Analyse de l’autophagie induite par la famine dans le corps adipeux larvaire de Drosophila melanogaster
Summary
Le présent protocole décrit l’induction de l’autophagie dans le corps adipeux larvaire de Drosophila melanogaster via l’épuisement des nutriments et analyse les changements dans l’autophagie à l’aide de souches de mouches transgéniques.
Abstract
L’autophagie est un processus d’auto-digestion cellulaire. Il livre la cargaison aux lysosomes pour la dégradation en réponse à divers stress, y compris la famine. Le dysfonctionnement de l’autophagie est associé au vieillissement et à de multiples maladies humaines. La machinerie d’autophagie est hautement conservée, de la levure à l’homme. Le corps adipeux larvaire de Drosophila melanogaster, un analogue du foie et du tissu adipeux des vertébrés, fournit un modèle unique pour surveiller l’autophagie in vivo. L’autophagie peut être facilement induite par la privation de nutriments dans le corps adipeux larvaire. La plupart des gènes liés à l’autophagie sont conservés chez la drosophile. De nombreuses souches de mouches transgéniques exprimant des marqueurs d’autophagie marqués ont été développées, ce qui facilite le suivi des différentes étapes du processus d’autophagie. L’analyse clonale permet une comparaison étroite des marqueurs de l’autophagie dans des cellules ayant différents génotypes dans le même morceau de tissu. Le protocole actuel détaille les procédures pour (1) générer des clones somatiques dans le corps adipeux larvaire, (2) induire l’autophagie par privation d’acides aminés et (3) disséquer le corps adipeux larvaire, visant à créer un modèle pour analyser les différences d’autophagie à l’aide d’un marqueur autophagosome (GFP-Atg8a) et d’une analyse clonale.
Introduction
L’autophagie est un processus « auto-alimentaire » induit par divers stress, dont la privation d’acides aminés1. La macroautophagie (ci-après appelée autophagie) est le type d’autophagie le plus étudié et joue un rôle irremplaçable dans le maintien de l’homéostasie cellulaire2. Le dysfonctionnement de l’autophagie est associé à plusieurs maladies humaines3. De plus, certains gènes liés à l’autophagie sont des cibles potentielles pour le traitement de diverses maladies4.
L’autophagie est régulée de manière très sophistiquée5. En cas de famine, les membranes d’isolement séquestrent des matériaux cytoplasmiques pour former des autophagosomes à double membrane6. Les autophagosomes fusionnent ensuite avec les endosomes et les lysosomes pour former des amphisomes et des autolysosomes. À l’aide d’enzymes hydrolytiques lysosomales, le contenu cytoplasmique englouti est dégradé et les nutriments sont recyclés7.
L’autophagie est un processus conservé au cours de l’évolution8. Drosophila melanogaster est un excellent modèle pour étudier le processus d’autophagie in vivo. La privation d’acides aminés induit facilement l’autophagie dans le tissu adipeux des mouches, un analogue du foie humain et du tissu adipeux9. Les défauts de l’autophagie perturbent les schémas de poncta distincts de plusieurs protéines liées à l’autophagie, telles que Atg8, Atg9, Atg18, Syx17, Rab7, LAMP1 et p62, entre autres10. Par conséquent, l’analyse des modèles de ces marqueurs d’autophagie aidera à discerner l’apparition de défauts d’autophagie et l’étape d’autophagie défectueuse. Par exemple, la protéine de type ubiquitine Atg8 est le marqueur d’autophagie11 le plus couramment utilisé. Chez Drosophila melanogaster, des souches transgéniques marquées par une protéine fluorescente verte (GFP) Atg8a ont été développées avec succès12. GFP-Atg8a est diffusé dans le cytosol et les noyaux dans les cellules nourries. En cas de famine, GFP-Atg8a est traité et modifié par la phosphatidyléthanolamine (PE) et forme puncta, qui marque les membranes d’isolement et les autophagosomes pleinement développés13,14. Grâce à la microscopie à fluorescence directe, l’induction de l’autophagie peut être facilement observée comme une augmentation de la formation de puncta GFP-Atg815. Atg8a puncta ne se formait pas en réponse à la famine en présence d’un défaut d’initiation de l’autophagie. Comme le GFP-Atg8a peut être éteint et digéré par le faible pH des autolysosomes, le GFP-Atg8a puncta peut augmenter en nombre si l’autophagie est bloquée aux stades avancés16.
Comme l’autophagie est très sensible à la disponibilité nutritionnelle17, de légères différences dans les conditions de culture entraînent souvent des variations dans les phénotypes. Par conséquent, l’analyse clonale, une méthode qui analyse les cellules mutantes par rapport aux cellules témoins de type sauvage dans le même tissu, présente un avantage majeur dans la dissection des défauts d’autophagie18. Tirant parti de la recombinaison spécifique au site médiée par la cible de flippase/flippase (FLP/FRT) entre chromosomes homologues, les mouches porteuses de tissus mosaïques sont facilement fabriquées19,20. Les cellules de type sauvage entourant les cellules mutantes forment un contrôle interne parfait pour éviter les différences individuelles21.
La présente étude décrit comment induire l’autophagie par privation d’acides aminés et générer des tissus adipeux en mosaïque exprimant la GFP-Atg8a. Ces protocoles peuvent être utilisés pour analyser les différences d’autophagie entre clones mutants.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le présent protocole décrit les méthodes permettant (1) de générer des mouches porteuses de clones mutants dans les corps adipeux larvaires, (2) d’induire l’autophagie par privation d’acides aminés et (3) de disséquer les corps adipeux larvaires. Afin de générer des clones avec succès dans les corps adipeux larvaires, les étapes critiques suivantes doivent être effectuées avec diligence. (1) La synchronisation précise du choc thermique est cruciale car la recombinaison mitotique ne se produit que lors…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous sommes reconnaissants à THFC et BDSC d’avoir fourni les souches de mouches. Le Dr Tong Chao est soutenu par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (32030027, 91754103, 92157201) et les fonds de recherche fondamentale pour les universités centrales. Nous remercions l’installation centrale de l’Institut des sciences de la vie (LSI) pour ses services.
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Axygen | MCT-150-C | |
| #5 Forceps | Dumont | RS-5015 | |
| 9 Dressions Spot plate | PYREX | 7220-85 | |
| Fluorescence Microscope | Nikon | SMZ1500 | |
| Glycerol | Sangon Biotech | A100854-0100 | |
| KCl | Sangon Biotech | A610440-0500 | Composition of 1x PBS solution |
| KH2PO4 | Sangon Biotech | A600445-0500 | Composition of 1x PBS solution |
| Laboratory spatula | Fisher | 14-375-10 | |
| Long forceps | R' DEER | RST-14 | |
| Microscope cover glass | CITOTEST | 80340-1130 | |
| Microscope slides | CITOTEST | 80302-2104 | |
| Na2HPO4 | Sangon Biotech | A501727-0500 | Composition of 1x PBS solution |
| NaCl | Sangon Biotech | A610476-0005 | Composition of 1x PBS solution |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Petri dish | Corning | 430166 | |
| Standard cornmeal/molasses/agar fly food | Tong Lab-made | ||
| Stereo microscope | Nikon | SMZ745 | |
| Sucrose | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd. | 10021418 | |
| Vectashield antifade mounting medium with DAPI | Vectorlabratory | H-1200-10 | Recommended mounting medium |
| Fly stocks | |||
| y'w* Iso FRT19A | Tong Lab's fly stocks | ||
| y'w* Mu1FRT19A/ FM7,Kr GFP | Tong Lab's fly stocks | ||
| y'w* Mu2 FRT19A/ FM7,Kr GFP | Tong Lab's fly stocks | ||
| hsFLP ubiRFP FRT19A; cgGal4 UAS-GFP-Atg8a | Tong Lab's fly stocks |
References
- Yorimitsu, T., Klionsky, D. J. Autophagy: Molecular machinery for self-eating. Cell Death & Differentiation. 12 (2), 1542-1552 (2005).
- Jin, S., White, E. Role of autophagy in cancer: Management of metabolic stress. Autophagy. 3 (1), 28-31 (2007).
- Mizushima, N., Levine, B. Autophagy in human diseases. New England Journal of Medicine. 383 (16), 1564-1576 (2020).
- Mizushima, N., et al. Autophagy fights disease through cellular self-digestion. Nature. 451 (7182), 1069-1075 (2008).
- Yang, Z., Klionsky, D. J. Eaten alive: A history of macroautophagy. Nature Cell Biology. 12 (9), 814-822 (2010).
- Lamb, C. A., Yoshimori, T., Tooze, S. A. The autophagosome: Origins unknown, biogenesis complex. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (12), 759-774 (2013).
- Klionsky, D. J., Eskelinen, E. L., Deretic, V. Autophagosomes, phagosomes, autolysosomes, phagolysosomes, autophagolysosomes…Wait,I’mconfused. Autophagy. 10 (4), 549-551 (2014).
- Zhang, S., Hama, Y., Mizushima, N. The evolution of autophagy proteins-Diversification in eukaryotes and potential ancestors in prokaryotes. Journal of Cell Science. 134 (13), (2021).
- Scott, R. C., Schuldiner, O., Neufeld, T. P. Role and regulation of starvation-induced autophagy in the Drosophila fat body. Developmental Cell. 7 (2), 167-178 (2004).
- Liu, W., et al. Mitochondrial protein import regulates cytosolic protein homeostasis and neuronal integrity. Autophagy. 14 (8), 1293-1309 (2018).
- Ichimura, Y., et al. A ubiquitin-like system mediates protein lipidation. Nature. 408 (6811), 488-492 (2000).
- Rusten, T. E., et al. Programmed autophagy in the Drosophila fat body is induced by ecdysone through regulation of the PI3K pathway. Developmental Cell. 7 (2), 179-192 (2004).
- Nishida, Y., et al. Discovery of Atg5/Atg7-independent alternative macroautophagy. Nature. 461 (7264), 654-658 (2009).
- Ravikumar, B., et al. Regulation of mammalian autophagy in physiology and pathophysiology. Physiological Reviews. 90 (4), 1383-1435 (2010).
- Xie, Z., Nair, U., Klionsky, D. J. Atg8 controls phagophore expansion during autophagosome formation. Molecular Biology of the Cell. 19 (8), 3290-3298 (2008).
- Shintani, T., Klionsky, D. J. Cargo proteins facilitate the formation of transport vesicles in the cytoplasm to vacuole targeting pathway. Journal of Biological Chemistry. 279 (29), 29889-29894 (2004).
- Russell, R. C., Yuan, H. X., Guan, K. L. Autophagy regulation by nutrient signaling. Cell Research. 24 (1), 42-57 (2014).
- Nagy, P., et al. How and why to study autophagy in Drosophila: It’s more than just a garbage chute. Methods. 75, 151-161 (2015).
- Golic, K. G., Lindquist, S. The FLP recombinase of yeast catalyzes site-specific recombination in the Drosophila genome. Cell. 59 (3), 499-509 (1989).
- Senecoff, J. F., Cox, M. M. Directionality in FLP protein-promoted site-specific recombination is mediated by DNA-DNA pairing. Journal of Biological Chemistry. 261 (16), 7380-7386 (1986).
- Germani, F., Bergantinos, C., Johnston, L. A. Mosaic analysis in Drosophila. Genetics. 208 (2), 473-490 (2018).
- Zappia, M. P., et al. E2F/Dp inactivation in fat body cells triggers systemic metabolic changes. eLife. 10, 67753 (2021).
- Demerec, M. . Biology of Drosophila. , (1965).
- Rizki, R. M., et al. Drosophila larval fat body surfaces. Wilhelm Roux’s Archives of Developmental Biology. 192 (1), 1-7 (1983).
- Szeto, J., et al. ALIS are stress-induced protein storage compartments for substrates of the proteasome and autophagy. Autophagy. 2 (3), 189-199 (2006).
- Renna, M., et al. Chemical inducers of autophagy that enhance the clearance of mutant proteins in neurodegenerative diseases. Journal of Biological Chemistry. 285 (15), 11061-11067 (2010).
- Guo, S., et al. A large-scale RNA interference screen identifies genes that regulate autophagy at different stages. Scientific Reports. 8, 1-15 (2018).
- Tian, W., et al. An antibody for analysis of autophagy induction. Nature Methods. 17 (2), 232-239 (2020).
- Nezis, I. P. Selective autophagy in Drosophila. International Journal of Cell Biology. 2012, 146767 (2012).
- Chu, Y., et al. Fluorescent materials for monitoring mitochondrial biology. Materials. 14 (15), 4180 (2021).
