Summary
在这里，我们描述了使用卵巢切除小鼠生成人工蜕膜化模型的方法，这是子宫内膜蜕膜化研究领域的经典子宫内膜蜕膜化实验。
Abstract
子宫内膜蜕膜化是子宫内膜独特的分化过程，与月经和怀孕密切相关。蜕膜化障碍导致各种子宫内膜疾病，如不孕、复发性流产和早产。子宫内膜蜕膜化模型在生殖研究中的开发和应用长期以来一直是生殖研究者的一大亮点。鼠标已被广泛用于研究繁殖和蜕膜化。关于蜕膜化，有三种成熟的小鼠模型，即自然妊娠蜕膜化（NPD），人工蜕膜化（AD）和 体外 蜕膜化（IVD）。其中，AD被认为是小鼠蜕膜化的可靠模型，易于实现且接近NPD。本文重点介绍了一种改进的小鼠人工蜕膜化模型的生成和应用方法，以避免卵巢效应，该方法可以获得组内方差小的可重复性结果。该方法为子宫内膜蜕膜化的研究提供了良好可靠的动物模型。
Introduction
随着人类辅助生殖技术的发展，目前体外受精-胚胎移植（IVF-ET）的临床妊娠率已经达到甚至超过自然妊娠。尽管如此，许多辅助生殖临床实践中的患者仍然接受多次胚胎移植，但未能如愿以偿。但其具体分子机制尚不明确，因此临床干预无效，是生殖医学面临的重大挑战之一1，2。
子宫内膜因素约占IVF失败原因的三分之二3。人类胚胎植入分为三个阶段：定位、粘附和侵袭4，5，6。母体子宫内膜经历一系列变化以满足胚胎的到来。形成植入“窗口期”为胚胎植入提供了有利条件7，8。
在大多数哺乳动物中，囊胚粘附在子宫的管腔上皮后，囊胚周围的基质细胞迅速开始增殖和分化，间充质的快速重塑改变了其形状和功能，导致胚胎着床5，9，10。部位体积和重量的快速增加使囊胚嵌入子宫基质中，这一过程称为蜕膜化11。子宫内膜基质在准备怀孕时分化和重塑，而基质细胞的过渡为蜕膜细胞提供空间和新的信号连接以执行其功能12，13。基质细胞转化为蜕膜细胞并分泌许多标志性因子，如催乳素（PRL）、胰岛素样生长因子结合蛋白1（Igfbp1）等。研究表明，蜕膜化异常是胚胎着床失败的关键原因之一，但蜕膜化异常的原因尚不清楚，需要进一步阐明1，14。
小鼠人工蜕膜化模型对于研究蜕膜化的生理过程和分子机制至关重要。人工蜕膜化（AD）主要是指通过人工方法建立的子宫内膜蜕膜化过程，以模拟怀孕或月经周期。在形态方面，妊娠蜕膜化和人工蜕膜化总体差异不大15，16。子宫腺在蜕膜形成之前存在于子宫内膜中，在蜕膜化后消失。关于基因表达，自然妊娠蜕膜化（NPD）和AD15之间仅略有差异。因此，小鼠人工蜕膜化模型可以模拟妊娠蜕膜化，探索人类生殖疾病的未知发病机制和新疗法。
NPD，AD和 体外 蜕膜化（IVD）是实现小鼠蜕膜化的三种方法。NPD模型依赖于自然怀孕，最接近母体的生理状态，包括胚胎的影响。比较植入和非植入部位之间的差异是研究蜕膜化的一种更生理、更方便的方法。AD模型是通过使用宫内注射芝麻油作为兴奋剂来诱导假怀孕雌性小鼠与输精管切除的雄性小鼠进行蜕膜化以避免胚胎的影响而开发的。NPD和AD模型在不同的研究目的中起着至关重要的作用，但它们无法避免母体激素代谢的不同活动引起的交配失败和组内差异。IVD是一种依赖于雌激素和孕酮联合在细胞水平上的治疗方法，需要更严格的实验条件和操作能力。然而， 体外 模型不能完全模拟生理条件下的蜕膜反应15。因此，我们提出了一种从传统AD改进而来的简单而改进的诱导方法，以减少内源性激素对蜕膜化的影响。在保证蜕膜化诱导成功的基础上，更接近生理状态，更适合需要排除胚胎因素的实验。
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Protocol
所有描述的动物实验均由南京大学医学院附属鼓楼医院动物使用与护理委员会（第20171202号）批准。所有操作均遵循适当的动物护理和使用机构以及国家准则。
注意：小鼠在特定的无病原体（SPF）环境中饲养，温度为22°C±1°C，相对湿度为50%±1%，光照/黑暗循环为12小时/ 12小时，并且可以自由获取食物和水。
1.小鼠卵巢切除术
- 手术前1天用高温高压灭菌器对手术器械进行消毒。
- 称量8周龄C57BL / 6小鼠，腹膜内（ip）相应地注射1%戊巴比妥钠以麻醉小鼠。使用的剂量为40毫克/千克17。该剂量提供40-60分钟的镇静，符合卵巢切除术的要求。对于术前镇痛，向小鼠注射5mg / kg美洛昔康（sc）。
注意：小鼠的成功麻醉可以通过深部肌肉反射的消失和稳定的呼吸来表示。成功麻醉的迹象包括触摸内眦时不眨眼，拉舌头时不吞咽，捏脚趾之间的皮肤时不弯曲腿，针刺尾巴时没有弹跳。 - 将保护性眼膏涂抹在眼球上，以防止麻醉期间干燥。
- 当小鼠完全麻醉时开始手术。将小鼠置于操作表面上的俯卧位置并固定，并用肥皂水润湿后剃掉背部的毛发。剃须后用70%乙醇消毒皮肤。
- 在平行于脊柱的双后肢大腿根部上缘0.5厘米（或肋骨下方1.0厘米）处找到手术切口部位（图1A）。
注意：正确的切口位置对于快速定位卵巢至关重要。 - 以切口部位为中心，用碘伏3x对切口区域进行消毒，然后在切口区域周围放置手术单。
- 用剪刀做一个约0.5-1.0厘米的纵向切口。切开筋膜并用镊子被动地分开肌肉。
- 通过薄肌肉层在靠近肾脏下极的切口区域找到一块白色脂肪垫（图1B）。
注意：白色脂肪垫是卵巢位置最明显的指标。 - 用止血夹夹住脂肪块，并将脂肪垫包裹的卵巢从切口中拉出。
- 用弯曲的镊子夹住卵巢和输卵管的连接处，并用剪刀沿着卵巢蒂取出卵巢。使用电凝笔或在酒精灯上加热的 1 mL 注射器的针头止血。
注意：一定要保留输卵管，这是随后将芝麻油注入子宫角的解剖标志。 - 用生理盐水冲洗手术切口以防止组织粘连，用4-0缝合线分别缝合肌肉和皮肤，再次用碘伏消毒手术切口。
- 将小鼠置于笼子中的俯卧位，并在配备有光源和通风系统的25°C培养箱中复苏约2小时。
- 手术后注意小鼠，将它们单独放回原来的喂食地点，直到它们完全恢复，并给它们足够的水和食物。
2.术后休息和雌激素和孕酮制剂
- 确保小鼠在卵巢切除术后休息2周。
- 在超净柜中，将雌激素 （2 ng/μL） 和孕酮 （0.2 ng/μL） 添加到 RNA 无酶离心管中的芝麻油中。
- 将离心管置于37°C的恒温水浴中，并连续摇动管以加速溶解。
- 完全溶解后，将芝麻油溶液分成 100 μL 等分，以方便使用。将制备好的雌激素和黄体酮溶液储存在4°C的冰箱中。
3.诱导人工蜕膜化模型
- 皮下（皮下）将100ng雌激素在50μL芝麻油中注射到每只小鼠中3天，然后休息2天15天。
注意：确保雌激素和黄体酮已配制并放置在不同的地方。黄体酮对雌激素的任何污染都可能导致失败。 - 将（sc.c.）1mg黄体酮和10ng雌激素在50μL芝麻油中注射到每只小鼠中，再注射3天15。
- 操作小鼠在第三次雌激素 - 孕酮联合注射后15 6小时诱导人工蜕膜化模型。
- 在输卵管下端找到子宫角，沿子宫角缓慢注射20μL芝麻油，将组织推回，缝合切口，让小鼠恢复。手术方法与小鼠卵巢切除术15相同。
注意：只有在卵巢切除术成功的情况下进行第二次手术（皮肤切口愈合良好，卵巢完全切除，输卵管的残余端不粘附在周围组织上）。
注意：对于诱导AD模型，20μL芝麻油是合适的;超过 20 μL 的芝麻油很容易穿透另一侧。 - 注射（sc.c.）50μL含有1mg黄体酮和10ng雌激素（H.）的芝麻油，再注射4天。详见 图215，18。
4. 样品采集
- 通过二氧化碳窒息对小鼠（n = 6）实施安乐死并收集子宫。观察双侧子宫的形状，拍照并称量子宫角（图3A，B）。
- 用10%福尔马林固定3-5毫米的子宫组织，嵌入石蜡中，并切片。用苏木精和伊红染色切片以观察形态变化19 （图4A）。
- 将另外3-5毫米的子宫组织嵌入最佳切割温度化合物（OCT）中，在液氮中冷冻，并储存在-80°C冰箱中。将组织冷冻切片至10μm，并通过偶氮偶联方法20 检测子宫组织中的碱性磷酸酶活性（图4B）。
注意：使用冷冻切片检测ALP含量，而不是石蜡切片，可以获得令人满意的结果。 - 用Trizol试剂提取子宫的总RNA，并在带有qPCR预混液（材料表）的实时PCR系统（材料表）上进行定量实时PCR（qPCR），以检测催乳素家族8亚家族成员2（Prl8a2），碱性磷酸酶肝/骨/肾（Alpl）和胰岛素样生长因子结合蛋白1（Igfbp1）15的相对mRNA表达，通过标准化为18S mRNA水平（图4C-E).遵循PCR条件：第1阶段，95°C持续30秒;第2阶段，95°C持续10秒，60°C持续30秒;重复循环40倍。引物序列的完整列表见表1。
- 使用2-ΔΔCT 方法和t检验方法分析qPCR数据，以便在适当的软件中进行统计分析。在这项研究中，p < 0.05被认为具有统计学意义。
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Representative Results
小鼠蜕膜化模型指标包括子宫的一般形态、蜕膜化和非蜕膜化子宫的质量比、子宫内膜的组织学形态、蜕膜化标志物分子的表达水平。油诱导小鼠人工蜕膜子宫的一般形态更接近妊娠期子宫。子宫体变厚，子宫腔比非诱导侧小。诱导子宫角的体积和重量明显高于非诱导侧（图3A，B）。子宫组织HE染色显示，腺体消失，诱导角上的子宫内膜基质细胞分化为大、圆形、细胞质和多核蜕膜细胞，细胞边界不明确。非诱导侧切片显示正常生理状态下的子宫内膜组织形态（图4A）。偶氮偶联法的结果表明，油诱导侧的碱性磷酸酶含量明显高于非诱导侧（图4B）。qPCR结果显示，诱导角中Prl8a2、Alpl和Igfbp1的mRNA表达显著高于非诱导角，表明油可以诱导小鼠人工蜕膜化（图4C-E）。
图1：小鼠卵巢切除术的手术切口 。 （A）小鼠卵巢切除术位置。（B）卵巢切除术中小鼠卵巢的位置。（C）卵巢切除术期间卵巢的位置。 请点击此处查看此图的大图。
图 2：操作过程。 整个过程包括卵巢切除术、术后休息、人工蜕膜化模型的诱导和表型验证。 请点击此处查看此图的大图。
图3：小鼠人工蜕膜化模型的生成 。 （A）油诱导人工蜕膜化的代表性图片。右侧子宫没有注射油，称为油（-）。左侧子宫被注射油，称为油（+）。（B）注射或不注射油的子宫重量。p < 0.001。 请点击此处查看此图的大图。
图 4：小鼠人工蜕膜化模型的验证。 （A）油诱导人工蜕膜化的代表性HE图。比例尺 = 1 mm 和 100 μm。 （B）偶氮偶联法检测人工蜕膜碱性磷酸酶活性。比例尺= 200 μm和50 μm。 （C）通过qPCR检测Prl8a2 mRNA的表达水平。* <0.05。（D）Alpl mRNA的表达水平。** p < 0.01。（E）Igfbp1 mRNA的表达水平。** p < 0.01。请点击此处查看此图的大图。
| Igfbp1 小鼠 qPCR-F | GCCCAACAGAAAGCAGGAGAGATG |
| Igfbp2 小鼠 qPCR-R | 格塔加卡加加格特卡 |
| Prl8a2 小鼠 qPCR-F | ACCACAACCCATTCTCAGCTGG |
| Prl8a2 小鼠 qPCR-R | TGTTCAGGTCCATGAGCTGGTG |
| 阿尔普尔小鼠 qPCR-F | CCAGAAAGACACCTTGACTGTGG |
| 阿尔普尔小鼠 qPCR-R | TCTTGTCCGTGTCGCTCACCAT |
| 18s 鼠标 qPCR-F | ATGGCCGTTCTTAGTTGGTG |
| 18s 小鼠 qPCR-R | CGGACATCTAAGGGCATCAC |
表1：引物序列列表。
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Discussion
小鼠的蜕膜化是一个自发的过程，取决于胚胎的存在，这与人类不同。然而，已经发现人工刺激，如子宫注射玻璃珠和子宫撕裂，可以诱导子宫内膜而不是胚胎的蜕膜化。此外，研究人员发现，许多因素可以诱导蜕膜或参与蜕膜化，例如将类固醇激素，前列腺素和生长抑制因子注射到子宫腔中21。与上述建模方法相比，这里详述的卵巢切除术小鼠模型，使用芝麻油作为兴奋剂，可以排除雌激素和孕激素内源性产生的影响。因此，它经济且易于操作。
卵巢应干净地切除，以防止残留的卵巢组织，这会影响随后蜕膜化的诱导。此步骤旨在减少卵巢产生的内源性雌激素和黄体酮的影响。应避免输卵管损伤，因为在将芝麻油注入子宫腔时，它可以用作寻找子宫的标志。如果发生腹腔粘连或输卵管切除，操作者必须注意区分子宫和肠道。
皮下注射过程中容易发生漏油。应选择腹部皮肤作为皮下注射部位，避免使用。有必要注入油并慢慢拔出针头。如果鼠标活动时无法拔出针头，则很容易导致泄漏。应用棉球按压针头部位片刻，防止漏水。在该操作中使用外源性雌激素和孕激素注射，以在诱导蜕膜化操作之前保持小鼠的激素水平稳定。该注射方法模拟小鼠着床周围期的激素变化。本文在第二个雌激素峰后诱导了蜕膜化。
这个手术成功的关键是注入的芝麻油量。过多的芝麻油会穿透子宫另一角的腔。芝麻油不足会导致蜕膜化反应降低或沿子宫蜕膜化不均匀，导致意想不到的实验差异。在手术过程中，注射香油时应将注射器针头插入子宫腔，并轻轻来回拉动，以确保针头在子宫腔内。如果注射成功，部分子宫腔可以被视为透明。应用镊子轻轻夹住针刺约10秒，确保闭合，可防止拔出针头后芝麻油泄漏。同时，用针头轻轻向下推子宫体，使香油均匀地散布在子宫腔内。
术后治疗和复苏是该模型成功的其他关键。首先，在手术过程中保持切口的无菌环境至关重要。在小鼠复苏之前，用碘伏对手术切口进行消毒，并用一块医用纱布覆盖，以减少感染的发生率。手术后，小鼠需要代谢麻醉剂2-3小时才能恢复。在此期间，需要将小鼠放入25°C培养箱中，以更快地恢复，并避免用70%酒精和碘酒消毒引起的体温过低。术后几天内应注意愈合情况，及时处理切口开裂、肿胀、溃疡等各种手术并发症。
Prl8a2 和 Alpl 是最经典的蜕膜化标记。Igfbp1也是小鼠蜕膜化细胞中的主要蛋白质，被认为是小鼠蜕膜化的特异性标志物。与未注油的对照侧相比，油诱导子宫角中 Prl8a2， Alpl和 Igfbp1 mRNA的表达水平显着增加。此外，油诱导侧的碱性磷酸酶活性明显高于对照侧。这些结果都表明人工蜕膜化模型15的成功。
小鼠人工蜕膜化模型可用于验证致病性不孕分子，为诊断和治疗与子宫内膜蜕膜化异常相关的不孕症提供良好的验证模型。该模型可用于研究生殖疾病，例如反复流产和反复植入失败。它用于研究母体因素在胚胎植入和侵袭中的作用。该AD模型安全性好，成功率高，解决了内源性激素的影响。然而，这是一个耗时且要求很高的过程。我们将进一步优化我们的实验方法，以促进研究。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
笔者希望感谢国家自然科学基金（82001629，XQS）、江苏省自然科学基金青年计划（BK20200116，XQS）和江苏省博士后科研基金（2021K277B，XQS）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Estrogen | Sigma | E2758 | Hormone supplement |
| Progesterone | Sigma | P0130 | Hormone supplement |
| Sesame oil | Sigma | S3547 | Hormone supplement |
| Sodium pentobarbital | Dainippon Sumitomo Pharma Co.,Ltd. | Anaesthesia | |
| Meloxicam injection | Qilu Animal Health Products Co., Ltd | Analgesia | |
| Alkaline phophatase stain kit(kaplow's/azo coupling method) | Solarbio | G1480 | Alkaline phophatase stain |
| Eosin | Servicebio | G1005-2 | HE stain |
| Hematoxylin | Servicebio | G1005-1 | HE stain |
| ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix | Vazyme | Q711-02 | qPCR |
| 70% ethanol | Lircon | ZH1120090 | Disinfect |
| Iodophor | Runzekang | RZK-DF | Disinfect |
| Erythromycin Eye Ointment | Guangzhou Baiyunshan | Mice eyeball protect | |
| 4-0 suture | Ethicon | W329 | Incision suture |
| 10% formalin | Yulu | L25010118 | Tissue fix |
| Optimal cutting temperature compound | Sakura | 4583 | Ssection |
| Trizol reagent | Ambion | 15596018 | qPCR |
References
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