Analyse der Hunger-induzierten Autophagie in der Drosophila melanogaster-Larve des Fettkörpers
Summary
Das vorliegende Protokoll beschreibt die Induktion von Autophagie im Fettkörper der Drosophila melanogaster-Larve durch Nährstoffmangel und analysiert Veränderungen in der Autophagie anhand transgener Fliegenstämme.
Abstract
Autophagie ist ein zellulärer Selbstverdauungsprozess. Es liefert Fracht an die Lysosomen, die als Reaktion auf verschiedene Belastungen, einschließlich Hunger, abgebaut werden. Die Fehlfunktion der Autophagie wird mit dem Altern und mehreren menschlichen Krankheiten in Verbindung gebracht. Die Autophagie-Maschinerie ist hochkonserviert – von der Hefe bis zum Menschen. Der Larvenfettkörper von Drosophila melanogaster, einem Analogon für Leber und Fettgewebe von Wirbeltieren, stellt ein einzigartiges Modell für die Überwachung der Autophagie in vivo dar. Autophagie kann leicht durch Nährstoffmangel im Fettkörper der Larve induziert werden. Die meisten Autophagie-assoziierten Gene sind in Drosophila konserviert. Es wurden viele transgene Fliegenstämme entwickelt, die markierte Autophagiemarker exprimieren, was die Überwachung verschiedener Schritte im Autophagieprozess erleichtert. Die klonale Analyse ermöglicht einen genauen Vergleich von Autophagie-Markern in Zellen mit unterschiedlichen Genotypen im selben Gewebestück. Das aktuelle Protokoll beschreibt Verfahren für (1) die Erzeugung somatischer Klone im Larvenfettkörper, (2) die Induktion von Autophagie durch Aminosäuremangel und (3) die Präparation des Larvenfettkörpers, mit dem Ziel, ein Modell für die Analyse von Unterschieden in der Autophagie unter Verwendung eines Autophagosomenmarkers (GFP-Atg8a) und einer klonalen Analyse zu erstellen.
Introduction
Autophagie ist ein “selbstfressender” Prozess, der durch verschiedene Stressfaktoren induziert wird, einschließlich Aminosäuremangel1. Die Makroautophagie (im Folgenden als Autophagie bezeichnet) ist die am besten untersuchte Form der Autophagie und spielt eine unersetzliche Rolle bei der Aufrechterhaltung der zellulären Homöostase2. Die Fehlfunktion der Autophagie wird mit mehreren menschlichen Krankheiten in Verbindung gebracht3. Darüber hinaus sind einige Gene, die mit der Autophagie in Verbindung stehen, potenzielle Ziele für die Behandlung verschiedener Krankheiten4.
Die Autophagie wird auf hochentwickelte Weise reguliert5. Bei Hunger sequestrieren die Isolationsmembranen zytoplasmatisches Material, um doppelmembranige Autophagosomen zu bilden6. Autophagosomen verschmelzen dann mit Endosomen und Lysosomen zu Amphisomen und Autolysosomen. Mit Hilfe lysosomaler hydrolytischer Enzyme wird der eingeschlossene zytoplasmatische Inhalt abgebaut und die Nährstoffe recycelt7.
Autophagie ist ein evolutionär konservierter Prozess8. Drosophila melanogaster ist ein großartiges Modell, um den Autophagieprozess in vivo zu untersuchen. Aminosäuremangel induziert leicht Autophagie im Körpergewebe von Fliegenfett, einem Analogon der menschlichen Leber und des Fettgewebes9. Defekte in der Autophagie stören die unterschiedlichen Puncta-Muster mehrerer Autophagie-verwandter Proteine, wie z.B. Atg8, Atg9, Atg18, Syx17, Rab7, LAMP1 und p62, um nur einige zu nennen10. Daher wird die Analyse der Muster dieser Autophagiemarker helfen, das Auftreten von Autophagiedefekten und den defekten Autophagieschritt zu erkennen. So ist beispielsweise das Ubiquitin-ähnliche Protein Atg8 der am häufigsten verwendete Autophagiemarker11. In Drosophila melanogaster wurden erfolgreich transgene Stämme mit einem grün fluoreszierenden Protein (GFP)-markiertem Atg8a entwickelt12. GFP-Atg8a diffundiert im Zytosol und in den Zellkernen der gefütterten Zellen. Nach dem Aushungern wird GFP-Atg8a durch Phosphatidylethanolamin (PE) prozessiert und modifiziert und bildet Puncta, die die Isolationsmembranen und voll entwickelten Autophagosomen markieren13,14. Durch direkte Fluoreszenzmikroskopie kann die Autophagie-Induktion leicht als Erhöhung der GFP-Atg8-Puncta-Bildung beobachtet werden15. Atg8a puncta würde sich nicht als Reaktion auf Hunger in Gegenwart eines Autophagie-Initiationsdefekts bilden. Da GFP-Atg8a durch den niedrigen pH-Wert in Autolysosomen abgeschreckt und verdaut werden kann, kann die Anzahl von GFP-Atg8a puncta zunehmen, wenn die Autophagie in späten Stadien blockiert wird16.
Da die Autophagie sehr empfindlich auf die Verfügbarkeit von Nährstoffen reagiert17, führen geringfügige Unterschiede in den Kulturbedingungen oft zu Variationen der Phänotypen. Daher hat die klonale Analyse, eine Methode, die mutierte Zellen im Vergleich zu Wildtyp-Kontrollzellen im selben Gewebe analysiert, einen großen Vorteil bei der Analyse von Autophagie-Defekten18. Unter Ausnutzung der Flippase/Flippase Recognition Target (FLP/FRT)-vermittelten ortsspezifischen Rekombination zwischen homologen Chromosomen werden Fliegen, die Mosaikgewebe tragen, leicht hergestellt19,20. Die Wildtyp-Zellen, die die mutierten Zellen umgeben, bilden eine perfekte interne Kontrolle, um individuelle Unterschiede zu vermeiden21.
Die vorliegende Arbeit beschreibt, wie Autophagie durch Aminosäuremangel induziert und GFP-Atg8a-exprimierendes Mosaikfettgewebe erzeugt werden kann. Diese Protokolle können zur Analyse von Unterschieden in der Autophagie zwischen mutierten Klonen verwendet werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das vorliegende Protokoll beschreibt die Methoden, um (1) Fliegen zu erzeugen, die mutierte Klone in den Larvenfettkörpern tragen, (2) Autophagie durch Aminosäuremangel zu induzieren und (3) die Larvenfettkörper zu sezieren. Um erfolgreich Klone in den Fettkörpern der Larven zu erzeugen, müssen die folgenden kritischen Schritte gewissenhaft durchgeführt werden. (1) Das genaue Timing des Hitzeschocks ist entscheidend, da die mitotische Rekombination nur dann stattfindet, wenn das Gewebe eine Mitose durchläuft, und …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken THFC und BDSC für die Bereitstellung der Fliegenstämme. Dr. Tong Chao wird von der National Natural Science Foundation of China (32030027, 91754103, 92157201) und Grundlagenforschungsfonds für die zentralen Universitäten unterstützt. Wir danken der Core Facility im Life Sciences Institute (LSI) für die Bereitstellung von Dienstleistungen.
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Axygen | MCT-150-C | |
| #5 Forceps | Dumont | RS-5015 | |
| 9 Dressions Spot plate | PYREX | 7220-85 | |
| Fluorescence Microscope | Nikon | SMZ1500 | |
| Glycerol | Sangon Biotech | A100854-0100 | |
| KCl | Sangon Biotech | A610440-0500 | Composition of 1x PBS solution |
| KH2PO4 | Sangon Biotech | A600445-0500 | Composition of 1x PBS solution |
| Laboratory spatula | Fisher | 14-375-10 | |
| Long forceps | R' DEER | RST-14 | |
| Microscope cover glass | CITOTEST | 80340-1130 | |
| Microscope slides | CITOTEST | 80302-2104 | |
| Na2HPO4 | Sangon Biotech | A501727-0500 | Composition of 1x PBS solution |
| NaCl | Sangon Biotech | A610476-0005 | Composition of 1x PBS solution |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Petri dish | Corning | 430166 | |
| Standard cornmeal/molasses/agar fly food | Tong Lab-made | ||
| Stereo microscope | Nikon | SMZ745 | |
| Sucrose | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd. | 10021418 | |
| Vectashield antifade mounting medium with DAPI | Vectorlabratory | H-1200-10 | Recommended mounting medium |
| Fly stocks | |||
| y'w* Iso FRT19A | Tong Lab's fly stocks | ||
| y'w* Mu1FRT19A/ FM7,Kr GFP | Tong Lab's fly stocks | ||
| y'w* Mu2 FRT19A/ FM7,Kr GFP | Tong Lab's fly stocks | ||
| hsFLP ubiRFP FRT19A; cgGal4 UAS-GFP-Atg8a | Tong Lab's fly stocks |
References
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