Summary
यहां, हम ओवेरिक्टोमाइज्ड माउस का उपयोग करके एक कृत्रिम निर्णायक मॉडल उत्पन्न करने की विधि का वर्णन करते हैं, जो एंडोमेट्रियल निर्णय के अनुसंधान क्षेत्र में एक क्लासिक एंडोमेट्रियल निर्णय प्रयोग है।
Abstract
एंडोमेट्रियल निर्णय एंडोमेट्रियम की एक अनूठी भेदभाव प्रक्रिया है, जो मासिक धर्म और गर्भावस्था से निकटता से संबंधित है। निर्णय लेने की हानि विभिन्न एंडोमेट्रियल विकारों की ओर ले जाती है, जैसे बांझपन, आवर्तक गर्भपात और अपरिपक्व जन्म। प्रजनन अध्ययन में एंडोमेट्रियल निर्णय मॉडल का विकास और उपयोग लंबे समय से प्रजनन शोधकर्ताओं के लिए एक मुख्य आकर्षण रहा है। माउस का उपयोग बड़े पैमाने पर प्रजनन और निर्णय का अध्ययन करने में किया गया है। निर्णय के संबंध में तीन अच्छी तरह से स्थापित माउस मॉडल हैं, अर्थात् प्राकृतिक गर्भावस्था निर्णय (एनपीडी), कृत्रिम निर्णय (एडी), और इन विट्रो निर्णायककरण (आईवीडी)। उनमें से, एडी को माउस निर्णय के लिए एक विश्वसनीय मॉडल माना जाता है, जिसे लागू करना आसान है और एनपीडी के करीब है। यह पेपर डिम्बग्रंथि के प्रभावों से बचने के लिए ओवरेक्टोमी के साथ माउस कृत्रिम निर्णय मॉडल की पीढ़ी और आवेदन प्रक्रिया की एक संशोधित विधि पर केंद्रित है, जो समूह के भीतर छोटे भिन्नताओं के साथ अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम प्राप्त कर सकता है। यह विधि एंडोमेट्रियल निर्णय के अध्ययन के लिए एक अच्छा और विश्वसनीय पशु मॉडल प्रदान करती है।
Introduction
मानव-सहायता प्राप्त प्रजनन प्रौद्योगिकी के विकास के साथ, इन विट्रो निषेचन-भ्रूण हस्तांतरण (आईवीएफ-ईटी) की वर्तमान नैदानिक गर्भावस्था दर प्राकृतिक गर्भावस्था तक पहुंच गई है या उससे भी अधिक हो गई है। इसके बावजूद, सहायक प्रजनन नैदानिक अभ्यास में कई रोगी अभी भी कई भ्रूण स्थानांतरण से गुजरते हैं लेकिन वांछित गर्भावस्था को प्राप्त करने में विफल रहते हैं। हालांकि, इसका विशिष्ट आणविक तंत्र अभी भी स्पष्ट नहीं है, इसलिए नैदानिक हस्तक्षेप अप्रभावी है, जो प्रजनन चिकित्सा 1,2 का सामना करने वाली महत्वपूर्ण चुनौतियों में से एक है।
एंडोमेट्रियल कारक आईवीएफ विफलता के कारणों के लगभग दो-तिहाई के लिए जिम्मेदारहैं। मानव भ्रूण आरोपण को तीन चरणों में विभाजित किया गया है: स्थिति, आसंजन और आक्रमण 4,5,6। भ्रूण के आगमन को पूरा करने के लिए मातृ एंडोमेट्रियम परिवर्तनों की एक श्रृंखला से गुजरता है। एक आरोपण "खिड़की अवधि" बनाने से भ्रूण प्रत्यारोपण 7,8 के लिए अनुकूल परिस्थितियां प्रदान की जाती हैं।
अधिकांश स्तनधारियों में, ब्लास्टोसिस्ट के गर्भाशय के ल्यूमिनल एपिथेलियम का पालन करने के बाद, ब्लास्टोसिस्ट के आसपास की स्ट्रोमल कोशिकाएं तेजी से प्रसार और अंतर करना शुरू कर देती हैं, और मेसेनचाइम के तेजी से रीमॉडेलिंग से इसका आकार और कार्य बदल जाता है, जिससे भ्रूण प्रत्यारोपण 5,9,10 हो जाता है। साइट की मात्रा और वजन में तेजी से वृद्धि ब्लास्टोसिस्ट को गर्भाशय स्ट्रोमा में एम्बेडेड होने की अनुमति देती है, एक प्रक्रिया जिसे निर्णायक11 के रूप में जाना जाता है। एंडोमेट्रियल स्ट्रोमा गर्भावस्था की तैयारी में अंतर करता है और फिर से तैयार करता है, जबकि स्ट्रोमल कोशिकाओं का संक्रमण निर्णायक कोशिकाओं को अपनेकार्यों को करने के लिए स्थान और नए सिग्नलिंग कनेक्शन प्रदान करता है। स्ट्रोमल कोशिकाएं निर्णायक कोशिकाओं में बदल जाती हैं और प्रोलैक्टिन (पीआरएल), इंसुलिन जैसे विकास कारक-बाध्यकारी प्रोटीन 1 (आईजीएफबीपी 1), और इसी तरह जैसे कई प्रतिष्ठित कारकों का स्राव करती हैं। अध्ययनों से पता चला है कि असामान्य निर्णय भ्रूण प्रत्यारोपण विफलता के प्रमुख कारणों में से एक है, लेकिन असामान्य निर्णय का कारण अभी भी अस्पष्ट है और इसे और स्पष्ट करने की आवश्यकता है।
माउस कृत्रिम निर्णायक मॉडल शारीरिक प्रक्रिया और आणविक तंत्र अंतर्निहित निर्णय का अध्ययन करने के लिए आवश्यक है। कृत्रिम निर्णय (एडी) मुख्य रूप से गर्भावस्था या मासिक धर्म चक्र को अनुकरण करने के लिए कृत्रिम तरीकों द्वारा स्थापित एंडोमेट्रियल निर्णय की प्रक्रिया को संदर्भित करता है। आकृति विज्ञान के संदर्भ में, गर्भावस्था के निर्णय और कृत्रिम निर्णय के बीच थोड़ा समग्र अंतर है15,16. गर्भाशय ग्रंथियां एंडोमेट्रियम में निर्णय लेने से पहले मौजूद होती हैं और निर्णय लेने के बाद गायब हो जाती हैं। जीन अभिव्यक्ति के बारे में, प्राकृतिक गर्भावस्था निर्णायककरण (एनपीडी) और एडी15 के बीच केवल एक मामूली अंतर की पहचान की जाती है। नतीजतन, चूहों में कृत्रिम निर्णय मॉडल अज्ञात रोगजनन और मानव प्रजनन रोगों के नए उपचार का पता लगाने के लिए गर्भावस्था निर्णय का अनुकरण कर सकता है।
एनपीडी, एडी, और इन विट्रो निर्णायकीकरण (आईवीडी) माउस निर्णय प्राप्त करने के तीन तरीके हैं। एनपीडी मॉडल प्राकृतिक गर्भावस्था पर निर्भर करता है और भ्रूण के प्रभाव सहित मातृ शारीरिक स्थिति के सबसे करीब है। आरोपण और गैर-आरोपण साइटों के बीच अंतर की तुलना निर्णय लेने का अध्ययन करने के लिए एक अधिक शारीरिक और सुविधाजनक दृष्टिकोण है। एडी मॉडल को उत्तेजक के रूप में तिल के तेल के अंतर्गर्भाशयी इंजेक्शन का उपयोग करके विकसित किया गया था ताकि भ्रूण से प्रभाव से बचने के लिए वासेक्टोमाइज्ड पुरुषों के साथ जुड़े एक स्यूडोप्रेग्नेंट मादा माउस में निर्णय लिया जा सके। एनपीडी और एडी मॉडल दोनों विभिन्न शोध उद्देश्यों में आवश्यक भूमिका निभाते हैं, लेकिन वे मातृ हार्मोन चयापचय की विभिन्न गतिविधियों के कारण संभोग विफलता और समूह के भीतर अंतर से बच नहीं सकते हैं। आईवीडी सेलुलर स्तर पर संयुक्त एस्ट्रोजन और प्रोजेस्टेरोन के उपचार के आधार पर एक विधि है, जिसके लिए अधिक कठोर प्रयोगात्मक स्थितियों और परिचालन क्षमता की आवश्यकता होती है। हालांकि, इन विट्रो मॉडल शारीरिक परिस्थितियों15 के तहत निर्णायक प्रतिक्रिया को पूरी तरह से अनुकरण नहीं कर सकता है। इसलिए, हम निर्णय लेने पर अंतर्जात हार्मोन के प्रभाव को कम करने के लिए पारंपरिक एडी से संशोधित एक सरल और बेहतर प्रेरण विधि का प्रस्ताव करते हैं। निर्णायक प्रेरण की सफलता सुनिश्चित करने के आधार पर, यह शारीरिक स्थिति के करीब है और उन प्रयोगों के लिए अधिक उपयुक्त है जिन्हें भ्रूण कारकों को बाहर करने की आवश्यकता है।
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Protocol
वर्णित सभी पशु प्रयोगों को नानजिंग यूनिवर्सिटी मेडिकल स्कूल की जानवरों के उपयोग और देखभाल पर समिति के संबद्ध ड्रम टॉवर अस्पताल (नंबर 20171202) द्वारा अनुमोदित किया गया था। सभी ऑपरेशन उचित पशु देखभाल और उपयोग एजेंसी और राष्ट्रीय दिशानिर्देशों का पालन करते हैं।
नोट: चूहों को एक विशिष्ट रोगज़नक़-मुक्त (एसपीएफ) वातावरण में उठाया गया था, जिसमें 22 डिग्री सेल्सियस ± 1 डिग्री सेल्सियस का तापमान, 50% ± 1% की सापेक्ष आर्द्रता, 12 घंटे / 12 घंटे का हल्का / अंधेरा चक्र, और भोजन और पानी तक मुफ्त पहुंच थी।
1. माउस ओवैरेक्टोमी
- ऑपरेशन से 1 दिन पहले उच्च तापमान और उच्च दबाव वाले स्टरलाइज़र के साथ सर्जिकल उपकरणों को निष्फल करें।
- 8 सप्ताह के C57BL/6 चूहों का वजन करें और चूहों को एनेस्थेटाइज करने के लिए तदनुसार 1% सोडियम पेंटोबार्बिटल इंजेक्ट करें। उपयोग की जाने वाली खुराक 40 मिलीग्राम / किग्रा17 है। यह खुराक 40-60 मिनट की बेहोशी प्रदान करती है, जो ओवैरेक्टोमी की आवश्यकताओं को पूरा करती है। प्री-ऑपरेटिव एनाल्जेसिया के लिए, चूहों को 5 मिलीग्राम / किग्रा मेलोक्सिकैम (एससी) के साथ इंजेक्ट करें।
नोट: चूहों में सफल संज्ञाहरण को गहरी मांसपेशियों की सजगता और स्थिर श्वास के गायब होने से संकेत दिया जा सकता है। सफल संज्ञाहरण के संकेतों में आंतरिक कैंथस को छूते समय कोई पलक नहीं झपकना, जीभ खींचते समय कोई निगलना नहीं, पैर की उंगलियों के बीच त्वचा को चुभते समय कोई पैर झुकना नहीं, और पूंछ की आवश्यकता होने पर कोई उछाल नहीं होना शामिल है। - संज्ञाहरण के दौरान सूखापन को रोकने के लिए आंखों की पुतलियों पर सुरक्षात्मक आंख मलहम लागू करें।
- जब चूहों को पूरी तरह से एनेस्थेटाइज किया जाता है तो ऑपरेशन शुरू करें। चूहों को ऑपरेटिंग सतह पर प्रवण स्थिति में रखें और ठीक करें, और साबुन के पानी से गीला करने के बाद पीठ पर बालों को शेव करें। शेविंग के बाद 70% इथेनॉल के साथ त्वचा को कीटाणुरहित करें।
- रीढ़ के समानांतर दोनों पिछले अंगों की जांघ की जड़ के ऊपरी किनारे पर 0.5 सेमी (या पसली के नीचे 1.0 सेमी) पर ऑपरेशन चीरा साइट ज्ञात कीजिये (चित्र 1ए)।
नोट: अंडाशय को जल्दी से स्थानीय बनाने के लिए एक सही चीरा स्थान आवश्यक है। - चीरा साइट को केंद्र के रूप में लें और आयोडोफर 3 एक्स के साथ चीरा क्षेत्र को कीटाणुरहित करें, फिर चीरा क्षेत्र के चारों ओर एक सर्जिकल ड्रेप रखें।
- कैंची का उपयोग करके लगभग 0.5-1.0 सेमी का अनुदैर्ध्य चीरा लगाएं। प्रावरणी को काटें और निष्क्रिय रूप से मांसपेशियों को चिमटी से अलग करें।
- पतली मांसपेशियों की परत के माध्यम से गुर्दे के निचले ध्रुव के करीब चीरा क्षेत्र में सफेद वसा पैड का एक टुकड़ा खोजें (चित्रा 1 बी)।
नोट: सफेद वसा पैड अंडाशय के स्थान का सबसे स्पष्ट संकेतक है। - हेमोस्टैटिक क्लिप के साथ वसा द्रव्यमान को दबाएं, और वसा पैड द्वारा लपेटे गए अंडाशय को चीरा से बाहर खींचें।
- घुमावदार चिमटी के साथ अंडाशय और फैलोपियन ट्यूब के जंक्शन को दबाएं, और कैंची के साथ डिम्बग्रंथि पेडिकल के साथ अंडाशय को हटा दें। अल्कोहल लैंप पर गर्म इलेक्ट्रोकोग्यूलेशन पेन या 1 एमएल सिरिंज की सुई का उपयोग करके रक्तस्राव को रोकें।
नोट: फैलोपियन ट्यूब को संरक्षित करना सुनिश्चित करें, जो गर्भाशय के सींगों में तिल के तेल के बाद के इंजेक्शन के लिए शारीरिक मील का पत्थर है। - ऊतक आसंजन को रोकने के लिए सर्जिकल चीरा को सामान्य खारा के साथ कुल्ला करें, क्रमशः मांसपेशियों और त्वचा को सिलने के लिए 4-0 सीवन का उपयोग करें, और फिर से आयोडोफर के साथ सर्जिकल चीरा को कीटाणुरहित करें।
- चूहों को पिंजरे में प्रवण स्थिति में रखें और उन्हें लगभग 2 घंटे के लिए प्रकाश स्रोत और वेंटिलेशन सिस्टम से लैस 25 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में पुनर्जीवित करें।
- ऑपरेशन के बाद चूहों पर ध्यान दें, उन्हें पूरी तरह से ठीक होने तक अकेले मूल भोजन स्थान पर वापस रखें, और उन्हें पर्याप्त पानी और भोजन दें।
2. पोस्टऑपरेटिव रेस्ट और एस्ट्रोजन और प्रोजेस्टेरोन फॉर्मूलेशन
- सुनिश्चित करें कि चूहों को ओवैरेक्टोमी के बाद 2 सप्ताह तक आराम करें।
- एक अल्ट्रा-क्लीन कैबिनेट में, आरएनए एंजाइम-मुक्त सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में तिल के तेल में एस्ट्रोजेन (2 एनजी / एसएल) और प्रोजेस्टेरोन (0.2 एनजी /
- सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों को थर्मोस्टैटिक पानी के स्नान में 37 डिग्री सेल्सियस पर रखें और विघटन में तेजी लाने के लिए ट्यूबों को लगातार हिलाएं।
- पूर्ण विघटन के बाद, सुविधाजनक उपयोग के लिए तिल के तेल के घोल को 100 μL एलिकूट्स में विभाजित करें। तैयार एस्ट्रोजन और प्रोजेस्टेरोन समाधान को 4 डिग्री सेल्सियस पर रेफ्रिजरेटर में स्टोर करें।
3. प्रेरित कृत्रिम निर्णय मॉडल
- चमड़े के नीचे (एससी) 3 दिनों के लिए प्रत्येक माउस में 50 μL तिल के तेल में 100 एनजी एस्ट्रोजन इंजेक्ट करता है, इसके बाद 2 दिनों का आराम15।
नोट: सुनिश्चित करें कि एस्ट्रोजन और प्रोजेस्टेरोन तैयार किए गए हैं और विभिन्न स्थानों पर रखे गए हैं। प्रोजेस्टेरोन द्वारा एस्ट्रोजन का कोई भी संदूषण विफलता का कारण बन सकता है। - प्रत्येक माउस में 50 μL तिल के तेल में 1 मिलीग्राम प्रोजेस्टेरोन और 10 एनजी एस्ट्रोजन इंजेक्टकरें।
- तीसरे एस्ट्रोजन-प्रोजेस्टेरोन संयुक्त इंजेक्शन के बाद कृत्रिम निर्णय मॉडल15 6 घंटे को प्रेरित करने के लिए चूहों को संचालित करें।
- फैलोपियन ट्यूबों के निचले छोर पर गर्भाशय के सींग का पता लगाएं और गर्भाशय के सींग के साथ धीरे-धीरे 20 μL तिल के तेल को इंजेक्ट करें, ऊतक को पीछे धकेलें, चीरा को सींचें, और माउस को ठीक होने दें। ऑपरेशन के लिए दृष्टिकोण माउस ओवरेक्टोमी15 के समान है।
नोट: केवल एक सफल ओवैरेक्टोमी की स्थिति में दूसरी सर्जरी के साथ आगे बढ़ें (त्वचा चीरा अच्छी तरह से ठीक हो जाता है, अंडाशय पूरी तरह से आबकारी होता है, और फैलोपियन ट्यूब के अवशिष्ट छोर का आसपास के ऊतकों का पालन नहीं किया जाता है)।
नोट: एडी मॉडल को प्रेरित करने के लिए, तिल के तेल का 20 μL उपयुक्त है; तिल का तेल आसानी से दूसरी तरफ प्रवेश करेगा। - अगले 4 दिनों के लिए 1 मिलीग्राम प्रोजेस्टेरोन और 10 एनजी एस्ट्रोजन (एच) युक्त तिल के तेल के 50 μL इंजेक्ट करें। चित्र 215,18 में विवरण देखें।
4. नमूना संग्रह
- कार्बन डाइऑक्साइड श्वासावरोध द्वारा चूहों (एन = 6) को यूथेनाइज़ करें और यूटेरी एकत्र करें। द्विपक्षीय यूटेरी के आकार का निरीक्षण करें, तस्वीरें लें, और गर्भाशय के सींगों का वजन करें (चित्रा 3 ए, बी)।
- गर्भाशय ऊतक के 3-5 मिमी को 10% फॉर्मेलिन के साथ ठीक करें, पैराफिन में एम्बेड करें, और उन्हें वर्गीकृत करें। रूपात्मक परिवर्तनों का निरीक्षण करने के लिए हेमेटॉक्सिलिन और ईओसिन के साथ वर्गों को दाग दें19 (चित्रा 4 ए)।
- इष्टतम काटने के तापमान यौगिक (ओसीटी) में गर्भाशय ऊतक के एक और 3-5 मिमी को एम्बेड करें, तरल नाइट्रोजन में फ्रीज करें, और -80 डिग्री सेल्सियस रेफ्रिजरेटर में स्टोर करें। जमे हुए ऊतक को 10 μm तक खंडित करें और एज़ो युग्मन विधि 20 (चित्रा 4 बी) द्वारा गर्भाशय केऊतकों में क्षारीय फॉस्फेट गतिविधि का पता लगाएं।
नोट: एएलपी सामग्री का पता लगाने के लिए जमे हुए वर्गों का उपयोग करके संतोषजनक परिणाम प्राप्त किए जा सकते हैं, न कि पैराफिन अनुभाग। - ट्राइज़ोल अभिकर्मक के साथ गर्भाशय के कुल आरएनए को निकालें और प्रोलैक्टिन परिवार 8 उपपरिवार सदस्य 2 (Prl8a2), क्षारीय फॉस्फेट यकृत / हड्डी / गुर्दे (Alpl) और इंसुलिन जैसे विकास कारक-बाध्यकारी प्रोटीन 1 (Igfbp1)15 की सापेक्ष एमआरएनए अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए QPCR मास्टर मिक्स (सामग्री की तालिका) के साथ वास्तविक समय पीसीआर सिस्टम (सामग्री की तालिका) पर मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर (QPCR) निष्पादित करें। ). पीसीआर शर्तों का पालन करें: स्टेज 1, 30 सेकंड के लिए 95 डिग्री सेल्सियस; चरण 2, 10 सेकंड के लिए 95 डिग्री सेल्सियस और 30 सेकंड के लिए 60 डिग्री सेल्सियस; चक्र को 40x दोहराएं। प्राइमर अनुक्रमों की एक पूरी सूची तालिका 1 में प्रदान की गई है।
- उपयुक्त सॉफ्टवेयर में सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए 2-3सीटी विधि और एक टी-टेस्ट विधि का उपयोग करके क्यूपीसीआर डेटा का विश्लेषण करें। इस अध्ययन में, पी < 0.05 को सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण माना जाता था।
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Representative Results
माउस निर्णायक मॉडल इंडेक्स में गर्भाशय की सामान्य आकृति विज्ञान, निर्णायक और गैर-निर्णायक गर्भाशय का द्रव्यमान अनुपात, एंडोमेट्रियम की हिस्टोलॉजिकल आकृति विज्ञान और निर्णायक मार्कर अणुओं का अभिव्यक्ति स्तर शामिल है। तेल द्वारा प्रेरित चूहों के कृत्रिम निर्णायक गर्भाशय की सामान्य आकृति विज्ञान गर्भावस्था में गर्भाशय के करीब है। गर्भाशय का शरीर मोटा हो जाता है, और गर्भाशय गुहा गैर-प्रेरित पक्ष से छोटा हो जाता है। प्रेरित गर्भाशय के सींग की मात्रा और वजन गैर-प्रेरित पक्ष (चित्रा 3 ए, बी) की तुलना में काफी अधिक है। गर्भाशय के ऊतकों के धुंधला होने से पता चला कि ग्रंथियां गायब हो जाती हैं और प्रेरित सींग पर एंडोमेट्रियल स्ट्रोमल कोशिकाएं अस्पष्ट कोशिका सीमाओं के साथ बड़े, गोल, साइटोप्लाज्मिक और बहुराष्ट्रीय निर्णायक कोशिकाओं में विभेदित होती हैं। गैर-प्रेरित पक्ष खंड एक सामान्य शारीरिक स्थिति (चित्रा 4 ए) के तहत एंडोमेट्रियल ऊतक आकृति विज्ञान दिखाते हैं। एज़ो युग्मन विधि के परिणाम से पता चला कि तेल-प्रेरित पक्ष की क्षारीय फॉस्फेट सामग्री गैर-प्रेरित पक्ष (चित्रा 4 बी) की तुलना में काफी अधिक थी। क्यूपीसीआर के परिणामों से पता चला है कि प्रेरित सींग में Prl8a2, Alpl और Igfbp1 की एमआरएनए अभिव्यक्ति गैर-प्रेरित सींग की तुलना में काफी अधिक थी, यह सुझाव देते हुए कि तेल चूहों में कृत्रिम निर्णय को प्रेरित कर सकता है (चित्रा 4C-E)।
चित्र 1: माउस ओवैरेक्टोमी का ऑपरेटिव चीरा। (ए) माउस ओवैरेक्टोमी स्थिति। (बी) ओवैरेक्टोमी के दौरान माउस अंडाशय की स्थिति। (सी) ओवैरेक्टोमी के दौरान अंडाशय की साइट। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्र 2: ऑपरेशन की प्रक्रिया। पूरी प्रक्रिया में ओवैरेक्टोमी, पोस्टऑपरेटिव रेस्ट, कृत्रिम निर्णायक मॉडल का प्रेरण और फेनोटाइपिक सत्यापन शामिल हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्र 3: माउस कृत्रिम निर्णय मॉडल की पीढ़ी। (ए) तेल द्वारा प्रेरित कृत्रिम निर्णय की प्रतिनिधि तस्वीर। दाहिने तरफ के गर्भाशय को तेल के साथ इंजेक्ट नहीं किया गया था, जिसे तेल (-) नाम दिया गया था। बाईं ओर के गर्भाशय को तेल के साथ इंजेक्ट किया गया था, जिसे तेल (+) नाम दिया गया था। (बी) तेल के साथ या बिना इंजेक्ट किए गए गर्भाशय का वजन। पी < 0.001. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्र 4: माउस कृत्रिम निर्णय मॉडल का सत्यापन। (A) तेल द्वारा प्रेरित कृत्रिम निर्णय की प्रतिनिधि एचई तस्वीर। स्केल बार = 1 मिमी और 100 μm. (B) एज़ो युग्मन विधि ने कृत्रिम निर्णायक की क्षारीय फॉस्फेट गतिविधि का पता लगाया। स्केल सलाखों = 200 μm और 50 μm. (C) QPCR द्वारा Prl8a2 mRNA के अभिव्यक्ति स्तर का पता लगाया गया था। * पी < 0.05. (डी) एएलपीएल एमआरएनए का अभिव्यक्ति स्तर। ** पी < 0.01. (ई) IGFBP1 mRNA का अभिव्यक्ति स्तर। ** पी < 0.01. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
| Igfbp1 माउस QPCR-F | GCCCAAGAAGAAGCAGGAG |
| Igfbp2 माउस QPCR-R | GTAGACACACCCAGAGTCCA |
| Prl8a2 माउस qPCR-F | ACCACACACCTCTCAGCTGG |
| Prl8a2 माउस qPCR-R | TGTTCAGGTCCATGAGCTGGTG |
| Alpl माउस qPCR-F | CCAGAAGACACCTTGACTGG |
| Alpl माउस qPCR-R | TCTTGTCCGTGCTCACCAT |
| 18s माउस qPCR-F | ATGGCCGTTCTTAGTGGTG |
| 18 s माउस QPCR-R | CGGACATCTAAGGGCATCAC |
तालिका 1: प्राइमर अनुक्रमों की सूची।
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Discussion
चूहों में निर्णय भ्रूण की उपस्थिति के आधार पर एक सहज प्रक्रिया है, जो मनुष्यों से अलग है। हालांकि, यह पाया गया है कि कृत्रिम उत्तेजना जैसे कांच के मोतियों के गर्भाशय इंजेक्शन और गर्भाशय लेसेशन भ्रूण के बजाय एंडोमेट्रियम के निर्णय को प्रेरित कर सकते हैं। इसके अलावा, शोधकर्ताओं ने पाया कि कई कारक निर्णायक को प्रेरित कर सकते हैं या निर्णय लेने में भाग ले सकते हैं, जैसे कि स्टेरॉयड हार्मोन, प्रोस्टाग्लैंडिंस और गर्भाशय गुहा21 में विकास निरोधात्मक कारकों का इंजेक्शन। उपरोक्त मॉडलिंग विधियों की तुलना में, ओवैरेक्टोमी के साथ विस्तृत माउस मॉडल, उत्तेजक के रूप में तिल के तेल का उपयोग करके, एस्ट्रोजेन और प्रोजेस्टेरोन के प्रभावों को बाहर कर सकता है। इसलिए, यह किफायती और संचालित करने में आसान है।
अवशिष्ट डिम्बग्रंथि ऊतक को रोकने के लिए अंडाशय को साफ रूप से हटा दिया जाना चाहिए, जो निर्णय लेने के बाद के प्रेरण को प्रभावित करेगा। इस कदम का उद्देश्य अंडाशय द्वारा उत्पादित अंतर्जात एस्ट्रोजन और प्रोजेस्टेरोन के प्रभाव को कम करना है। फैलोपियन ट्यूब को नुकसान से बचा जाना चाहिए क्योंकि इसका उपयोग गर्भाशय गुहा में तिल के तेल को इंजेक्ट करते समय गर्भाशय की तलाश के लिए एक संकेत के रूप में किया जा सकता है। यदि पेट का आसंजन या फैलोपियन ट्यूब हटाने होता है, तो ऑपरेटर को आंत्र से गर्भाशय को अलग करने पर ध्यान देना चाहिए।
चमड़े के नीचे इंजेक्शन की प्रक्रिया में तेल रिसाव आसानी से होता है। किसी को पेट की त्वचा को चमड़े के नीचे इंजेक्शन साइट के रूप में चुनना चाहिए और निपल्स से बचना चाहिए। तेल इंजेक्ट करना और सुई को धीरे-धीरे बाहर निकालना आवश्यक है। यदि माउस सक्रिय होने पर सुई को बाहर नहीं खींचा जा सकता है, तो यह आसानी से रिसाव का परिणाम है। रिसाव को रोकने के लिए एक पल के लिए सूती गेंद के साथ सुई साइट को दबाना चाहिए। एक्सोजेनस एस्ट्रोजन और प्रोजेस्टेरोन इंजेक्शन का उपयोग इस ऑपरेशन में किया गया था ताकि उत्प्रेरण निर्णय ऑपरेशन से पहले चूहों के हार्मोन के स्तर को स्थिर रखा जा सके। इस इंजेक्शन विधि ने चूहों के पेरी-आरोपण अवधि में हार्मोन परिवर्तन का अनुकरण किया। यहां, हमने दूसरे एस्ट्रोजन शिखर के बाद निर्णय लेने को प्रेरित किया।
इस ऑपरेशन की सफलता की कुंजी तिल के तेल की मात्रा है। बहुत अधिक तिल का तेल यूटेरी के दूसरे सींग की गुहा में प्रवेश करेगा। अपर्याप्त तिल के तेल से गर्भाशय के साथ निर्णय लेने की प्रतिक्रिया या असमान निर्णय में कमी आएगी, जिसके परिणामस्वरूप अप्रत्याशित प्रयोगात्मक अंतर होंगे। ऑपरेशन के दौरान, तिल के तेल को इंजेक्ट करते समय सिरिंज सुई को गर्भाशय गुहा में डालना चाहिए और धीरे-धीरे आगे और पीछे खींचना चाहिए ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि सुई गर्भाशय गुहा में है। गर्भाशय गुहा के हिस्से को पारदर्शी के रूप में देखा जा सकता है यदि सफलतापूर्वक इंजेक्शन दिया जाए। किसी को धीरे से पिनप्रिक को लगभग 10 सेकंड तक चिमटी के साथ दबाना चाहिए ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि यह बंद है, जो सुई को बाहर निकालने के बाद तिल के तेल के रिसाव को रोक सकता है। इसी समय, धीरे से गर्भाशय के शरीर को सुई से नीचे की ओर धकेलें ताकि तिल का तेल गर्भाशय गुहा में समान रूप से फैल जाए।
ऑपरेशन के बाद उपचार और पुनर्जीवन इस मॉडल की सफलता की अन्य कुंजी हैं। सबसे पहले, ऑपरेशन के दौरान चीरा के लिए एक बाँझ वातावरण रखना आवश्यक है। चूहों को पुनर्जीवित करने से पहले, ऑपरेशन चीरा को आयोडोफोर के साथ कीटाणुरहित करें और संक्रमण की घटनाओं को कम करने के लिए इसे चिकित्सा धुंध के टुकड़े के साथ कवर करें। ऑपरेशन के बाद, चूहों को ठीक होने के लिए 2-3 घंटे के लिए एनेस्थेटिक्स को चयापचय करने की आवश्यकता होती है। इस अवधि के दौरान, चूहों को तेजी से ठीक होने और 70% अल्कोहल और आयोडोफर के साथ कीटाणुशोधन के कारण हाइपोथर्मिया से बचने के लिए 25 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रखा जाना चाहिए। ऑपरेशन के बाद कुछ दिनों के भीतर उपचार पर ध्यान देना चाहिए और समय पर ऑपरेटिव जटिलताओं के प्रकारों को संभालना चाहिए, जैसे कि चीरा क्रैकिंग, सूजन, अल्सरिंग, और इसी तरह।
Prl8a2 और Alpl सबसे शास्त्रीय निर्णायक मार्कर हैं। IGFBP1 चूहों में निर्णायक कोशिकाओं में मुख्य प्रोटीन भी है और इसे चूहों में निर्णायककरण का विशिष्ट मार्कर माना जाता है। तेल-प्रेरित गर्भाशय के सींग में Prl8a2, Alpl, और Igfbp1 mRNA के अभिव्यक्ति स्तर तेल इंजेक्शन के बिना नियंत्रण पक्ष की तुलना में काफी बढ़ जाते हैं। इसके अलावा, तेल-प्रेरित पक्ष पर क्षारीय फॉस्फेट गतिविधि नियंत्रण पक्ष की तुलना में काफी अधिक है। ये परिणाम सभी कृत्रिम निर्णय मॉडल15 की सफलता का संकेत देते हैं।
माउस कृत्रिम निर्णायक मॉडल का उपयोग रोगजनक बांझपन अणुओं को मान्य करने के लिए किया जा सकता है और असामान्य एंडोमेट्रियल निर्णय से जुड़े बांझपन के निदान और उपचार के लिए एक अच्छा सत्यापन मॉडल प्रदान करता है। यह मॉडल प्रजनन रोगों का अध्ययन करने के लिए उपयोगी है, जैसे कि बार-बार गर्भपात और बार-बार आरोपण विफलता। इसका उपयोग भ्रूण आरोपण और आक्रमण में मातृ कारकों की भूमिका का अध्ययन करने के लिए किया जाता है। इस एडी मॉडल में अच्छी सुरक्षा, एक उच्च सफलता दर है, और अंतर्जात हार्मोन के प्रभाव को हल करता है। हालांकि, यह एक समय लेने वाली और अत्यधिक मांग वाली प्रक्रिया है। हम अनुसंधान की सुविधा के लिए हमारे प्रयोगात्मक तरीकों को और अनुकूलित करेंगे।
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।
Acknowledgments
लेखक चीन के राष्ट्रीय प्रकृति विज्ञान फाउंडेशन (82001629, एक्सक्यूएस), जियांग्सू प्रांत के प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन के युवा कार्यक्रम (बीके 20200116, एक्सक्यूएस), और जियांग्सू प्रांत पोस्टडॉक्टरल रिसर्च फंडिंग (2021 के 277 बी, एक्सक्यूएस) से समर्थन स्वीकार करना चाहते हैं।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Estrogen | Sigma | E2758 | Hormone supplement |
| Progesterone | Sigma | P0130 | Hormone supplement |
| Sesame oil | Sigma | S3547 | Hormone supplement |
| Sodium pentobarbital | Dainippon Sumitomo Pharma Co.,Ltd. | Anaesthesia | |
| Meloxicam injection | Qilu Animal Health Products Co., Ltd | Analgesia | |
| Alkaline phophatase stain kit(kaplow's/azo coupling method) | Solarbio | G1480 | Alkaline phophatase stain |
| Eosin | Servicebio | G1005-2 | HE stain |
| Hematoxylin | Servicebio | G1005-1 | HE stain |
| ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix | Vazyme | Q711-02 | qPCR |
| 70% ethanol | Lircon | ZH1120090 | Disinfect |
| Iodophor | Runzekang | RZK-DF | Disinfect |
| Erythromycin Eye Ointment | Guangzhou Baiyunshan | Mice eyeball protect | |
| 4-0 suture | Ethicon | W329 | Incision suture |
| 10% formalin | Yulu | L25010118 | Tissue fix |
| Optimal cutting temperature compound | Sakura | 4583 | Ssection |
| Trizol reagent | Ambion | 15596018 | qPCR |
References
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