ショウジョウバエメラノガスター幼虫脂肪体における飢餓誘発オートファジーの解析
Summary
本プロトコルは、ショ ウジョウバエメラノガスター 幼虫の脂肪体における栄養素の枯渇 による オートファジーの誘導を説明し、トランスジェニックハエ株を使用してオートファジーの変化を分析します。
Abstract
オートファジーは細胞の自己消化プロセスです。飢餓を含む様々なストレスに応答して分解のためにリソソームに貨物を届ける。オートファジーの機能不全は、老化と複数の人間の病気に関連しています。オートファジー機構は、酵母からヒトまで高度に保存されています。脊椎動物の肝臓および脂肪組織の類似体である ショウジョウバエメラノガスターの幼虫脂肪体は、 in vivoでオートファジーをモニタリングするためのユニークなモデルを提供します。オートファジーは、幼虫の脂肪体の栄養飢餓によって容易に誘発される可能性があります。ほとんどのオートファジー関連遺伝子は ショウジョウバエに保存されています。 タグ付けされたオートファジーマーカーを発現する多くのトランスジェニックハエ株が開発されており、オートファジープロセスのさまざまなステップのモニタリングが容易になっています。クローン解析により、同じ組織片内の異なる遺伝子型を持つ細胞のオートファジーマーカーを綿密に比較することができます。本プロトコルでは、(1)幼虫の脂肪体内で体細胞クローンを作製する手順、(2)アミノ酸飢餓 による オートファジーの誘導、(3)幼虫の脂肪体を解剖する手順を詳述し、オートファゴソームマーカー(GFP-Atg8a)を用いたオートファジーの違いを解析するモデルの作成とクローン解析を目指しています。
Introduction
オートファジーは、アミノ酸飢餓を含むさまざまなストレスによって引き起こされる「自食」プロセスです1。マクロオートファジー(以下、オートファジーと呼びます)は、最もよく研究されているタイプのオートファジーであり、細胞の恒常性を維持する上でかけがえのない役割を果たしています2。オートファジーの機能不全は、いくつかのヒト疾患と関連している3。さらに、いくつかのオートファジー関連遺伝子は、さまざまな疾患を治療するための潜在的な標的です4。
オートファジーは高度に高度に制御されています5.飢餓状態になると、単離膜は細胞質物質を隔離して二重膜オートファゴソームを形成する6。次に、オートファゴソームはエンドソームおよびリソソームと融合して、アンフィソームおよびオートリソソームを形成します。リソソーム加水分解酵素の助けを借りて、飲み込まれた細胞質内容物が分解され、栄養素がリサイクルされます7。
オートファジーは進化的に保存されたプロセスです8。ショウジョウバエメラノガスターは、in vivoでのオートファジープロセスを研究するための優れたモデルです。アミノ酸飢餓は、ヒト肝臓および脂肪組織の類似体であるハエ脂肪体組織においてオートファジーを容易に誘導する9。オートファジーの欠陥は、Atg8、Atg9、Atg18、Syx17、Rab7、LAMP1、p62など、いくつかのオートファジー関連タンパク質の明確な点状突起パターンを破壊します10。したがって、これらのオートファジーマーカーのパターンを分析することは、オートファジー欠陥の発生とオートファジーステップの欠陥を識別するのに役立ちます。例えば、ユビキチン様タンパク質Atg8は、最も一般的に使用されるオートファジーマーカー11である。ショウジョウバエメラノガスターでは、緑色蛍光タンパク質(GFP)タグ付きAtg8aを有するトランスジェニック株の開発に成功しました12。GFP-Atg8aは、細胞質ゾルおよび栄養細胞内の核に拡散する。飢餓状態になると、GFP-Atg8aはホスファチジルエタノールアミン(PE)によって処理および修飾され、単離膜および完全に発達したオートファゴソームを標識するプンクタを形成します13,14。直接蛍光顕微鏡法により、オートファジー誘導はGFP-Atg8点状突起形成の増加として容易に観察することができる15。Atg8aプンクタは、オートファジー開始欠陥の存在下では飢餓に応答して形成されないであろう。GFP-Atg8aはオートリソソームの低pHによって消光および消化できるため、オートファジーが後期段階でブロックされると、GFP-Atg8aの点状突起の数が増える可能性があります16。
オートファジーは栄養の入手可能性に非常に敏感であるため17、培養条件のわずかな違いが表現型の変動につながることがよくあります。したがって、クローン解析は、同じ組織内の変異細胞対野生型コントロール細胞を分析する方法であり、オートファジー欠損を解剖する上で大きな利点を有する18。フリップパーゼ/フリッパーゼ認識ターゲット(FLP/FRT)を介した相同染色体間の部位特異的組換えを利用して、モザイク組織を運ぶハエを容易に作製する19,20。変異細胞を取り囲む野生型細胞は、個体差を避けるための完全な内部コントロールを形成する21。
本研究では、アミノ酸飢餓によりオートファジーを誘導し、GFP-Atg8a発現モザイク脂肪体組織を作製する方法について述べる。これらのプロトコルは、変異クローン間のオートファジーの違いを分析するために使用できます。
Protocol
Representative Results
Discussion
本プロトコルは、(1)幼虫の脂肪体に変異クローンを運ぶハエを作製し、(2)アミノ酸飢餓によってオートファジーを誘導し、(3)幼虫の脂肪体を解剖する方法を記載しています。幼虫の脂肪体でクローンを正常に生成するためには、以下の重要なステップを熱心に実行する必要があります。(1)組織が有糸分裂を起こしている場合にのみ有糸分裂の再結合が起こるため、ヒートショックの正確なタ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ハエ株を提供してくれたTHFCとBDSCに感謝しています。Tong Chao博士は、中国国家自然科学財団(32030027、91754103、92157201)および中央大学の基礎研究基金の支援を受けています。私たちは、サービスを提供してくれたライフサイエンスインスティテュート(LSI)の中核施設に感謝します。
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Axygen | MCT-150-C | |
| #5 Forceps | Dumont | RS-5015 | |
| 9 Dressions Spot plate | PYREX | 7220-85 | |
| Fluorescence Microscope | Nikon | SMZ1500 | |
| Glycerol | Sangon Biotech | A100854-0100 | |
| KCl | Sangon Biotech | A610440-0500 | Composition of 1x PBS solution |
| KH2PO4 | Sangon Biotech | A600445-0500 | Composition of 1x PBS solution |
| Laboratory spatula | Fisher | 14-375-10 | |
| Long forceps | R' DEER | RST-14 | |
| Microscope cover glass | CITOTEST | 80340-1130 | |
| Microscope slides | CITOTEST | 80302-2104 | |
| Na2HPO4 | Sangon Biotech | A501727-0500 | Composition of 1x PBS solution |
| NaCl | Sangon Biotech | A610476-0005 | Composition of 1x PBS solution |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Petri dish | Corning | 430166 | |
| Standard cornmeal/molasses/agar fly food | Tong Lab-made | ||
| Stereo microscope | Nikon | SMZ745 | |
| Sucrose | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd. | 10021418 | |
| Vectashield antifade mounting medium with DAPI | Vectorlabratory | H-1200-10 | Recommended mounting medium |
| Fly stocks | |||
| y'w* Iso FRT19A | Tong Lab's fly stocks | ||
| y'w* Mu1FRT19A/ FM7,Kr GFP | Tong Lab's fly stocks | ||
| y'w* Mu2 FRT19A/ FM7,Kr GFP | Tong Lab's fly stocks | ||
| hsFLP ubiRFP FRT19A; cgGal4 UAS-GFP-Atg8a | Tong Lab's fly stocks |
References
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