Análisis de la autofagia inducida por inanición en el cuerpo graso larvario de Drosophila melanogaster
Summary
El presente protocolo describe la inducción de autofagia en el cuerpo graso larvario de Drosophila melanogaster a través del agotamiento de nutrientes y analiza los cambios en la autofagia utilizando cepas de moscas transgénicas.
Abstract
La autofagia es un proceso de autodigestión celular. Entrega carga a los lisosomas para su degradación en respuesta a diversas tensiones, incluida la inanición. El mal funcionamiento de la autofagia se asocia con el envejecimiento y múltiples enfermedades humanas. La maquinaria de autofagia está altamente conservada, desde la levadura hasta los humanos. El cuerpo graso larval de Drosophila melanogaster, un análogo para el hígado de vertebrados y el tejido adiposo, proporciona un modelo único para monitorear la autofagia in vivo. La autofagia puede ser fácilmente inducida por la falta de nutrientes en el cuerpo de grasa larval. La mayoría de los genes relacionados con la autofagia se conservan en Drosophila. Se han desarrollado muchas cepas de moscas transgénicas que expresan marcadores de autofagia marcados, lo que facilita el monitoreo de diferentes pasos en el proceso de autofagia. El análisis clonal permite una comparación cercana de los marcadores de autofagia en células con diferentes genotipos en la misma pieza de tejido. El protocolo actual detalla los procedimientos para (1) generar clones somáticos en el cuerpo graso de la larva, (2) inducir la autofagia a través de la inanición de aminoácidos y (3) diseccionar el cuerpo graso de la larva, con el objetivo de crear un modelo para analizar las diferencias en la autofagia utilizando un marcador autofagosómico (GFP-Atg8a) y análisis clonal.
Introduction
La autofagia es un proceso de “autoalimentación” inducido por diversas tensiones, incluida la inanición de aminoácidos1. La macroautofagia (en adelante autofagia) es el tipo de autofagia mejor estudiado y desempeña un papel insustituible en el mantenimiento de la homeostasis celular2. El mal funcionamiento de la autofagia está asociado con varias enfermedades humanas3. Además, algunos genes relacionados con la autofagia son dianas potenciales para el tratamiento de diversas enfermedades4.
La autofagia está regulada de una manera altamente sofisticada5. Tras la inanición, las membranas de aislamiento secuestran materiales citoplasmáticos para formar autofagosomas de doble membrana6. Los autofagosomas luego se fusionan con endosomas y lisosomas para formar anfisomas y autolisosomas. Con la ayuda de enzimas hidrolíticas lisosomales, los contenidos citoplasmáticos engullidos se degradan y los nutrientes se reciclan7.
La autofagia es un proceso evolutivamente conservado8. Drosophila melanogaster es un gran modelo para estudiar el proceso de autofagia in vivo. La inanición de aminoácidos induce fácilmente la autofagia en el tejido corporal graso de la mosca, un análogo del hígado humano y el tejido adiposo9. Los defectos en la autofagia interrumpen los distintos patrones de puncta de varias proteínas relacionadas con la autofagia, como Atg8, Atg9, Atg18, Syx17, Rab7, LAMP1 y p62, entre otras10. Por lo tanto, el análisis de los patrones de estos marcadores de autofagia ayudará a discernir la aparición de defectos de autofagia y el paso de autofagia defectuosa. Por ejemplo, la proteína similar a la ubiquitina Atg8 es el marcador de autofagia más utilizado11. En Drosophila melanogaster, se han desarrollado con éxito cepas transgénicas con una proteína verde fluorescente (GFP) Atg8a12. GFP-Atg8a se difunde en el citosol y los núcleos de las células alimentadas. Tras la inanición, GFP-Atg8a es procesada y modificada por fosfatidiletanolamina (PE) y forma puncta, que marca las membranas de aislamiento y los autofagosomas completamente desarrollados13,14. A través de la microscopía de fluorescencia directa, la inducción de autofagia puede ser fácilmente observada como un aumento en la formación de GFP-Atg8 puncta15. Atg8a punto no se formaría en respuesta a la inanición en presencia de un defecto de iniciación de la autofagia. Como GFP-Atg8a puede ser enfriado y digerido por el bajo pH en los autolisosomas, GFP-Atg8a puncta puede aumentar en número si la autofagia se bloquea en las últimas etapas16.
Como la autofagia es altamente sensible a la disponibilidad nutricional17, ligeras diferencias en las condiciones de cultivo a menudo conducen a variaciones en los fenotipos. Por lo tanto, el análisis clonal, un método que analiza células mutantes versus células de control de tipo salvaje en el mismo tejido, tiene una gran ventaja en la disección de defectos de autofagia18. Aprovechando la recombinación específica del sitio mediada por el objetivo de reconocimiento flippasa / flippase (FLP / FRT) entre cromosomas homólogos, las moscas que transportan tejidos en mosaico se hacen fácilmente19,20. Las células de tipo salvaje que rodean a las células mutantes forman un control interno perfecto para evitar diferencias individuales21.
El presente estudio describe cómo inducir la autofagia por inanición de aminoácidos y generar tejidos corporales de grasa en mosaico que expresan GFP-Atg8a. Estos protocolos se pueden utilizar para analizar las diferencias en la autofagia entre clones mutantes.
Protocol
Representative Results
Discussion
El presente protocolo describe los métodos para (1) generar moscas portadoras de clones mutantes en los cuerpos grasos larvales, (2) inducir la autofagia a través de la inanición de aminoácidos y (3) diseccionar los cuerpos grasos de las larvas. Para generar clones con éxito en los cuerpos grasos larvales, los siguientes pasos críticos deben llevarse a cabo diligentemente. (1) Sincronizar el choque térmico con precisión es crucial porque la recombinación mitótica solo ocurre cuando el tejido está experimentand…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Estamos agradecidos con THFC y BDSC por proporcionar las cepas de mosca. El Dr. Tong Chao cuenta con el apoyo de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (32030027, 91754103, 92157201) y fondos de investigación fundamental para las universidades centrales. Agradecemos a la instalación central en el Instituto de Ciencias de la Vida (LSI) por proporcionar servicios.
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Axygen | MCT-150-C | |
| #5 Forceps | Dumont | RS-5015 | |
| 9 Dressions Spot plate | PYREX | 7220-85 | |
| Fluorescence Microscope | Nikon | SMZ1500 | |
| Glycerol | Sangon Biotech | A100854-0100 | |
| KCl | Sangon Biotech | A610440-0500 | Composition of 1x PBS solution |
| KH2PO4 | Sangon Biotech | A600445-0500 | Composition of 1x PBS solution |
| Laboratory spatula | Fisher | 14-375-10 | |
| Long forceps | R' DEER | RST-14 | |
| Microscope cover glass | CITOTEST | 80340-1130 | |
| Microscope slides | CITOTEST | 80302-2104 | |
| Na2HPO4 | Sangon Biotech | A501727-0500 | Composition of 1x PBS solution |
| NaCl | Sangon Biotech | A610476-0005 | Composition of 1x PBS solution |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Petri dish | Corning | 430166 | |
| Standard cornmeal/molasses/agar fly food | Tong Lab-made | ||
| Stereo microscope | Nikon | SMZ745 | |
| Sucrose | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd. | 10021418 | |
| Vectashield antifade mounting medium with DAPI | Vectorlabratory | H-1200-10 | Recommended mounting medium |
| Fly stocks | |||
| y'w* Iso FRT19A | Tong Lab's fly stocks | ||
| y'w* Mu1FRT19A/ FM7,Kr GFP | Tong Lab's fly stocks | ||
| y'w* Mu2 FRT19A/ FM7,Kr GFP | Tong Lab's fly stocks | ||
| hsFLP ubiRFP FRT19A; cgGal4 UAS-GFP-Atg8a | Tong Lab's fly stocks |
References
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