Analyse van door uithongering geïnduceerde autofagie in het Drosophila melanogaster larvale vetlichaam
Summary
Het huidige protocol beschrijft de inductie van autofagie in het Drosophila melanogaster larvaal vetlichaam via nutriëntendepletie en analyseert veranderingen in autofagie met behulp van transgene vliegenstammen.
Abstract
Autofagie is een cellulair zelfverteringsproces. Het levert lading aan de lysosomen voor degradatie als reactie op verschillende spanningen, waaronder uithongering. De storing van autofagie wordt geassocieerd met veroudering en meerdere menselijke ziekten. De autofagiemachinerie is sterk geconserveerd – van gist tot mens. Het larvale vetlichaam van Drosophila melanogaster, een analoog voor gewervelde lever en vetweefsel, biedt een uniek model voor het monitoren van autofagie in vivo. Autofagie kan gemakkelijk worden geïnduceerd door uithongering van voedingsstoffen in het larvale vetlichaam. De meeste autofagie-gerelateerde genen worden bewaard in Drosophila. Er zijn veel transgene vliegenstammen ontwikkeld die gelabelde autofagiemarkers tot expressie brengen, wat de monitoring van verschillende stappen in het autofagieproces vergemakkelijkt. De klonale analyse maakt een nauwkeurige vergelijking mogelijk van autofagiemarkers in cellen met verschillende genotypen in hetzelfde stuk weefsel. Het huidige protocol beschrijft procedures voor (1) het genereren van somatische klonen in het larvale vetlichaam, (2) het induceren van autofagie via aminozuuruithongering en (3) het ontleden van het larvale vetlichaam, met als doel een model te creëren voor het analyseren van verschillen in autofagie met behulp van een autofagosoommarker (GFP-Atg8a) en klonale analyse.
Introduction
Autofagie is een “zelf-etend” proces geïnduceerd door verschillende stress, waaronder aminozuurhonger1. Macroautofagie (hierna autofagie genoemd) is het meest bestudeerde type autofagie en speelt een onvervangbare rol bij het handhaven van cellulaire homeostase2. De storing van autofagie is geassocieerd met verschillende menselijke ziekten3. Bovendien zijn sommige autofagie-gerelateerde genen potentiële doelwitten voor de behandeling van verschillende ziekten4.
Autofagie wordt op een zeer geavanceerde manier gereguleerd5. Bij uithongering sequesteren de isolatiemembranen cytoplasmatische materialen om dubbelmembrane autofagosomen te vormen6. Autofagosomen fuseren dan met endosomen en lysosomen om amfosomen en autolysosomen te vormen. Met behulp van lysosomale hydrolytische enzymen wordt de overspoelde cytoplasmatische inhoud afgebroken en worden de voedingsstoffen gerecycled7.
Autofagie is een evolutionair geconserveerd proces8. Drosophila melanogaster is een geweldig model voor het bestuderen van het autofagieproces in vivo. Aminozuurhonger induceert gemakkelijk autofagie in vliegvet lichaamsweefsel, een analoog van menselijke lever en vetweefsel9. Defecten in autofagie verstoren de verschillende punctapatronen van verschillende autofagie-gerelateerde eiwitten, zoals Atg8, Atg9, Atg18, Syx17, Rab7, LAMP1 en p62, onder andere10. Daarom zal het analyseren van de patronen van deze autofagiemarkers helpen bij het onderscheiden van het optreden van autofagiedefecten en de defecte autofagiestap. Het ubiquitine-achtige eiwit Atg8 is bijvoorbeeld de meest gebruikte autofagiemarker11. In Drosophila melanogaster zijn transgene stammen met een groen fluorescerend eiwit (GFP)-gelabeld Atg8a met succes ontwikkeld12. GFP-Atg8a wordt verspreid in het cytosol en de kernen in de gevoede cellen. Bij uithongering wordt GFP-Atg8a verwerkt en gemodificeerd door fosfatidylethanolamine (PE) en vormt puncta, die de isolatiemembranen en volledig ontwikkelde autofagosomen labelen13,14. Door middel van directe fluorescentiemicroscopie kan de autofagie-inductie gemakkelijk worden waargenomen als een toename van GFP-Atg8 punctavorming15. Atg8a puncta zou zich niet vormen als reactie op uithongering in de aanwezigheid van een autofagie-initiatiedefect. Omdat GFP-Atg8a kan worden geblust en verteerd door de lage pH in autolysosomen, kan GFP-Atg8a puncta in aantal toenemen als autofagie in late stadia wordt geblokkeerd16.
Omdat autofagie zeer gevoelig is voor de beschikbaarheid van voeding17, leiden kleine verschillen in kweekomstandigheden vaak tot variaties in fenotypen. Daarom heeft klonale analyse, een methode die mutante cellen analyseert versus wild-type controlecellen in hetzelfde weefsel, een groot voordeel bij het ontleden van autofagiedefecten18. Door gebruik te maken van flippase / flippase recognition target (FLP / FRT) -gemedieerde site-specifieke recombinatie tussen homologe chromosomen, worden vliegen die mozaïekweefsels dragen gemakkelijk gemaakt19,20. De wild-type cellen rond de mutante cellen vormen een perfecte interne controle om individuele verschillen te voorkomen21.
De huidige studie beschrijft hoe autofagie te induceren door aminozuurhonger en GFP-Atg8a-expressie mozaïekvetweefsels te genereren. Deze protocollen kunnen worden gebruikt voor het analyseren van verschillen in autofagie tussen gemuteerde klonen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het huidige protocol beschrijft de methoden om (1) vliegen te genereren die gemuteerde klonen in de larvale vetlichamen dragen, (2) autofagie te induceren door aminozuurhonger en (3) de larvale vetlichamen te ontleden. Om met succes klonen in de larvale vetlichamen te genereren, moeten de volgende kritieke stappen ijverig worden uitgevoerd. (1) Het nauwkeurig timen van de hitteschok is cruciaal omdat mitotische recombinatie alleen optreedt wanneer het weefsel mitose ondergaat, en (2) zowel de temperatuur als de duur van …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We zijn THFC en BDSC dankbaar voor het leveren van de vliegsoorten. Dr. Tong Chao wordt ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (32030027, 91754103, 92157201) en fundamentele onderzoeksfondsen voor de centrale universiteiten. We danken de kernfaciliteit in het Life Sciences Institute (LSI) voor het verlenen van diensten.
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Axygen | MCT-150-C | |
| #5 Forceps | Dumont | RS-5015 | |
| 9 Dressions Spot plate | PYREX | 7220-85 | |
| Fluorescence Microscope | Nikon | SMZ1500 | |
| Glycerol | Sangon Biotech | A100854-0100 | |
| KCl | Sangon Biotech | A610440-0500 | Composition of 1x PBS solution |
| KH2PO4 | Sangon Biotech | A600445-0500 | Composition of 1x PBS solution |
| Laboratory spatula | Fisher | 14-375-10 | |
| Long forceps | R' DEER | RST-14 | |
| Microscope cover glass | CITOTEST | 80340-1130 | |
| Microscope slides | CITOTEST | 80302-2104 | |
| Na2HPO4 | Sangon Biotech | A501727-0500 | Composition of 1x PBS solution |
| NaCl | Sangon Biotech | A610476-0005 | Composition of 1x PBS solution |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Petri dish | Corning | 430166 | |
| Standard cornmeal/molasses/agar fly food | Tong Lab-made | ||
| Stereo microscope | Nikon | SMZ745 | |
| Sucrose | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd. | 10021418 | |
| Vectashield antifade mounting medium with DAPI | Vectorlabratory | H-1200-10 | Recommended mounting medium |
| Fly stocks | |||
| y'w* Iso FRT19A | Tong Lab's fly stocks | ||
| y'w* Mu1FRT19A/ FM7,Kr GFP | Tong Lab's fly stocks | ||
| y'w* Mu2 FRT19A/ FM7,Kr GFP | Tong Lab's fly stocks | ||
| hsFLP ubiRFP FRT19A; cgGal4 UAS-GFP-Atg8a | Tong Lab's fly stocks |
References
- Yorimitsu, T., Klionsky, D. J. Autophagy: Molecular machinery for self-eating. Cell Death & Differentiation. 12 (2), 1542-1552 (2005).
- Jin, S., White, E. Role of autophagy in cancer: Management of metabolic stress. Autophagy. 3 (1), 28-31 (2007).
- Mizushima, N., Levine, B. Autophagy in human diseases. New England Journal of Medicine. 383 (16), 1564-1576 (2020).
- Mizushima, N., et al. Autophagy fights disease through cellular self-digestion. Nature. 451 (7182), 1069-1075 (2008).
- Yang, Z., Klionsky, D. J. Eaten alive: A history of macroautophagy. Nature Cell Biology. 12 (9), 814-822 (2010).
- Lamb, C. A., Yoshimori, T., Tooze, S. A. The autophagosome: Origins unknown, biogenesis complex. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (12), 759-774 (2013).
- Klionsky, D. J., Eskelinen, E. L., Deretic, V. Autophagosomes, phagosomes, autolysosomes, phagolysosomes, autophagolysosomes…Wait,I’mconfused. Autophagy. 10 (4), 549-551 (2014).
- Zhang, S., Hama, Y., Mizushima, N. The evolution of autophagy proteins-Diversification in eukaryotes and potential ancestors in prokaryotes. Journal of Cell Science. 134 (13), (2021).
- Scott, R. C., Schuldiner, O., Neufeld, T. P. Role and regulation of starvation-induced autophagy in the Drosophila fat body. Developmental Cell. 7 (2), 167-178 (2004).
- Liu, W., et al. Mitochondrial protein import regulates cytosolic protein homeostasis and neuronal integrity. Autophagy. 14 (8), 1293-1309 (2018).
- Ichimura, Y., et al. A ubiquitin-like system mediates protein lipidation. Nature. 408 (6811), 488-492 (2000).
- Rusten, T. E., et al. Programmed autophagy in the Drosophila fat body is induced by ecdysone through regulation of the PI3K pathway. Developmental Cell. 7 (2), 179-192 (2004).
- Nishida, Y., et al. Discovery of Atg5/Atg7-independent alternative macroautophagy. Nature. 461 (7264), 654-658 (2009).
- Ravikumar, B., et al. Regulation of mammalian autophagy in physiology and pathophysiology. Physiological Reviews. 90 (4), 1383-1435 (2010).
- Xie, Z., Nair, U., Klionsky, D. J. Atg8 controls phagophore expansion during autophagosome formation. Molecular Biology of the Cell. 19 (8), 3290-3298 (2008).
- Shintani, T., Klionsky, D. J. Cargo proteins facilitate the formation of transport vesicles in the cytoplasm to vacuole targeting pathway. Journal of Biological Chemistry. 279 (29), 29889-29894 (2004).
- Russell, R. C., Yuan, H. X., Guan, K. L. Autophagy regulation by nutrient signaling. Cell Research. 24 (1), 42-57 (2014).
- Nagy, P., et al. How and why to study autophagy in Drosophila: It’s more than just a garbage chute. Methods. 75, 151-161 (2015).
- Golic, K. G., Lindquist, S. The FLP recombinase of yeast catalyzes site-specific recombination in the Drosophila genome. Cell. 59 (3), 499-509 (1989).
- Senecoff, J. F., Cox, M. M. Directionality in FLP protein-promoted site-specific recombination is mediated by DNA-DNA pairing. Journal of Biological Chemistry. 261 (16), 7380-7386 (1986).
- Germani, F., Bergantinos, C., Johnston, L. A. Mosaic analysis in Drosophila. Genetics. 208 (2), 473-490 (2018).
- Zappia, M. P., et al. E2F/Dp inactivation in fat body cells triggers systemic metabolic changes. eLife. 10, 67753 (2021).
- Demerec, M. . Biology of Drosophila. , (1965).
- Rizki, R. M., et al. Drosophila larval fat body surfaces. Wilhelm Roux’s Archives of Developmental Biology. 192 (1), 1-7 (1983).
- Szeto, J., et al. ALIS are stress-induced protein storage compartments for substrates of the proteasome and autophagy. Autophagy. 2 (3), 189-199 (2006).
- Renna, M., et al. Chemical inducers of autophagy that enhance the clearance of mutant proteins in neurodegenerative diseases. Journal of Biological Chemistry. 285 (15), 11061-11067 (2010).
- Guo, S., et al. A large-scale RNA interference screen identifies genes that regulate autophagy at different stages. Scientific Reports. 8, 1-15 (2018).
- Tian, W., et al. An antibody for analysis of autophagy induction. Nature Methods. 17 (2), 232-239 (2020).
- Nezis, I. P. Selective autophagy in Drosophila. International Journal of Cell Biology. 2012, 146767 (2012).
- Chu, Y., et al. Fluorescent materials for monitoring mitochondrial biology. Materials. 14 (15), 4180 (2021).
