Summary
Aquí, describimos el método de generación de un modelo de decidualización artificial utilizando el ratón ovariectomizado, un experimento clásico de decidualización endometrial en el campo de investigación de la decidualización endometrial.
Abstract
La decidualización endometrial es un proceso de diferenciación único del endometrio, estrechamente relacionado con la menstruación y el embarazo. El deterioro de la decidualización conduce a diversos trastornos endometriales, como infertilidad, aborto espontáneo recurrente y parto prematuro. El desarrollo y uso del modelo de decidualización endometrial en estudios reproductivos ha sido un punto culminante para los investigadores reproductivos durante mucho tiempo. El ratón ha sido ampliamente utilizado en el estudio de la reproducción y la decidualización. Hay tres modelos de ratón bien establecidos con respecto a la decidualización, a saber, la decidualización natural del embarazo (NPD), la decidualización artificial (AD) y la decidualización in vitro (IVD). Entre ellos, AD se considera un modelo confiable para la decidualización del mouse, que es fácil de implementar y cercano a NPD. Este trabajo se centra en un método modificado del proceso de generación y aplicación del modelo de decidualización artificial de ratón con ovariectomía para evitar efectos ováricos, que pueden obtener resultados altamente reproducibles con pequeñas varianzas dentro del grupo. Este método proporciona un modelo animal bueno y confiable para el estudio de la decidualización endometrial.
Introduction
Con el desarrollo de la tecnología de reproducción asistida por humanos, la tasa actual de embarazo clínico de fertilización in vitro-transferencia de embriones (FIV-ET) ha alcanzado o incluso superado la del embarazo natural. A pesar de ello, muchas pacientes en la práctica clínica de reproducción asistida todavía se someten a múltiples transferencias embrionarias pero no logran el embarazo deseado. Sin embargo, su mecanismo molecular específico aún no está claro, por lo que la intervención clínica es ineficaz, lo que es uno de los desafíos significativos que enfrenta la medicina reproductiva 1,2.
Los factores endometriales representan cerca de dos tercios de las causas del fracaso de la FIV3. La implantación del embrión humano se divide en tres etapas: posicionamiento, adhesión e invasión 4,5,6. El endometrio materno sufre una serie de cambios para cumplir con la llegada del embrión. La formación de un "período ventana" de implantación proporciona condiciones favorables para la implantación del embrión 7,8.
En la mayoría de los mamíferos, después de que el blastocisto se adhiere al epitelio luminal del útero, las células estromales que rodean el blastocisto rápidamente comienzan a proliferar y diferenciarse, y la rápida remodelación del mesénquima cambia su forma y función, lo que lleva a la implantación del embrión 5,9,10. El rápido aumento en el volumen y el peso del sitio permite que el blastocisto se incruste en el estroma uterino, un proceso conocido como decidualización11. El estroma endometrial se diferencia y remodela en preparación para el embarazo, mientras que la transición de las células estromales proporciona espacio y nuevas conexiones de señalización para que las células deciduales realicen sus funciones12,13. Las células estromales se transforman en células deciduales y secretan muchos factores icónicos como la prolactina (PRL), la proteína 1 de unión al factor de crecimiento similar a la insulina (Igfbp1), etc. Los estudios han demostrado que la decidualización anormal es una de las razones clave para el fracaso de la implantación embrionaria, pero la causa de la decidualización anormal aún no está clara y necesita serdilucidada más 1,14.
El modelo de decidualización artificial de ratón es esencial para estudiar el proceso fisiológico y los mecanismos moleculares subyacentes a la decidualización. La decidualización artificial (DA) se refiere principalmente al proceso de decidualización endometrial establecido por métodos artificiales para simular el embarazo o el ciclo menstrual. En términos de morfología, hay poca diferencia general entre la decidualización del embarazo y la decidualización artificial15,16. Las glándulas uterinas existen en el endometrio antes de que se formen las deciduas y desaparecen después de la decidualización. En cuanto a la expresión génica, solo se identifica una ligera diferencia entre la decidualización natural del embarazo (NPD) y la AD15. En consecuencia, el modelo de decidualización artificial en ratones puede simular la decidualización del embarazo para explorar la patogénesis desconocida y el nuevo tratamiento de las enfermedades reproductivas humanas.
NPD, AD y decidualización in vitro (IVD) son tres métodos para lograr la decidualización del ratón. El modelo NPD depende del embarazo natural y es el más cercano al estado fisiológico materno, incluidos los efectos de los embriones. La comparación de las diferencias entre los sitios de implantación y no implantación es un enfoque más fisiológico y conveniente para estudiar la decidualización. El modelo AD se desarrolló mediante el uso de una inyección intrauterina de aceite de sésamo como estimulante para inducir la decidualización en una ratona hembra pseudoembarazada apareada con machos vasectomizados para evitar el impacto de los embriones. Tanto los modelos NPD como AD juegan un papel esencial en diferentes propósitos de investigación, pero no pueden evitar el fracaso del apareamiento y las diferencias dentro del grupo causadas por las diferentes actividades del metabolismo hormonal materno. IVD es un método que depende del tratamiento combinado de estrógeno y progesterona a nivel celular, que requiere condiciones experimentales y capacidad de operación más estrictas. Sin embargo, el modelo in vitro no puede simular completamente la respuesta decidual en condiciones fisiológicas15. Por lo tanto, proponemos un método de inducción simple y mejorado modificado de la EA tradicional para reducir el efecto de las hormonas endógenas en la decidualización. Basado en garantizar el éxito de la inducción de decidualización, está más cerca del estado fisiológico y es más adecuado para experimentos que necesitan excluir factores embrionarios.
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Protocol
Todos los experimentos con animales descritos fueron aprobados por el Comité sobre el Uso y Cuidado de Animales (No. 20171202) del Hospital Amateur Drum Tower del Hospital Afiliado de la Facultad de Medicina de la Universidad de Nanjing. Todas las operaciones siguen las pautas nacionales y de cuidado y uso de animales apropiados.
NOTA: Los ratones se criaron en un ambiente específico libre de patógenos (SPF), con una temperatura de 22 °C ± 1 °C, humedad relativa de 50% ± 1%, un ciclo de luz/oscuridad de 12 h/12 h, y libre acceso a alimentos y agua.
1. Ovariectomía en ratones
- Esterilice los instrumentos quirúrgicos con un esterilizador de alta temperatura y alta presión 1 día antes de la operación.
- Pesar ratones C57BL/6 de 8 semanas de edad e inyectar pentobarbital de sodio al 1% en consecuencia para anestesiar a los ratones. La dosis utilizada es de 40 mg/kg17. Esta dosis proporciona 40-60 minutos de sedación, que cumple con los requisitos de una ovariectomía. Para la analgesia preoperatoria, inyecte ratones con 5 mg/kg de meloxicam (s.c).
NOTA: La anestesia exitosa en ratones puede indicarse por la desaparición de los reflejos musculares profundos y la respiración constante. Los signos de anestesia exitosa incluyen no parpadear al tocar el canto interno, no tragar al tirar de la lengua, no doblar la pierna al pellizcar la piel entre los dedos de los pies y no rebotar al pinchar la cola. - Aplique el ungüento protector para los ojos en los globos oculares para evitar la sequedad durante la anestesia.
- Comience la operación cuando los ratones estén completamente anestesiados. Coloque y fije los ratones en posición prona en la superficie de operación, y afeite el pelo en la espalda después de mojarlos con agua jabonosa. Desinfecte la piel con etanol al 70% después del afeitado.
- Encuentre el sitio de la incisión de la operación a 0,5 cm (o 1,0 cm por debajo de la costilla) en el borde superior de la raíz del muslo de ambas extremidades posteriores paralelas a la columna vertebral (Figura 1A).
NOTA: Una ubicación correcta de la incisión es esencial para localizar rápidamente el ovario. - Tome el sitio de la incisión como centro y desinfecte el área de la incisión con yodóforo 3x, luego coloque una cortina quirúrgica alrededor del área de la incisión.
- Haga una incisión longitudinal de aproximadamente 0.5-1.0 cm con tijeras. Corte la fascia y separe pasivamente los músculos con pinzas.
- Encuentre un pedazo de la almohadilla de grasa blanca en el campo de incisión cerca del polo inferior del riñón a través de la capa muscular delgada (Figura 1B).
NOTA: La almohadilla de grasa blanca es el indicador más obvio de la ubicación del ovario. - Sujete la masa grasa con clips hemostáticos y saque el ovario envuelto por la almohadilla de grasa fuera de la incisión.
- Sujete la unión del ovario y la trompa de Falopio con pinzas curvas y retire el ovario a lo largo del pedículo ovárico con tijeras. Detenga el sangrado con una pluma de electrocoagulación o una aguja de una jeringa de 1 ml calentada en la lámpara de alcohol.
NOTA: Asegúrese de preservar la trompa de Falopio, que es el punto de referencia anatómico para la posterior inyección de aceite de sésamo en los cuernos uterinos. - Enjuague la incisión quirúrgica con solución salina normal para evitar la adhesión del tejido, use una sutura 4-0 para coser el músculo y la piel respectivamente, y desinfecte la incisión quirúrgica con yodóforo nuevamente.
- Coloque a los ratones en posición prona en la jaula y reanimarlos en una incubadora a 25 °C equipada con una fuente de luz y un sistema de ventilación durante aproximadamente 2 h.
- Preste atención a los ratones después de la operación, vuelva a colocarlos solos en el lugar de alimentación original hasta que se recuperen por completo y déles suficiente agua y comida.
2. Reposo postoperatorio y formulación de estrógenos y progesterona
- Asegúrese de que los ratones descansen durante 2 semanas después de la ovariectomía.
- En un gabinete ultralimpio, agregue estrógeno (2 ng / μL) y progesterona (0.2 ng / μL) en aceite de sésamo en tubos de centrífuga libres de enzimas de ARN.
- Coloque los tubos de la centrífuga en un baño de agua termostático a 37 °C y agite los tubos continuamente para acelerar la disolución.
- Después de la disolución completa, divida la solución de aceite de sésamo en aliqouts de 100 μL para un uso conveniente. Conservar las soluciones preparadas de estrógeno y progesterona en nevera a 4 °C.
3. Modelo de decidualización artificial inducida
- Por vía subcutánea (s.c) inyectar 100 ng de estrógeno en 50 μL de aceite de sésamo en cada ratón durante 3 días, seguido de 2 días de descanso15.
NOTA: Asegúrese de que el estrógeno y la progesterona se hayan formulado y colocado en diferentes lugares. Cualquier contaminación de estrógeno por progesterona puede conducir a la falla. - Inyecte (s.c.) 1 mg de progesterona y 10 ng de estrógeno en 50 μL de aceite de sésamo en cada ratón durante otros 3 días15.
- Operar los ratones para inducir el modelo de decidualización artificial15 6 h después de la tercera inyección combinada de estrógeno-progesterona.
- Encuentre el cuerno del útero en el extremo inferior de las trompas de Falopio e inyecte 20 μL de aceite de sésamo lentamente junto con el cuerno uterino, empuje el tejido hacia atrás, suture la incisión y permita que el ratón se recupere. El enfoque de la operación es el mismo que el de la ovariectomía de ratón15.
NOTA: Solo proceda con la segunda cirugía en caso de una ovariectomía exitosa (la incisión en la piel está bien curada, el ovario se extirpa por completo y el extremo residual de la trompa de Falopio no se adhiere a los tejidos circundantes).
NOTA: Para inducir el modelo de DA, 20 μL de aceite de sésamo es apropiado; más de 20 μL de aceite de sésamo penetrarán fácilmente en el otro lado. - Inyecte (s.c.) 50 μL de aceite de sésamo que contenga 1 mg de progesterona y 10 ng de estrógeno (H.) durante otros 4 días. Ver detalles en la Figura 215,18.
4. Recogida de muestras
- Eutanasia a los ratones (n = 6) por asfixia de dióxido de carbono y recoger el útero. Observe la forma del útero bilateral, tome fotos y pese los cuernos uterinos (Figura 3A, B).
- Fijar 3-5 mm del tejido del útero con 10% de formalina, incrustar en parafina y seccionarlos. Tinción de las secciones con hematoxilina y eosina para observar los cambios morfológicos19 (Figura 4A).
- Incrustar otros 3-5 mm del tejido del útero en un compuesto de temperatura de corte óptima (OCT), congelar en nitrógeno líquido y almacenar en un refrigerador de -80 ° C. Congelar la sección del tejido a 10 μm y detectar la actividad de la fosfatasa alcalina en el tejido uterino mediante el método de acoplamiento azoico20 (Figura 4B).
NOTA: Se pueden obtener resultados satisfactorios utilizando secciones congeladas para detectar el contenido de ALP, no secciones de parafina. - Extraer el ARN total del útero con el reactivo Trizol y realizar PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR) en un sistema de PCR en tiempo real (Tabla de materiales) con mezcla maestra de qPCR (Tabla de materiales) para detectar la expresión relativa de ARNm del miembro 2 de la subfamilia 2 de la familia 8 de prolactina (Prl8a2), fosfatasa alcalina hígado/hueso/riñón (Alpl) y proteína 1 de unión al factor de crecimiento similar a la insulina (Igfbp1)15 mediante normalización a niveles de ARNm 18S (Figura 4C-E ). Siga las condiciones de PCR: Etapa 1, 95 °C durante 30 s; Etapa 2, 95 °C durante 10 s y 60 °C durante 30 s; Repita el ciclo 40x. Una lista completa de secuencias de cebadores se proporciona en la Tabla 1.
- Analice los datos de qPCR utilizando el método 2-ΔΔCT y un método de prueba t para el análisis estadístico en el software apropiado. En este estudio, p < 0,05 fue considerado estadísticamente significativo.
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Representative Results
Los índices del modelo de decidualización del ratón incluyen la morfología general del útero, la relación de masa del útero decidualizado y no decidualizado, la morfología histológica del endometrio y el nivel de expresión de las moléculas marcadoras de decidualización. La morfología general del útero decidualizado artificial de ratones inducido por aceite es más cercana a la del útero en el embarazo. El cuerpo uterino se vuelve grueso y la cavidad uterina se vuelve más pequeña que el lado no inducido. El volumen y el peso del cuerno uterino inducido son significativamente mayores que los del lado no inducido (Figura 3A, B). La tinción HE del tejido uterino mostró que las glándulas desaparecen y las células del estroma endometrial en el cuerno inducido se diferencian en células deciduales grandes, redondas, citoplasmáticas y multinucleadas con límites celulares poco claros. Las secciones laterales no inducidas muestran la morfología del tejido endometrial en un estado fisiológico normal (Figura 4A). El resultado del método de acoplamiento azoico mostró que el contenido de fosfatasa alcalina del lado inducido por aceite fue significativamente mayor que el lado no inducido (Figura 4B). Los resultados de la qPCR mostraron que la expresión de ARNm de Prl8a2, Alpl e Igfbp1 en el cuerno inducido fue significativamente mayor que en el no inducido, lo que sugiere que el aceite puede inducir la decidualización artificial en ratones (Figura 4C-E).
Figura 1: La incisión operatoria de la ovariectomía de ratón. (A) Posición de la ovariectomía de ratón. (B) La posición del ovario del ratón durante la ovariectomía. (C) El sitio del ovario durante la ovariectomía. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: El procedimiento de la operación. Todo el procedimiento incluye la ovariectomía, el reposo postoperatorio, la inducción del modelo de decidualización artificial y la validación fenotípica. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Generación del modelo de decidualización artificial del ratón. (A) Imagen representativa de la decidualización artificial inducida por el petróleo. El útero del lado derecho no fue inyectado con aceite, llamado aceite (-). El útero del lado izquierdo fue inyectado con aceite, llamado aceite (+). (B) El peso del útero inyectado con o sin aceite. p < 0,001. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Validación del modelo de decidualización artificial del ratón. (A) Imagen representativa de HE de la decidualización artificial inducida por el petróleo. Barra de escala = 1 mm y 100 μm. (B) El método de acoplamiento azoico detectó la actividad de la fosfatasa alcalina de la decidua artificial. Barras de escala = 200 μm y 50 μm. (C) El nivel de expresión del ARNm de Prl8a2 se detectó mediante qPCR. * p < 0,05. (D) El nivel de expresión del ARNm de Alpl. ** p < 0,01. (E) El nivel de expresión del ARNm de Igfbp1. ** p < 0,01. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Igfbp1 Ratón qPCR-F | GCCCAACAGAAAGCAGGAGATG |
| Igfbp2 Ratón qPCR-R | GTAGACACACCAGCAGAGTCCA |
| Prl8a2 Ratón qPCR-F | ACCACAACCCATTCTCAGCTGG |
| Prl8a2 Ratón qPCR-R | TGTTCAGGTCCATGAGCTGGTG |
| Alpl Ratón qPCR-F | CCAGAAAGACACCTTGACTGTGG |
| Alpl Ratón qPCR-R | TCTTGTCCGTGTCGCTCACCAT |
| 18s Ratón qPCR-F | ATGGCCGTTCTTAGTTGGTG |
| 18s Ratón qPCR-R | CGGACATCTAAGGGCATCAC |
Tabla 1: Lista de secuencias de cebadores.
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Discussion
La decidualización en ratones es un proceso espontáneo que depende de la presencia de embriones, que es diferente de los humanos. Sin embargo, se ha encontrado que la estimulación artificial, como la inyección uterina de perlas de vidrio y la laceración uterina, puede inducir la decidualización del endometrio en lugar de embriones. Además, los investigadores encontraron que muchos factores podrían inducir deciduales o participar en la decidualización, como la inyección de hormonas esteroides, prostaglandinas y factores inhibidores del crecimiento en la cavidad uterina21. En comparación con los métodos de modelado anteriores, el modelo de ratón detallado aquí con ovariectomía, utilizando aceite de sésamo como estimulante, puede excluir los efectos del estrógeno y la progesterona producidos endógenamente. Por lo tanto, es económico y fácil de operar.
Los ovarios deben extirparse limpiamente para evitar el tejido ovárico residual, lo que afectará la posterior inducción de la decidualización. Este paso tiene como objetivo reducir los efectos del estrógeno endógeno y la progesterona producidos por los ovarios. Se debe evitar el daño a la trompa de Falopio porque se puede usar como un signo para buscar el útero al inyectar el aceite de sésamo en la cavidad uterina. Si se produce una adhesión abdominal o la extirpación de las trompas de Falopio, el operador debe prestar atención a distinguir el útero del intestino.
La fuga de aceite ocurre fácilmente en el proceso de inyección subcutánea. Se debe seleccionar la piel abdominal como un sitio de inyección subcutánea y evitar los pezones. Es necesario inyectar el aceite y sacar la aguja lentamente. Si la aguja no se puede extraer cuando el ratón está activo, resulta fácilmente en fugas. Uno debe presionar el sitio de la aguja con una bola de algodón por un momento para evitar fugas. Las inyecciones exógenas de estrógeno y progesterona se utilizaron en esta operación para mantener estables los niveles hormonales de los ratones antes de la operación de decidualización inductora. Este método de inyección simuló cambios hormonales en el período de periimplantación de ratones. Aquí, indujimos la decidualización después del segundo pico de estrógeno.
La clave del éxito de esta operación es la cantidad de aceite de sésamo inyectado. Demasiado aceite de sésamo penetrará en la cavidad del otro cuerno del útero. La insuficiencia de aceite de sésamo conducirá a una disminución de la respuesta de decidualización o una decidualización desigual a lo largo del útero, lo que dará lugar a diferencias experimentales inesperadas. Durante la operación, se debe insertar la aguja de la jeringa en la cavidad uterina al inyectar aceite de sésamo y tirar suavemente hacia adelante y hacia atrás para asegurarse de que la aguja esté en la cavidad uterina. Parte de la cavidad uterina se puede ver como transparente si se inyecta con éxito. Uno debe sujetar suavemente el pinchazo con pinzas durante aproximadamente 10 s para asegurarse de que esté cerrado, lo que puede evitar la fuga de aceite de sésamo después de sacar la aguja. Al mismo tiempo, empuje suavemente el cuerpo uterino hacia abajo con la aguja para que el aceite de sésamo se extienda uniformemente en la cavidad del útero.
El tratamiento postoperatorio y la reanimación son otras claves del éxito de este modelo. En primer lugar, mantener un ambiente estéril para la incisión durante la operación es esencial. Antes de que los ratones resuciten, desinfecte la incisión de la operación con yodóforo y cúbrala con un trozo de gasa médica para reducir la incidencia de infección. Después de la operación, los ratones necesitan metabolizar los anestésicos durante 2-3 h para recuperarse. Durante este período, los ratones deben colocarse en una incubadora a 25 ° C para recuperarse más rápido y evitar la hipotermia causada por la desinfección con alcohol al 70% y yodóforo. Uno debe prestar atención a la curación dentro de unos días después de la operación y manejar los tipos de complicaciones quirúrgicas a tiempo, como grietas en la incisión, hinchazón, ulceración, etc.
Prl8a2 y Alpl son los marcadores de decidualización más clásicos. Igfbp1 es también la proteína principal en células decidualizadas en ratones y se considera el marcador específico de decidualización en ratones. Los niveles de expresión de ARNm de Prl8a2, Alpl e Igfbp1 en el cuerno uterino inducido por aceite aumentan significativamente en comparación con el lado de control sin inyección de aceite. Además, la actividad de la fosfatasa alcalina en el lado inducido por el aceite es significativamente mayor que en el lado de control. Todos estos resultados indican el éxito del modelo de decidualización artificial15.
El modelo de decidualización artificial de ratón se puede utilizar para validar moléculas de infertilidad patógenas y proporcionar un buen modelo de validación para diagnosticar y tratar la infertilidad asociada con la decidualización endometrial anormal. Este modelo es útil para estudiar enfermedades reproductivas, como el aborto repetido y el fracaso repetido de la implantación. Se utiliza para estudiar el papel de los factores maternos en la implantación e invasión embrionaria. Este modelo de EA tiene buena seguridad, una alta tasa de éxito y resuelve la influencia de las hormonas endógenas. Sin embargo, es un proceso lento y muy exigente. Optimizaremos aún más nuestros métodos experimentales para facilitar la investigación.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores desean agradecer el apoyo de la Fundación Nacional de Ciencias de la Naturaleza de China (82001629, XQS), el Programa Juvenil de la Fundación de Ciencias Naturales de la Provincia de Jiangsu (BK20200116, XQS) y la Financiación de Investigación Postdoctoral de la Provincia de Jiangsu (2021K277B, XQS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Estrogen | Sigma | E2758 | Hormone supplement |
| Progesterone | Sigma | P0130 | Hormone supplement |
| Sesame oil | Sigma | S3547 | Hormone supplement |
| Sodium pentobarbital | Dainippon Sumitomo Pharma Co.,Ltd. | Anaesthesia | |
| Meloxicam injection | Qilu Animal Health Products Co., Ltd | Analgesia | |
| Alkaline phophatase stain kit(kaplow's/azo coupling method) | Solarbio | G1480 | Alkaline phophatase stain |
| Eosin | Servicebio | G1005-2 | HE stain |
| Hematoxylin | Servicebio | G1005-1 | HE stain |
| ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix | Vazyme | Q711-02 | qPCR |
| 70% ethanol | Lircon | ZH1120090 | Disinfect |
| Iodophor | Runzekang | RZK-DF | Disinfect |
| Erythromycin Eye Ointment | Guangzhou Baiyunshan | Mice eyeball protect | |
| 4-0 suture | Ethicon | W329 | Incision suture |
| 10% formalin | Yulu | L25010118 | Tissue fix |
| Optimal cutting temperature compound | Sakura | 4583 | Ssection |
| Trizol reagent | Ambion | 15596018 | qPCR |
References
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