Das vorliegende Protokoll beschreibt die Induktion von Autophagie im Fettkörper der Drosophila melanogaster-Larve durch Nährstoffmangel und analysiert Veränderungen in der Autophagie anhand transgener Fliegenstämme.
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Methodenartikel
Analyse der Hunger-induzierten Autophagie in der Drosophila melanogaster-Larve des Fettkörpers
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Autophagie ist ein zellulärer Selbstverdauungsprozess. Es liefert Fracht an die Lysosomen, die als Reaktion auf verschiedene Belastungen, einschließlich Hunger, abgebaut werden. Die Fehlfunktion der Autophagie wird mit dem Altern und mehreren menschlichen Krankheiten in Verbindung gebracht. Die Autophagie-Maschinerie ist hochkonserviert - von der Hefe bis zum Menschen. Der Larvenfettkörper von Drosophila melanogaster, einem Analogon für Leber und Fettgewebe von Wirbeltieren, stellt ein einzigartiges Modell für die Überwachung der Autophagie in vivo dar. Autophagie kann leicht durch Nährstoffmangel im Fettkörper der Larve induziert werden. Die meisten Autophagie-assoziierten Gene sind in Drosophila konserviert. Es wurden viele transgene Fliegenstämme entwickelt, die markierte Autophagiemarker exprimieren, was die Überwachung verschiedener Schritte im Autophagieprozess erleichtert. Die klonale Analyse ermöglicht einen genauen Vergleich von Autophagie-Markern in Zellen mit unterschiedlichen Genotypen im selben Gewebestück. Das aktuelle Protokoll beschreibt Verfahren für (1) die Erzeugung somatischer Klone im Larvenfettkörper, (2) die Induktion von Autophagie durch Aminosäuremangel und (3) die Präparation des Larvenfettkörpers, mit dem Ziel, ein Modell für die Analyse von Unterschieden in der Autophagie unter Verwendung eines Autophagosomenmarkers (GFP-Atg8a) und einer klonalen Analyse zu erstellen.
Einleitung
Autophagie ist ein "selbstfressender" Prozess, der durch verschiedene Stressfaktoren induziert wird, einschließlich Aminosäuremangel1. Die Makroautophagie (im Folgenden als Autophagie bezeichnet) ist die am besten untersuchte Form der Autophagie und spielt eine unersetzliche Rolle bei der Aufrechterhaltung der zellulären Homöostase2. Die Fehlfunktion der Autophagie wird mit mehreren menschlichen Krankheiten in Verbindung gebracht3. Darüber hinaus sind einige Gene, die mit der Autophagie in Verbindung stehen, potenzielle Ziele für die Behandlung verschiedener Krankheiten4. <....
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Protokoll
1. Drosophila-Kreuzung und Eiablage
- 3 männliche (Genotyp hsFLP ubiRFP FRT19A; cgGal4 UAS-GFP-Atg8a) und 15 weibliche (Genotyp y' w* Mu FRT19A/ FM7, Kr GFP) adulte Fliegen (siehe Materialtabelle) werden zur Paarung in ein Kulturfläschchen (mit Standard-Maismehl/Melasse/Agar-Drosophila-Medium bei 25 °C) gegeben.
HINWEIS: Es müssen mehrere Kulturfläschchen derselben Kreuzung aufgestellt werden, um sicherzustellen, dass genügend Larven für weitere Experimente vorhanden sind. Der männliche Fliegenstamm mit dem Genotyp hsFLP ubiRFP FRT19A; cgGal4 UAS-GFP-Atg8a trägt eine FRT-Stelle am X-C....
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Ergebnisse
Unter gefütterten Bedingungen wird das GFP-markierte Ubiquitin-ähnliche Protein, GFP-Atg8a, in den Zellen diffundiert. Beim Verhungern bildet es grüne Puncta und markiert Autophagosomen. Sobald Autophagosomen mit Lysosomen verschmelzen, wird GFP in den sauren Autolysosomen gelöscht und die grünen Puncta verschwinden. Wenn keine Autophagie induziert wird oder die Autophagosomenreifung beschleunigt wird, ist zu erwarten, dass die Anzahl der GFP-Puncta gering ist. Wenn jedoch die Fusion zwischen Autophagosomen und Lysosomen.......
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Diskussion
Das vorliegende Protokoll beschreibt die Methoden, um (1) Fliegen zu erzeugen, die mutierte Klone in den Larvenfettkörpern tragen, (2) Autophagie durch Aminosäuremangel zu induzieren und (3) die Larvenfettkörper zu sezieren. Um erfolgreich Klone in den Fettkörpern der Larven zu erzeugen, müssen die folgenden kritischen Schritte gewissenhaft durchgeführt werden. (1) Das genaue Timing des Hitzeschocks ist entscheidend, da die mitotische Rekombination nur dann stattfindet, wenn das Gewebe eine Mitose durchläuft, und (2) sow.......
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Offenlegungen
Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.
Danksagungen
Wir danken THFC und BDSC für die Bereitstellung der Fliegenstämme. Dr. Tong Chao wird von der National Natural Science Foundation of China (32030027, 91754103, 92157201) und Grundlagenforschungsfonds für die zentralen Universitäten unterstützt. Wir danken der Core Facility im Life Sciences Institute (LSI) für die Bereitstellung von Dienstleistungen.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen | Axygen | MCT-150-C | |
| #5 Pinzette | Dumont | RS-5015 | |
| 9 Dressions Spotplatte | PYREX | 7220-85 | |
| Fluoreszenzmikroskop | Nikon | SMZ1500 | |
| Glycerol | Sangon Biotech | A100854-0100 | |
| KCl | Sangon Biotech | A610440-0500 | Zusammensetzung von 1x PBS-Lösung |
| KH2PO4 | Sangon Biotech | A600445-0500 | Zusammensetzung von 1x PBS-Lösung |
| Laborspatel | Fisher | 14-375-10 | |
| Lange Pinzette | R' DEER | RST-14 | |
| Mikroskop-Deckglas | CITOTEST | 80340-1130 | |
| Objektträger | CITOTEST | 80302-2104 | |
| Na2HPO4 | Sangon Biotech | A501727-0500 | Zusammensetzung von 1x PBS-Lösung |
| NaCl | Sangon Biotech | A610476-0005 | Zusammensetzung von 1x PBS-Lösung |
| Paraformaldehyd | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Petrischale | Corning | 430166 | |
| Standard Maismehl / Melasse / Agar Fliegenfutter | Tong Lab-made | ||
| Stereomikroskop | Nikon | SMZ745 | |
| Saccharose | Sinopharm Chemisches Reagenz Co., Ltd. | ||
| Vectashield Antifading-Eindeckmedium mit DAPI | Vectorlabratory | H-1200-10 | Empfohlenes Eindeckmedium |
| Fly stocks | |||
| y'w* Iso FRT19A | Tong Lab's Fly Stocks | ||
| y'w* Mu1FRT19A/ FM7,Kr GFP | Tong Lab's Fliegenstöcke< | ||
| em>y'w* Mu2 FRT19A/ FM7,Kr GFP | Tong Lab's Fliegenstöcke | ||
| hsFLP ubiRFP FRT19A; cgGal4 UAS-GFP-Atg8a | Tong Lab's Fliegenstöcke |
Referenzen
- Yorimitsu, T., Klionsky, D. J. Autophagy: Molecular machinery for self-eating. Cell Death & Differentiation. 12 (2), 1542-1552 (2005).
- Jin, S., White, E. Role of autophagy in cancer: Management of metabolic stress. Autophagy. 3 (1), 28-31 (2007).
- Mizushi....
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Nachdrucke und Genehmigungen
