). Även på cellnivå är optimering av bindningen och upptaget av en läkemedelsbärare ett komplext biologiskt designproblem. Således är det värdefullt att skilja hur starkt en ny bärare interagerar med en cell från den funktionella effekten av en bärares last när den väl levererats till den cellen.
För att fortsätta det kemoterapeutiska exemplet är "hur väl det binder till en cancercell" ett separat problem från "hur bra det dödar en cancercell". Kvantitativa in vitro-analyser för de senare är väl etablerade och är vanligtvis beroende av att mäta viabiliteten. Den mesta publicerade forskningen om cellbärarinteraktioner är dock kvalitativ eller semikvantitativ. I allmänhet är dessa mätningar beroende av fluorescerande märkning av bäraren och rapporterar följaktligen interaktioner med celler i relativa eller godtyckliga enheter. Detta arbete kan dock standardiseras och göras absolut kvantitativt med ett litet antal karakteriseringsexperiment. Sådan absolut kvantifiering är värdefull, eftersom den underlättar rationella, inter- och intraklassjämförelser av olika läkemedelsleveranssystem-nanopartiklar, mikropartiklar, virus, antikropps-läkemedelskonjugat, konstruerade terapeutiska celler eller extracellulära vesiklar.
Dessutom är kvantifiering en förutsättning för efterföljande metaanalyser eller in silico-modelleringsmetoder . I den här artikeln presenteras videoguider, liksom ett beslutsträd för hur man uppnår in vitro-kvantifiering för carrier drug delivery-system, som tar hänsyn till skillnader i bärarstorlek och märkningsmodalitet. Dessutom diskuteras ytterligare överväganden för kvantitativ bedömning av avancerade drug delivery-system. Detta är avsett att fungera som en värdefull resurs för att förbättra rationell utvärdering och design för nästa generations medicin.
Introduction
Utformningen av drug delivery-konstruktioner som uppvisar specifikt, designat beteende beroende på vilken celltyp de möter har väckt stort forskningsintresse. Potentiella läkemedelsleveranskonstruktioner eller "bärare" inkluderar lipidformuleringar, nanoodlade oorganiska ämnen, polymera sammansättningar, extracellulära vesiklar, funktionaliserade bakterieceller eller modifierade virus. Alla dessa kan uppvisa organ-, vävnads- eller cellspecificitet på grund av fysikaliska egenskaper, ytegenskaper eller konstruerade kemiska funktionaliseringar såsom antikroppsfäste 1,2.
Ett nästan allestädes närvarande steg i in vitro-bärarutvärdering är att inkubera celler med en suspension som innehåller nämnda läkemedelsbelastade bärare. Efter inkubation mäts bärarprestanda via en funktionell avläsning av läkemedelslastens prestanda, till exempel transfektionseffektivitet eller toxicitet. Funktionella avläsningar är användbara, eftersom de är ett nedströms mått på bärarens effektivitet. För mer komplexa läkemedelsleveranskonstruktioner blir det emellertid allt viktigare att gå bortom funktionella avläsningar och separat kvantifiera graden av bärarinteraktion med cellen av intresse. Det finns några anledningar till detta.
För det första ökar intresset för att upptäcka (och iterativt förbättra) "plattformsteknik", som kan bära en mängd olika laster. Till exempel kan lipidnanopartiklar (LNP) som är utformade för att kapsla in RNA byta ut en RNA-sekvens mot en annan med få försiktighetsåtgärder3. För att iterativt förbättra bärartekniken är det därför viktigt att kvantifiera dess prestanda oberoende av lastfunktionaliteten. För det andra kanske funktionella avläsningar inte är enkla för lasten av intresse, vilket äventyrar förmågan att snabbt iterera och utvärdera bärarformuleringar. Medan man kan utföra in vitro-optimering med hjälp av en modelllast med en enkel funktionell avläsning (till exempel fluorescens), kan byte av last ändra det biologiska svaret på en bärare4 och kan därför inte ge representativa resultat. För det tredje är många bärare utformade för att interagera med och tas upp av en specifik celltyp. En sådan målinriktningsförmåga hos ett transportföretag kan och bör särskiljas från prestandan hos dess terapeutiska laststolpeinriktning. För att fortsätta LNP-exemplet kan en RNA-last vara extremt potent, men om LNP inte kan binda till cellen, internaliseras och frigöra RNA kommer ingen nedströms funktionell effekt att observeras. Detta kan vara ett problem särskilt för bärare som är avsedda att rikta in sig på svårtransfekta celltyper, såsom T-celler5. Omvänt kan en LNP rikta in sig extremt effektivt, men RNA-lasten kanske inte fungerar. En nedströmsanalys som bara mäter lastfunktionalitet kommer inte att kunna skilja mellan dessa två situationer, vilket komplicerar utvecklingen och optimeringen av carrier drug delivery-system.
I detta arbete diskuteras hur man absolut kvantifierar bärarförening . Association är en term som hänvisar till den experimentellt uppmätta graden av interaktion mellan en bärare och en cell. Association skiljer inte mellan membranbindning och internalisering - en bärare kan vara associerad eftersom den är bunden till cellytan eller för att cellen har internaliserat den. Associering mäts vanligtvis som en del av cellbärarinkubationsexperiment. Historiskt sett har association rapporterats antingen i godtyckliga fluorescerande enheter (vanligtvis "median fluorescensintensitet" eller MFI) eller som "procentassociation", mätvärden vars begränsningar tidigare har diskuterats6. Kort sagt, dessa mätningar är inte jämförbara mellan experiment, laboratorier och läkemedelsbärare på grund av skillnader i experimentella protokoll, flödescytometerinställningar och märkningsintensiteter hos olika bärare. Ansträngningar har gjorts för att övervinna den förra genom att kalibrera cytometern och därigenom omvandla det relativa måttet på MFI till ett absolut kvantitativt mått på fluorescens7. Denna metod tar emellertid inte hänsyn till variationen i märkningsintensiteten hos olika bärare och tillåter således inte en rationell jämförelse av olika bärarprestanda i en målcell som valts8.
Här, hur man praktiskt konverterar från relativa, godtyckliga fluorescerande enheter till det absoluta kvantitativa måttet för "antal bärare per cell" demonstreras genom att utföra ett litet antal ytterligare karakteriseringsexperiment. Om ett annat mått på bärarkoncentration önskas (t.ex. bärarmassa per cell eller bärarvolym per cell) är det enkelt att konvertera från bärare per cell, förutsatt att bärarkarakterisering har gjorts. För korthet och för att undvika jargong används ordet "bärare" inom detta arbete för att hänvisa till det stora sortimentet av läkemedelsleveranskonstruktioner. Dessa kvantifieringstekniker är lika tillämpliga, oavsett om de tillämpas på en nanokonstruerad guldpartikel eller en biokonstruerad bakterie.
Några fakta möjliggör omvandling från godtyckliga fluorescerande enheter till bärare per cell. För det första är den uppmätta fluorescensintensiteten proportionell mot koncentrationen av en fluorofor9 (eller en fluorescerande märkt bärare), förutsatt att fluorescensen ligger inom instrumentets detektionsgränser och instrumenteringsinställningarna är desamma. Således, om fluorescensen hos en bärare och fluorescensen hos ett prov är kända, kan man bestämma hur många bärare som finns i det provet om alla mätningar utfördes under samma inställningar och förhållanden. Men särskilt för mindre bärare kanske det inte är möjligt att mäta bärarfluorescens, cellautofluorescens och cellassocierad fluorescens med bärare på samma instrument med samma inställningar. I detta fall finns det ett andra krav på att göra det möjligt att konvertera mellan uppmätt fluorescens på ett instrument och uppmätt fluorescens på ett annat. För att göra detta kan en standardkurva för fluoroforkoncentrationen fastställas för att mäta fluorescensintensiteten på båda instrumenten och dra nytta av molekylerna av ekvivalent löslig fluorokrom (MESF) standard9. Detta möjliggör sedan mätning av bärarfluorescensen i bulk på en icke-cytometer, en mätning som kan göras på bärare av vilken storlek eller egenskap som helst. När en sådan bulkkvantifiering görs på en bärarsuspension med känd koncentration kan antalet bärare per cell i ett prov återigen beräknas.
Medan detta arbete visar processen för att mäta bärarassociation (som bestäms av uppmätt fluorescensintensitet), kan ett analogt protokoll utföras för andra mått på cellbärarinteraktion (t.ex. ett experimentellt protokoll som skiljer internaliserade och membranbundna bärare). Dessutom skulle detta protokoll vara i stort sett detsamma om associationen mättes genom en icke-fluorescerande analys (till exempel genom masscytometri).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Välja lämplig ström
- Följ beslutsträdet som beskrivs i bild 1 för att fastställa det bästa arbetsflödet (ström) (bild 2) för den experimentella konfiguration som används. Se diskussionen för ytterligare kommentarer om detta val av ström.
- Om du följer cytometerströmmen fortsätter du med steg 2.1.1-2.2.7. Om du följer massströmmen fortsätter du med stegen 3.1.1.1–3.1.5.7.
Bild 1: Beslutsträd för arbetsflöde. Beslutet om vilken Stream som ska användas beror främst på transportörens typ av intresse. Större bärare och bärare med höga spridningsegenskaper kan lättare detekteras individuellt på cytometrar, vilket gör dem lämpliga för kvantifiering med hjälp av cytometerströmmen. Bulkströmmen är lämplig för alla andra bärartyper. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 2: Översikt över arbetsflöden. Detta protokoll är uppdelat i två olika strömmar. Cytometerströmmen använder en känslig cytometer för att räkna bärarna i suspension, mäta deras individuella fluorescens och sedan bestämma fluorescensen hos celler inkuberade med bärare. Bulkströmmen använder icke-cytometribaserade tekniker, såsom nanopartikelspårningsanalys, för att räkna bärarna i suspension. Den enskilda bärarfluorescensen kvantifieras sedan med hjälp av en mikroplattläsare eller spektrofluorometer. Användningen av flödescytometern är därför begränsad till att mäta den slutliga fluorescensen hos celler inkuberade med bärare, en mätning som kan göras på ett bredare spektrum av cytometrar och som är oberoende av vilken bärartyp som används. Förkortningar: MESF = molekyler av ekvivalent löslig fluorokrom; MFI = median fluorescensintensitet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
2. Cytometerströmmen
- Transportörsräkning
OBS: Vilken flödescytometer som helst kan användas för denna mätning, förutsatt att flödeshastigheten (μL / s) är känd. Om flödeshastigheten är okänd och inte kan bestämmas, fortsätt inte med detta steg. Fortsätt istället med steg 3.1. Att räkna bärarna i suspension möjliggör noggrann och reproducerbar bestämning av antalet bärare som inkuberas i varje cellexperiment.- Ställ in cytometern för att detektera bärare, både av en optisk spridningskanal (vanligtvis sidospridning [SSC]) och fluorescens. Se till att justera tröskeln för att möjliggöra detektering av bärarna.
OBS: Iteration genom olika optiska spridningskanaler kan krävas om SSC inte ger en tydlig signal (t.ex. framåtspridning [FSC]). - Kör ett prov med endast spädningsvätska för att kvantifiera antalet bakgrundshändelser i både SSC- och fluorescerande kanaler.
OBS: Idealiska bakgrundshändelser räknas < 100 händelser / s. - Förbered bärarna för flödescytometri.
- Se till att bärarna är väl upphängda genom virvel eller ultraljudsbehandling, beroende på vilket bärarsystem som är inblandat.
- Se om möjligt till att bärarkoncentrationen ligger mellan 1 000 bärare/μl och 10 000 bärare/μl. Ett händelseantal på en till två storleksordningar högre än bakgrunden är en bra början. Om storleksordningen på bärarkoncentrationen är okänd är en bra början att förbereda en utspädning på 1:1 000 från lager. Använd de första resultaten som återkoppling för att informera framtida provutspädningar.
OBS: En grumlig suspension är i allmänhet för koncentrerad.
- Ladda det första bärarprovet på cytometern och börja spela in.
- Jämför händelseantal som härrör från både SSC- och fluorescenskanalerna; dessa bör vara ungefär lika (<10% skillnad). Om inte, kontrollera cytometerinställningarna, t.ex. fotomultiplikatorrör (PMT) inställningar och laserintensitet för den fluorescerande kanalen. Alternativt kan du använda andra metoder som konfokalmikroskopi för att validera att bärarnas fluorescerande märkning är närvarande och enhetlig.
- Upprepa steg 2.1.3–2.1.5 ytterligare två eller flera gånger med olika utspädningar från beståndet. Kontrollera att antalet händelser i varje prov är minst en storleksordning högre än antalet bakgrundshändelser.
- Kontrollera att tre eller flera prover visar en linjär trend, det vill säga att en tvåfaldig provutspädning bör resultera i en motsvarande tvåfaldig minskning av den uppmätta bärarkoncentrationen.
- Använd proverna inom det linjära området, motsvarande utspädningsfaktorer och det kända cytometerflödet för att beräkna stambärarkoncentrationen enligt ekvation (1):
(1)
där C är lagerhållarens koncentration i bärare/ml. Vi rekommenderar att du använder händelseantalet som härleds från optisk spridningsdetektering snarare än fluorescens.
- Ställ in cytometern för att detektera bärare, både av en optisk spridningskanal (vanligtvis sidospridning [SSC]) och fluorescens. Se till att justera tröskeln för att möjliggöra detektering av bärarna.
- Flödescytometriavläsning av bärarcellexperimentet, inklusive bestämning av fluorescensintensitet per bärare
OBS: Helst kommer den fluorescerande intensiteten per bärare att bestämmas så nära bärarcellexperimentet som möjligt. Detta för att säkerställa att de MFI som erhållits för enskilda bärare direkt kan jämföras med MFI för celler associerade med bärarna. I praktiken kommer en cytometer vanligtvis att generera liknande resultat när den används på varandra följande dagar med samma PMT-spänningar, men detta kan inte garanteras.- Designa bärarcellexperimentet. Använd bärarkoncentrationen som bestäms i steg 2.1 för att administrera önskad dos av bärare.
- Ställ in flödescytometern för det slutliga bärarcellexperimentet genom att bestämma optimala PMT-spänningsinställningar i relevanta kanaler. Ange tröskelvärdena så att transportörsidentifiering tillåts.
- Kör bärarna i suspension för att bestämma fluorescensintensiteten per bärare under de aktuella PMT-inställningarna.
- Om det behövs, ändra cytometertrösklarna för att upptäcka cellerna och inte bärarna.
- Kör ett negativt kontrollprov - celler som inte inkuberas med bärare - för att bestämma cellernas bakgrundsfluorescens (autofluorescens).
- Kör bärarcellsproverna för att bestämma fluorescensintensiteten per cell. Denna fluorescens är en linjär kombination av cellulär autofluorescens och närvaron av fluorescerande bärare.
- Beräkna antalet bärare per cell med hjälp av följande ekvation (2):
(2)
där Passoc är antalet associerade bärare per cell, FI-cell är MFI för celler inkuberade med bärare, FI-bakgrund är MFI för celler som inte inkuberas med bärare, och FI-bärare är MFI för bärare i suspension.
(1)
(2)3. Bulkströmmen
- Bärarräkning: nanopartikelspårningsanalys
OBS: I bulkströmmen är bärarräkning ett nödvändigt steg för att kvantifiera den absoluta fluorescensintensiteten per bärare (se steg 3.1.4). Dessutom möjliggör räkning av bärarna i suspension den exakta och reproducerbara bestämningen av antalet bärare som inkuberas i varje cellexperiment.- Förberedelse
- Montera flödescellen på lasermodulen och lås hela lasermodulen på plats inuti instrumentet.
- Spola långsamt (inte snabbare än 0,1 ml/s) flödescellen med ~1 ml destillerat vatten. Om det bildas bubblor i flödescellen, dra tillbaka suspensionen delvis för att slå samman bubblan med luft-vätskegränssnittet innan du fortsätter.
- Starta kameran ungefär halvvägs genom spolning; Var noga med att bekräfta att bärarskräp tvättas ut. Välj Capture för att öppna fliken Capture Settings och klicka på Starta kamera.
- Torka systemet med 1 ml luft. Om några statiska bärare är synliga på skärmen, rengör flödescellen enligt tillverkarens instruktioner.
- Förbered bärarna för Nanoparticle Tracking Analysis genom att se till att bärarna är väl upphängda via virvel eller ultraljudsbehandling, beroende på vilket bärarsystem som är inblandat. Om stamkoncentrationens storleksordning är okänd, förbered en utspädning på 1:100 från stamberedningen och använd de ursprungliga resultaten som återkoppling för att informera framtida provutspädningar. Späd bärarna i vatten och inte fosfatbuffrad saltlösning (PBS) för att bereda minst ~0,6–1 ml av varje prov med en bärarkoncentration mellan 1 × 107 bärare/ml och 1 × 109 bärare/ml.
OBS: En grumlig suspension är i allmänhet för koncentrerad. Buffertar och salter kan generera högt bakgrundsbrus.
- Mätning
- Ta ut lasermodulen och placera den upprätt.
- Dra upp det första bärarprovet i en spruta på 1 ml. Fäst sprutan på rörinloppet och ladda försiktigt provet i flödescellen. Om det bildas bubblor i flödescellen, dra tillbaka suspensionen delvis för att slå samman bubblan med luft-vätskegränssnittet innan du fortsätter. Se till att hela flödescellen är fylld med vätska och pausa sedan.
- Justera kamerafokus om det behövs för att visualisera enskilda bärare. Gör grova fokusjusteringar med den roterande ratten på instrumentets högra sida. Gör finare justeringar genom att välja fliken Maskinvara | Pumpar/steg. Ändra fokus genom att justera skjutreglaget Fokus .
- Justera kameranivån för att se till att det inte finns någon övermättnad. På fliken Capture väljer du den optimala kameranivån genom att justera skjutreglaget.
- Om instrumentet är utrustat med detta tillbehör, ladda sprutan som innehåller bärarprovet i sprutpumpen för att säkerställa kontinuerligt provflöde under mätningarna.
- Under fliken SOP väljer du Standardmätning för att ta fem bilder på 30 s vardera. Ange Basfilnamn och, om så önskas, lägg till ytterligare exempelinformation genom att klicka på knappen Avancerat (som öppnar en modal dialog med en mängd olika val).
OBS: Om en utspädningsfaktor anges kommer den slutliga mätningen av bärarkoncentrationen att justeras automatiskt av programvaran. Att ange denna faktor rekommenderas mot. Utför i stället justeringen manuellt, vilket underlättar analysen och gör det möjligt att bedöma om varje utspädning faller inom instrumentets dynamiska område (steg 3.1.3.4). - Tryck på Skapa och kör skript och vänta tills ett popup-fönster visas som ber dig att skicka förhandsprov.
- Om du använder sprutpumpen väljer du fliken Hårdvara | Fliken Sprutpump | ställ in infusionshastigheten på 30-80 och tryck på Infusera. Om du inte använder sprutpumpen ska du flytta fram provet manuellt.
- I popup-fönstret väljer du OK för att börja fånga. Efter var och en av de fem inspelningarna, när popup-fönstret Please advance sample dyker upp igen, kontrollera att provet fortfarande rör sig genom flödescellen, antingen manuellt eller via sprutpumpen. Välj sedan OK för att fortsätta med nästa inspelning.
OBS: Efter fem inspelningar öppnar programvaran automatiskt fliken Process och öppnar ett popup-fönster som ber om att justera processinställningarna.
- Analys
- På fliken Process justerar du skjutreglaget Detektionströskel (mellan 4 och 8) för att korrekt identifiera distinkta bärare som är synliga på skärmen. Justera skärmförstärkningen också för att underlätta visualiseringen; Det kommer inte att påverka nedströmsanalysen. Använd skjutreglaget under inspelningsskärmen för att bläddra igenom flera bildrutor i videon för att underlätta inställningen av detekteringströskeln.
OBS: Detektionströskeln bör ställas in en gång och därefter inte ändras mellan mätningar eller prover. - I popup-fönstret (obs efter steg 3.1.2.9) trycker du på OK för att starta spårningsanalysen. Övervaka analysens framsteg genom att klicka på fliken Analys | Fliken Enkel analys .
- När analysen är klar letar du efter en exportinställningsprompt som ska visas, där Inkludera PDF och Inkludera experimentsammanfattning ska väljas som standard. Välj andra exportformat efter behov.
- I avsnittet Resultat i PDF-dataexporten, för att säkerställa att den uppmätta koncentrationen är tillförlitlig, kontrollera att den uppmätta bärarkoncentrationen ligger mellan 1 × 107 bärare/ml och 1 × 109 bärare/ml - instrumentets dynamiska omfång - och kontrollera om det finns eventuella felmeddelanden eller varningsmeddelanden under koncentrationsmätningsresultatet.
- Upprepa steg 3.1.2.1–3.1.3.4 två eller flera gånger med olika utspädningar från beståndet. Se till att koncentrationen av varje prov faller inom instrumentets linjära intervall.
- Välj ut tre eller flera prover som visar en linjär trend, det vill säga en tvåfaldig provutspädning bör resultera i en motsvarande tvåfaldig minskning av den uppmätta bärarkoncentrationen. Använd de utvalda proverna och motsvarande utspädningsfaktorer för att beräkna stambärarkoncentrationen.
- På fliken Process justerar du skjutreglaget Detektionströskel (mellan 4 och 8) för att korrekt identifiera distinkta bärare som är synliga på skärmen. Justera skärmförstärkningen också för att underlätta visualiseringen; Det kommer inte att påverka nedströmsanalysen. Använd skjutreglaget under inspelningsskärmen för att bläddra igenom flera bildrutor i videon för att underlätta inställningen av detekteringströskeln.
- Bestämning av den absoluta fluorescensintensiteten per bärare
OBS: Eftersom fluorescensen hos enskilda bärare i denna ström inte kan karakteriseras direkt, kvantifieras fluorescensintensiteten i bulk. Denna metod bygger på det faktum att fluorescensintensiteten är linjärt relaterad till fluorokromkoncentrationen enligt Lambert-Beer-lagen. När en sådan bulkkvantifiering av bärare i suspension görs på en suspension av känd bärarkoncentration (se steg 3.1) kan fluorescensen per bärare härledas. Detta steg kan göras på antingen en fluorescensplattläsare eller en spektrofluorometer. Fluorescensintensiteten jämförs med en standardkurva av prover med känd absolut fluorescens, angiven i antal MESF.- Använd en lösning av den fria fluorokromen för att märka bäraren: återsuspendera färgämnet i lämplig buffert (t.ex. DMSO) och utför ytterligare utspädningar i samma buffert som bärarutspädningsmedlet. Alternativt kan du använda en lösning av en antikropp konjugerad till fluorokromen. Beräkna stamlösningens (MESF/ml) koncentration från koncentrationen i mg/ml, molekylvikten i mg/mol och Avogadros tal med hjälp av ekvation (3). Utför en seriell utspädning i bärarutspädningsmedlet för att generera standardkurvprover.
(3)
OBS: Använd en fluorokromkonjugerad antikropp endast om graden av märkning, dvs det molära förhållandet mellan fluorokrom och antikropp i lösningen, är känd. Generera initialt en standardkurva med ett brett spektrum, eftersom fluorescensintensiteten hos bärarprovet fortfarande är okänd. Härifrån begränsar du det till att inkludera det intervall som krävs. - Förbered bärarproverna.
OBS: Bästa praxis är att testa två eller flera bärarutspädningar för att validera att mätningarna är linjära och faller inom standardkurvans intervall. - Mät fluorescensen för lika stora volymer av varje prov, dvs både bärar- och standardkurvor.
- Generera en standardkurva och dra av den absoluta fluorescensintensiteten i bulk i MESF / ml för de uppmätta bärarproverna.
- Beräkna den absoluta fluorescensintensiteten per bärare (MESF/bärare) genom att dividera bulkfluorescensen (MESF/ml) med bärarkoncentrationen (bärare/ml) enligt ekvation (4):
(4)
- Använd en lösning av den fria fluorokromen för att märka bäraren: återsuspendera färgämnet i lämplig buffert (t.ex. DMSO) och utför ytterligare utspädningar i samma buffert som bärarutspädningsmedlet. Alternativt kan du använda en lösning av en antikropp konjugerad till fluorokromen. Beräkna stamlösningens (MESF/ml) koncentration från koncentrationen i mg/ml, molekylvikten i mg/mol och Avogadros tal med hjälp av ekvation (3). Utför en seriell utspädning i bärarutspädningsmedlet för att generera standardkurvprover.
- Cellexperiment (inklusive bestämning av ekvivalent fluorescensintensitet per bärare)
OBS: I detta steg används flödescytometrikvantiteringspärlor för att generera en standardkurva för förhållandet mellan MESF och MFI. Dessa kvantifieringspärlor består av flera pärlpopulationer med ett känt antal MESF per pärla, och dessa enskilda pärlor kan detekteras av vilken cytometer som helst. Helst bestäms MESF-standardkurvan samtidigt som avläsningen av bärarcellexperimenten. Detta för att säkerställa att MFI-värdena beräknade för enskilda bärare direkt kan jämföras med MFI för celler associerade med bärare. I praktiken kommer en cytometer vanligtvis att generera liknande resultat när den används på varandra följande dagar med samma PMT-spänningar, men detta kan inte garanteras.- Designa bärarcellexperimentet. Använd den bärarkoncentration som bestäms i avsnitt 3.1.3 för att administrera den önskade dosen bärare.
- Ställ in flödescytometern för det slutliga bärarcellexperimentet genom att bestämma optimala PMT-spänningsinställningar i relevanta kanaler.
- Kör ett negativt kontrollprov, det vill säga celler som inte inkuberas med bärare, för att bestämma bakgrundsfluorescensen.
- Förbered och återsuspendera flödescytometrikvantifieringspärlorna. Använd samma buffert som används för cellproverna (t.ex. PBS). Om pärlpopulationerna tillhandahålls separat, slå ihop dem.
- Kör flödescytometrikvantifieringspärlprovet.
- Kör bärarcellsproverna för att bestämma fluorescensintensiteten per cell.
- Använd kvantifieringspärlprovet för att generera en standardkurva som omvandlar den absoluta fluorescensintensiteten (MESF) till MFI. Använd denna standardkurva och resultaten från steg 3.1.4 för att beräkna bärarnas teoretiska MFI. Beräkna antalet bärare per cell med ekvation (5):
(5)
Där Passoc är antalet associerade bärare per cell, FI-cell är MFI för celler inkuberade med bärare, FI-bakgrund är MFI för celler som inte inkuberas med bärare och FI-bärare är den beräknade MFI för bärare i suspension (steg 3.1.4).
- Förberedelse
(3)
(4)
(5)Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Som diskuterats tidigare kräver olika läkemedelsbärartyper användning av olika tekniker för absolut kvantifiering av cellbärarassociation. Till exempel är 633 nm disulfidstabiliserade poly(metakrylsyra) (PMASH) kärnskalpartiklar stora och täta nog för detektion med användning av en känslig flödescytometer. Som sådan märktes dessa partiklar fluorescerande, sedan gated och räknades med hjälp av sidovinkelljusspridning (SALS, analogt med SSC), liksom lämplig fluorescerande kanal (Figur 3). Skillnaden i antal händelser i båda kanalerna var 1,98%, väl inom det acceptabla intervallet.
Däremot är 100 nm superparamagnetiska järnoxidnanopartiklar för små för att detektera individuellt och analyserades således med hjälp av bulkströmmen. Dessa nanopartiklar räknades och karakteriserades med hjälp av nanopartikelspårningsanalys (figur 4). Den genomsnittliga nanopartikelstorleken på 136 nm återspeglar nanopartikelns hydrodynamiska diameter i vatten. Den nanopartikelkoncentration som mäts - fortfarande okorrigerad för den utförda utspädningen - faller inom instrumentets dynamiska område, vilket tyder på framgångsrik och exakt bestämning av nanopartikelkoncentrationen.
Om man fortsätter i bulkströmmen ska den absoluta fluorescensintensiteten hos en bärarsuspension omvandlas till ett MFI-värde på den flödescytometer som används för den slutliga cellbärarinkubationen. I detta experiment användes kvantifieringspärlor märkta med samma fluorescerande färgämne som bäraren på flera dagar för att generera standardkurvor på en flödescytometer (figur 5). Korrelationen mellan det uppmätta MFI och MESF-värdet för kvantifieringspärlorna är linjär och i stort sett lika mellan de uppmätta datumen. Små skillnader mellan datum kan dock observeras, och som sådan rekommenderas att regenerera en standardkurva som en del av avläsningen av bärarcellexperimenten.
När MFI för enskilda bärare har bestämts kan cellbärarföreningsdata absolut kvantifieras och tolkas mer exakt. Att utföra tidsförloppsexperiment, t.ex. inkubera HeLa-celler fluorescerande märkta med 235 nm PMASH-kapslar , för olika tidpunkter mellan 0 h och 24 h (figur 6) rekommenderas. Som förväntat ökar mediancellfluorescensen med tiden, vilket indikerar att kapslarna associerar med HeLa-celler. Även om sådana experiment kan användas för att jämföra den relativa bärarprestandan vid olika tidpunkter, är dessa resultat inte absolut kvantitativa.
Betydelsen av absolut kvantifiering, oavsett om den görs via Cytometer Stream eller Bulk Stream, blir tydlig när man jämför föreningen av två bärartyper. Figur 7 visar samma två experiment, analyserade med antingen relativ kvantifiering (figur 7A) eller absolut kvantifiering. Skillnaden i det uppenbara cellulära svaret på bärare är skarpt, beroende på den utförda analysen; bärare bör inte jämföras direkt när de använder relativ kvantifiering (figur 7A), medan absolut kvantifiering är oberoende av märkningsintensitet och därmed mer jämförbar (figur 7B).
Figur 3: Räkna partiklar med hjälp av en flödescytometer (Cytometer Stream). En Apogee-flödescytometer användes. (A) Partikelräkning med hjälp av en optisk kanal (SALS), vilket resulterar i ett händelseantal på 200 659. (B) Bärarräkning med hjälp av bärarens fluorescerande kanal, vilket resulterar i ett händelseantal på 204 636. I båda fallen applicerades en arcsinhtransform följt av gating (vid 6 respektive 4). Siffror skapade från rådata från 633 nm kärnskalpartiklar publicerades först i Faria et al.10. Förkortning: SALS = ljusspridning med liten vinkel. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Räkna bärare med hjälp av nanopartikelspårningsanalys (bulkström). Superparamagnetiska järnoxidnanopartiklar av 100 nm i storlek karakteriserades och räknades med hjälp av Nanoparticle Tracking Analysis. Vänster, koncentrations-/storlekshistogram över enskilda resultat av fem replikatmätningar. Rätt, genomsnittlig koncentrations-/storleksfördelning ± SEM för fem replikat. I detta specifika prov utfördes en utspädning på 1:2 000 från stam för att erhålla en koncentration inom instrumentets dynamiska område. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Konvertera MESF till MFI med hjälp av kvantifieringspärlor på en flödescytometer (Bulk Stream). Fluorescerande pärlor med fyra olika MESF-värden analyserades på en flödescytometer på olika dagar och standardkurvor ritades. Förkortningar: MESF = molekyler av ekvivalent löslig fluorokrom; MFI = median fluorescensintensitet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: Slutligt cellexperiment på flödescytometertidskursserier (Cytometer Stream och Bulk Stream). Representativa bilder av flödescytometridata från ett tidsförloppsexperiment. THP-1-celler inkuberades med en 235 nm polymerkapsel i 0 h, 1 h, 2 h, 4 h, 8 h, 16 h och 24 h (vänster till höger). Bärarfluorescens visas på x-axeln, medan en optisk kanal visas på y-axeln. I alla fall utfördes en arcsinh-transform. Ingen gating utfördes (förutom att välja gränserna för grafen). Skapad från rådata i Faria et al.10. Förkortning: SALS = ljusspridning med liten vinkel. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7: Relativ kontra absolut kvantifiering av bärarcellassociation (cytometerström och bulkström). Båda figurerna visualiserar data från samma två experiment, en 24 timmars inkubation mellan RAW264.7 makrofager och 150 nm (blå) eller 633 nm kärnskalbärare (orange), skapad från rådata i Faria et al.10. Medianerna för båda de tekniska replikaten plottas. (A) Relativ kvantifiering, rapporterad som MFI i a.u. (B) Absolut kvantifiering, rapporterad som antalet bärare per cell. Förkortningar: MFI = median fluorescensintensitet; a.u. = godtyckliga enheter. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Att karakterisera interaktionerna mellan läkemedelsbärare och celler blir allt viktigare i utvecklingen av nya drug delivery-system. Specifikt, för att möjliggöra rationell utvärdering och jämförelse av olika bärarkonstruktioner, är absolut kvantifiering av bärarens prestanda för att interagera med mål- och off-target-celler kritisk. Detta protokoll beskriver en tvåströmsmetodik som gör det möjligt för alla forskare som arbetar med en läkemedelsbärare att konvertera relativa, semikvantitativa flödescytometridata om cellbärarförening till absoluta kvantitativa resultat. Den skisserade processen är tillämplig på alla typer av bärare - små, stora, organiska, oorganiska - förutsatt att de är fluorescerande märkta. Olika bärare kräver dock olika metoder för att beräkna bärarna per cell. Detta beror på gränserna för olika instrument som används för de nödvändiga karakteriseringsmätningarna.
Som sådan är detta protokoll uppdelat i två strömmar: Cytometerströmmen och bulkströmmen. Den första, Cytometer Stream, är det enklare tillvägagångssättet och kräver bara en flödescytometer, men denna cytometer måste vara tillräckligt känslig för att upptäcka de enskilda bärarna som används, eller med andra ord, läkemedelsbäraren av intresse måste vara stor och tät nog för att detekteras. Bulkströmmen är kompatibel med alla bärartyper, eftersom behovet av att upptäcka enskilda bärare kringgås genom användning av alternativ instrumentering. Massströmmen kräver dock att fler karakteriseringsexperiment görs.
För att hjälpa till med att välja lämplig ström (och som sådan lämplig teknik) har ovanstående överväganden sammanfattats i ett beslutsträd (figur 1). För att upprepa är bulkströmmen lämplig för alla forskare oavsett vilken bärartyp som används och kan därför alltid återställas till som en säkerhetskopia. Arbetsflödena för de två strömmarna beskrivs i figur 2. I synnerhet med de pågående framstegen i känsligheten hos flödescytometrar är det möjligt att cytometerströmmen kan användas för mer <300 nm-bärare.
Några anteckningar bör göras om denna procedur. För det första är den beskrivna strategin för att omvandla cellfluorescensen till ett absolut antal bärare per cell beroende av mätningen av den enskilda bärarfluorescensen i suspension. Fluorescensen påverkas emellertid av fluorokromens omedelbara kemiska miljö (t.ex. bärarutspädningsmedlet, cellytan eller olika intracellulära fack). I synnerhet är den sura miljön i det endosomala facket känt för att påverka fluorescensintensiteten hos vissa primärt proteinbaserade färgämnen11. Som sådan, oavsett vilken bärartyp som studerats, rekommenderas att använda pH-okänsliga och mycket fotostabila färgområden för märkning av läkemedelsbärare (se materialtabellen för en rekommendation). Den ytterligare fördelen med detta färgämnesområde är dess allmänna ljusstyrka, vilket ökar känsligheten hos läkemedelsbärardetektering.
För det andra är de metoder som diskuteras ovan avsedda att ge vägledning men utgör inte på något sätt en exklusiv lista över tekniker som kan användas för att utföra de olika stegen i kvantifieringsarbetsflödet. I synnerhet finns det en mängd olika tekniker för att räkna mindre eller lågspridande bärare (som de i bulkströmmen). Dessa inkluderar andra instrument som kan utföra samma Nanoparticle Tracking Analysis12, liksom andra metoder helt och hållet, såsom dynamisk ljusspridning med flera vinklar, masspektroskopi, elektronmikroskopi 13, gravimetri eller optisk densitetsmätningar (vidare granskad av Shang och Gao14). Dessutom är denna experimentella kvantifiering - att flytta från godtyckliga fluorescensenheter till ett absolut antal bärare per cell - bara en del av vad som kan kallas ett "kvantitativt biologiarbetsflöde". Absolut experimentell kvantifiering är nödvändig men inte tillräcklig. Att bara kvantifiera och rapportera bärarassociationen tar inte hänsyn till skillnader i partikelassociation på grund av den experimentella inställningen, såsom inkubationstid, dos och koncentration av tillsatt läkemedelsbärare, eller antalet celler som används per experimentell behållare.
Dessutom kan bärare med olika fysikalisk-kemiska egenskaper ha mycket olika doser levererade till celler, även när den experimentella installationen är identisk15. Bärarens prestanda - även in vitro - kan inte bestämmas utan att ta hänsyn till alla dessa faktorer. Med andra ord möjliggör enbart kvantifieringen av bärarcellassociationen i allmänhet inte en opartisk jämförelse av bärare mellan forskare och laboratorier. Mot denna bakgrund har det tidigare diskuterats vikten av att utföra tidsförloppsexperiment av bärar-cellassociation och efterföljande in silico matematisk modellering för att härleda kinetiska parametrar (dvs. hastighetskonstanter) som ett opartiskt och kvantitativt mått på affiniteten mellan ett visst bärar-cellpar10. Experimentell kvantifiering är också en förutsättning för att andra in silico-tekniker ska kunna tillämpas, såsom att identifiera potentiella källor till biologisk heterogenitet16 eller bestämma penetrationskinetik i en komplex biologisk modell17. I kombination med riktlinjerna för minimal informationsrapportering i bionanoexperimentell litteratur för standardiserad rapportering18 kan den kvantitativa utvärderingen av bärarprestanda påskynda utvecklingen av ny nanomedicin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av Australian National Health and Medical Research Council (NHMRC; Programbidrag nr GNT1149990), Australian Center for HIV and Hepatitis Virology Research (ACH2), samt en gåva från Réjane Louise Langlois dödsbo. F.C. erkänner utmärkelsen av ett National Health and Medical Research Council (NHMRC) Senior Principal Research Fellowship (GNT1135806). Figur 1 och figur 2 skapades med BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 647 C2 Maleimide | Invitrogen | A20347 | pH-stable dye used to label 150 nm, 235 nm, or 633 nm PMASH carriers; example of good dye to use in cell-carrier association studies |
| Apogee A50 Microflow | Apogee | Sensitive flow cytometer capable of detecting small carriers for counting | |
| CytoFLEX S Flow Cytometer | Beckman Coulter | Sensitive flow cytometer capable of detecting small carriers for counting and read out for final cell-barrier experiments | |
| FCS Express | De Novo Software | Software used to analyze flow cytometry data, i.e., perform gating and derive median fluorescence intensity values of populations of choice. Alternatives include FlowJo, OMIQ, Python | |
| Infinite 200 PRO | Tecan Lifesciences | Standard microplate reader instrument used for bulk fluorescence measurements of carriers in solution | |
| LSRFortessa Cell Analyzer | BD Biosciences | Less sensitive flow cytometer, but one more generally available to researchers. Can be used to read out final cell-carrier experiment | |
| NanoSight NS300 | Malvern Panalytical | Instrument used for Nanoparticle Tracking Analysis | |
| Prism 8 | GraphPad | Software used to graph and calculate standard curves. Alternatives include Microsoft Excel, Origin, Minitab, Python amongst many others | |
| Quantum MESF kits Alexa Fluor 647 | Bangs Laboratories | 647 | Absolute quantitation beads for flow cytometery. Used to convert fluorescence intensities measured in bulk on a microplate reader to fluorescence intensities measured on a flow cytometer using the MESF standard |
References
- Conde, J., et al. Revisiting 30 years of biofunctionalization and surface chemistry of inorganic nanoparticles for nanomedicine. Frontiers in Chemistry. 2, 48 (2014).
- Cheng, Q., et al. Selective ORgan Targeting (SORT) nanoparticles for tissue specific mRNA delivery and CRISPR/Cas gene editing. Nature Nanotechnology. 15 (4), 313-320 (2020).
- Jackson, N. A. C., Kester, K. E., Casimiro, D., Gurunathan, S., DeRosa, F. The promise of mRNA vaccines: A biotech and industrial perspective. npj Vaccines. 5 (1), 1-6 (2020).
- Press, A. T., et al. Cargo-carrier interactions significantly contribute to micellar conformation and biodistribution. NPG Asia Materials. 9 (10), 444 (2017).
- Cevaal, P. M., et al. In vivo T cell-targeting nanoparticle drug delivery systems: Considerations for rational design. ACS Nano. 15 (3), 3736-3753 (2021).
- Faria, M., Johnston, S. T., Mitchell, A. J., Crampin, E., Caruso, F. Bio-nano science: Better metrics would accelerate progress. Chemistry of Materials. 33 (19), 7613-7619 (2021).
- Shin, H., Kwak, M., Geol Lee, T., Youn Lee, J. Quantifying the level of nanoparticle uptake in mammalian cells using flow cytometry. Nanoscale. 12 (29), 15743-15751 (2020).
- Lozano-Andrés, E., et al. Considerations for MESF-bead based assignment of absolute fluorescence values to nanoparticles and extracellular vesicles by flow cytometry. bioRxiv. , (2021).
- Schwartz, A., et al. Formalization of the MESF unit of fluorescence intensity. Cytometry. Part B, Clinical Cytometry. 57 (1), 1-6 (2004).
- Faria, M., et al. Revisiting cell-particle association in vitro: A quantitative method to compare particle performance. Journal of Controlled Release. 307, 355-367 (2019).
- Chen, A. K., Cheng, Z., Behlke, M. A., Tsourkas, A. Assessing the sensitivity of commercially available fluorophores to the intracellular environment. Analytical Chemistry. 80 (19), 7437-7444 (2008).
- Comfort, N., et al. Nanoparticle tracking analysis for the quantification and size determination of extracellular vesicles. Journal of Visualized Experiments. (169), e62447 (2021).
- Cui, J., et al. Immobilized particle imaging for quantification of nano- and microparticles. Langmuir. 32 (14), 3532-3540 (2016).
- Shang, J., Gao, X. Nanoparticle counting: Towards accurate determination of the molar concentration. Chemical Society Reviews. 43 (21), 7267-7278 (2014).
- Thomas, D. G., et al. ISD3: A particokinetic model for predicting the combined effects of particle sedimentation, diffusion and dissolution on cellular dosimetry for in vitro systems. Particle and Fibre Toxicology. 15 (1), 6 (2018).
- Johnston, S. T., Faria, M., Crampin, E. J. Isolating the sources of heterogeneity in nano-engineered particle-cell interactions. The Journal of the Royal Society Interface. 17 (166), 20200221 (2020).
- Ahmed-Cox, A., et al. Spatio-temporal analysis of nanoparticles in live tumor spheroids impacted by cell origin and density. Journal of Controlled Release. 341, 661-675 (2022).
- Faria, M., et al. Minimum information reporting in bio-nano experimental literature. Nature Nanotechnology. 13 (9), 777-785 (2018).
