Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

ניתוח אוטופגיה הנגרמת על ידי רעב בגוף השומן של הזחל Drosophila melanogaster

Published: August 4, 2022 doi: 10.3791/64282
Automatic Translation
1, 1
1Ministry of Education Key Laboratory of Biosystems Homeostasis and Protection and Innovation Center for Cell Signaling Network, Life Sciences Institute, Zhejiang University

Summary

הפרוטוקול הנוכחי מתאר את השראת האוטופגיה בגוף השומן של הזחל Drosophila melanogaster באמצעות דלדול חומרי מזון ומנתח שינויים באוטופגיה באמצעות זני זבובים טרנסגניים.

Abstract

אוטופגיה היא תהליך של עיכול עצמי תאי. הוא מעביר מטען לליזוזומים לפירוק בתגובה ללחצים שונים, כולל רעב. תקלה של אוטופגיה קשורה להזדקנות ומחלות אנושיות מרובות. מנגנון האוטופגיה שמור מאוד - משמרים ועד בני אדם. גוף שומן הזחל של Drosophila melanogaster, אנלוגי לכבד חולייתנים ולרקמת שומן, מספק מודל ייחודי לניטור אוטופגיה in vivo. אוטופגיה יכולה להיגרם בקלות על ידי רעב תזונתי בגוף שומן הזחל. רוב הגנים הקשורים לאוטופגיה נשמרים בדרוזופילה. פותחו זנים רבים של זבובים טרנסגניים המבטאים סמני אוטופגיה מתויגים, המאפשרים ניטור של שלבים שונים בתהליך האוטופגיה. ניתוח השבטים מאפשר השוואה קרובה של סמני אוטופגיה בתאים בעלי גנוטיפים שונים באותה פיסת רקמה. הפרוטוקול הנוכחי מפרט נהלים עבור (1) יצירת שיבוטים סומטיים בגוף שומן הזחל, (2) גרימת אוטופגיה באמצעות רעב חומצות אמינו, ו-(3) ניתוח גוף שומן הזחל, במטרה ליצור מודל לניתוח הבדלים באוטופגיה באמצעות סמן אוטופגוזום (GFP-Atg8a) וניתוח שבטים.

Introduction

אוטופגיה היא תהליך "אכילה עצמית" המושרה על ידי לחצים שונים, כולל רעב חומצות אמינו1. מקרואוטופגיה (להלן אוטופגיה) היא הסוג הנחקר ביותר של אוטופגיה וממלאת תפקיד שאין לו תחליף בשמירה על הומאוסטזיס תאי2. תקלה של אוטופגיה קשורה למספר מחלות אנושיות3. בנוסף, חלק מהגנים הקשורים לאוטופגיה הם מטרות פוטנציאליות לטיפול במחלות שונות4.

אוטופגיה מוסדרת בצורה מתוחכמת ביותר5. בעת הרעב, קרומי הבידוד מבודדים חומרים ציטופלזמיים ליצירת אוטופגוזומים בעלי קרום כפול6. לאחר מכן אוטופגוזומים מתמזגים עם אנדוזומים וליזוזומים ליצירת אמפיזומים ואוטוליזוזומים. בעזרת אנזימים הידרוליטיים ליזוזומליים, התוכן הציטופלזמי שנבלע מתפרק, והחומרים המזינים ממוחזרים7.

אוטופגיה היא תהליך שימור אבולוציוני8. Drosophila melanogaster הוא מודל נהדר לחקר תהליך autophagy in vivo. רעב חומצות אמינו גורם בקלות לאוטופגיה ברקמת גוף שומן הזבובים, אנלוגיה של כבד אנושי ורקמת שומן9. פגמים באוטופגיה משבשים את דפוסי הפונקטה המובהקים של מספר חלבונים הקשורים לאוטופגיה, כגון Atg8, Atg9, Atg18, Syx17, Rab7, LAMP1 ו-p62, בין היתר10. לכן, ניתוח הדפוסים של סמני אוטופגיה אלה יסייע להבחין בהתרחשות של פגמים אוטופגיים ואת שלב אוטופגיה פגום. לדוגמה, החלבון דמוי האוביקוויטין Atg8 הוא סמן האוטופגיההנפוץ ביותר 11. ב- Drosophila melanogaster, זנים טרנסגניים עם חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) המתויג Atg8a פותחו בהצלחה12. GFP-Atg8a מפוזר בציטוזול ובגרעינים בתאים המוזנים. לאחר הרעבה, GFP-Atg8a מעובד ושונה על ידי פוספטידיל-אתנולאמין (PE) ויוצר פונקטה, אשר מסמנת את קרומי הבידוד ואת האוטופגוזומים המפותחים במלואם13,14. באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ישיר, ניתן לראות בקלות את השראת האוטופגיה כעלייה בהיווצרות GFP-Atg8 puncta15. Atg8a puncta לא ייווצר בתגובה לרעב בנוכחות פגם בהתחלת אוטופגיה. מכיוון ש-GFP-Atg8a יכול להיות מרווה-מעוכל על ידי ה-pH הנמוך באוטוליזוזומים, GFP-Atg8a puncta עשוי לעלות במספרים אם אוטופגיה נחסמת בשלבים מאוחרים16.

מכיוון שאוטופגיה רגישה מאוד לזמינות תזונתית17, הבדלים קלים בתנאי התרבית מובילים לעתים קרובות לשינויים בפנוטיפים. לכן, לאנליזה של שבטים, שיטה המנתחת תאים מוטנטיים לעומת תאי ביקורת מסוג בר באותה רקמה, יש יתרון גדול בניתוח פגמים אוטופגיים18. תוך ניצול של רקומבינציה ספציפית לאתר בתיווך FLPASE/FLPASE (FLP/FRT) בין כרומוזומים הומולוגיים, זבובים הנושאים רקמות פסיפס מיוצרים בקלות19,20. התאים מסוג פרא המקיפים את התאים המוטנטיים יוצרים בקרה פנימית מושלמת כדי למנוע הבדלים אינדיבידואליים21.

המחקר הנוכחי מתאר כיצד לגרום לאוטופגיה על ידי רעב חומצות אמינו וליצור רקמות גוף של שומן פסיפס המבטא GFP-Atg8a. פרוטוקולים אלה יכולים לשמש לניתוח הבדלים באוטופגיה בין שיבוטים מוטנטיים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. מעבר דרוזופילה והטלת ביצים

  1. הכניסו 3 זכרים (גנוטיפ hsFLP ubiRFP FRT19A; cgGal4 UAS-GFP-Atg8a) ו-15 נקבות (גנוטיפ y' w* Mu FRT19A/ FM7, Kr GFP ) זבובים בוגרים (ראו טבלת חומרים) לבקבוקון תרבית ( עם קמח תירס /מולסה/אגר סטנדרטי ב-25°C) להזדווגות.
    הערה: יש להגדיר בקבוקוני תרבית מרובים של אותו צלב כדי להבטיח מספיק זחלים לניסויים נוספים. זן הזבוב הזכר עם גנוטיפ hsFLP ubiRFP FRT19A; cgGal4 UAS-GFP-Atg8a נושא אתר FRT בכרומוזום X ליד הצנטרומר (FRT19A). זה גם מבטא FLP על הלם חום ב 37 ° C. טרנסגן עם ביטוי RFP בכל מקום מוכנס לכרומוזום X. GFP-Atg8a מתבטא תחת שליטה של cgGal4 בגוף שומן הזחל22. נקבת זן הזבוב עם גנוטיפ y' w* Mu FRT19A / FM7, Kr GFP נושאת מוטציה קטלנית (Mu) ו-FRT19A על כרומוזום X. תוכנית המעבר המפורטת מוצגת באיור 1.
  2. להטלת ביצים מעבירים את הזבובים לבקבוקון תרבית חדש. בשעה 48 לאחר ההקדמה, הקש על בקבוקון ההזדווגות עד שהזבובים יהיו המומים ויפיל על המדיה שבבסיס הבקבוקון.
    1. נתקו את בקבוקון ה"הזדווגות" וכסו את פיו בבקבוקון הפוך מנותק במדיה טרייה (בקבוקון תרבית טרי). לאחר מכן, העבירו את הזבובים לבקבוקון התרבית הטרי על ידי היפוך והקשה על הבקבוקונים.
    2. חברו את בקבוקון התרבית הטרי (עם הזבובים המועברים) והשליכו את בקבוקון התרבות הישן. הניחו את בקבוקון התרבית הטרי הזה באינקובטור של 25 מעלות צלזיוס להטלת ביצים על המצע הטרי.
      הערה: חימום מקדים של בקבוקוני התרבית הטריים ל-25 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות לפני תהליך העברת הזבובים יסייע לזבובים להסתגל לסביבה החדשה במהירות ויזרז את הטלת הביצים.
  3. הוציאו את הזבובים לאחר 6 שעות של הטלת ביצים. אם יש צורך לחזור על הניסויים, העבירו את הזבובים הללו לבקבוקון תרבית אחר (כמתואר בשלב 1.2). אחרת, השליכו את הזבובים על ידי השלכתם לבקבוק המכיל 75% אתנול).
    1. לדגור על הבקבוקון עם עוברים באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת כדי לגרום לביטוי FLP. לאחר מכן, הניחו אותם באינקובטור של 25 מעלות צלזיוס ואפשרו לעוברים להמשיך להתפתח.
      הערה: היווצרות מוצלחת של שיבוטים מוטנטיים יכולה להיות מאושרת לאחר מכן באמצעות הדמיה. היעדר אותות RFP מסמן את השיבוטים המוטנטים.

2. רעב חומצות אמינו גורם לאוטופגיה

  1. בעזרת מרית מעבדה, גרפו את המדיה המכילה את הזחלים המתפתחים לתוך צלחת פטרי 75 שעות לאחר הטלת הביצים. מוסיפים 3 מ"ל של 1x PBS לצלחת ומפרידים בעדינות את מצע התרבית ואת הזחלים באמצעות מלקחיים ארוכים. בחר 10 עד 15 זחלי כוכב שלישי מוקדם.
    הערה: יש לבחור בקפידה את זחלי הכוכב השלישי המוקדם. השלב ההתפתחותי של הזחלים הוא קריטי להצלחת פרוטוקול זה. בשל משך הטלת הביצים המוגבל, רוב הזחלים בבקבוקון התרבית צפויים להיות בשלב האינסטאר השלישי בתחילת 75 שעות הדגירה. עם זאת, מתכוני מדיה תרבותיים שונים עשויים להוביל לשינויים בתזמון ההתפתחותי של הזחלים. הקריטריונים להבחנה בין זחלי כוכב שלישי מוקדם הם אורך הגוף, נוכחות של ספירקלים קדמיים ואחוריים, כמו גם ווים mandibular של מנגנון הפה23.
  2. מלא את הבארות של צלחת ספוט שקע זכוכית 9 בארות (ראה טבלת חומרים) עם 1x PBS. מניחים את הזחלים המופרדים בבארות באמצעות מלקחיים ארוכים ושוטפים היטב את הזחלים כדי להסיר את כל שאריות המדיה.
  3. קח 5 מ"ל של תמיסת 20% סוכרוז (ב- PBS 1x) בבקבוקון ריק והנח את הזחלים הנקיים של הכוכב השלישי בתמיסה זו באמצעות מלקחיים ארוכים. לדגור בקבוקון זה באינקובטור של 25 מעלות צלזיוס במשך 6 שעות לפני הקציר אותם לנתיחה.
    הערה: תמיסת 20% סוכרוז (ב-1x PBS) משמשת כמדיום הרעבה חסר חומצות אמינו.

3. דיסקציה שלישית של זחלי אינסטאר ועיבוד רקמות דגימה

  1. לחדד שני זוגות של #5 מלקחיים (ראה טבלה של חומרים) באופן שווה משני הצדדים עם אבן השחזה.
  2. הוסף 400 μL של 1x PBS לכל באר של צלחת שקע זכוכית 9 בארות ולהעביר את הזחלים לתוך הבארות עם מלקחיים ארוכים. מניחים זחל אחד בבאר כאשר הצד הגבי (הצד עם קנה הנשימה) פונה כלפי מעלה.
    1. אחוז את הקוטיקולה של הזחל עם שני #5 מלקחיים באמצע גזע הזחל וקרע בעדינות את הקוטיקולות. גופי השומן החשופים, יחד עם רקמות פנימיות אחרות של הזחל, עדיין יהיו מחוברים לפגר הזחל. משוך מספיק כדי לחשוף את האיברים הפנימיים ככל האפשר. חזור על שלב זה עבור כל הזחלים.
      הערה: לכל זחל יש שתי חתיכות גדולות של גוף שומן לאורך גזע הגוף. רקמת גוף השומן היא חד-שכבה לבנה, אטומה ושטוחה שניתן להבחין בה בקלות תחת מיקרוסקופ דיסקציה24.
  3. מעבירים את פגר הזחל לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל המכיל 500 μL של 4% פרפורמלדהיד (PFA). יש לדגור במשך 30 דקות בטמפרטורה של 25°C מבלי לנער את הצינורות.
    אזהרה: 4% PFA רעיל. יש ללבוש כפפות ומסכות להגנה.
    הערה: מומלץ להכין 4% PFA במאגר PBS אחד. אבקת PFA אינה מתמוססת ב-PBS אחד באופן מיידי. לפיכך, התערובת חייבת להיות מודגרת ב 65 ° C באינקובטור לילה או מזועזע לסירוגין במשך 45 דקות ב 25 °C (75 °F).
  4. לאחר דגירה של 30 דקות של הפגר עם 4% PFA, פיפטה החוצה את תמיסת PFA, להוסיף 500 μL של 1x PBS לתוך הצינור, ולנער בעדינות את הצינור על מסובב שטוח במשך 10 דקות לפני השלכת תמיסת PBS 1x (חזור על 3x).
  5. בעזרת מלקחיים ארוכים, מעבירים את פגר הזחל הקבוע והשטוף לבאר בצלחת ספוט 9 שקעים מלאה ב- PBS 1x. באמצעות #5 מלקחיים, להסיר את כל רקמות הגוף ללא שומן.
  6. השתמש במלקחיים #5 כדי להרכיב את חתיכות גוף השומן על מגלשת מיקרוסקופ באמצעות 80% גליצרול כאמצעי הרכבה ולהניח כיסוי על גבי.
    הערה: לפני ההרכבה, בדוק את ה- pH של 80% גליצרול (באמצעות ניירות pH, pH = 7 הוא אופטימלי) כדי להגן על אות GFP. אמצעי הרכבה (ראה טבלת חומרים) עם DAPI בגליצרול 80% יסייעו בהדמיה של גרעיני תאי גוף שומן. שקופיות אלה יציבות במשך שבוע אחד כאשר מאוחסן בחושך ב 4 °C (75 °F).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

בתנאים מוזנים, החלבון דמוי האוביקוויטין המתויג GFP, GFP-Atg8a, מפוזר בתוך התאים. עם רעב, הוא יוצר פונקטה ירוקה ומתייג אוטופגוזומים. ברגע שאוטופגוזומים מתמזגים עם ליזוזומים, GFP מרוה באוטוליזוזומים החומציים, והפונקטה הירוקה נעלמת. אם אוטופגיה אינה מושרית או שההבשלה האוטופגוזומית מואצת, מספר ה-GFP puncta צפוי להיות נמוך. עם זאת, אם האיחוי בין אוטופגוזומים וליזוזומים נחסם או שה- pH של האוטוליזוזום הופך לבסיסי, המספר ו / או הגודל של GFP puncta צפוי להיות גבוה.

בפרוטוקול המוצג כאן, מערכת FLP/FRT משרה רקומבינציה מיטוטית ומייצרת רקמות עם תאים מסוג בר ומוטנטיים. בעוד התאים מסוג בר מבטאים RFP, התאים המוטנטיים חסרים ביטוי RFP. הביטוי של RFP בכל תאי גוף השומן יצביע על כך שרקומבינציה מיטוטית בתיווך FLP / FRT לא הושרה בהצלחה או שהמוטציה היא קטלנית לתאים. במקרה האחרון (כלומר, אם המוטציה היא קטלנית), גוף השומן הזחל צפוי להכיל כמה תאים עם אותות RFP ברמה גבוהה יותר מאשר התאים הסובבים אותו.

באיור 2, GFP-Atg8a (ירוק) יצר פונקטה בתאים מסוג בר (אדום), מה שמרמז על כך שאוטופגיה נגרמה בהצלחה. בשיבוטים המוטנטיים (RFP negative), הדפוס של GFP-Atg8a puncta היה שונה מזה שבתאים מסוג בר שמסביב, מה שמרמז על פגמים באוטופגיה. מעט מאוד פונקטה של GFP-ATG8a זוהו בשיבוטים מוטנטיים של Mu1 (איור 2B), מה שמצביע על כך שאוטופגיה נחסמה בשלבי ההתחלה או הבשלה אוטוליזוזימית מואצת. המספרים והגודל של GFP-Atg8a puncta גדלו מאוד בשיבוטים מוטנטיים של Mu2 (איור 2C), מה שמרמז על איחוי אוטופגוזום-ליזוזום או פגמים בהחמצה אוטוליזוזומית. נדרשים ניסויים נוספים כדי להבחין בין אפשרויות אלה. יתר על כן, יש לכמת את הגדלים והמספר של פונקטה כדי לקבוע אם ההבדלים הנצפים מובהקים סטטיסטית.

Figure 1
איור 1: ייצוג סכמטי של הליכי הניסוי לניטור סמן האוטופגיה GFP-Atg8a בגוף שומן של זחל פסיפס הנושא שיבוטים מוטנטיים. מוצגת תוכנית המעבר ליצירת זבובים המבטאים GFP-Atg8a ברקמות גוף שומן הזחל ונושאים שיבוטים מוטנטיים (זן עם מוטציה נקודתית קטלנית [Mu] על כרומוזום X משמש כדוגמה). לאחר הלם חום ב 37 ° C במשך 1 שעה כדי להפעיל ביטוי FLP, תאים מוטנטיים הומוזיגוטים עם ביטוי GFP-Atg8a יכול להיווצר y' w * Mu FRT19A / hsFLP ubiRFP FRT19A; cgGal4 UAS-GFP-Atg8a / + גוף שומן הזחל. אוטופגיה נגרמת בגוף השומן על ידי דגירה של הזחלים בתמיסת 20% סוכרוז במשך 6 שעות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: הדפוסים של GFP-Atg8a puncta בשיבוטים של Mu1 ו-Mu2 היו שונים מאלה של שיבוטי הבקרה. Mu1 ו-Mu2 הם שני מוטנטים קטלניים עצמאיים בכרומוזום X. זבובי FRT19A איזוגניים y' w*, משמשים כבקרה. תבניות GFP-Atg8a (ירוקות) נותחו בגופי השומן של זחלי הפסיפס Mu1 או Mu2. השיבוטים המוטנטיים (או שיבוטי הבקרה) סומנו באופן שלילי על ידי RFP (אדום). (A) בשיבוט הבקרה (RFP שלילי), הדפוסים של GFP-Atg8a puncta היו דומים לאלה שבתאים החיוביים של RFP שמסביב. (B) בשיבוטים מוטנטיים Mu1 (RFP שלילי), ה-GFP-Atg8a puncta הופחת במידה ניכרת. (C) בשיבוטים מוטנטיים Mu2 (RFP שלילי), המספרים והגודל של GFP-Atg8a puncta גדלו. סרגל קנה מידה: 10 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הפרוטוקול הנוכחי מתאר את השיטות (1) ליצור זבובים הנושאים שיבוטים מוטנטיים בגופי שומן הזחל, (2) לגרום לאוטופגיה באמצעות רעב חומצות אמינו, ו-(3) לנתח את גופי השומן של הזחל. על מנת לייצר שיבוטים בהצלחה בגופי שומן הזחל, יש לבצע את השלבים הקריטיים הבאים בחריצות. (1) תזמון מדויק של שוק החום הוא קריטי מכיוון שרקומבינציה מיטוטית מתרחשת רק כאשר הרקמה עוברת מיטוזה, ו-(2) גם טמפרטורת הלם החום וגם משך הזמן קריטיים לגרימת ביטוי FLP. מומלץ אמבט מים סטנדרטי של 37 מעלות צלזיוס להלם חום של שעה אחת. בהתחשב באפשרות המוגברת למוות עוברי/זחל במהלך הלם חום ורעב, יש להגדיר מעברים מרובים ליצירת דגימת רקמה מספקת להדמיה.

בנוסף, ייתכן שיהיה צורך לשנות שלבים מסוימים בהתחשב בתנאי הטיפוח בפועל. לדוגמה, ההבדלים בסביבה ובתרבית דרוזופילה בין מעבדות עשויים להשפיע על קצב הגדילה של הזחלים. לכן, ייתכן שיהיה צורך לתקנן את זמן ההתפתחות הדרוש לעוברים כדי להגיע לשלב האינסטאר השלישי המוקדם ואת משך הרעב של הזחלים (גידול של 20% סוכרוז כדי לגרום לאוטופגיה) בכל מעבדה בנפרד.

GFP-Atg8a הוא הסמן הנפוץ ביותר לקביעת אוטופגיה. עם זאת, השינויים בתבנית הפונקטה GFP-Atg8a אינם מצליחים לאתר ישירות את הפגם האוטופגי המדויק או את השלב המושפע. לכן, יש לנתח סמנים מרובים כדי לפרש נתונים כאלה במדויק. הפרוטוקול המוצג כאן יכול להיות מותאם לחלבונים אחרים הקשורים לאוטופגיה עם הזנים הטרנסגניים שלהםבהתאמה 25. סמנים מרובים המסומנים בחלבונים פלואורסצנטיים שונים (כגון חלבון פלואורסצנטי כחול [BFP]) ניתנים לניתוח בו זמנית כדי להבהיר את תהליכי האתחול או האיחוי. שינוי אוטופגיה מבוקר, באמצעות כימיקלים26 או הפרעות RNA של גנים קריטיים27, יכול להיות משולב עם הגישה הנוכחית כדי להבהיר מנגנוני אוטופגיה עוד יותר. בנוסף, ניתוח סמנים חלבוניים אנדוגניים של אוטופגיה (באמצעות אימונוהיסטוכימיה) ברקמות פסיפס חשוב כדי לאשר את הפנוטיפים28.

למרות שאוטופגיה הוכרה במקור כתהליך אקראי ולא סלקטיבי, עדויות הולכות וגדלות מצביעות על כך שהיא יכולה להיות סלקטיבית ופוגעת באופן סלקטיבי באברונים ציטופלזמיים כגון מיטוכונדריה והרשתית האנדופלסמית, בין היתר29. יתר על כן, ההליך המתואר כאן יכול להיות מיושם כדי לחקור אוטופגיה סלקטיבית. לדוגמה, ניתן לנטר מיטופגיה בגופי שומן זבובים על ידי הצמדת חלבונים פלואורסצנטיים (כגון תגי טנדם Keima או GFP-RFP) לרצף מיקוד מיטוכונדריאלי30.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין ניגודי עניינים.

Acknowledgments

אנו אסירי תודה ל-THFC ול-BDSC על אספקת זני הזבובים. ד"ר טונג צ'או נתמך על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (32030027, 91754103, 92157201) וקרנות מחקר בסיסיות עבור האוניברסיטאות המרכזיות. אנו מודים למתקן הליבה של המכון למדעי החיים (LSI) על מתן השירותים.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL microcentrifuge tube Axygen MCT-150-C
#5 Forceps Dumont RS-5015
9 Dressions Spot plate PYREX 7220-85
Fluorescence Microscope Nikon SMZ1500
Glycerol Sangon Biotech A100854-0100
KCl Sangon Biotech A610440-0500 Composition of 1x PBS solution
KH2PO4 Sangon Biotech A600445-0500 Composition of 1x PBS solution
Laboratory spatula Fisher 14-375-10
Long forceps R' DEER RST-14
Microscope cover glass CITOTEST 80340-1130
Microscope slides CITOTEST 80302-2104
Na2HPO4 Sangon Biotech A501727-0500 Composition of 1x PBS solution
NaCl Sangon Biotech A610476-0005 Composition of 1x PBS solution
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 158127
Petri dish Corning 430166
Standard cornmeal/molasses/agar fly food Tong Lab-made
Stereo microscope Nikon SMZ745
Sucrose Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd. 10021418
Vectashield antifade mounting medium with DAPI Vectorlabratory H-1200-10 Recommended mounting medium
Fly stocks
y'w* Iso FRT19A Tong Lab's fly stocks
y'w* Mu1FRT19A/ FM7,Kr GFP Tong Lab's fly stocks
y'w* Mu2 FRT19A/ FM7,Kr GFP Tong Lab's fly stocks
hsFLP ubiRFP FRT19A; cgGal4 UAS-GFP-Atg8a Tong Lab's fly stocks

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Yorimitsu, T., Klionsky, D. J. Autophagy: Molecular machinery for self-eating. Cell Death & Differentiation. 12 (2), 1542-1552 (2005).
  2. Jin, S., White, E. Role of autophagy in cancer: Management of metabolic stress. Autophagy. 3 (1), 28-31 (2007).
  3. Mizushima, N., Levine, B. Autophagy in human diseases. New England Journal of Medicine. 383 (16), 1564-1576 (2020).
  4. Mizushima, N., et al. Autophagy fights disease through cellular self-digestion. Nature. 451 (7182), 1069-1075 (2008).
  5. Yang, Z., Klionsky, D. J. Eaten alive: A history of macroautophagy. Nature Cell Biology. 12 (9), 814-822 (2010).
  6. Lamb, C. A., Yoshimori, T., Tooze, S. A. The autophagosome: Origins unknown, biogenesis complex. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (12), 759-774 (2013).
  7. Klionsky, D. J., Eskelinen, E. L., Deretic, V. Autophagosomes, phagosomes, autolysosomes, phagolysosomes, autophagolysosomes...Wait,I'mconfused. Autophagy. 10 (4), 549-551 (2014).
  8. Zhang, S., Hama, Y., Mizushima, N. The evolution of autophagy proteins-Diversification in eukaryotes and potential ancestors in prokaryotes. Journal of Cell Science. 134 (13), (2021).
  9. Scott, R. C., Schuldiner, O., Neufeld, T. P. Role and regulation of starvation-induced autophagy in the Drosophila fat body. Developmental Cell. 7 (2), 167-178 (2004).
  10. Liu, W., et al. Mitochondrial protein import regulates cytosolic protein homeostasis and neuronal integrity. Autophagy. 14 (8), 1293-1309 (2018).
  11. Ichimura, Y., et al. A ubiquitin-like system mediates protein lipidation. Nature. 408 (6811), 488-492 (2000).
  12. Rusten, T. E., et al. Programmed autophagy in the Drosophila fat body is induced by ecdysone through regulation of the PI3K pathway. Developmental Cell. 7 (2), 179-192 (2004).
  13. Nishida, Y., et al. Discovery of Atg5/Atg7-independent alternative macroautophagy. Nature. 461 (7264), 654-658 (2009).
  14. Ravikumar, B., et al. Regulation of mammalian autophagy in physiology and pathophysiology. Physiological Reviews. 90 (4), 1383-1435 (2010).
  15. Xie, Z., Nair, U., Klionsky, D. J. Atg8 controls phagophore expansion during autophagosome formation. Molecular Biology of the Cell. 19 (8), 3290-3298 (2008).
  16. Shintani, T., Klionsky, D. J. Cargo proteins facilitate the formation of transport vesicles in the cytoplasm to vacuole targeting pathway. Journal of Biological Chemistry. 279 (29), 29889-29894 (2004).
  17. Russell, R. C., Yuan, H. X., Guan, K. L. Autophagy regulation by nutrient signaling. Cell Research. 24 (1), 42-57 (2014).
  18. Nagy, P., et al. How and why to study autophagy in Drosophila: It's more than just a garbage chute. Methods. 75, 151-161 (2015).
  19. Golic, K. G., Lindquist, S. The FLP recombinase of yeast catalyzes site-specific recombination in the Drosophila genome. Cell. 59 (3), 499-509 (1989).
  20. Senecoff, J. F., Cox, M. M. Directionality in FLP protein-promoted site-specific recombination is mediated by DNA-DNA pairing. Journal of Biological Chemistry. 261 (16), 7380-7386 (1986).
  21. Germani, F., Bergantinos, C., Johnston, L. A. Mosaic analysis in Drosophila. Genetics. 208 (2), 473-490 (2018).
  22. Zappia, M. P., et al. E2F/Dp inactivation in fat body cells triggers systemic metabolic changes. eLife. 10, 67753 (2021).
  23. Demerec, M. Biology of Drosophila. , Hafner Pub. Co. New York, NJ. (1965).
  24. Rizki, R. M., et al. Drosophila larval fat body surfaces. Wilhelm Roux's Archives of Developmental Biology. 192 (1), 1-7 (1983).
  25. Szeto, J., et al. ALIS are stress-induced protein storage compartments for substrates of the proteasome and autophagy. Autophagy. 2 (3), 189-199 (2006).
  26. Renna, M., et al. Chemical inducers of autophagy that enhance the clearance of mutant proteins in neurodegenerative diseases. Journal of Biological Chemistry. 285 (15), 11061-11067 (2010).
  27. Guo, S., et al. A large-scale RNA interference screen identifies genes that regulate autophagy at different stages. Scientific Reports. 8, 1-15 (2018).
  28. Tian, W., et al. An antibody for analysis of autophagy induction. Nature Methods. 17 (2), 232-239 (2020).
  29. Nezis, I. P. Selective autophagy in Drosophila. International Journal of Cell Biology. 2012, 146767 (2012).
  30. Chu, Y., et al. Fluorescent materials for monitoring mitochondrial biology. Materials. 14 (15), 4180 (2021).

Tags

החודש ב-JoVE גיליון 186
ניתוח אוטופגיה הנגרמת על ידי רעב בגוף השומן של הזחל <em>Drosophila melanogaster</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Shi, K., Tong, C. Analyzing… More

Shi, K., Tong, C. Analyzing Starvation-Induced Autophagy in the Drosophila melanogaster Larval Fat Body. J. Vis. Exp. (186), e64282, doi:10.3791/64282 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter