ניתוח אוטופגיה הנגרמת על ידי רעב בגוף השומן של הזחל Drosophila melanogaster
Summary
הפרוטוקול הנוכחי מתאר את השראת האוטופגיה בגוף השומן של הזחל Drosophila melanogaster באמצעות דלדול חומרי מזון ומנתח שינויים באוטופגיה באמצעות זני זבובים טרנסגניים.
Abstract
אוטופגיה היא תהליך של עיכול עצמי תאי. הוא מעביר מטען לליזוזומים לפירוק בתגובה ללחצים שונים, כולל רעב. תקלה של אוטופגיה קשורה להזדקנות ומחלות אנושיות מרובות. מנגנון האוטופגיה שמור מאוד – משמרים ועד בני אדם. גוף שומן הזחל של Drosophila melanogaster, אנלוגי לכבד חולייתנים ולרקמת שומן, מספק מודל ייחודי לניטור אוטופגיה in vivo. אוטופגיה יכולה להיגרם בקלות על ידי רעב תזונתי בגוף שומן הזחל. רוב הגנים הקשורים לאוטופגיה נשמרים בדרוזופילה. פותחו זנים רבים של זבובים טרנסגניים המבטאים סמני אוטופגיה מתויגים, המאפשרים ניטור של שלבים שונים בתהליך האוטופגיה. ניתוח השבטים מאפשר השוואה קרובה של סמני אוטופגיה בתאים בעלי גנוטיפים שונים באותה פיסת רקמה. הפרוטוקול הנוכחי מפרט נהלים עבור (1) יצירת שיבוטים סומטיים בגוף שומן הזחל, (2) גרימת אוטופגיה באמצעות רעב חומצות אמינו, ו-(3) ניתוח גוף שומן הזחל, במטרה ליצור מודל לניתוח הבדלים באוטופגיה באמצעות סמן אוטופגוזום (GFP-Atg8a) וניתוח שבטים.
Introduction
אוטופגיה היא תהליך “אכילה עצמית” המושרה על ידי לחצים שונים, כולל רעב חומצות אמינו1. מקרואוטופגיה (להלן אוטופגיה) היא הסוג הנחקר ביותר של אוטופגיה וממלאת תפקיד שאין לו תחליף בשמירה על הומאוסטזיס תאי2. תקלה של אוטופגיה קשורה למספר מחלות אנושיות3. בנוסף, חלק מהגנים הקשורים לאוטופגיה הם מטרות פוטנציאליות לטיפול במחלות שונות4.
אוטופגיה מוסדרת בצורה מתוחכמת ביותר5. בעת הרעב, קרומי הבידוד מבודדים חומרים ציטופלזמיים ליצירת אוטופגוזומים בעלי קרום כפול6. לאחר מכן אוטופגוזומים מתמזגים עם אנדוזומים וליזוזומים ליצירת אמפיזומים ואוטוליזוזומים. בעזרת אנזימים הידרוליטיים ליזוזומליים, התוכן הציטופלזמי שנבלע מתפרק, והחומרים המזינים ממוחזרים7.
אוטופגיה היא תהליך שימור אבולוציוני8. Drosophila melanogaster הוא מודל נהדר לחקר תהליך autophagy in vivo. רעב חומצות אמינו גורם בקלות לאוטופגיה ברקמת גוף שומן הזבובים, אנלוגיה של כבד אנושי ורקמת שומן9. פגמים באוטופגיה משבשים את דפוסי הפונקטה המובהקים של מספר חלבונים הקשורים לאוטופגיה, כגון Atg8, Atg9, Atg18, Syx17, Rab7, LAMP1 ו-p62, בין היתר10. לכן, ניתוח הדפוסים של סמני אוטופגיה אלה יסייע להבחין בהתרחשות של פגמים אוטופגיים ואת שלב אוטופגיה פגום. לדוגמה, החלבון דמוי האוביקוויטין Atg8 הוא סמן האוטופגיההנפוץ ביותר 11. ב- Drosophila melanogaster, זנים טרנסגניים עם חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) המתויג Atg8a פותחו בהצלחה12. GFP-Atg8a מפוזר בציטוזול ובגרעינים בתאים המוזנים. לאחר הרעבה, GFP-Atg8a מעובד ושונה על ידי פוספטידיל-אתנולאמין (PE) ויוצר פונקטה, אשר מסמנת את קרומי הבידוד ואת האוטופגוזומים המפותחים במלואם13,14. באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ישיר, ניתן לראות בקלות את השראת האוטופגיה כעלייה בהיווצרות GFP-Atg8 puncta15. Atg8a puncta לא ייווצר בתגובה לרעב בנוכחות פגם בהתחלת אוטופגיה. מכיוון ש-GFP-Atg8a יכול להיות מרווה-מעוכל על ידי ה-pH הנמוך באוטוליזוזומים, GFP-Atg8a puncta עשוי לעלות במספרים אם אוטופגיה נחסמת בשלבים מאוחרים16.
מכיוון שאוטופגיה רגישה מאוד לזמינות תזונתית17, הבדלים קלים בתנאי התרבית מובילים לעתים קרובות לשינויים בפנוטיפים. לכן, לאנליזה של שבטים, שיטה המנתחת תאים מוטנטיים לעומת תאי ביקורת מסוג בר באותה רקמה, יש יתרון גדול בניתוח פגמים אוטופגיים18. תוך ניצול של רקומבינציה ספציפית לאתר בתיווך FLPASE/FLPASE (FLP/FRT) בין כרומוזומים הומולוגיים, זבובים הנושאים רקמות פסיפס מיוצרים בקלות19,20. התאים מסוג פרא המקיפים את התאים המוטנטיים יוצרים בקרה פנימית מושלמת כדי למנוע הבדלים אינדיבידואליים21.
המחקר הנוכחי מתאר כיצד לגרום לאוטופגיה על ידי רעב חומצות אמינו וליצור רקמות גוף של שומן פסיפס המבטא GFP-Atg8a. פרוטוקולים אלה יכולים לשמש לניתוח הבדלים באוטופגיה בין שיבוטים מוטנטיים.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקול הנוכחי מתאר את השיטות (1) ליצור זבובים הנושאים שיבוטים מוטנטיים בגופי שומן הזחל, (2) לגרום לאוטופגיה באמצעות רעב חומצות אמינו, ו-(3) לנתח את גופי השומן של הזחל. על מנת לייצר שיבוטים בהצלחה בגופי שומן הזחל, יש לבצע את השלבים הקריטיים הבאים בחריצות. (1) תזמון מדויק של שוק החום הוא קריטי מ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו אסירי תודה ל-THFC ול-BDSC על אספקת זני הזבובים. ד”ר טונג צ’או נתמך על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (32030027, 91754103, 92157201) וקרנות מחקר בסיסיות עבור האוניברסיטאות המרכזיות. אנו מודים למתקן הליבה של המכון למדעי החיים (LSI) על מתן השירותים.
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Axygen | MCT-150-C | |
| #5 Forceps | Dumont | RS-5015 | |
| 9 Dressions Spot plate | PYREX | 7220-85 | |
| Fluorescence Microscope | Nikon | SMZ1500 | |
| Glycerol | Sangon Biotech | A100854-0100 | |
| KCl | Sangon Biotech | A610440-0500 | Composition of 1x PBS solution |
| KH2PO4 | Sangon Biotech | A600445-0500 | Composition of 1x PBS solution |
| Laboratory spatula | Fisher | 14-375-10 | |
| Long forceps | R' DEER | RST-14 | |
| Microscope cover glass | CITOTEST | 80340-1130 | |
| Microscope slides | CITOTEST | 80302-2104 | |
| Na2HPO4 | Sangon Biotech | A501727-0500 | Composition of 1x PBS solution |
| NaCl | Sangon Biotech | A610476-0005 | Composition of 1x PBS solution |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Petri dish | Corning | 430166 | |
| Standard cornmeal/molasses/agar fly food | Tong Lab-made | ||
| Stereo microscope | Nikon | SMZ745 | |
| Sucrose | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd. | 10021418 | |
| Vectashield antifade mounting medium with DAPI | Vectorlabratory | H-1200-10 | Recommended mounting medium |
| Fly stocks | |||
| y'w* Iso FRT19A | Tong Lab's fly stocks | ||
| y'w* Mu1FRT19A/ FM7,Kr GFP | Tong Lab's fly stocks | ||
| y'w* Mu2 FRT19A/ FM7,Kr GFP | Tong Lab's fly stocks | ||
| hsFLP ubiRFP FRT19A; cgGal4 UAS-GFP-Atg8a | Tong Lab's fly stocks |
References
- Yorimitsu, T., Klionsky, D. J. Autophagy: Molecular machinery for self-eating. Cell Death & Differentiation. 12 (2), 1542-1552 (2005).
- Jin, S., White, E. Role of autophagy in cancer: Management of metabolic stress. Autophagy. 3 (1), 28-31 (2007).
- Mizushima, N., Levine, B. Autophagy in human diseases. New England Journal of Medicine. 383 (16), 1564-1576 (2020).
- Mizushima, N., et al. Autophagy fights disease through cellular self-digestion. Nature. 451 (7182), 1069-1075 (2008).
- Yang, Z., Klionsky, D. J. Eaten alive: A history of macroautophagy. Nature Cell Biology. 12 (9), 814-822 (2010).
- Lamb, C. A., Yoshimori, T., Tooze, S. A. The autophagosome: Origins unknown, biogenesis complex. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (12), 759-774 (2013).
- Klionsky, D. J., Eskelinen, E. L., Deretic, V. Autophagosomes, phagosomes, autolysosomes, phagolysosomes, autophagolysosomes…Wait,I’mconfused. Autophagy. 10 (4), 549-551 (2014).
- Zhang, S., Hama, Y., Mizushima, N. The evolution of autophagy proteins-Diversification in eukaryotes and potential ancestors in prokaryotes. Journal of Cell Science. 134 (13), (2021).
- Scott, R. C., Schuldiner, O., Neufeld, T. P. Role and regulation of starvation-induced autophagy in the Drosophila fat body. Developmental Cell. 7 (2), 167-178 (2004).
- Liu, W., et al. Mitochondrial protein import regulates cytosolic protein homeostasis and neuronal integrity. Autophagy. 14 (8), 1293-1309 (2018).
- Ichimura, Y., et al. A ubiquitin-like system mediates protein lipidation. Nature. 408 (6811), 488-492 (2000).
- Rusten, T. E., et al. Programmed autophagy in the Drosophila fat body is induced by ecdysone through regulation of the PI3K pathway. Developmental Cell. 7 (2), 179-192 (2004).
- Nishida, Y., et al. Discovery of Atg5/Atg7-independent alternative macroautophagy. Nature. 461 (7264), 654-658 (2009).
- Ravikumar, B., et al. Regulation of mammalian autophagy in physiology and pathophysiology. Physiological Reviews. 90 (4), 1383-1435 (2010).
- Xie, Z., Nair, U., Klionsky, D. J. Atg8 controls phagophore expansion during autophagosome formation. Molecular Biology of the Cell. 19 (8), 3290-3298 (2008).
- Shintani, T., Klionsky, D. J. Cargo proteins facilitate the formation of transport vesicles in the cytoplasm to vacuole targeting pathway. Journal of Biological Chemistry. 279 (29), 29889-29894 (2004).
- Russell, R. C., Yuan, H. X., Guan, K. L. Autophagy regulation by nutrient signaling. Cell Research. 24 (1), 42-57 (2014).
- Nagy, P., et al. How and why to study autophagy in Drosophila: It’s more than just a garbage chute. Methods. 75, 151-161 (2015).
- Golic, K. G., Lindquist, S. The FLP recombinase of yeast catalyzes site-specific recombination in the Drosophila genome. Cell. 59 (3), 499-509 (1989).
- Senecoff, J. F., Cox, M. M. Directionality in FLP protein-promoted site-specific recombination is mediated by DNA-DNA pairing. Journal of Biological Chemistry. 261 (16), 7380-7386 (1986).
- Germani, F., Bergantinos, C., Johnston, L. A. Mosaic analysis in Drosophila. Genetics. 208 (2), 473-490 (2018).
- Zappia, M. P., et al. E2F/Dp inactivation in fat body cells triggers systemic metabolic changes. eLife. 10, 67753 (2021).
- Demerec, M. . Biology of Drosophila. , (1965).
- Rizki, R. M., et al. Drosophila larval fat body surfaces. Wilhelm Roux’s Archives of Developmental Biology. 192 (1), 1-7 (1983).
- Szeto, J., et al. ALIS are stress-induced protein storage compartments for substrates of the proteasome and autophagy. Autophagy. 2 (3), 189-199 (2006).
- Renna, M., et al. Chemical inducers of autophagy that enhance the clearance of mutant proteins in neurodegenerative diseases. Journal of Biological Chemistry. 285 (15), 11061-11067 (2010).
- Guo, S., et al. A large-scale RNA interference screen identifies genes that regulate autophagy at different stages. Scientific Reports. 8, 1-15 (2018).
- Tian, W., et al. An antibody for analysis of autophagy induction. Nature Methods. 17 (2), 232-239 (2020).
- Nezis, I. P. Selective autophagy in Drosophila. International Journal of Cell Biology. 2012, 146767 (2012).
- Chu, Y., et al. Fluorescent materials for monitoring mitochondrial biology. Materials. 14 (15), 4180 (2021).
