Summary
本プロトコルは、ショ ウジョウバエメラノガスター 幼虫の脂肪体における栄養素の枯渇 による オートファジーの誘導を説明し、トランスジェニックハエ株を使用してオートファジーの変化を分析します。
Abstract
オートファジーは細胞の自己消化プロセスです。飢餓を含む様々なストレスに応答して分解のためにリソソームに貨物を届ける。オートファジーの機能不全は、老化と複数の人間の病気に関連しています。オートファジー機構は、酵母からヒトまで高度に保存されています。脊椎動物の肝臓および脂肪組織の類似体である ショウジョウバエメラノガスターの幼虫脂肪体は、 in vivoでオートファジーをモニタリングするためのユニークなモデルを提供します。オートファジーは、幼虫の脂肪体の栄養飢餓によって容易に誘発される可能性があります。ほとんどのオートファジー関連遺伝子は ショウジョウバエに保存されています。 タグ付けされたオートファジーマーカーを発現する多くのトランスジェニックハエ株が開発されており、オートファジープロセスのさまざまなステップのモニタリングが容易になっています。クローン解析により、同じ組織片内の異なる遺伝子型を持つ細胞のオートファジーマーカーを綿密に比較することができます。本プロトコルでは、(1)幼虫の脂肪体内で体細胞クローンを作製する手順、(2)アミノ酸飢餓 による オートファジーの誘導、(3)幼虫の脂肪体を解剖する手順を詳述し、オートファゴソームマーカー(GFP-Atg8a)を用いたオートファジーの違いを解析するモデルの作成とクローン解析を目指しています。
Introduction
オートファジーは、アミノ酸飢餓を含むさまざまなストレスによって引き起こされる「自食」プロセスです1。マクロオートファジー(以下、オートファジーと呼びます)は、最もよく研究されているタイプのオートファジーであり、細胞の恒常性を維持する上でかけがえのない役割を果たしています2。オートファジーの機能不全は、いくつかのヒト疾患と関連している3。さらに、いくつかのオートファジー関連遺伝子は、さまざまな疾患を治療するための潜在的な標的です4。
オートファジーは高度に高度に制御されています5.飢餓状態になると、単離膜は細胞質物質を隔離して二重膜オートファゴソームを形成する6。次に、オートファゴソームはエンドソームおよびリソソームと融合して、アンフィソームおよびオートリソソームを形成します。リソソーム加水分解酵素の助けを借りて、飲み込まれた細胞質内容物が分解され、栄養素がリサイクルされます7。
オートファジーは進化的に保存されたプロセスです8。ショウジョウバエメラノガスターは、in vivoでのオートファジープロセスを研究するための優れたモデルです。アミノ酸飢餓は、ヒト肝臓および脂肪組織の類似体であるハエ脂肪体組織においてオートファジーを容易に誘導する9。オートファジーの欠陥は、Atg8、Atg9、Atg18、Syx17、Rab7、LAMP1、p62など、いくつかのオートファジー関連タンパク質の明確な点状突起パターンを破壊します10。したがって、これらのオートファジーマーカーのパターンを分析することは、オートファジー欠陥の発生とオートファジーステップの欠陥を識別するのに役立ちます。例えば、ユビキチン様タンパク質Atg8は、最も一般的に使用されるオートファジーマーカー11である。ショウジョウバエメラノガスターでは、緑色蛍光タンパク質(GFP)タグ付きAtg8aを有するトランスジェニック株の開発に成功しました12。GFP-Atg8aは、細胞質ゾルおよび栄養細胞内の核に拡散する。飢餓状態になると、GFP-Atg8aはホスファチジルエタノールアミン(PE)によって処理および修飾され、単離膜および完全に発達したオートファゴソームを標識するプンクタを形成します13,14。直接蛍光顕微鏡法により、オートファジー誘導はGFP-Atg8点状突起形成の増加として容易に観察することができる15。Atg8aプンクタは、オートファジー開始欠陥の存在下では飢餓に応答して形成されないであろう。GFP-Atg8aはオートリソソームの低pHによって消光および消化できるため、オートファジーが後期段階でブロックされると、GFP-Atg8aの点状突起の数が増える可能性があります16。
オートファジーは栄養の入手可能性に非常に敏感であるため17、培養条件のわずかな違いが表現型の変動につながることがよくあります。したがって、クローン解析は、同じ組織内の変異細胞対野生型コントロール細胞を分析する方法であり、オートファジー欠損を解剖する上で大きな利点を有する18。フリップパーゼ/フリッパーゼ認識ターゲット(FLP/FRT)を介した相同染色体間の部位特異的組換えを利用して、モザイク組織を運ぶハエを容易に作製する19,20。変異細胞を取り囲む野生型細胞は、個体差を避けるための完全な内部コントロールを形成する21。
本研究では、アミノ酸飢餓によりオートファジーを誘導し、GFP-Atg8a発現モザイク脂肪体組織を作製する方法について述べる。これらのプロトコルは、変異クローン間のオートファジーの違いを分析するために使用できます。
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Protocol
1. ショウジョウバエ の交配と産卵
- 3匹のオス(遺伝子型 hsFLP ubiRFP FRT19A;cgGal4 UAS-GFP-Atg8a)と15匹のメス(遺伝子型 y' w * Mu FRT19A / FM7、Kr GFP )の成虫( 材料の表を参照)を培養バイアル(標準的なコーンミール/糖蜜/寒天ショ ウジョウバエ 培地を25°C)に入れて交配します。
注:さらなる実験に十分な幼虫を確保するために、同じ交配の複数の培養バイアルをセットアップする必要があります。遺伝子型hsFLP ubiRFP FRT19A; cgGal4 UAS-GFP-Atg8aを有する雄のハエ株は、セントロメア(FRT19A)近くのX染色体にFRT部位を有する。また、37°Cのヒートショック時のFLPも発現します。 ユビキタスRFP発現を有する導入遺伝子がX染色体に挿入される。GFP-Atg8aは、幼虫脂肪体22においてcgGal4の制御下で発現している。遺伝子型y' w * Mu FRT19A / FM7、Kr GFPを有する雌のハエ株は、X染色体上に致死的突然変異(Mu)およびFRT19Aを有する。詳細な交差スキームを図1に示します。 - 産卵のために、ハエを新しい培養バイアルに移します。導入後48時間で、ハエが気絶するまで「嵌合」バイアルをタップし、バイアルの底にあるメディアにドロップダウンします。
- 「嵌合」バイアルのプラグを抜き、新鮮な培地(新鮮な培養バイアル)を入れたプラグを抜いた倒立バイアルで口を覆います。次に、バイアルをひっくり返して軽くたたくことにより、ハエを新鮮な培養バイアルに移します。
- 新鮮な培養バイアルを(移したハエと一緒に)差し込み、古い培養バイアルを廃棄します。この新鮮な培養バイアルを25°Cのインキュベーターに入れ、新鮮な培地に産卵します。
注:フライトランスファープロセスの前に、新鮮な培養バイアルを25°Cに15分間予熱すると、ハエが新しい環境にすばやく適応し、産卵を早めるのに役立ちます。
- 産卵の6時間後にハエを取り除きます。実験を繰り返す必要がある場合は、これらのハエを別の培養バイアルに移します(ステップ1.2で説明)。それ以外の場合は、ハエを75%エタノールを含むフラスコに捨てて廃棄します)。
- バイアルと胚を37°Cの水浴中で1時間インキュベートし、FLP発現を誘導した。その後、それらを25°Cのインキュベーターに入れ、胚が成長し続けるようにします。
注:変異クローンの形成が成功したことは、その後のイメージングによって確認することができます。RFPシグナルがないことは、変異クローンをマークします。
- バイアルと胚を37°Cの水浴中で1時間インキュベートし、FLP発現を誘導した。その後、それらを25°Cのインキュベーターに入れ、胚が成長し続けるようにします。
2. アミノ酸飢餓はオートファジーを誘発する
- 実験室のヘラを使用して、産卵の75時間後に発育中の幼虫を含む培地をペトリ皿にすくい取ります。3 mLの1x PBSを皿に加え、長い鉗子を使用して培地と幼虫を穏やかに分離します。10〜15匹の初期の3齢幼虫を選択します。
注:初期の3齢幼虫は慎重に選択する必要があります。幼虫の発達段階は、このプロトコルの成功にとって重要です。産卵期間が制限されているため、培養バイアル内のほとんどの幼虫は、孵卵の75時間までに3齢初期段階にあると予想されます。ただし、培地のレシピが異なると、幼虫の発育タイミングにばらつきが生じる可能性があります。初期の3齢幼虫を区別するための基準は、体長、前部および後部の気門の存在、ならびに口腔装置23の下顎フックである。 - 9ウェルガラスくぼみスポットプレート( 材料表を参照)のウェルに1x PBSを充填します。分離した3齢幼虫を長い鉗子を使用してウェルに入れ、幼虫を徹底的に洗浄してすべての培地残留物を取り除きます。
- 空のバイアルに5 mLの20%スクロース(1x PBS中)溶液を入れ、長い鉗子を使用してこの溶液にきれいな3齢幼虫を入れます。このバイアルを25°Cのインキュベーターで6時間インキュベートしてから、解剖のために回収します。
注:20%スクロース(1x PBS中)溶液は、アミノ酸欠乏飢餓培地として機能します。
3. 3齢幼虫の解剖とサンプル組織処理
- 砥石で両側の#5鉗子( 材料の表を参照)の2対を均等に研ぎます。
- 400 μLの1x PBSを9ウェルガラスくぼみスポットプレートの各ウェルに加え、幼虫を長い鉗子でウェルに移します。背側(気管のある側)を上に向けて、1匹の幼虫をウェルに入れます。
- 幼虫の幹の真ん中にある2つの#5鉗子で幼虫のキューティクルをつかみ、キューティクルをそっと引き裂きます。露出した脂肪体は、他の幼虫の内部組織とともに、幼虫の死骸に付着します。内臓をできるだけ露出させるのに十分なほど引っ張ります。すべての幼虫に対してこの手順を繰り返します。
注:各幼虫には、体の幹に沿って2つの大きな脂肪体があります。脂肪体組織は、解剖顕微鏡24の下で容易に区別することができる白色、不透明、および平坦な単層である。
- 幼虫の幹の真ん中にある2つの#5鉗子で幼虫のキューティクルをつかみ、キューティクルをそっと引き裂きます。露出した脂肪体は、他の幼虫の内部組織とともに、幼虫の死骸に付着します。内臓をできるだけ露出させるのに十分なほど引っ張ります。すべての幼虫に対してこの手順を繰り返します。
- 幼虫の死骸を、500 μLの4%パラホルムアルデヒド(PFA)を含む1.5 mLの微量遠心チューブに移します。チューブを振らずに25°Cで30分間インキュベートします。
注意:4%PFAは有毒です。保護のために手袋とマスクを着用してください。
注: 1x PBS バッファーで 4% PFA を調製することをお勧めします。PFAパウダーは1x PBSに瞬時に溶解しません。したがって、混合物をインキュベーター内で65°Cで一晩インキュベートするか、25°Cで45分間断続的に振とうする必要があります。 - 枝肉を4%PFAで30分間インキュベートした後、PFA溶液をピペットで取り出し、500 μLの1x PBSをチューブに加え、フラットローテーター上でチューブを10分間静かに振ってから、1x PBS溶液を廃棄します(3回繰り返します)。
- 長い鉗子を使用して、固定および洗浄された幼虫の死骸を、1x PBSで満たされた9つのくぼみスポットプレートのウェルに移します。#5鉗子を使用して、すべての無脂肪体組織を取り除きます。
- #5鉗子を使用して、80%グリセロールを封入媒体として使用して脂肪体の断片を顕微鏡スライドにマウントし、その上にカバーガラスを置きます。
注意: 取り付ける前に、GFPシグナルを保護するために、80%グリセロールのpHを確認してください(pHペーパーを使用して、pH = 7が最適です)。80%グリセロール中のDAPIを含むマウントメディア( 材料の表を参照)は、脂肪体細胞の核のイメージングに役立ちます。これらのスライドは、4°Cの暗所で保存した場合、1週間安定です。
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Representative Results
摂食条件下では、GFPタグ付きユビキチン様タンパク質GFP-Atg8aが細胞内に拡散します。飢餓状態になると、緑色のプンクタを形成し、オートファゴソームを標識します。オートファゴソームがリソソームと融合すると、GFPは酸性オートリソソームで消光し、緑色の点状突起は消失します。オートファジーが誘導されない場合、またはオートファゴソームの成熟が促進される場合、GFP点状突起の数は少なくなると予想されます。しかし、オートファゴソームとリソソームの融合がブロックされたり、オートリソソームのpHが塩基性になったりすると、GFP punctaの数や大きさが高くなると予想されます。
ここで提示されたプロトコルでは、FLP / FRTシステムは有糸分裂組換えを誘導し、野生型細胞と変異細胞の両方を持つ組織を生成します。野生型細胞はRFPを発現するが、変異細胞はRFP発現を欠いている。すべての脂肪体細胞におけるRFPの発現は、FLP / FRTを介した有糸分裂組換えがうまく誘導されなかったか、突然変異が細胞致死的であることを示しています。後者の場合(すなわち、突然変異が細胞致死性である場合)、幼虫の脂肪体は周囲の細胞よりも高いレベルのRFPシグナルを有する少数の細胞を有すると予想される。
図2において、GFP-Atg8a(緑)は野生型細胞(赤)で点状突起を形成し、オートファジーの誘導に成功したことを示唆している。変異クローン(RFP陰性)では、GFP-Atg8aプンクタのパターンが周囲の野生型細胞とは異なることが示唆され、オートファジーの欠陥が示唆されました。Mu1変異クローンではGFP-ATG8aプンクタはほとんど検出されず(図2B)、開始ステップでオートファジーがブロックされたか、オートリソソームの成熟が促進されたことを示しています。GFP-Atg8aプンクタの数とサイズはMu2変異クローンで大幅に増加し(図2C)、オートファゴソーム-リソソーム融合またはオートリソソーム酸性化の欠陥を示唆しています。これらの可能性を区別するには、さらなる実験が必要です。さらに、観察された差が統計的に有意かどうかを判断するには、点状突起のサイズと数を定量化する必要があります。
図1:変異クローンを保有するモザイク幼虫脂肪体におけるオートファジーマーカーGFP-Atg8aをモニタリングするための実験手順の概略図。 幼虫の脂肪体組織においてGFP-Atg8aを発現し、変異クローンを保有するハエを生成するための交雑スキームが示されている(X染色体上に致死点変異[Mu]を有する株が例として役立つ)。37°Cで1時間のヒートショックでFLP発現を活性化した後、GFP-Atg8a発現を有するホモ接合変異細胞を y'w*ミューFRT19A/hsFLP ubiRFP FRT19A;cgGal4 UAS-GFP-Atg8a / +幼虫脂肪体において生成することができる。オートファジーは、幼虫を20%スクロース溶液中で6時間インキュベートすることによって脂肪体に誘導される。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:Mu1およびMu2クローンにおけるGFP-Atg8aプンクタのパターンは、コントロールクローンのパターンとは異なる。 Mu1とMu2は、X染色体上の2つの独立した致死変異体です。異質化y' w*、FRT19Aハエはコントロールとして機能します。GFP-Atg8a(緑色)パターンを、対照、Mu1、またはMu2モザイク幼虫脂肪体において分析した。変異クローン(または対照クローン)は、RFP(赤)によって否定的にマークされた。(A)コントロールクローン(RFP陰性)では、GFP-Atg8aプンクタのパターンは周囲のRFP陽性細胞のパターンと類似していた。(B)Mu1変異クローン(RFP陰性)では、GFP-Atg8a点状突起が大幅に減少した。(C)Mu2変異クローン(RFP陰性)では、GFP-Atg8aプンクタの数とサイズが増加しました。スケールバー:10μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
本プロトコルは、(1)幼虫の脂肪体に変異クローンを運ぶハエを作製し、(2)アミノ酸飢餓によってオートファジーを誘導し、(3)幼虫の脂肪体を解剖する方法を記載しています。幼虫の脂肪体でクローンを正常に生成するためには、以下の重要なステップを熱心に実行する必要があります。(1)組織が有糸分裂を起こしている場合にのみ有糸分裂の再結合が起こるため、ヒートショックの正確なタイミングが重要であり、(2)ヒートショックの温度と持続時間の両方がFLP発現を誘導するために重要です。1時間のヒートショック用の標準的な37°Cの水浴が推奨されます。ヒートショックや飢餓時の胚/幼虫の死亡の可能性が高まることを考慮すると、イメージングに十分な組織サンプルを生成するために、複数の交差を設定する必要があります。
また、実際の培養条件を考慮して、一部のステップを変更する必要がある場合があります。例えば、実験室間の環境や ショウジョウバエ の培地の違いは、幼虫の成長速度に影響を与える可能性があります。したがって、胚が3齢初期に達するのに必要な発生時間と幼虫の飢餓の期間(オートファジーを誘導するために20%スクロースで培養する)は、各ラボで個別に標準化する必要があるかもしれません。
GFP-Atg8aは、オートファジーを決定するために最も一般的に使用されるマーカーです。しかし、GFP-Atg8aの点状パターンの変化は、正確なオートファジー欠損や影響を受けるステップを直接特定することはできません。したがって、そのようなデータを正確に解釈するには、複数のマーカーを分析する必要があります。ここに提示されたプロトコルは、それらのそれぞれのトランスジェニック株を有する他のオートファジー関連タンパク質に適合させることができる25。異なる蛍光タンパク質(青色蛍光タンパク質[BFP]など)で標識された複数のマーカーを同時に分析して、開始または融合プロセスを解明することができます。制御されたオートファジー修飾は、化学物質26 または重要な遺伝子27のRNA干渉を使用して、オートファジー機構をさらに解明するために本アプローチと組み合わせることができる。さらに、モザイク組織におけるオートファジーの内因性タンパク質マーカーを(免疫組織化学を用いて)解析することは、表現型を確認するために重要である28。
オートファジーはもともとランダムで非選択的なプロセスとして認識されていましたが、ミトコンドリアや小胞体などの細胞質オルガネラを選択的かつ選択的に分解できることを示す証拠が増えています29。さらに、ここで説明する手順は、選択的オートファジーを探索するために適用することができる。例えば、マイトファジーは、蛍光タンパク質(KeimaまたはGFP−RFPタンデムタグなど)をミトコンドリア標的配列30に付着させることによって、フライ脂肪体においてモニターすることができる。
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Disclosures
著者は利益相反を宣言しません。
Acknowledgments
ハエ株を提供してくれたTHFCとBDSCに感謝しています。Tong Chao博士は、中国国家自然科学財団(32030027、91754103、92157201)および中央大学の基礎研究基金の支援を受けています。私たちは、サービスを提供してくれたライフサイエンスインスティテュート(LSI)の中核施設に感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Axygen | MCT-150-C | |
| #5 Forceps | Dumont | RS-5015 | |
| 9 Dressions Spot plate | PYREX | 7220-85 | |
| Fluorescence Microscope | Nikon | SMZ1500 | |
| Glycerol | Sangon Biotech | A100854-0100 | |
| KCl | Sangon Biotech | A610440-0500 | Composition of 1x PBS solution |
| KH2PO4 | Sangon Biotech | A600445-0500 | Composition of 1x PBS solution |
| Laboratory spatula | Fisher | 14-375-10 | |
| Long forceps | R' DEER | RST-14 | |
| Microscope cover glass | CITOTEST | 80340-1130 | |
| Microscope slides | CITOTEST | 80302-2104 | |
| Na2HPO4 | Sangon Biotech | A501727-0500 | Composition of 1x PBS solution |
| NaCl | Sangon Biotech | A610476-0005 | Composition of 1x PBS solution |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Petri dish | Corning | 430166 | |
| Standard cornmeal/molasses/agar fly food | Tong Lab-made | ||
| Stereo microscope | Nikon | SMZ745 | |
| Sucrose | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd. | 10021418 | |
| Vectashield antifade mounting medium with DAPI | Vectorlabratory | H-1200-10 | Recommended mounting medium |
| Fly stocks | |||
| y'w* Iso FRT19A | Tong Lab's fly stocks | ||
| y'w* Mu1FRT19A/ FM7,Kr GFP | Tong Lab's fly stocks | ||
| y'w* Mu2 FRT19A/ FM7,Kr GFP | Tong Lab's fly stocks | ||
| hsFLP ubiRFP FRT19A; cgGal4 UAS-GFP-Atg8a | Tong Lab's fly stocks |
References
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