Summary
Burada, endometrial desidualizasyon araştırma alanında klasik bir endometrial desidualizasyon deneyi olan ovariektomize fareyi kullanarak yapay bir desidualizasyon modeli oluşturma yöntemini açıklıyoruz.
Abstract
Endometrial desidualizasyon, menstrüasyon ve gebelik ile yakından ilişkili olan endometriyumun benzersiz bir farklılaşma sürecidir. Desidualizasyonun bozulması infertilite, tekrarlayan düşük ve erken doğum gibi çeşitli endometriyal bozukluklara yol açar. Endometriyal desidualizasyon modelinin üreme çalışmalarında geliştirilmesi ve kullanılması, üreme araştırmacıları için uzun zamandır bir vurgu olmuştur. Fare, üreme ve desidualizasyonu incelemek için yaygın olarak kullanılmıştır. Desidualizasyon ile ilgili üç köklü fare modeli vardır, yani doğal gebelik desidualizasyonu (NPD), yapay desidualizasyon (AD) ve in vitro desidualizasyon (IVD). Bunlar arasında AD, uygulanması kolay ve NPD'ye yakın olan fare desidualizasyonu için güvenilir bir model olarak kabul edilir. Bu yazıda, yumurtalık etkilerinden kaçınmak için yumurtalık etkilerinden kaçınmak için fare yapay desidualizasyon modelinin yumurtalık ile oluşturulması ve uygulama sürecinin modifiye edilmiş bir yöntemine odaklanılmıştır, bu da grup içinde küçük varyanslarla yüksek oranda tekrarlanabilir sonuçlar elde edebilir. Bu yöntem, endometrial desidualizasyon çalışması için iyi ve güvenilir bir hayvan modeli sağlar.
Introduction
İnsan destekli üreme teknolojisinin gelişmesiyle birlikte, in vitro fertilizasyon-embriyo transferinin (IVF-ET) mevcut klinik gebelik oranı, doğal gebeliğin seviyesine ulaşmış veya hatta aşmıştır. Buna rağmen, yardımcı üreme klinik pratiğindeki birçok hasta hala çoklu embriyo transferlerine maruz kalmaktadır, ancak istenildiği gibi gebelik elde edememektedir. Bununla birlikte, spesifik moleküler mekanizması hala belirsizdir, bu nedenle klinik müdahale etkisizdir, bu da üreme tıbbının karşılaştığı önemli zorluklardan biridir 1,2.
Endometriyal faktörler, IVF başarısızlığının nedenlerinin yaklaşık üçte ikisini oluşturur3. İnsan embriyosu implantasyonu üç aşamaya ayrılır: konumlandırma, yapışma ve istila 4,5,6. Maternal endometriyum, embriyonun gelişini karşılamak için bir dizi değişikliğe uğrar. İmplantasyon "pencere dönemi" oluşturmak, embriyo implantasyonu için uygun koşullar sağlar 7,8.
Çoğu memelide, blastosist uterusun luminal epiteline yapıştıktan sonra, blastosisti çevreleyen stromal hücreler hızla çoğalmaya ve farklılaşmaya başlar ve mezenkimin hızlı bir şekilde yeniden şekillenmesi şeklini ve işlevini değiştirerek embriyo implantasyonuna yol açar 5,9,10. Site hacmindeki ve ağırlığındaki hızlı artış, blastosistin desidualizasyon11 olarak bilinen bir süreç olan uterus stromasına gömülmesine izin verir. Endometriyal stroma gebeliğe hazırlık aşamasında farklılaşır ve yeniden şekillenirken, stromal hücrelerin geçişi, desidual hücrelerin işlevlerini yerine getirmeleri için alan ve yeni sinyal bağlantıları sağlar12,13. Stromal hücreler desidual hücrelere dönüşür ve prolaktin (PRL), insülin benzeri büyüme faktörü bağlayıcı protein 1 (Igfbp1) gibi birçok ikonik faktör salgılar. Çalışmalar, anormal desidualizasyonun embriyo implantasyon başarısızlığının temel nedenlerinden biri olduğunu göstermiştir, ancak anormal desidualizasyonun nedeni hala belirsizdir ve daha fazla aydınlatılması gerekmektedir 1,14.
Fare yapay desidualizasyon modeli, desidualizasyonun altında yatan fizyolojik süreci ve moleküler mekanizmaları incelemek için gereklidir. Yapay desidualizasyon (AD) esas olarak hamileliği veya adet döngüsünü simüle etmek için yapay yöntemlerle kurulan endometrial desidualizasyon sürecini ifade eder. Morfoloji açısından, gebelik desidualizasyonu ile yapay desidualizasyon arasında genel olarak çok az fark vardır15,16. Rahim bezleri desidua oluşmadan önce endometriyumda bulunur ve desidualizasyondan sonra kaybolur. Gen ekspresyonu ile ilgili olarak, doğal gebelik desidualizasyonu (NPD) ile AD15 arasında sadece küçük bir fark tespit edilmiştir. Sonuç olarak, farelerdeki yapay desidualizasyon modeli, bilinmeyen patogenezi ve insan üreme hastalıklarının yeni tedavisini araştırmak için gebelik desidualizasyonunu simüle edebilir.
NPD, AD ve in vitro desidualizasyon (IVD), fare desidualizasyonunu elde etmek için üç yöntemdir. NPD modeli doğal gebeliğe bağlıdır ve embriyoların etkileri de dahil olmak üzere maternal fizyolojik duruma en yakın olanıdır. İmplantasyon ve implantasyon dışı bölgeler arasındaki farkları karşılaştırmak, desidualizasyonu incelemek için daha fizyolojik ve uygun bir yaklaşımdır. AD modeli, embriyoların etkisinden kaçınmak için vazektomize erkeklerle çiftleştirilmiş sahte hamile bir dişi farede desidualizasyonu indüklemek için uyarıcı olarak intrauterin susam yağı enjeksiyonu kullanılarak geliştirilmiştir. Hem NPD hem de AD modelleri farklı araştırma amaçlarında önemli roller oynar, ancak çiftleşme başarısızlığından ve maternal hormon metabolizmasının farklı aktivitelerinin neden olduğu grup içi farklılıklardan kaçınamazlar. IVD, östrojen ve progesteronun kombine tedavisine hücresel düzeyde bağlı, daha sıkı deneysel koşullar ve ameliyat yeteneği gerektiren bir yöntemdir. Bununla birlikte, in vitro model, fizyolojik koşullar altında desidual yanıtı tam olarak simüle edemez15. Bu nedenle, endojen hormonların desidualizasyon üzerindeki etkisini azaltmak için geleneksel AD'den modifiye edilmiş basit ve geliştirilmiş bir indüksiyon yöntemi öneriyoruz. Desidualizasyon indüksiyonunun başarısını sağlamaya dayanarak, fizyolojik duruma daha yakındır ve embriyo faktörlerini dışlaması gereken deneyler için daha uygundur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Açıklanan tüm hayvan deneyleri, Nanjing Üniversitesi Tıp Fakültesi Hayvanların Kullanımı ve Bakımı Komitesi (No. 20171202) Bağlı Davul Kulesi Hastanesi tarafından onaylanmıştır. Tüm operasyonlar uygun hayvan bakımına ve kullanım ajansına ve ulusal yönergelere uygundur.
NOT: Fareler, 22 °C ± 1 °C sıcaklıkta,% 50 ±% 1 bağıl nem, 12 saat / 12 saatlik bir aydınlık / karanlık döngüsü ve yiyecek ve suya serbest erişim ile belirli bir patojensiz (SPF) ortamda yetiştirilmiştir.
1. Fare ovariektomi
- Ameliyattan 1 gün önce cerrahi aletleri yüksek sıcaklık ve yüksek basınçlı sterilizatör ile sterilize edin.
- 8 haftalık C57BL/6 fareleri tartın ve intraperitoneal olarak (i.p) fareleri uyuşturmak için buna göre% 1 sodyum pentobarbital enjekte edin. Kullanılan doz 40 mg/kg17'dir. Bu doz, yumurtalık ameliyathanesinin gereksinimlerini karşılayan 40-60 dakikalık sedasyon sağlar. Ameliyat öncesi analjezi için, farelere 5 mg / kg meloksikam (s.c) enjekte edin.
NOT: Farelerde başarılı anestezi, derin kas reflekslerinin ortadan kalkması ve sabit nefes alma ile belirtilebilir. Başarılı anestezi belirtileri arasında iç kanthusa dokunurken göz kırpma, dili çekerken yutkunma, cildi ayak parmakları arasında sıkıştırırken bacak bükülmesi ve kuyruğu iğnelerken zıplama olmaması sayılabilir. - Anestezi sırasında kuruluğu önlemek için koruyucu göz merhemini göz kürelerine uygulayın.
- Fareler tamamen uyuşturulduğunda operasyona başlayın. Fareleri çalışma yüzeyindeki eğilimli pozisyona yerleştirin ve sabitleyin ve saçları sabunlu suyla ıslattıktan sonra arkada tıraş edin. Tıraştan sonra cildi %70 etanol ile dezenfekte edin.
- Ameliyat kesi yerini, omurgaya paralel her iki arka ekstremitenin uyluk kökünün üst kenarında 0,5 cm (veya kaburganın 1,0 cm altında) bulun (Şekil 1A).
NOT: Yumurtalık hızlı bir şekilde lokalize olmak için doğru bir insizyon yeri şarttır. - Kesi bölgesini merkez olarak alın ve kesi alanını iodophor 3x ile dezenfekte edin, ardından kesi alanının etrafına cerrahi bir örtü yerleştirin.
- Makas kullanarak yaklaşık 0.5-1.0 cm'lik uzunlamasına bir kesi yapın. Fasyayı kesin ve kasları cımbızla pasif olarak ayırın.
- İnce kas tabakasından böbreğin alt kutbuna yakın kesi alanında beyaz yağ yastığının bir parçasını bulun (Şekil 1B).
NOT: Beyaz yağ yastığı, yumurtalık yerinin en belirgin göstergesidir. - Yağ kütlesini hemostatik klipslerle sıkıştırın ve yağ yastığı tarafından sarılmış yumurtalıkları insizyondan çekin.
- Yumurtalık ve fallop tüpünün birleşme noktasını kavisli cımbızla kelepçeleyin ve yumurtalık pedikülü boyunca yumurtalıkları makasla çıkarın. Bir elektrokoagülasyon kalemi veya alkol lambasında ısıtılmış 1 mL'lik bir şırınga iğnesi kullanarak kanamayı durdurun.
NOT: Susam yağının uterus boynuzlarına daha sonra enjekte edilmesi için anatomik dönüm noktası olan fallop tüpünü koruduğunuzdan emin olun. - Doku yapışmasını önlemek için cerrahi insizyonu normal salinle durulayın, sırasıyla kas ve cildi dikmek için 4-0'lık bir dikiş kullanın ve cerrahi insizyonu tekrar iyodofor ile dezenfekte edin.
- Fareleri kafeste yüzüstü konuma getirin ve yaklaşık 2 saat boyunca bir ışık kaynağı ve bir havalandırma sistemi ile donatılmış 25 ° C'lik bir inkübatörde canlandırın.
- Ameliyattan sonra farelere dikkat edin, tamamen iyileşene kadar onları orijinal beslenme yerine geri koyun ve onlara yeterli su ve yiyecek verin.
2. Postoperatif istirahat ve östrojen ve progesteron formülasyonu
- Farelerin yumurtalık ameliyatından sonra 2 hafta dinlendiğinden emin olun.
- Ultra temiz bir kabinde, RNA enzimsiz santrifüj tüplerinde susam yağına östrojen (2 ng / μL) ve progesteron (0.2 ng / μL) ekleyin.
- Santrifüj tüplerini 37 °C'de termostatik bir su banyosuna yerleştirin ve çözünmeyi hızlandırmak için tüpleri sürekli sallayın.
- Tamamen çözündükten sonra, rahat kullanım için susam yağı çözeltisini 100 μL aliqouts'a bölün. Hazırlanan östrojen ve progesteron çözeltilerini buzdolabında 4 ° C'de saklayın.
3. İndüklenmiş yapay desidualizasyon modeli
- Subkutan olarak (s.c), 3 gün boyunca her fareye 50 μL susam yağı içinde 100 ng östrojen enjekte edin, ardından 2 gün dinlenme15.
NOT: Östrojen ve progesteronun formüle edildiğinden ve farklı yerlere yerleştirildiğinden emin olun. Östrojenin progesteron ile kontaminasyonu başarısızlığa yol açabilir. - Her fareye 3 gün daha15 gün boyunca 50 μL susam yağı içinde 1 mg progesteron ve 10 ng östrojen enjekte edin (s.c.)
- Üçüncü östrojen-progesteron kombine enjeksiyonundan15 6 saat sonra yapay desidualizasyon modelini indüklemek için fareleri çalıştırın.
- Fallop tüplerinin alt ucundaki uterus boynuzunu bulun ve uterus boynuzu ile birlikte yavaşça 20 μL susam yağı enjekte edin, dokuyu geri itin, insizyonu dikin ve farenin iyileşmesine izin verin. Operasyona yaklaşım fare ovariektomi15 ile aynıdır.
NOT: Başarılı bir yumurtalık ameliyatı durumunda sadece ikinci ameliyata devam edin (cilt insizyonu iyi iyileşir, yumurtalık tamamen eksize edilir ve fallop tüpünün kalan ucu çevre dokulara yapışmaz).
NOT: AD modelini indüklemek için 20 μL susam yağı uygundur; 20 μL'den fazla susam yağı diğer tarafa kolayca nüfuz edecektir. - 4 gün daha 1 mg progesteron ve 10 ng östrojen (H.) içeren 50 μL susam yağı enjekte edin (s.c.) Ayrıntılara Şekil 215,18'deki bakınız.
4. Örnek toplama
- Fareleri (n = 6) karbondioksit boğulması ile ötenazi yapın ve uterusu toplayın. İki taraflı uterinin şeklini gözlemleyin, fotoğraf çekin ve uterus boynuzlarını tartın (Şekil 3A, B).
- Rahim dokusunun 3-5 mm'sini %10 formalin ile sabitleyin, parafine gömün ve kesitleyin. Morfolojik değişiklikleri gözlemlemek için kesitleri hematoksilin ve eozin ile lekeleyin19 (Şekil 4A).
- Rahim dokusunun 3-5 mm'sini daha optimum kesme sıcaklığı bileşiğine (OCT) gömün, sıvı azotta dondurun ve -80 ° C'lik bir buzdolabında saklayın. Dondurulmuş doku 10 μm'ye kadar kesitlenir ve azo kuplaj yöntemi20 ile uterus dokusundaki alkalen fosfataz aktivitesi tespit edilir (Şekil 4B).
NOT: ALP içeriğini tespit etmek için dondurulmuş kesitler kullanılarak tatmin edici sonuçlar elde edilebilir, parafin kesitleri değil. - Trizol reaktifi ile uterusun toplam RNA'larını çıkarın ve prolaktin ailesi 8 alt aile üyesi 2 (Prl8a2), alkali fosfataz karaciğer / kemik / böbrek (Alpl) ve insülin benzeri büyüme faktörü bağlayıcı protein 1 (Igfbp1)15'in göreceli mRNA ekspresyonunu 18S mRNA seviyelerine normalleştirerek tespit etmek için qPCR ana karışımı (Malzeme Tablosu) ile gerçek zamanlı bir PCR sisteminde (qPCR) kantitatif gerçek zamanlı PCR (qPCR) gerçekleştirin (Şekil 4C-E ). PCR koşullarını takip edin: Aşama 1, 30 s için 95 °C; Aşama 2, 10 s için 95 °C ve 30 s için 60 °C; 40x döngüsünü tekrarlayın. Astar dizilerinin tam listesi Tablo 1'de verilmiştir.
- Uygun yazılımda istatistiksel analiz için 2-ΔΔCT yöntemini ve bir t-testi yöntemini kullanarak qPCR verilerini analiz edin. Bu çalışmada p < 0.05 istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Fare desidualizasyon modeli indeksleri, uterusun genel morfolojisini, desidualize ve desidualize olmayan uterusun kütle oranını, endometriyumun histolojik morfolojisini ve desidualizasyon belirteci moleküllerinin ekspresyon seviyesini içerir. Yağ tarafından indüklenen farelerin yapay desidualize uterusunun genel morfolojisi, hamilelikte uterusunkine daha yakındır. Uterus gövdesi kalınlaşır ve uterus boşluğu indüklenmeyen taraftan daha küçük hale gelir. İndüklenen uterus boynuzunun hacmi ve ağırlığı, indüklenmeyen tarafınkinden anlamlı derecede daha yüksektir (Şekil 3A, B). Rahim dokusunun HE boyanması, bezlerin kaybolduğunu ve indüklenen boynuzdaki endometrial stromal hücrelerin, belirsiz hücre sınırları olan büyük, yuvarlak, sitoplazmik ve çok çekirdekli desidual hücrelere farklılaştığını göstermiştir. İndüklenmeyen yan kesitler endometriyal doku morfolojisini normal fizyolojik bir durum altında gösterir (Şekil 4A). Azo kaplin yönteminin sonucu, yağla indüklenen tarafın alkalen fosfataz içeriğinin, indüklenmeyen taraftan önemli ölçüde daha yüksek olduğunu göstermiştir (Şekil 4B). qPCR sonuçları, indüklenen boynuzdaki Prl8a2, Alball ve Igfbp1'in mRNA ekspresyonunun, indüklenmemiş olandan önemli ölçüde daha yüksek olduğunu ve yağın farelerde yapay desidualizasyonu indükleyebileceğini düşündürdüğünü göstermiştir (Şekil 4C-E).
Resim 1: Fare ovariektominin operatif insizyonu . (A) Fare ovariektomi pozisyonu. (B) Yumurtalık ameliyatı sırasında fare yumurtalıklarının pozisyonu. (C) Yumurtalık ameliyatı sırasında yumurtalık bölgesi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: İşlemin prosedürü. Tüm prosedür ovariektomi, postoperatif istirahat, yapay desidualizasyon modelinin indüksiyonu ve fenotipik validasyonu içerir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Fare yapay desidualizasyon modelinin oluşturulması . (A) Petrol tarafından indüklenen yapay desidualizasyonun temsili resmi. Sağ taraftaki uterusa yağ (-) adı verilen yağ enjekte edilmedi. Sol taraftaki uterusa yağ (+) adı verilen yağ enjekte edildi. (B) Yağ ile veya yağ olmadan enjekte edilen uterusun ağırlığı. p < 0.001. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Fare yapay desidualizasyon modelinin doğrulanması . (A) Petrol tarafından indüklenen yapay desidualizasyonun temsili HE resmi. Ölçek Çubuğu = 1 mm ve 100 μm. (B) Azo kaplin yöntemi, yapay desiduanın alkalen fosfataz aktivitesini tespit etti. Ölçek çubukları = 200 μm ve 50 μm. (C) Prl8a2 mRNA'nın ekspresyon seviyesi qPCR ile tespit edildi. * p < 0.05. (D) Alpl mRNA'nın ekspresyon seviyesi. ** p < 0.01. (E) Igfbp1 mRNA'nın ekspresyon seviyesi. ** p < 0.01. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
| Igfbp1 Fare qPCR-F | GCCCAACAGAAAGCAGGAGATG |
| Igfbp2 Fare qPCR-R | GTAGACACACCAGCAGAGTCCA |
| Prl8a2 Fare qPCR-F | ACCACAACCCATTCTCAGCTGG |
| Prl8a2 Fare qPCR-R | TGTTCAGGTCCATGAGCTGGTG |
| Alpl Fare qPCR-F | CCAGAAAGACACCTTGACTGTGG |
| Alpl Fare qPCR-R | TCTTGTCCGTGTCGCTCACCAT |
| 18s Fare qPCR-F | ATGGCCGTTCTTAGTTGGTG |
| 18s Fare qPCR-R | CGGACATCTAAGGGCATCAC |
Tablo 1: Astar dizilerinin listesi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Farelerde desidualizasyon, insanlardan farklı olan embriyoların varlığına bağlı olarak kendiliğinden bir süreçtir. Bununla birlikte, cam boncukların uterus enjeksiyonu ve uterus yırtılması gibi yapay stimülasyonun, embriyolar yerine endometriyumun desidualizasyonuna neden olabileceği bulunmuştur. Ek olarak, araştırmacılar, steroid hormonlarının, prostaglandinlerin ve büyüme inhibitör faktörlerin uterus boşluğuna enjekte edilmesi gibi birçok faktörün desidual indükleyebileceğini veya desidualizasyona katılabileceğini bulmuşlardır21. Yukarıdaki modelleme yöntemleriyle karşılaştırıldığında, burada uyarıcı olarak susam yağı kullanan ovariektomi ile detaylandırılan fare modeli, endojen olarak üretilen östrojen ve progesteronun etkilerini dışlayabilir. Bu nedenle ekonomik ve kullanımı kolaydır.
Yumurtalıklar, daha sonra desidualizasyonun indüksiyonunu etkileyecek olan artık yumurtalık dokusunu önlemek için temiz bir şekilde çıkarılmalıdır. Bu adım, yumurtalıklar tarafından üretilen endojen östrojen ve progesteronun etkilerini azaltmayı amaçlamaktadır. Fallop tüpünün zarar görmesinden kaçınılmalıdır, çünkü susam yağını uterus boşluğuna enjekte ederken uterusu aramak için bir işaret olarak kullanılabilir. Karın yapışıklığı veya fallop tüpü çıkarılması meydana gelirse, operatör uterusu bağırsaktan ayırt etmeye dikkat etmelidir.
Subkutan enjeksiyon sürecinde yağ sızıntısı kolayca meydana gelir. Karın derisini deri altı enjeksiyon bölgesi olarak seçmeli ve meme uçlarından kaçınmalıdır. Yağı enjekte etmek ve iğneyi yavaşça çıkarmak gerekir. Fare aktifken iğne dışarı çekilemezse, kolayca sızıntıya neden olur. Sızıntıyı önlemek için iğne bölgesine bir süre pamuk topu ile bastırılmalıdır. Bu operasyonda, indükleyici desidualizasyon operasyonundan önce farelerin hormon seviyelerini sabit tutmak için eksojen östrojen ve progesteron enjeksiyonları kullanıldı. Bu enjeksiyon yöntemi, farelerin peri-implantasyon dönemindeki hormon değişikliklerini simüle etti. Burada, ikinci östrojen zirvesinden sonra desidualizasyonu indükledik.
Bu işlemin başarısının anahtarı, enjekte edilen susam yağı miktarıdır. Çok fazla susam yağı, uterusun diğer boynuzunun boşluğuna nüfuz edecektir. Yetersiz susam yağı, desidualizasyon yanıtının azalmasına veya uterus boyunca düzensiz desidualizasyona yol açacak ve beklenmedik deneysel farklılıklara neden olacaktır. Operasyon sırasında, susam yağı enjekte edilirken şırınga iğnesini uterus boşluğuna sokmalı ve iğnenin uterus boşluğunda olduğundan emin olmak için yavaşça ileri geri çekilmelidir. Rahim boşluğunun bir kısmı başarılı bir şekilde enjekte edilirse şeffaf olarak görülebilir. Kapatıldığından emin olmak için iğneyi yaklaşık 10 saniye cımbızla hafifçe kelepçelemelisiniz, bu da iğneyi çıkardıktan sonra susam yağının sızmasını önleyebilir. Aynı zamanda, susam yağının uterus boşluğuna eşit şekilde yayılmasını sağlamak için uterus gövdesini iğne ile yavaşça aşağı doğru itin.
Ameliyat sonrası tedavi ve resüsitasyon, bu modelin başarısının diğer anahtarlarıdır. Öncelikle operasyon sırasında kesi için steril bir ortam bulundurulması esastır. Fareler yeniden canlandırılmadan önce, operasyon insizyonunu iyodofor ile dezenfekte edin ve enfeksiyon insidansını azaltmak için bir parça tıbbi gazlı bezle örtün. Ameliyattan sonra, farelerin iyileşmesi için anestezikleri 2-3 saat boyunca metabolize etmesi gerekir. Bu süre zarfında, daha hızlı iyileşmek ve% 70 alkol ve iyodofor ile dezenfeksiyonun neden olduğu hipotermiyi önlemek için farelerin 25 ° C'lik bir inkübatöre yerleştirilmesi gerekir. Ameliyattan sonraki birkaç gün içinde iyileşmeye dikkat edilmeli ve kesi çatlaması, şişme, ülserleşme gibi operatif komplikasyonları zamanında ele almalıdır.
Prl8a2 ve Alpl en klasik desidualizasyon belirteçleridir. Igfbp1 ayrıca farelerde desidualize hücrelerde ana proteindir ve farelerde desidualizasyonun spesifik belirteci olarak kabul edilir. Yağa bağlı uterus boynuzundaki Prl8a2, Alpl ve Igfbp1 mRNA'nın ekspresyon seviyeleri, yağ enjeksiyonu yapılmayan kontrol tarafına kıyasla önemli ölçüde artmıştır. Ayrıca, yağın indüklediği taraftaki alkalen fosfataz aktivitesi, kontrol tarafına göre önemli ölçüde daha yüksektir. Bu sonuçların hepsi yapay desidualizasyon modeli15'in başarısını göstermektedir.
Fare yapay desidualizasyon modeli, patojenik infertilite moleküllerini doğrulamak ve anormal endometrial desidualizasyon ile ilişkili infertiliteyi teşhis etmek ve tedavi etmek için iyi bir doğrulama modeli sağlamak için kullanılabilir. Bu model, tekrarlanan kürtaj ve tekrarlanan implantasyon başarısızlığı gibi üreme hastalıklarını incelemek için yararlıdır. Embriyo implantasyonu ve invazyonunda maternal faktörlerin rolünü incelemek için kullanılır. Bu AD modeli iyi bir güvenliğe, yüksek bir başarı oranına sahiptir ve endojen hormonların etkisini çözer. Ancak, zaman alıcı ve oldukça zorlu bir süreçtir. Araştırmayı kolaylaştırmak için deneysel yöntemlerimizi daha da optimize edeceğiz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.
Acknowledgments
Yazarlar, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (82001629, XQS), Jiangsu Eyaleti Doğa Bilimleri Vakfı Gençlik Programı (BK20200116, XQS) ve Jiangsu Eyaleti Doktora Sonrası Araştırma Fonu'ndan (2021K277B, XQS) destek almak istemektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Estrogen | Sigma | E2758 | Hormone supplement |
| Progesterone | Sigma | P0130 | Hormone supplement |
| Sesame oil | Sigma | S3547 | Hormone supplement |
| Sodium pentobarbital | Dainippon Sumitomo Pharma Co.,Ltd. | Anaesthesia | |
| Meloxicam injection | Qilu Animal Health Products Co., Ltd | Analgesia | |
| Alkaline phophatase stain kit(kaplow's/azo coupling method) | Solarbio | G1480 | Alkaline phophatase stain |
| Eosin | Servicebio | G1005-2 | HE stain |
| Hematoxylin | Servicebio | G1005-1 | HE stain |
| ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix | Vazyme | Q711-02 | qPCR |
| 70% ethanol | Lircon | ZH1120090 | Disinfect |
| Iodophor | Runzekang | RZK-DF | Disinfect |
| Erythromycin Eye Ointment | Guangzhou Baiyunshan | Mice eyeball protect | |
| 4-0 suture | Ethicon | W329 | Incision suture |
| 10% formalin | Yulu | L25010118 | Tissue fix |
| Optimal cutting temperature compound | Sakura | 4583 | Ssection |
| Trizol reagent | Ambion | 15596018 | qPCR |
References
- Carson, S. A., Kallen, A. N. Diagnosis and management of infertility: A review. JAMA. 326 (1), 65-76 (2021).
- Yatsenko, S. A., Rajkovic, A. Genetics of human female infertility dagger. Biology of Reproduction. 101 (3), 549-566 (2019).
- Sang, Y., Li, Y., Xu, L., Li, D., Du, M. Regulatory mechanisms of endometrial decidualization and pregnancy-related diseases. Acta Biochimica et Biophysica Sinica. 52 (2), 105-115 (2020).
- Ng, S. W., et al. Endometrial decidualization: The primary driver of pregnancy health. International Journal of Molecular Sciences. 21 (11), 4092 (2020).
- Birgit, G., Brosens, J. J. Cyclic decidualization of the human endometrium in reproductive health and failure. Endocrine Reviews. 35 (6), 851-905 (2014).
- Owusu-Akyaw, A., Krishnamoorthy, K., Goldsmith, L. T., Morelli, S. S. The role of mesenchymal-epithelial transition in endometrial function. Human Reproduction Update. 25 (1), 114-133 (2019).
- Paulson, E. E., Comizzoli, P. Endometrial receptivity and embryo implantation in carnivores-commonalities and differences with other mammalian species. Biology of Reproduction. 104 (4), 771-783 (2021).
- Kelleher, A. M., Milano-Foster, J., Behura, S. K., Spencer, T. E. Uterine glands coordinate on-time embryo implantation and impact endometrial decidualization for pregnancy success. Nature Communications. 9 (1), 2435 (2018).
- Tian, J., et al. Attenuated monoamine oxidase a impairs endometrial receptivity in women with adenomyosis via downregulation of FOXO1dagger. Biology of Reproduction. 105 (6), 1443-1457 (2021).
- Large, M. J., DeMayo, F. J. The regulation of embryo implantation and endometrial decidualization by progesterone receptor signaling. Molecular and Cellular Endocrinology. 358 (2), 155-165 (2012).
- Dunn, C. L., Kelly, R. W., Critchley, H. O. Decidualization of the human endometrial stromal cell: an enigmatic transformation. Reproductive BioMedicine Online. 7 (2), 151-161 (2003).
- Zhu, H., Hou, C. C., Luo, L. F., Hu, Y. J., Yang, W. X. Endometrial stromal cells and decidualized stromal cells: Origins, transformation and functions. Gene. 551 (1), 1-14 (2014).
- Jose, R. M., et al. Endometrial and decidual stromal precursors show a different decidualization capacity. Reproduction. 160 (1), 83-91 (2020).
- Pan-Castillo, B., et al. Morphophysical dynamics of human endometrial cells during decidualization. Nanomedicine. 14 (7), 2235-2245 (2018).
- Wang, C., et al. Comparative analysis of mouse decidualization models at the molecular level. Genes. 11 (8), 935 (2020).
- De Clercq, K., Hennes, A., Vriens, J. Isolation of mouse endometrial epithelial and stromal cells for in vitro decidualization. Journal of Visualized Experiments. (121), e55168 (2017).
- Kerger, H., et al. Microvascular oxygen delivery and interstitial oxygenation during sodium pentobarbital anesthesia. Anesthesiology. 86 (2), 372-386 (1997).
- Filant, J., Spencer, T. E. Endometrial glands are essential for blastocyst implantation and decidualization in the mouse uterus. Biology of Reproduction. 88 (4), 93 (2013).
- Sheng, X., et al. The mitochondrial protease LONP1 maintains oocyte development and survival by suppressing nuclear translocation of AIFM1 in mammals. EBioMedicine. 75, 103790 (2022).
- Grogg, E., Pearse, A. G. Coupling azo dye methods for histochemical demonstration of alkaline phosphatase. Nature. 170 (4327), 578-579 (1952).
- Labarta, E., et al. Analysis of serum and endometrial progesterone in determining endometrial receptivity. Human Reproduction. 36 (11), 2861-2870 (2021).
