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Summary

Le présent protocole décrit l’induction de l’autophagie dans le corps adipeux larvaire de Drosophila melanogaster via l’épuisement des nutriments et analyse les changements dans l’autophagie à l’aide de souches de mouches transgéniques.

Abstract

L’autophagie est un processus d’auto-digestion cellulaire. Il livre la cargaison aux lysosomes pour la dégradation en réponse à divers stress, y compris la famine. Le dysfonctionnement de l’autophagie est associé au vieillissement et à de multiples maladies humaines. La machinerie d’autophagie est hautement conservée, de la levure à l’homme. Le corps adipeux larvaire de Drosophila melanogaster, un analogue du foie et du tissu adipeux des vertébrés, fournit un modèle unique pour surveiller l’autophagie in vivo. L’autophagie peut être facilement induite par la privation de nutriments dans le corps adipeux larvaire. La plupart des gènes liés à l’autophagie sont conservés chez la drosophile. De nombreuses souches de mouches transgéniques exprimant des marqueurs d’autophagie marqués ont été développées, ce qui facilite le suivi des différentes étapes du processus d’autophagie. L’analyse clonale permet une comparaison étroite des marqueurs de l’autophagie dans des cellules ayant différents génotypes dans le même morceau de tissu. Le protocole actuel détaille les procédures pour (1) générer des clones somatiques dans le corps adipeux larvaire, (2) induire l’autophagie par privation d’acides aminés et (3) disséquer le corps adipeux larvaire, visant à créer un modèle pour analyser les différences d’autophagie à l’aide d’un marqueur autophagosome (GFP-Atg8a) et d’une analyse clonale.

Introduction

L’autophagie est un processus « auto-alimentaire » induit par divers stress, dont la privation d’acides aminés¹. La macroautophagie (ci-après appelée autophagie) est le type d’autophagie le plus étudié et joue un rôle irremplaçable dans le maintien de l’homéostasie cellulaire². Le dysfonctionnement de l’autophagie est associé à plusieurs maladies humaines³. De plus, certains gènes liés à l’autophagie sont des cibles potentielles pour le traitement de diverses maladies⁴.

L’autophagie est régulée de manière très sophistiquée⁵. En cas de famine, les membranes d’isolement séquestrent des matériaux cytoplasmiques pour former des autophagosomes à double membrane⁶. Les autophagosomes fusionnent ensuite avec les endosomes et les lysosomes pour former des amphisomes et des autolysosomes. À l’aide d’enzymes hydrolytiques lysosomales, le contenu cytoplasmique englouti est dégradé et les nutriments sont recyclés⁷.

L’autophagie est un processus conservé au cours de l’évolution⁸. Drosophila melanogaster est un excellent modèle pour étudier le processus d’autophagie in vivo. La privation d’acides aminés induit facilement l’autophagie dans le tissu adipeux des mouches, un analogue du foie humain et du tissu adipeux⁹. Les défauts de l’autophagie perturbent les schémas de poncta distincts de plusieurs protéines liées à l’autophagie, telles que Atg8, Atg9, Atg18, Syx17, Rab7, LAMP1 et p62, entre autres¹⁰. Par conséquent, l’analyse des modèles de ces marqueurs d’autophagie aidera à discerner l’apparition de défauts d’autophagie et l’étape d’autophagie défectueuse. Par exemple, la protéine de type ubiquitine Atg8 est le marqueur d’autophagie¹¹ le plus couramment utilisé. Chez Drosophila melanogaster, des souches transgéniques marquées par une protéine fluorescente verte (GFP) Atg8a ont été développées avec succès¹². GFP-Atg8a est diffusé dans le cytosol et les noyaux dans les cellules nourries. En cas de famine, GFP-Atg8a est traité et modifié par la phosphatidyléthanolamine (PE) et forme puncta, qui marque les membranes d’isolement et les autophagosomes pleinement développés^13,14. Grâce à la microscopie à fluorescence directe, l’induction de l’autophagie peut être facilement observée comme une augmentation de la formation de puncta GFP-Atg8¹⁵. Atg8a puncta ne se formait pas en réponse à la famine en présence d’un défaut d’initiation de l’autophagie. Comme le GFP-Atg8a peut être éteint et digéré par le faible pH des autolysosomes, le GFP-Atg8a puncta peut augmenter en nombre si l’autophagie est bloquée aux stades avancés¹⁶.

Comme l’autophagie est très sensible à la disponibilité nutritionnelle¹⁷, de légères différences dans les conditions de culture entraînent souvent des variations dans les phénotypes. Par conséquent, l’analyse clonale, une méthode qui analyse les cellules mutantes par rapport aux cellules témoins de type sauvage dans le même tissu, présente un avantage majeur dans la dissection des défauts d’autophagie¹⁸. Tirant parti de la recombinaison spécifique au site médiée par la cible de flippase/flippase (FLP/FRT) entre chromosomes homologues, les mouches porteuses de tissus mosaïques sont facilement fabriquées^19,20. Les cellules de type sauvage entourant les cellules mutantes forment un contrôle interne parfait pour éviter les différences individuelles²¹.

La présente étude décrit comment induire l’autophagie par privation d’acides aminés et générer des tissus adipeux en mosaïque exprimant la GFP-Atg8a. Ces protocoles peuvent être utilisés pour analyser les différences d’autophagie entre clones mutants.

Protocol

1. Croisement de la drosophile et ponte Introduire 3 mouches adultes mâles (génotype hsFLP ubiRFP FRT19A; cgGal4 UAS-GFP-Atg8a) et 15 femelles (génotype y’ w* Mu FRT19A/FM7, Kr GFP ) dans un flacon de culture (avec semoule de maïs/mélasse/gélose standard Drosophila media à 25 °C) pour l’accouplement.NOTE: Plusieurs flacons de culture du même croisement doivent être mis en place pour assurer suffisamment de larves pour d’autres expériences. La souche de mouche mâle avec le génotype hsFLP ubiRFP FRT19A; cgGal4 UAS-GFP-Atg8a porte un site FRT au chromosome X près du centromère (FRT19A). Il exprime également le FLP lors d’un choc thermique à 37 °C. Un transgène avec une expression RFP ubiquitaire est inséré sur le chromosome X. La GFP-Atg8a est exprimée sous le contrôle de cgGal4 dans le corps adipeux larvaire22. La souche de mouche femelle de génotype y’ w* Mu FRT19A / FM7, Kr GFP porte une mutation létale (Mu) et FRT19A sur le chromosome X. Le schéma détaillé du croisement est illustré à la figure 1. Pour la ponte, transférez les mouches dans un nouveau flacon de culture. 48 h après l’introduction, tapotez le flacon d’accouplement jusqu’à ce que les mouches soient assommées et déposez-le sur le support à la base du flacon.Débranchez le flacon « d’accouplement » et couvrez sa bouche avec un flacon inversé débranché avec du milieu frais (flacon de culture fraîche). Ensuite, transférez les mouches dans le flacon de culture fraîche en retournant et en tapotant les flacons. Branchez le flacon de culture fraîche (avec les mouches transférées) et jetez l’ancien flacon de culture. Placez ce flacon de culture fraîche dans un incubateur à 25 °C pour la ponte sur le support frais.REMARQUE: Préchauffer les flacons de culture fraîche à 25 ° C pendant 15 minutes avant le processus de transfert des mouches aidera les mouches à s’adapter rapidement au nouvel environnement et accélérera la ponte. Retirez les mouches après 6 h de ponte. Si les expériences doivent être répétées, transférez ces mouches dans un autre flacon de culture (comme décrit à l’étape 1.2). Sinon, jeter les mouches en les jetant dans une fiole contenant 75% d’éthanol).Incuber le flacon avec les embryons dans un bain-marie à 37 °C pendant 1 h pour induire l’expression de FLP. Ensuite, placez-les dans un incubateur à 25 °C et laissez les embryons continuer à se développer.NOTE: La formation réussie de clones mutants peut être confirmée ultérieurement par imagerie. L’absence de signaux RFP marque les clones mutants. 2. La privation d’acides aminés induit l’autophagie À l’aide d’une spatule de laboratoire, prélever le milieu contenant les larves en développement dans une boîte de Petri 75 h après la ponte. Ajouter 3 ml de 1x PBS dans la capsule et séparer délicatement les milieux de culture et les larves à l’aide de longues pinces. Sélectionnez 10 à 15 larves du troisième stade précoce.REMARQUE: Les larves du troisième stade précoce doivent être choisies avec soin. Le stade de développement des larves est essentiel au succès de ce protocole. En raison de la durée de ponte limitée, la plupart des larves du flacon de culture devraient être au stade précoce du troisième stade à 75 heures d’incubation. Cependant, différentes recettes de milieux de culture peuvent entraîner des variations dans le calendrier de développement des larves. Les critères permettant de distinguer les larves du début du troisième stade sont la longueur du corps, la présence de spiracles antérieurs et postérieurs, ainsi que les crochets mandibulaires de l’appareil buccal23. Remplissez les puits d’une plaque de point de dépression en verre à 9 puits (voir le tableau des matériaux) avec 1x PBS. Placez les larves séparées du troisième stade dans les puits à l’aide de longues pinces et lavez soigneusement les larves pour éliminer tous les résidus de milieux. Prélever 5 mL de solution de saccharose à 20 % (dans 1x PBS) dans un flacon vide et placer les larves propres du troisième stade dans cette solution à l’aide de longues pinces. Incuber ce flacon dans un incubateur à 25 °C pendant 6 h avant de le récolter pour la dissection.REMARQUE: La solution de saccharose à 20% (dans 1x PBS) sert de milieu de famine déficient en acides aminés. 3. Dissection des larves du troisième stade et traitement des tissus des échantillons Aiguisez deux paires de pinces #5 (voir le tableau des matériaux) uniformément des deux côtés avec une pierre à aiguiser. Ajouter 400 μL de 1x PBS dans chaque puits de la plaque spot de dépression en verre à 9 puits et transférer les larves dans les puits avec de longues pinces. Placer une larve dans un puits avec la face dorsale (le côté avec la trachée) tournée vers le haut.Saisissez la cuticule de la larve avec deux pinces #5 au milieu du tronc larvaire et déchirez doucement les cuticules. Les corps adipeux exposés, ainsi que d’autres tissus internes larvaires, seront toujours attachés à la carcasse de la larve. Tirez suffisamment pour exposer les organes internes autant que possible. Répétez cette étape pour toutes les larves.NOTE: Chaque larve a deux gros morceaux de corps gras le long du tronc du corps. Le tissu adipeux est une monocouche blanche, opaque et plate qui peut être facilement distinguée au microscope à dissection24. Transférer la carcasse larvaire dans un tube microcentrifuge de 1,5 mL contenant 500 μL de paraformaldéhyde (PFA) à 4 %. Incuber pendant 30 min à 25 °C sans agiter les tubes.ATTENTION : 4 % de PFA est toxique. Portez des gants et des masques pour vous protéger.REMARQUE: La préparation de PFA à 4% dans 1x tampon PBS est recommandée. La poudre de PFA ne se dissout pas instantanément dans 1x PBS. Par conséquent, le mélange doit être incubé à 65 °C dans un incubateur pendant une nuit ou agité intermittente pendant 45 min à 25 °C. Après 30 minutes d’incubation de la carcasse avec 4 % de PFA, extraire à la pipette la solution de PFA, ajouter 500 μL de 1x PBS dans le tube et agiter doucement le tube sur un rotateur plat pendant 10 minutes avant de jeter la solution 1x PBS (répéter 3x). À l’aide de longues pinces, transférer la carcasse larvaire fixe et lavée dans un puits dans la plaque spot à 9 dépressions remplie de 1x PBS. À l’aide de la pince #5, retirez tous les tissus corporels non gras. Utilisez des pinces #5 pour monter les morceaux du corps gras sur une lame de microscope en utilisant 80% de glycérol comme support de montage et posez un couvercle sur le dessus.REMARQUE: Avant le montage, vérifiez le pH du glycérol à 80% (en utilisant des papiers de pH, pH = 7 est optimal) pour protéger le signal GFP. Le support de montage (voir le tableau des matériaux) avec DAPI dans 80% de glycérol aidera à imager les noyaux des cellules adipeuses du corps. Ces lames sont stables pendant 1 semaine lorsqu’elles sont stockées dans l’obscurité à 4 °C.

Representative Results

Dans des conditions nourries, la protéine de type ubiquitine marquée GFP, GFP-Atg8a, est diffusée à l’intérieur des cellules. En cas de famine, il forme des puncta verts et étiquette les autophagosomes. Une fois que les autophagosomes fusionnent avec les lysosomes, la GFP est éteinte dans les autolysosomes acides et les puncta verts disparaissent. Si l’autophagie n’est pas induite ou si la maturation de l’autophagosome est accélérée, le nombre de puncta GFP devrait être faible. Cependant, si la fusion …

Discussion

Le présent protocole décrit les méthodes permettant (1) de générer des mouches porteuses de clones mutants dans les corps adipeux larvaires, (2) d’induire l’autophagie par privation d’acides aminés et (3) de disséquer les corps adipeux larvaires. Afin de générer des clones avec succès dans les corps adipeux larvaires, les étapes critiques suivantes doivent être effectuées avec diligence. (1) La synchronisation précise du choc thermique est cruciale car la recombinaison mitotique ne se produit que lors…

Materials

1.5 mL microcentrifuge tube	Axygen	MCT-150-C
#5 Forceps	Dumont	RS-5015
9 Dressions Spot plate	PYREX	7220-85
Fluorescence Microscope	Nikon	SMZ1500
Glycerol	Sangon Biotech	A100854-0100
KCl	Sangon Biotech	A610440-0500	Composition of 1x PBS solution
KH2PO4	Sangon Biotech	A600445-0500	Composition of 1x PBS solution
Laboratory spatula	Fisher	14-375-10
Long forceps	R' DEER	RST-14
Microscope cover glass	CITOTEST	80340-1130
Microscope slides	CITOTEST	80302-2104
Na2HPO4	Sangon Biotech	A501727-0500	Composition of 1x PBS solution
NaCl	Sangon Biotech	A610476-0005	Composition of 1x PBS solution
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127
Petri dish	Corning	430166
Standard cornmeal/molasses/agar fly food			Tong Lab-made
Stereo microscope	Nikon	SMZ745
Sucrose	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd.	10021418
Vectashield antifade mounting medium with DAPI	Vectorlabratory	H-1200-10	Recommended mounting medium
Fly stocks
y'w* Iso FRT19A			Tong Lab's fly stocks
y'w* Mu1FRT19A/ FM7,Kr GFP			Tong Lab's fly stocks
y'w* Mu2 FRT19A/ FM7,Kr GFP			Tong Lab's fly stocks
hsFLP ubiRFP FRT19A; cgGal4 UAS-GFP-Atg8a			Tong Lab's fly stocks